CN114002438A - 一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫组化领域，具体涉及一种小鼠一抗‑小鼠组织同种属免疫组化染色方法。该方法包括：不经小鼠组织内源性鼠IgG封闭步骤，直接以小鼠一抗抗体进行一抗孵育，然后使用亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物进行二抗孵育，显色；所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物包括聚合物载体以及结合在聚合物载体上的标记酶和二抗抗体，所述二抗抗体为特异性识别所述小鼠一抗抗体亚型的亚型特异单克隆抗小鼠二抗。本发明的方法，一方面省去了内源性鼠IgG封闭步骤，简化了操作流程，节省了时间；一方面也大大降低小鼠一抗‑小鼠组织免疫组化实验的背景信号，提升了二抗检测系统试剂的特异性，使得组织染色结果更加清晰易读。

Description

一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法
技术领域
本发明属于免疫组化领域，具体涉及一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法。
背景技术
在人类疾病研究中，小鼠模型是一种重要的临床前研究工具。一方面，他们在基因和生物学上和人类相似；另一方面，它们可以模拟人类的疾病状态，但没有人类模型的组织样本限制。而在对小鼠模型的研究过程中，小鼠组织的免疫组织化学染色是一项重要的手段。
由于小鼠单克隆抗体技术的广泛应用，市场上流通的大部分一抗抗体都是“鼠源一抗”。这些“鼠源一抗”在小鼠组织中抗原的检测实验中，必须采用“抗小鼠二抗显色试剂”进行显色。传统的“抗小鼠二抗显色试剂”主要成分是“多聚酶标抗小鼠二抗聚合物“，该显色试剂无法区分小鼠组织中内源性的鼠IgG抗体和外部添加的“鼠源一抗”，因而会产生严重的背景染色，影响结果的判读。
目前市场上主流的“小鼠一抗-小鼠组织”同种属免疫组化实验，主要采用二抗显色系统方案是在常规免疫组化流程的一抗孵育步骤之前，加入一个内源性鼠IgG封闭步骤，而其用于检测一抗信号的“多聚酶标抗小鼠二抗聚合物”和传统的用于检测鼠源一抗的二抗聚合物并无不同。采用该方法的一个很典型的例子是Vector Laboratories公司的产品-
Figure BDA0003338791110000011
(Mouse on Mouse)
Figure BDA0003338791110000012
Polymer Kit(货号MP-2400)。该方法中，内源性鼠IgG封闭剂的主要成分是抗小鼠IgG的单价Fab片段，该单价Fab片段可以占据组织内内源性鼠IgG上的抗原表位，阻止后续添加的“多聚酶标抗小鼠二抗聚合物”(为多克隆抗体)对内源性鼠IgG的识别。虽然该方法目前已经在小鼠模型的临床前研究领域中成为了一种通用的技术手段，但是它也有几项技术缺陷：(1)采用单价Fab片段虽然可以有效封闭内源性鼠IgG，但是由于单价Fab片段易和组织发生非特异性吸附，进而在后续外源一抗的孵育步骤中捕获到一部分的小鼠一抗抗体，从而被“多聚过氧化物酶标抗小鼠二抗聚合物”识别，进而在最终的组织染色中显示为一种大范围的广泛的背景着色；(2)该方法在常规免疫组化流程的基础上，增加了一个内源性鼠IgG封闭的步骤，使得流程更为繁琐。而且该步骤耗时长，通常的做法是在常温下孵育一个小时，在一些文献报道中甚至将该步骤延长到4℃孵育过夜。
综上所述，目前的基于单价抗小鼠Fab封闭剂的“小鼠一抗-小鼠组织”同种属免疫组化方案，耗时长，步骤繁琐，且最终的染色效果也是差强人意的。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，解决现有“小鼠一抗-小鼠组织”同种属免疫组化染色显色方案存在背景染色以及染色步骤繁琐、耗时长的问题。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，包括：不经小鼠组织内源性鼠IgG封闭步骤，直接以小鼠一抗抗体进行一抗孵育，然后使用亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物进行二抗孵育，显色；
所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物包括聚合物载体以及结合在聚合物载体上的标记酶和二抗抗体，所述二抗抗体为特异性识别所述小鼠一抗抗体亚型的亚型特异单克隆抗小鼠二抗。
