CN116813779B - 一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents
一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用，属于生物技术领域。该抗Claudin18.2重组单克隆抗体是以SEQ ID NO.1所示的人工合成多肽作为免疫原，免疫新西兰大白兔并经细胞分选和有限稀释等步骤获得，包括重链可变区及轻链可变区，相比市售的抗人Claudin18.2单克隆抗体，本申请提供的重组单克隆抗体，与Claudin18.2蛋白具有更高亲和力，可高特异性和高灵敏度地识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上Claudin18.2蛋白的表达，可应用于免疫组织化学、间接ELISA、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的检测和评估结果，并降低检测成本和背景信号的干扰。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用。
背景技术
Claudins蛋白家族负责维持细胞间紧密连接，并通过建立屏障来控制细胞间的分子流动。Claudins在不同组织中表达不同亚型，其中Claudin18主要在胃组织中表达，其功能的改变与肿瘤的发生和发展有关。Claudin18具有Claudin18.1和Claudin18.2两种结构高度相似的剪接变体。研究表明，Claudin18.2在正常组织中的表达受到高度限制，但是在胃癌组织中发生异常表达，同时在胰腺癌、食管癌、卵巢癌等癌种中发生异位活化，这使得Claudin18.2成为消化系统恶性肿瘤治疗的一个潜在靶点。作为一个胃癌的新兴靶点，Claudin18.2最大的特点在于，具有这一靶点的患者数量约占全部胃癌患者的50％～60％，药物研发领域也有单抗、双抗、ADC和CART等多个类型的在研产品。为了更精准的筛选获益人群，开发应用Claudin18.2的伴随诊断也成为相关药企、诊断企业以及临床病理关注的热点。
市售的Claudin18.2抗体存在灵敏性不高、特异性差等问题，且该抗体目前受国外公司垄断。伴随诊断，如免疫组化和流式细胞检测的准确性直接影响了病人的临床治疗方案，所以对诊断的准确性要求非常高。随着国内针对Claudin18.2的靶点药越来越多进入临床，伴随诊断的抗体需求非常大。
因此，开发一种高灵敏度、强特异性的抗Claudin18.2抗体，对识别和检测组织或者血液中的肿瘤细胞上Claudin18.2蛋白的表达具有非常重要的作用。
发明内容
1.发明目的
本申请目的是提供一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用，该重组单克隆抗体能够特异性识别组织内Claudin18.2蛋白。经过多种不同组织的免疫组织化学(IHC)检测发现，该重组单克隆抗体可以很好的检测到正常上皮、肿瘤细胞或免疫细胞上Claudin18.2蛋白的表达，可应用于免疫组织化学、间接ELISA、免疫荧光、流式细胞术等检测与筛查领域。
2.技术方案
为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案如下：
本申请提供了一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体，该重组单克隆抗体能特异性的与Claudin18.2蛋白结合，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括SEQ ID NO.8-10所示的氨基酸序列中的一种，轻链可变区包括SEQ ID NO.11-13所示的氨基酸序列中的一种。
进一步地，上述一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体，重链可变区包括SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
进一步地，上述一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体，重链可变区包括SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
进一步地，上述一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体，重链可变区包括SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。
本申请还提供了一种核酸，该核酸编码上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
进一步地，上述编码抗Claudin18.2重组单克隆抗体的核酸，包括：
如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的重链可变区；
如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的重链可变区；
如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的重链可变区；
如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列的轻链可变区。
如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的轻链可变区。
如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，用于编码上述抗Claudin18.2重组兔单克隆抗体的包括SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列的轻链可变区。
本申请还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有上述编码抗Claudin18.2重组单克隆抗体的核酸，可以表达抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
进一步地，上述重组表达载体包括：含有上述编码抗Claudin18.2重组单克隆抗体的核酸的pcDNA3.4++质粒。
本申请还提供了一种重组表达细胞，该重组表达细胞包括上述重组表达载体或上述编码抗Claudin18.2重组单克隆抗体的核酸，可以表达抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
