CN103063832A

CN103063832A - 基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法

Info

Publication number: CN103063832A
Application number: CN2013100018640A
Authority: CN
Inventors: 唐点平; 高壮强; 杨黄浩; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-01-05
Filing date: 2013-01-05
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其包括如下步骤：1、通过硼氢化钠还原法制备铂纳米颗粒模拟酶。2、将铂纳米颗粒模拟酶标记到抗体上，制成铂标抗体纳米探针。3、将已包被在酶标微孔板上的抗体、待测样品以及铂标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成免疫复合物；4、加入显色底物液进行显色检测。本方法可用于比色免疫检测大分子目标物，本发明涉及纳米探针复合物制备工艺简单，成本低，免疫检测方法简便、显色快速、灵敏度高，为临床免疫学检测提供了一种无酶、灵敏且性能稳定的新方法。

Description

基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法

技术领域

本发明属于纳米材料和生物分析技术领域，尤其是涉及一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法。

背景技术

免疫分析技术因其独有的特异性，在临床诊断和环境检测等方面得到广泛地应用。酶联免疫分析技术(ELISA)自1971年建立以来，便由于其所具有的快速、灵敏、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的免疫分析方法之一，涉及免疫学检验的各个领域。但是，如果它所用到的蛋白酶的一些本质的缺点可以被克服，比如说蛋白酶容易失活、稳定性不高等，那么酶联免疫分析的性能将可能被进一步的提高。此外，提取和纯化蛋白酶往往是耗时、昂贵和复杂的；制备和纯化酶标记的抗体复合物也是非常复杂和昂贵的。因此，人们在努力地寻找天然蛋白酶的各类替代品（即人工模拟酶）用于免疫分析。纳米科学和纳米技术的出现，为人工模拟酶的发展开阔了新的视野。纳米材料由于它们具有比表面积大等优点使他们成为很吸引人的高效催化剂。到目前为止，很多纳米材料已经被发现具有模拟酶的催化活性。比如，四氧化三铁磁性纳米颗粒、带正电荷的金纳米颗粒、氧化石墨烯和单壁碳纳米管等已经被发现具有本质的类过氧化物酶活性。[J. Xie et al., TrAC Anal. Chem., 2012, 39: 114] 而且已经有文献报道一些纳米材料模拟酶可以替代天然蛋白酶应用于免疫分析，展现出优秀的稳定性。但是，目前这些纳米材料模拟酶催化活性还不够高，往往需要经过复杂的修饰才能标记到抗体上。这些不足导致了基于这些纳米材料模拟酶的免疫分析的灵敏度往往不够高、检测线不够低，使得其无法达到实际临床免疫学检测低丰度蛋白的需求。因此在模拟酶免疫分析中，催化活性高、稳定性好、易于标记生物分子的纳米材料模拟酶标记物的开发具有极其重要的意义。

在这些纳米材料模拟酶中，铂纳米颗粒因其著名的优秀催化性能成为关注的重点。依据已有的报道，铂纳米颗粒具有高效的类过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显蓝色[M. Ma et al., Colloids Surf. A, 2011, 373: 6]。而且铂纳米颗粒易于与生物分子偶联，具有良好的生物相容性、水溶性和化学稳定性。在纳米生物检测领域中，铂纳米颗粒不仅可以作为信号载体放大检测信号，还可以作为标记物产生检测信号[J. Zhou et al., Biosens. Bioelectron. 2012, 35: 394] [J. Zhang et al., Biosens. Bioelectron. 2010, 26: 418]。因此，利用铂纳米颗粒作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶进行比色免疫分析具有重大的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析新方法，该分析方法主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测。利用铂纳米颗粒模拟酶催化活性高、稳定性高、易于标记等特点，在对其进行抗体标记形成纳米探针复合物之后，可以建立一种无酶、高灵敏且性能稳定的免疫分析方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法包括如下步骤：