本发明的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，一方面省去了“内源性鼠IgG封闭”这一步骤，简化了操作流程，节省了时间；一方面也大大降低“小鼠一抗-小鼠组织”免疫组化实验的背景信号，提升了二抗检测系统试剂的特异性，使得组织染色结果更加清晰易读。
优选地，所述亚型特异单克隆抗小鼠二抗为完整IgG蛋白、Fab’片段或Fab’2片段。进一步优选地，所述亚型特异单克隆抗小鼠二抗来自不同种属，所述不同种属为大鼠、兔、羊、马、驴或人。
小鼠一抗抗体为单克隆抗体，亚型已知。优选地，所述小鼠一抗抗体的亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3。
优选地，所述聚合物载体为链式聚合物、星型大分子聚合物或超支化聚合物。进一步优选地，所述超支化聚合物为超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架。
为进一步优化二抗试剂的信号放大效果，更优选地，所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物包括超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架，所述标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，所述二抗抗体通过偶联剂连接在所述标记酶上。进一步优选地，所述偶联剂为方酸二酯。
优选地，所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物由包括以下步骤的方法进行制备：
(1)先用方酸二酯偶联剂对超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架进行活化，获得活化骨架；
(2)将步骤(1)获得的活化骨架和标记酶进行偶联反应，获得超支化高分子-酶聚合物；
(3)利用方酸二酯偶联剂对所述超支化高分子-酶聚合物进行活化，然后和亚型特异单克隆抗小鼠二抗进行混合反应。
优选地，所述标记酶为辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。
附图说明
图1为参考实施例1的方法在小鼠肠组织上不加入一抗时的染色效果；
图2为使用对照品的方法在小鼠肠组织上不加入一抗时的染色效果；
图3为实施例1的方法在小鼠肠组织上的染色效果；
图4为使用对照品的方法在小鼠肠组织上的染色效果；
图5为参考实施例2的方法在小鼠肺组织上不加入一抗时的染色效果；
图6为使用对照品的方法在小鼠肺组织上不加入一抗时的染色效果；
图7为实施例2的方法在小鼠肺组织上的染色效果；
图8为使用对照品的方法在小鼠肺组织上的染色效果；
图9为参考实施例3的方法在小鼠肾组织上不加入一抗时的染色效果；
图10为使用对照品的方法在小鼠肾组织上不加入一抗时的染色效果；
图11为实施例3的方法在小鼠肾组织上的染色效果；
图12为使用对照品的方法在小鼠肾组织上的染色效果；
图13为参考实施例4的方法在小鼠肝组织上不加入一抗时的染色效果；
图14为使用对照品的方法在小鼠肝组织上不加入一抗时的染色效果；
图15为实施例4的方法在小鼠肝组织上的染色效果；
图16为使用对照品的方法在小鼠肝组织上的染色效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
对于大多数的商业化的小鼠单克隆IgG一抗来说，抗体的亚型是已知的，有以下几种：IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgG3。传统的用于“小鼠一抗-小鼠组织”免疫组化实验的“多聚酶标抗小鼠二抗聚合物”中的“抗小鼠二抗抗体”是多克隆抗体，可理解为具有不同反应性的多种二抗抗体的复合物，其反应性为IgG(H+L)，即对所有亚型的小鼠IgG都有反应活性；而且由于其多克隆的本质，也不可能100％去除其对小鼠组织上其他物质的交叉反应和非特异性结果。
本发明提出的方案，是在小鼠一抗-小鼠组织免疫组化实验中，针对已知的“小鼠一抗亚型”，选择对应的“亚型特异单克隆抗小鼠二抗”，制备相应的“多聚酶标-亚型特异单克隆抗小鼠二抗复合物”。相比于传统的多克隆二抗，本发明采用的是单克隆二抗，仅针对具体实验中所用的小鼠一抗的特定亚型具有高度特异性，而不会和其他小鼠IgG亚型和小鼠组织内抗原发生交叉反应。因此，本发明的方案可大大降低“小鼠一抗-小鼠组织”免疫组化实验的背景信号。此外，本发明的检测方法仅需二抗孵育一个步骤，省去了传统方法中的“内源性鼠IgG封闭步骤”，因而简化了操作流程，节省了时间。