进一步地，上述重组表达细胞包括：293细胞系。
本申请还提供了上述核酸、重组表达载体、重组表达细胞在制备抗Claudin18.2重组单克隆抗体中的应用。
本申请还提供了一种上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体的制备方法，包括：采用上述重组表达载体转染细胞获得重组表达细胞；培养转染后的重组表达细胞；收集上清液并纯化，得到抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
本申请还提供了一种标记抗体，包括上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体，并偶联了酶、荧光素、磁珠等偶联剂。
本申请还提供了上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体、核酸、重组表达载体、重组表达细胞或抗Claudin18.2重组单克隆抗体的制备方法在检测Claudin18.2蛋白分子，或制备检测Claudin18.2蛋白分子设备中的应用。
进一步地，上述检测Claudin18.2蛋白分子包括免疫组织化学、ELISA、免疫荧光、流式细胞术等检测方法中任意一种或多种。
进一步地，上述检测Claudin18.2蛋白分子设备包括试剂盒、抗体偶联、抗体芯片等中的任意一种或多种。
本申请还提供了一种检测Claudin18.2蛋白分子的试剂盒，该试剂盒包括上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体，以抗Claudin18.2重组单克隆抗体为一抗。
进一步地，上述试剂盒为流式细胞检测试剂盒，包括上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体，还包括流式细胞检测试剂。
进一步地，上述流式细胞检测试剂盒还包括：荧光标记二抗、PBS、牛血清白蛋白、Human IgG、7-AAD等试剂。
进一步地，上述试剂盒为免疫组织化学检测试剂盒包括：包括上述抗Claudin18.2重组单克隆抗体，还包括免疫组织化学检测试剂。
进一步地，上述免疫组织化学检测试剂盒包括：HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素、返蓝液等。
本申请还提供了上述一种检测Claudin18.2蛋白分子的试剂盒在检测Claudin18.2蛋白分子中的应用。
进一步地，上述流式细胞检测试剂盒应用包括：细胞复苏、FC受体阻断、一抗孵育、二抗孵育、7-AAD活性染色、上机收集数据等。
进一步地，上述免疫组织化学检测试剂盒应用包括：脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、复染、脱水、封片和镜检等。
3.有益效果
本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本申请提供的提供一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用，与Claudin18.2蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别和检测肿瘤组织上Claudin18.2蛋白的表达，在检测Claudin18.2蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学、间接ELISA、抗体芯片制备、流式细胞术、免疫荧光等检测与筛查领域，有利于获得准确的评估和检测结果。
(2)本申请提供的提供一种兔抗人/鼠Claudin18.2重组单克隆抗体及其制备与应用，由于其特异性好、与Claudin18.1不存在交叉、阳性信号强等特点，更容易区分胃癌特异性的阳性，有利于靶向治疗的伴随诊断精准性。
附图说明
图1为免疫组织化学检测本申请制备的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在人胃癌组织、人胃正常组织和人肺组织上的表达与市售的进口抗体比较结果，验证其只特异性识别Claudin18.2。
图2为免疫荧光检测本申请的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在胃上皮的染色与市售抗体的对比图。
图3是向胃癌细胞中加入定量的抗Claudin18.2单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C后进行流式细胞术染色分析，得到的空白同型对照、抗Claudin18.2重组单克隆抗体样品二者的荧光信号强度(MFI)对比图。
图4是抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在不同温度下保存后做的梯度浓度下的效价检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
人体组织样本是经过福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织样本，均进行了病理证实，并有患者知情同意书。
实施例1
本实施例提供兔抗人/鼠的抗Claudin18.2重组单克隆抗体的制备和筛选，具体包括如下步骤：
(1)抗原制备：对Claudin18.2分子序列进行分析，依据Claudin18.2蛋白分子在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择氨基酸序列为GIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFN(SEQ ID NO.1)的人工合成多肽作为Claudin18.2抗原，该段序列免疫原性强，亲水性高，并且特异性只识别Caludin18.2而不识别Claudin18.1及其它蛋白。
(2)动物免疫：将上述人工合成的抗原多肽经由KLH偶联后作为免疫原；将免疫原与完全弗氏佐剂(1:1)混合并乳化，采用皮下注射方法分别免疫2只新西兰大白兔；间隔两周后将免疫原与不完全弗氏佐剂(1:1)乳化进行第二次和第三次免疫；三次免疫后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；选取ELISA效价128000时的OD450大于0.5且IHC检测在胃上皮组织上的膜染信号强的兔子做脾脏切除手术；