（1）制备铂纳米颗粒模拟酶；

（2）将铂纳米颗粒模拟酶标记到抗体上制成铂标抗体纳米探针；

（3）将已包被在酶标微孔板上的抗体、待测样品以及铂标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离的铂标抗体纳米探针进行分离。

（4）加入铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值。再根据吸光度值的强弱用以定量待测样品。

步骤（1）和（2）所述的铂纳米颗粒模拟酶是通过硼氢化钠还原氯铂酸钾得到的；所述的铂纳米颗粒模拟酶粒径为3~5nm，其表面带负电荷。

步骤（2）所述铂纳米颗粒模拟酶与抗体的结合为正负电荷相吸作用结合、疏水作用结合和化学键作用结合。

步骤（3）所述酶标微孔板是高亲和力的96孔聚苯乙烯微孔板；所述待测样品为大分子目标物；所述夹心型免疫分析模式的完成采取两步法：即待测样品、已包被在酶标微孔板上的抗体混合发生免疫反应形成一种免疫复合物，在与铂标抗体纳米探针混合发生免疫反应形成免疫复合物。

步骤（4）所述铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液为含有浓度为7.63M 的过氧化氢和浓度为0.921mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的柠檬酸钠-磷酸缓冲液（pH 4.0）。

本发明的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法的测定原理是，首先将抗体包被到微孔板上，加入待测样品，再加入铂标抗体纳米探针孵育，从而在微孔板上形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫复合物。当待测样品含量低时，结合在微孔板上的铂标抗体纳米探针就少，显色反应减弱；吸光度值降低，反之结合在微孔板上的铂标抗体纳米探针就多，显色反应增强，吸光度值升高。从而达到定量分析的目的。

本发明的优点如下：

（1）本发明提供了一种将铂纳米颗粒作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶应用于比色免疫分析检测大分子目标物(主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测)的方法。本方法具有检测线低、灵敏度和稳定性高等优点。

（2）本发明使用无机纳米材料作为模拟酶，克服了传统生物活性酶标记方法中生物酶易失活、易变性等缺点，可望为疾病早期诊断等重要领域提供技术基础，具备显著的经济效益和社会效益。

（3）与辣根过氧化物酶相比，铂纳米颗粒是一种无机纳米材料，它性能更稳定、制备方法更简单、成本更低、标记抗体更容易，并且易于大规模制备。

（4）与已报道的基于模拟酶的免疫分析相比，本发明的基于铂纳米颗粒模拟酶的比色免疫分析具有更低的检测线、更高的灵敏度。本发明方法对于兔免疫球蛋白G的检出限为0.4 ng mL^-1，线性范围是5 ng mL^-1到250 ng mL^-1。

附图说明

图1是铂纳米颗粒模拟酶的透射电镜图；

图2是抗体（a）、铂纳米颗粒（b）和铂标抗体纳米探针复合物（c）的红外光谱图；

图3是基于铂纳米颗粒模拟酶免疫分析的示意图；

图4是基于铂纳米颗粒模拟酶免疫分析显色检测兔免疫球蛋白G标准工作曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。

实施例1

1. 铂纳米颗粒模拟酶制备

在搅拌的状态下，往10mL的90℃的二次水中加入400mL 浓度为10mM的氯铂酸钾（K₂PtCl₆）溶液。1分钟后，往上述混合液中加入100mL 1%(w/w)的柠檬酸钠，然后再过1分钟，加入400mL新鲜配制的含有1%(w/w)柠檬酸钠和0.08%(w/w)硼氢化钠的混合液。将上述反应液置于90℃油浴中加热10分钟，得到铂纳米颗粒模拟酶贮备液。通过透射电镜图表征所制备的铂纳米颗粒模拟酶，如图1所示。从图1可以看出，所制备的铂纳米颗粒大小分布均匀，粒径分布在3~5nm之间。