本发明的改进点主要在于使用亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物进行二抗孵育，来省去“内源性鼠IgG封闭步骤”。免疫组化染色中的其他环节，例如一抗孵育(或内源性鼠IgG封闭步骤)之前的环节，例如脱蜡、水化、抗原修复等，以及二抗孵育之后的显色环节，例如DAB显色、苏木素衬染、脱水、透明、封片等，可参考相关现有技术。例如，针对使用“多聚HRP酶二抗复合物”的情形，一般包括以下步骤：脱蜡、水化、抗原修复、内源性过氧化物酶封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素衬染、脱水、透明、封片，相应流程可参考现有免疫组化标准操作流程。
以下实施例中，二抗复合物试剂是基于“超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架”和“方酸二酯偶联化学”。具体方案如下：先用方酸二酯偶联剂对超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架进行活化，活化产物经过脱盐可去除多余未反应的方酸二酯小分子，获得表面含方酸单酯的聚二甲羟基丙酸酯。该经活化的骨架可以和表面含氨基的酶进行偶联反应，可获得“超支化高分子-酶”聚合物。另一方面，将“超支化高分子-酶”经过方酸二酯偶联剂进一步活化和脱盐后，和商业化的“亚型特异单克隆抗小鼠二抗”原料混合反应，纯化后可得“多聚酶标-亚型特异单克隆抗小鼠二抗复合物”。可参考申请人的前期研究成果CN111551709B来获得上述方案的详细说明。
作为一种典型示例，“多聚酶标-亚型特异单克隆抗小鼠二抗复合物”是以“表面活化的BoltornTM H40-辣根过氧化物酶-多聚物”为中间体，再与商业化的“亚型特异单克隆抗小鼠二抗”原料混合反应得到。
其中，“表面活化的BoltornTM H40-辣根过氧化物酶-多聚物”中间体的制备过程如下：
1)将1mg表面氨基化的聚二甲羟基丙酸酯超支化高分子BoltornTM H40(PolymerFactory公司，SKU：PFH-010412)于室温下溶解于2ml PBS缓冲液(PH＝7.4)中。
2)将3mg方酸二乙酯溶解于300ul DMSO中。一边搅拌，一边将方酸二乙酯全部滴加入Amine Functional BoltornTM H40溶液中，在室温下搅拌反应2小时。
3)将上述反应物通过Sephadex G-25(GE Life Science,SKU:17003302)纯化柱，除去剩余的方酸二乙酯，并且将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M,PH＝9)，获得表面含方酸单乙酯基团的聚二甲羟基丙酸酯超支化高分子溶液，约4ml。
4)将115mg辣根过氧化物酶[(PierceTMHorseradish Peroxidase,ThermoFisherScientific公司，SKU:31490)以20mg/ml浓度溶于PBS缓冲液(PH＝7.4)，然后一边搅拌一边滴加入上述第3)步中表面含方酸单乙酯基团的聚二甲羟基丙酸酯超支化高分子溶液中，室温搅拌反应3小时。
5)将上述溶液通过Superdex 200Prep Grade纯化柱(GE Life Science,SKU:17104301-17104306)，除去未完全反应的辣根过氧化物酶，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，收集最先流出纯化柱的大分子组分，获得纯净的“BoltornTM H40-辣根过氧化物酶聚合物”溶液，约13ml。
6)将2.7mg方酸二乙酯溶解于270ul DMSO中。一边搅拌一边把方酸二乙酯溶液全部滴加入上述溶液中，完成对辣根过氧化物酶表面的活化。之后，再次让溶液通过SephadexG-25纯化柱，除去多余的方酸二乙酯，并将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M,PH＝9)，获得表面经过方酸单酯活化的“BoltornTM H40-辣根过氧化物酶聚合物中间体”溶液，约17ml。
以下实例中，如无特殊说明，所用试剂均采用河南赛诺特生物技术有限公司的目录产品。
一、小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法的实施例
实施例1
本实施例的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，包括以下步骤：
1.脱蜡、水化
(1)选取小鼠石蜡包埋组织切片。
(2)将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。
(3)将切片置于无水乙醇中浸泡5分钟。
(4)将切片置于95％乙醇中浸泡5分钟。