(3)单克隆制备：碾磨上述兔脾脏组织，经细胞分选和有限稀释获得可高效分泌单克隆抗体的B细胞小群体，通过免疫组化和流式细胞术筛选出特异性分泌抗体的B细胞群，通过RT-PCR获得特异性B细胞的重、轻链基因序列的cDNA，通过同源重组将所得的cDNA构建到pcDNA3.4++载体上，挑单菌落测序，获得不同的重、轻链基因序列。将不同的重、轻链基因序列两两组合，并将构建完的质粒通过转染试剂转染到293细胞系，收集细胞上清；
(4)抗体序列：通过酶联免疫、免疫组化、流式细胞术验证收集的293细胞上清，证实含有以下核酸的质粒表达出的抗体与抗原有很好的免疫反应，分别将这些克隆命名为SDT-102-clone A(含有VH1和VL1)，SDT-102-clone B(含有VH2和VL2)，SDT-102-clone C(含有VH3和VL3)
编码第一条重链可变区(取名VH1)的核酸序列为：
GGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGACGAAACCCTGACACTCACCTGCACGGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATATATTGGATATATTAGTTATCGTGATAACGCATACTACGCGAGCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGTCCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATTTACCTACCATGACTATGGTGATTACCTATTCAGCTACTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTTA(SEQ ID NO.2)；
编码第二条重链可变区(取名VH2)的核酸序列为：
GGTGTCCAGTGTCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCAATACACTGATCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGGAGGGGCTGGAATGGATCGGATTCATTAATACTATTGGTACTACATACTACACGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATCCAATGGTGATTATGCCTTTAACTTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA(SEQ ID NO.3)；
编码第三条重链可变区(取名VH3)的核酸序列为：
GGTGTCCAGTGTCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCCTCTCTGGATTCTCCCTCGGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAATGGATCGGAATCATTTATGCTAGTGGTGCCCCATACTACGCGACCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGATTCGCTGGTTGTAGTCTTGGTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.4)；
编码第一条轻链可变区(取名VL1)的核酸序列为：
GGTGCCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCACCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACTGGTTATCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATACTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACC(SEQ ID NO.5)；
编码第二条轻链可变区(取名VL2)的核酸序列为：
GGTGCCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATACTACATCCAGTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGAATTTGTTTGTAGTAGTGCTGATTGTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCGAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACC(SEQ ID NO.6)；
编码第三条轻链可变区(取名VL3)的核酸序列为：
GGTGCCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTCTTTATAAGAACAACTACTTAGCCTGGTATCAGCACAAATCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCAGTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTTTTACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGCCGAATTTAATTGTAATAGTGGTGATTGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACC(SEQ ID NO.7)。
根据上述核酸序列，得到相对应的抗体的重链可变区(VH1-VH3)和轻链可变区(VL1-VL3)的氨基酸序列：
第一条重链可变区(VH1)的氨基酸序列为：
GVQCQSVEESGGRLVTPDETLTLTCTVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISYRD NAYYASWAKGRFTISKSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARFTYHDYGDYLFSYFNIWGPGTL VTVSL(SEQ ID NO.8，由SEQID NO.2编码)；
第二条重链可变区(VH2)的氨基酸序列为：
GVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSNTLIWVRQGPGEGLEWIGFINTIGTT YYTNWAKGRFTISKTSSTTVDLQMTSLTAADTATYFCARSNGDYAFNFWGPGTLVTISS(SE Q ID NO.9，由SEQ IDNO.3编码)；