2. 铂标抗体纳米探针复合物的制备

首先，将1.0mL所制备的铂纳米颗粒模拟酶用浓度为0.01M的氢氧化钠溶液调节pH值到8-9。第二，将20μL浓度为100μg/mL的羊抗兔IgG抗体加入上述铂纳米颗粒溶液中，然后将混合液在4℃搅拌下孵育5小时。第三，5小时后，在混合液中加入10μL浓度为10 wt %的牛白蛋白溶液，然后在4℃下孵育过夜封闭铂纳米颗粒上剩余的结合位点。最后，将上述混合液在8000rmp转速和4℃下离心20min，小心去除上层清夜，得到的沉淀再分散在1mL含有1.0 wt %牛白蛋白和0.1 wt % 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，储存于4℃。通过红外光谱表征所制备的铂标抗体纳米探针复合物，如图2所示。有图2可知，抗体在1645 cm^-1左右处有特征的红外吸收峰（曲线a），铂纳米颗粒在1645 cm^-1左右处没有明显红外吸收峰（曲线b），铂标抗体纳米探针复合物在1645 cm^-1左右处出现抗体的特征吸收峰（曲线c），表明抗体成功标记到铂纳米颗粒上。

3. 比色免疫分析检测兔IgG（本实施例以兔免疫球蛋白G（兔IgG）作为模型目标分析物）

图3是本发明的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析过程示意图。首先，在高亲和力的96孔酶标微孔板上每孔加入50 μL的羊抗兔IgG（浓度为1 μg mL^-1，包被缓冲液为0.05 M的碳酸盐缓冲液，pH 9.6）在4℃下孵育过夜，然后将上述的微孔板用PBST缓冲液洗涤3次，再每孔加入300 μL封闭液（1.0 wt %牛白蛋白）置于37℃下孵育1 h后用PBST缓冲液洗涤3次。其次，加入50μL一系列的兔IgG标准样品在37 ℃下孵育1 h，用PBST缓冲液洗涤4次，然后加入50 μL上述所制备的铂标抗体纳米探针复合物置于37℃下孵育1 h后用PBST缓冲液洗涤4次。最后，每孔加入100μL底物液（含有7.63 M的过氧化氢和0.921 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所用缓冲液为pH 4.0的柠檬酸钠-磷酸缓冲液），室温下显色5 min后，用酶标仪在650 nm处读取吸光度值。根据吸光度值和兔IgG浓度变化的关系绘制标准工作曲线，如图4所示。实验结果表明，该方法对于兔血清中免疫球蛋白G的检出限为0.4 ng mL^-1，线性范围是5 ng mL^-1至250 ng mL^-1。该方法与传统生物活性酶标记的方法相比，本发明使用无机纳米材料作为模拟酶，克服了传统生物活性酶标记方法中生物酶易失活、易变性等缺点，可望为疾病早期诊断等重要领域提供技术基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）制备铂纳米颗粒模拟酶；

（3）将已包被在酶标微孔板上的抗体、待测样品以及铂标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离的铂标抗体纳米探针进行分离；

（4）加入铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值。

2.根据权利要求1所述的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其特征在于：步骤（1）和（2）所述的铂纳米颗粒模拟酶是通过硼氢化钠还原氯铂酸钾得到的；所述的铂纳米颗粒模拟酶粒径为3~5nm，其表面带负电荷。

3.根据权利要求1所述的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其特征在于：步骤（2）所述铂纳米颗粒模拟酶与抗体的结合为正负电荷相吸作用结合、疏水作用结合和化学键作用结合。

4.根据权利要求1所述的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其特征在于：步骤（3）所述酶标微孔板是高亲和力的96孔聚苯乙烯微孔板；所述待测样品为大分子目标物；所述夹心型免疫分析模式的完成采取两步法：即待测样品、包被在酶标微孔板上的抗体混合发生免疫反应形成一种免疫复合物，再与铂标抗体纳米探针混合发生免疫反应形成免疫复合物。

5.根据权利要求1所述的基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法，其特征在于：步骤（4）所述铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液为含有浓度为7.63M 的过氧化氢和浓度为0.921mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的柠檬酸钠-磷酸缓冲液；所述柠檬酸钠-磷酸缓冲液的pH 值为4.0。