(5)将切片置于70％乙醇中浸泡5分钟。
(6)将切片置于去离子水中浸泡5分钟。
2.热抗原修复
向高压锅中加入EDTA抗原修复液(PH9)，将上述切片浸泡其中，盖上高压锅盖，加热至沸腾，维持2.5分钟。停止加热，自然冷却10分钟，水浴冷却20分钟。打开锅盖，将切片转移至去离子水中浸泡5分钟。更换去离子水，再将切片浸泡5分钟。
3.内源性过氧化物酶封闭
(1)用PBS缓冲液冲洗切片，甩干PBS缓冲液。
(2)向组织上滴加0.1ml的内源性过氧化物酶封闭剂，室温孵育5分钟。
(3)用PBS缓冲液冲洗切片。
(4)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。
4.一抗孵育
(1)甩干PBS缓冲液。
(2)向组织上滴加0.1ml一抗抗体，确保一抗溶液覆盖整个组织。
(3)室温孵育1小时。
(4)用PBS缓冲液冲洗切片。
(5)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。
5.二抗孵育
(1)甩干PBS缓冲液。
(2)向组织上滴加0.1ml相应的二抗复合物试剂，确保二抗溶液覆盖整个组织。
(3)室温孵育15分钟。
(4)用PBS缓冲液冲洗切片。
(5)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。
6.DAB显色
(1)配置DAB显色液：将1滴DAB底物溶液滴加入1mlDAB缓冲液中，混匀待用。
(2)甩干PBS缓冲液。
(3)向组织上滴加0.1ml DAB显色液。
(4)室温孵育5分钟
(5)用去离子水冲洗切片。
(6)将切片置于去离子水中浸泡5分钟，更换去离子水再浸泡5分钟。
7.苏木素衬染
(1)甩干去离子水。
(2)向组织上滴加0.1ml苏木素染液。
(3)室温孵育5分钟。
(4)用去离子水冲洗切片。
(5)将切片置于去离子水中浸泡5分钟，更换去离子水再浸泡5分钟。
8.脱水、透明、封片
(1)将切片置于70％乙醇中浸泡5分钟。
(2)将切片置于95％乙醇中浸泡5分钟。
(3)将切片置于无水乙醇中浸泡5分钟。
(4)将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。
(5)将切片从溶剂中取出，平铺，在组织上滴加0.05ml中性树酯，盖上盖玻片。放置于化学通风橱中过夜风干。
9.在显微镜下观察组织形态，判定染色结果。
本实施例中，一抗试剂采用小鼠抗BCL-2抗体工作液(克隆号：124；抗体亚型：IgG1；货号：CBM-0041)。二抗复合物试剂为“多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”，制备过程如下：
(1)将96.5mg IgG1亚型特异的大鼠抗小鼠单克隆二抗IgG(SouthernBiotech公司，货号：1144)在离心浓缩管内浓缩至2mg/ml，并将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M,PH＝9)。
(2)一边搅拌，一边将步骤(1)所得大鼠抗小鼠二抗溶液全部滴加入17ml“表面活化的BoltornTM H40-辣根过氧化物酶-多聚物中间体”溶液中。室温下搅拌反应过夜。
(3)向步骤(2)所得反应混合物中加入5％(质量分数，终浓度，下同)的BSA(稳定剂)，以及0.05％的Proclin300(杀菌剂)。所得的“多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”经过稀释(在抗体稀释液中以1:500的稀释比配制工作液)后便可进行免疫组织化学染色。
实施例2
本实施例的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，与实施例1的方法基本相同，区别说明如下：
一抗试剂采用小鼠抗TTF-1抗体工作液(克隆号：8G7G3/1；抗体亚型：IgG1；货号：CTM-0263)。二抗复合物试剂为“多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”(同实施例1)。
实施例3
本实施例的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，与实施例1的方法基本相同，区别说明如下：
一抗试剂采用小鼠抗SMA抗体工作液(克隆号：C1C1；抗体亚型：IgG2a；货号：CAM-0191)。二抗复合物试剂为“多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”，制备过程如下：