第三条重链可变区(VH3)的氨基酸序列为：
GVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTLSGFSLGTYWMSWVRQAPGKGLQWIGIIYASG APYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGFAGCSLGDLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.10，由SEQ IDNO.4编码)；
第一条轻链可变区(VL1)的氨基酸序列为：
GATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNWLSWYQQKPGQPPKLLIYRAS KLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAAAYYCLGGYDDDTDNAFGGGTEVVVKGDP VAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQID NO.11，由SEQ ID NO.5编码)；
第二条轻链可变区(VL2)的氨基酸序列为：
GATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSIGSSYLAWYQQKPGQPPKLLIYTTSSL ASGVPSRFKGGGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFVCSSADCYAFGGGTEVVVEGDPV APTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO.12，由SEQ ID NO.6编码)。
第三条轻链可变区(VL3)的氨基酸序列为：
GATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSLYKNNYLAWYQHKSGQPPKLLIYRAS SLASGVPSRFKGSGSGTQFTFTISDLECDDAATYYCQAEFNCNSGDCNAFGGGTEVVVKGD PVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO.13，由SEQ ID NO.7编码)。
在实施例中，将确认阳性的表达载体进行大量的细胞转染，继续培养3～5天后，收取细胞悬液，离心后取上清，经Protein A柱亲和层析纯化细胞上清，得到纯度大于95％的抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
在实施例中，将纯化后的单抗浓度测定、分装、分别于4℃冰箱和37℃温箱中保存测试抗体稳定性。附图4是本申请中的三个Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在不同温度下保存后做的8个梯度浓度下的效价检测，抗体在高温保存后效价没有明显下降，显示了抗体的稳定性好，易保存。
实施例2
本实施例提供本发明筛选的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在检测Claudin18.2蛋白分子中的应用，检测方法为免疫组织化学方法，以SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C为一抗，所用二抗为Anti-Rabbit and Mouse HRP-DAB IHC detection kit(货号：S0C1001)，具体包括：
将含有40例正常组织和癌症组织的石蜡组织芯片至于干燥箱中以63℃～65℃烤约1小时；
脱蜡水化：(操作全部在通风橱中完成)切片依次置于a)二甲苯2次，每次7分钟；b)100％酒精2次，每次5分钟；c)90％酒精2次，5分钟；d)75％酒精1次，3分钟；e)50％酒精1次，3分钟；结束后取出切片，蒸馏水冲洗三次，每次5分钟；
抗原修复：将切片置于盛有柠檬酸钠缓冲液或者EDTA修复液的染色盒，抗原修复锅中加入2L蒸馏水，并将染色盒置于高压锅中高温高压修复，待高压锅开始放气后，关闭出气阀，持续20分钟。然后结束加热，打开盖子，将内锅端出，自然冷却。蒸馏水冲洗干净，用1×PBS洗涤3次，每次3分钟；
阻断内源性过氧化物酶：将抗原修复后的切片置于3％的H2O2溶液中10分钟(通风橱中操作)，然后用1×PBS洗三次，每次5分钟；
用5％BSA+10％羊血清(PBST配置)封闭非特异性抗原，室温下30分钟；
一抗添加：封闭结束，磕掉片子上的封闭液，加入稀释好的一抗，每孔80～100μl，根据画圈的大小适当调整，将片子放入湿盒，然后缓慢的放进冰箱4℃静置过夜；
二抗工作液添加：第二天早上，拿出湿盒，室温静置10分钟。1×PBST漂洗3次，每次5分钟；加入二抗，室温孵育30分钟，PBST洗3次，每次5分钟；
DAB显色配置：按照每孔100μl计算，需要配置6ml，即用6ml显色缓冲液加入6滴显色液；每片滴加新鲜配置的显色液，显色1～2分钟，可以肉眼观察，以出现棕黄色为准，时间到了直接自来水冲洗终止显色。
苏木素复染2～5分钟；蒸馏水冲洗5min，PBS中脱色返蓝30秒，蒸馏水冲洗5分钟；
切片脱水：依次经梯度酒精脱水干燥a)50％酒精，5分钟；b)75％酒精，5分钟；c)90％酒精，5分钟；d)100％酒精3次，每次5分钟；e)二甲苯2次，每次5分钟；
封片：每片滴加50～100μl中性树胶，然后缓慢加盖玻片。
封片后的片子过夜晾干，第二天显微镜观察并用组织切片仪扫片得到免疫组化结果(图1)。
结果：本申请抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在正常的胃粘膜染色很强，主要在胃凹陷区和胃腺基部的上皮细胞中，大小鼠的胃黏膜、50％以上人的胃癌组织中也显示很强的染色，部分胰腺癌和结直肠癌等显示中低强度染色。在肺组织、结肠组织、横纹肌、肾脏组织、淋巴组织等都是不表达，体现了本申请抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C特异性识别Claudin18.2蛋白，与Claudin18.1及其它蛋白无交叉反应。
附图1为免疫组化学检测本申请制备的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在人胃癌组织、人胃正常组织和人肺组织上的表达与市售的进口抗体(clone#EPR19202)比较结果，验证其只特异性识别Claudin18.2。
实施例3
本实施例提供本发明筛选的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在检测Claudin18.2蛋白分子中的应用，检测方法为冰冻切片免疫荧光法，具体包括：
冰冻切片取出，室温放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10min。
切片用0.01M的PBS清洗后加入12％双氧水作用30min，以除去非特异染色。
0.01MPBS清洗，3次×10min。0.3％Triton X-100作用30分钟。
加入用抗体稀释液(含1％BSA的0.01MPBS，pH7.4)稀释至工作浓度的Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C，4℃过夜。
0.01MPBS清洗，3次×10min。加入荧光二抗FITC-IgG，室温孵育1小时。
0.01MPBS清洗，3次×10min。
缓冲甘油封片，并于共聚焦荧光显微镜下读片拍图。
结果：图2为免疫荧光检测本申请的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在胃上皮的染色与市售抗体(clone#EPR19202)的对比图。本申请抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在冰冻切片鼠胃粘膜组织上有很强的荧光染色。
实施例4
本实施例提供本发明筛选的抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C在检测Claudin18.2蛋白分子中的应用，检测方法为流式细胞术，以抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C为一抗，具体包括：
细胞复苏前处理结束后，如果有必要就使用台盼蓝对所有的细胞批次(诱导处理组与转染细胞样品除外)进行细胞活性的统计。
活性较好的细胞需要大于90％，将细胞按照每孔5×105～1×106个细胞量分装至96孔板中，4℃200g离心3in，弃上清；
每孔加入100μl封闭液(后续均指10％羊血清)，充分吹打混匀；
冰上孵育60min–孵育过程中，用清洗液稀释一抗，置于冰箱中(2～8℃)保存待用；
离心3min–弃上清,加入100μl稀释好的一抗，充分吹打混匀。冰上孵育30min，清洗离心3次。
加入100μl稀释好的A488标记的羊抗兔二抗，充分吹打混匀。置于冰上，暗处孵育30min。后清洗洗涤3次。
每孔加200μl7-AAD预混液重悬。冰上(或2～8℃)暗处孵育5min后上机。
结果：附图3是向胃癌细胞中加入定量的抗Claudin18.2单克隆抗体后进行流式细胞术染色分析，得到的空白同型对照、抗Claudin18.2重组单克隆抗体样品二者的荧光信号强度(MFI)对比图。抗Claudin18.2重组单克隆抗体SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-cloneC在培养的胃癌细胞中信号很强，而在同型对照中则无染色。
综上所述SDT-102-clone A，SDT-102-clone B和SDT-102-clone C全能够满足伴随诊断对Claudin18.2单克隆抗体的需求，可以为靶向药的使用提供精准的检测服务。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (11)
1.一种抗Claudin18.2重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
或
所述重链可变区包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列；
或
所述重链可变区包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ IDNO.13所示的氨基酸序列。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的抗Claudin18.2重组单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。
3.根据权利要求2所述的一种核酸，其特征在于，所述核酸包括SEQ ID NO.2-7所示的核苷酸序列中的一种或多种。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2或3所述的核酸。
5.一种重组表达细胞，其特征在于，所述重组表达细胞包括权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求2或3所述的核酸。
6.权利要求2或3所述的核酸、或权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组表达细胞在制备抗Claudin18.2重组单克隆抗体中的应用。
7.权利要求1所述的抗Claudin18.2重组单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求4所述的重组表达载体转染细胞获得重组表达细胞；培养转染后的重组表达细胞；收集上清液并纯化，得到抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
8.权利要求1所述的抗Claudin18.2重组单克隆抗体、或权利要求2或3所述的核酸、或权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组表达细胞、或权利要求6所述的抗Claudin18.2重组单克隆抗体的制备方法在制备检测Claudin18.2蛋白分子设备中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测Claudin18.2蛋白分子包括免疫组织化学、ELISA、免疫荧光、流式细胞术中任意一种或多种。
10.一种检测Claudin18.2蛋白分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的抗Claudin18.2重组单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的一种检测Claudin18.2蛋白分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括流式细胞检测试剂盒，或免疫组化检测试剂盒。
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