(1)将96.5mg IgG2a亚型特异的大鼠抗小鼠单克隆二抗IgG(SouthernBiotech公司，货号：1155)在离心浓缩管内浓缩至2mg/ml,并将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M,PH＝9)。
(2)一边搅拌，一边将步骤(1)所得大鼠抗小鼠二抗溶液全部滴加入17ml“表面活化的BoltornTM H40-辣根过氧化物酶-多聚物中间体”溶液中。室温下搅拌反应过夜。
(3)向(2)所得反应混合物中加入5％的BSA(稳定剂)，以及0.05％的Proclin300(杀菌剂)。所得的“多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”经过稀释后便可进行免疫组织化学染色。
实施例4
本实施例的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，与实施例1的方法基本相同，区别说明如下：
一抗试剂采用小鼠抗Glutamine Synthetase抗体工作液(克隆号：GS-6；抗体亚型：IgG2a；货号：CGM-0190)。二抗复合物试剂同实施例3。
在本发明的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法的其他实施例中，如果一抗试剂使用的是IgG3亚型，则二抗复合物使用多聚酶标-IgG3亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物，制备过程如下：
(1)将96.5mg IgG3亚型特异的大鼠抗小鼠单克隆二抗IgG(SouthernBiotech公司，货号：1191)在离心浓缩管内浓缩至2mg/ml,并将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M,PH＝9)。
(2)一边搅拌，一边将步骤(1)所得大鼠抗小鼠二抗溶液全部滴加入17ml“表面活化的BoltornTM H40-辣根过氧化物酶-多聚物中间体”溶液中。室温下搅拌反应过夜。
(3)向上述反应混合物中加入5％的BSA(稳定剂)，以及0.05％的Proclin300(杀菌剂)。所得的“多聚酶标-IgG3亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”经过稀释后便可进行免疫组织化学染色。
基于相同原理，可以利用现有方法制备“多聚酶标二抗复合物”，其中二抗抗体使用针对单克隆小鼠一抗抗体亚型的亚型特异单克隆抗小鼠二抗抗体(完整IgG蛋白或是这些抗体的Fab’2片段或者Fab’片段)，这些二抗抗体可采用商业化产品或利用现有方法自制。单克隆小鼠一抗抗体的亚型也可以是IgG2b,IgG2c。二抗抗体一般是来自不同种属的重组单克隆二抗抗体，比如大鼠、兔、羊、马、驴、人等。
除了以上超支化聚合物载体之外，可以使用链式骨架，比如葡聚糖、多肽聚合物等；或者使用星型大分子骨架，比如聚乙二胺树枝状聚合物。
二、实验例
实验例1
本实验例1针对实施例1和实施例2，说明“多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”在免疫组织化学实验中的特异性和灵敏度。
将“多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”在抗体稀释液中以1:500的稀释比配制所得的工作液，并以美国Vector Laboratories公司的产品Mouse onMouse Impress HRP Polymer Kit(货号：MP-2400)作为对照品，该产品的详细说明可参考https://vectorlabs.com/mouse-on-mouse-m-o-m-immpress-hrp-peroxidase-polymer-kit.html的说明。
本实验中，采用了经福尔马林固定及石蜡包埋的组织样本，包括小鼠肺，小鼠肠。实施例1和实施例2示出了采用上述相应二抗复合物试剂的手工免疫组化标准操作流程。对照品的染色流程相比上述免疫组化标准操作流程增加了鼠IgG封闭步骤，其余步骤相同。
使用对照品的免疫组化步骤简述：在“3.内源性过氧化物酶封闭”与“4.一抗孵育”步骤之间增加“小鼠组织内源性IgG封闭”，过程如下：
(1)在1.5ml离心管内，加入2.5ml PBS缓冲液，再加入90ul Mouse IgG BlockingReagent(Vector Laboratories，MP-2400内置组分)，混匀，得到鼠IgG封闭工作液。
(2)向组织上滴加0.1ml鼠IgG封闭工作液，常温孵育1小时。
(3)用PBS缓冲液冲洗切片。
(4)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。
1.1采用实施例1的方法和使用对照品的方法在小鼠肠组织上的染色效果对比
为了展示不同的染色方案下由于小鼠组织内源性IgG抗体造成的背景染色差异，第一步实验将一抗孵育步骤改为用PBS-T缓冲液孵育(注：在不加入一抗时，组织片理论上应呈阴性)，其余步骤按照相应试剂的标准操作步骤进行，结果如图1和图2所示。
图1中，实施例1的方法(使用多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物)中在小鼠肠组织上不加入一抗时的染色效果。图2为对照品在不加入一抗时的染色效果。
对比可知，图1中全片染色呈正常阴性，无背景着色；图2中在肠粘膜上皮和肌肉层中可见淡黄色背景着色，在肠粘膜固有层中可见深黑色背景着色，该背景着色会对阳性信号的判读造成严重干扰。
第二步实验，采用相应试剂的正常染色流程，实施例1采用多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物在肠组织上的染色效果如图3所示。采用对照品的方法在肠组织上的染色效果如图4所示。
对比可知，图3中肠固有层中的淋巴细胞呈正常阳性染色，结果良好；图4中除固有层中的淋巴细胞呈阳性外，上皮细胞和肌肉层中也可见淡黄色背景着色，影响判读。
1.2采用实施例2的方法和使用对照品的方法在小鼠肺组织上的染色效果对比
第一步实验，参考实验例1.1的说明，参考实施例2的方法在小鼠肺组织上不加入一抗时的染色效果如图5所示。使用对照品的方法在小鼠肺组织上不加入一抗时的染色效果如图6所示。在不加入一抗时，组织片理论上应呈阴性。
对比可知，图5中背景较为干净，仅在局部区域肺泡壁细胞间质处有棕色底物沉积物，不会干扰结果的判读；图6中在2型肺泡壁细胞、细支气管基底上皮细胞、以及细胞间质均可观察到严重的背景着色，严重影响结果判读。
第二步实验，采用相应试剂的正常染色流程，实施例2采用多聚酶标-IgG1亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物在肺组织上的染色效果如图7所示。采用对照品的方法在肺组织上的染色效果如图8所示。
对比可知，图7中，2型肺泡壁细胞和细支气管基底上皮细胞呈强阳性着色，结果良好，无可见的背景着色情况；图8中，2型肺泡壁细胞、细支气管基底上皮细胞、以及细胞间质均呈现严重背景着色，严重影响判读。
实验例2
本实验例针对实施例3和实施例4，说明“多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”在免疫组织化学实验中的特异性和灵敏度。
将“多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物”在抗体稀释液中以1:500的稀释比配制所得的工作液，并以美国Vector Laboratories公司的产品Mouse onMouse Impress HRP Polymer Kit(货号：MP-2400)作为对照品。
本实验中，采用了经福尔马林固定及石蜡包埋的组织样本，包括小鼠肾，小鼠肝。实施例3和实施例4示出了采用上述相应二抗复合物试剂的手工免疫组化标准操作流程。对照品的染色流程相比上述免疫组化标准操作流程增加了鼠IgG封闭步骤，其余步骤相同(具体封闭步骤可参考实验例1)。
2.1采用实施例3的方法和使用对照品的方法在小鼠肾组织上的染色效果对比
第一步实验，参考实验例1.1的说明，参考实施例3的方法在小鼠肾组织上不加入一抗时的染色效果如图9所示。使用对照品的方法在小鼠肾组织上不加入一抗时的染色效果如图10所示。在不加入一抗时，组织片理论上应呈阴性。
对比可知，图9中背景较为干净；图10中在肾小管区域及中部大血管管壁中均可观察到淡黄色背景着色。
第二步实验，采用相应试剂的正常染色流程，实施例3采用多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物在肾组织上的染色效果如图11所示。采用对照品的方法在肾组织上的染色效果如图12所示。
对比可知，图11中肾小管区域中的血管壁及中部大血管壁染色强阳性，结果清洗易读，无可见的背景着色情况；图12中除血管壁强阳性之外，周围区域还存在广泛的淡黄色背景染色。
2.2采用实施例4的方法和使用对照品的方法在小鼠肝组织上的染色效果对比
第一步实验，参考实验例1.1的说明，参考实施例4的方法在小鼠肝组织上不加入一抗时的染色效果如图13所示。使用对照品的方法在小鼠肝组织上不加入一抗时的染色效果如图14所示。在不加入一抗时，组织片理论上应呈阴性。
对比可知，图13中背景干净；图14中大面积肝巨噬细胞和肝细胞出现淡黄色背景，对结果判读形成干扰。
第二步实验，采用相应试剂的正常染色流程，实施例4采用多聚酶标-IgG2a亚型特异单克隆大鼠抗小鼠二抗复合物在肝组织上的染色效果如图15所示。采用对照品的方法在肝组织上的染色效果如图16所示。
对比可知，图15中仅中心肝静脉周围的肝细胞呈强阳性，无背景染色，结果清洗易读；图16中除中心肝静脉周围呈阳性外，大面积的肝巨噬细胞和部分肝细胞出现淡黄色背景染色，影响结果判读。
以上实验例涉及的实验程序汇总如以下表1所示。
表1各组实验例的实验程序汇总
Figure BDA0003338791110000111
注：自制聚合物即运用“亚型特异单克隆二抗抗体”制备“多聚HRP酶二抗复合物”(即亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物)。
综合对比各组染色结果可知，将亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物应用于“小鼠一抗-小鼠组织”同种属染色，能够有效降低因小鼠组织内内源性的抗体造成的背景染色，染色流程更短(不需要鼠IgG封闭步骤)，所得染色片背景更干净，更易判读结果。

Claims (10)

1.一种小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，包括：不经小鼠组织内源性鼠IgG封闭步骤，直接以小鼠一抗抗体进行一抗孵育，然后使用亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物进行二抗孵育，显色；
所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物包括聚合物载体以及结合在聚合物载体上的标记酶和二抗抗体，所述二抗抗体为特异性识别所述小鼠一抗抗体亚型的亚型特异单克隆抗小鼠二抗。
2.如权利要求1所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述亚型特异单克隆抗小鼠二抗为完整IgG蛋白、Fab’片段或Fab’2片段。
3.如权利要求2所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述亚型特异单克隆抗小鼠二抗来自不同种属，所述不同种属为大鼠、兔、羊、马、驴或人。
4.如权利要求1所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述小鼠一抗抗体的亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3。
5.如权利要求1所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述聚合物载体为链式聚合物、星型大分子聚合物或超支化聚合物。
6.如权利要求5所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述超支化聚合物为超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架。
7.如权利要求6所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物包括超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架，所述标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，所述二抗抗体通过偶联剂连接在所述标记酶上。
8.如权利要求7所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述偶联剂为方酸二酯。
9.如权利要求8所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述亚型特异性单克隆抗小鼠二抗复合物由包括以下步骤的方法进行制备：
(1)先用方酸二酯偶联剂对超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯骨架进行活化，获得活化骨架；
(2)将步骤(1)获得的活化骨架和标记酶进行偶联反应，获得超支化高分子-酶聚合物；
(3)利用方酸二酯偶联剂对所述超支化高分子-酶聚合物进行活化，然后和亚型特异单克隆抗小鼠二抗进行混合反应。
10.如权利要求1或5或9所述的小鼠一抗-小鼠组织同种属免疫组化染色方法，其特征在于，所述标记酶为辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。
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