CN1580774A - 乳腺癌的Her－2免疫组织化学诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种乳腺癌的Her－2免疫组织化学诊断试剂盒，其内容物中包括非特异性蛋白阻断剂，鼠抗人的初始抗体，羊抗鼠的单克隆连接抗体，酶标PAMAM试剂，由发色氧化反应剂、发色剂、显色缓冲液调配成的显色试剂等。利用PAMAM树突状多聚物的生物特性标记抗体，对乳腺癌的Her－2免疫组织化学诊断，不仅明显扩大染色可视性，提高免疫反应的特异性，敏感性，HER－2过度表达的检测更为准确，而且使与Her－2/neu蛋白过度表达患者能得到有效、及时地治疗，减少患者不必要的医疗费用支出，提高患者的生存质量和延长生存时间，体外诊断检测操作简便、对肿瘤早期诊断准确、稳定、有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于临床的肿瘤诊断试剂盒，特别是一种利用PAMAM树突状多聚物的生物特性标记抗体，对乳腺癌的Her-2进行免疫组织化学诊断的试剂盒。也可用于其他各种癌组织诊断Her-2的表达情况的检测。
背景技术
近年来乳腺癌患病人数正在急剧上升，发病率居女性肿瘤第一位。我国每年约有5-9万名妇女发生乳腺癌，3-4万名妇女死于乳腺癌。在沿海大城市如上海，乳腺癌发病率居女性肿瘤第一位。每年约有12-15万名乳腺癌患者需要观察和治疗。在所有的乳腺癌患者中，有25-30％的人有Her-2/neu(表皮生长因子受体)蛋白的过度表达，该类型肿瘤更具转移性，危险性。美国肿瘤学会2000年就推荐“Her-2/neu”作为乳腺癌标记物，无论对在诊断当时，还是复发时的检测都具有重要价值。自1987年斯莱曼(Slamon)等人发表了Her-2与人类乳腺癌的增生，预后相关研究以来，Her-2的研究取得很大进展。1998年美国罗氏公司推出治疗乳腺癌新药Herceptin(赫塞汀)得到FDA(美国食品和药物管理局)批准上市。并且迅速在加拿大，欧洲，日本得到使用。新药Herceptin的应用更推动了Her-2基因和蛋白的临床检查的发展。到了2000年美国临床肿瘤学会出版的《肿瘤标记物指南》又指出“在原发性乳腺癌病例中无论是在诊断当时，还是术后复发时，Her-2的过度表达对预后判断，治疗方案的选择等都具有重要的意义”。但是，目前已经有的乳腺癌诊断试剂操作程序繁琐，非特异性高，特异性低，不能迅速、准确地诊断恶性的乳腺癌、观察其预后转化。
PAMAM(聚酰胺-胺)是一种纳米级树突状多聚物，PAMAM Dendrimer树状大分子是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合物相比，可在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团，因而具有精确的分子结构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性。萨顿(SATON.)等人2001年发表用PAMAM来携带寡核酐酸基因片段进行体内和体外实验，证明其具有非常好的传递功能。帕特里安尼克(PATRIANILK)等人2002年应用PAMAM结合抗体片段靶向性治疗前列腺癌。专利号为US2003/0044407A1的“标记抗体或抗体片段的免疫脂质或多聚物用于系统治疗的传输或诊断试剂”中公开了2001年张，埃丝特(Chang，Esther H)等人，应用PAMAM标记稀有金属和抗体注入体内，通过核磁共振测定进行影像学诊断。但是因其在体内分解、代谢所产生的毒性作用尚不清楚，有动物实验研究表明，一定的PAMAM剂量可使小鼠产生溶血性变化。因此，体内实验难于广泛应用。
大量研究证实，Her-2阳性患者对现有的常规化疗、放疗及激素的抗乳腺癌治疗均不敏感，术后易复发，转移快，存活时间短，上述病例都与Her-2/neu(c-erbB-2)蛋白过度表达密切相关。一些发展国家已经建立了一些有效的Her-2/neu基因和蛋白检测、评价标准，用于指导和预测治疗的效果，但是其试剂昂贵，检测麻烦。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其利用PAMAM树突状多聚物的生物特性标记抗体，对乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断，不仅明显扩大染色可视性，提高免疫反应的特异性，敏感性，HER-2过度表达的检测更为准确，而且使与Her-2/neu蛋白过度表达患者能得到有效，及时的治疗，减少患者不必要的医疗费用支出，提高患者的生存质量和延长生存时间，体外诊断检测操作简便、对肿瘤早期诊断准确、稳定、有效。
本发明的目的是这样实现的：该试剂盒内容物中包括阻断人组织切片中交叉蛋白反应非特异性染色的非特异性蛋白阻断剂，与人体组织抗原结合的鼠抗人的初始抗体，能与初始抗体连接的羊抗鼠的单克隆连接抗体，用来标记单克隆连接抗体、具有扩大视觉效果、提高敏感性的酶标PAMAM试剂，通过相互协同作用提高显微镜观察染色效果的由发色氧化反应剂、发色剂、显色缓冲液按常规调配成的显色试剂，操作时依次滴入的各试剂用量的重量比为：非特异性蛋白阻断剂∶初始抗体∶连接抗体∶酶标PAMAM试剂∶显色试剂＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。
所述用于非特异性阻断人组织切片中交叉蛋白反应的非特异性蛋白阻断剂，由动物血清组成。
所述初始抗体是针对人体乳腺癌组织中特异性Her-2抗原所制备的鼠抗人的特异性抗体。
所述用于特异性初始抗体与显色试剂之间的连接桥梁的连接抗体是由羊抗鼠的抗体组成。
所述用来标记抗体的酶标PAMAM试剂中的PAMAM是一种纳米级树状多聚物，其表面有高密度的氨基基团，在生理环境的pH时带正电性，与带负电的抗体蛋白结合，酶标PAMAM试剂是由辣根过氧化物酶标记的抗体与带正电荷的PAMAM Dendrimer混合，在室温条件下反应10～15分钟制成，二者的混合浓度为0.1～10∶1摩尔比。
所述显色剂中的发色氧化反应剂由03％过氧化氢水溶液组成，棕色发色剂选用DAB，红色发色剂选用AEC，紫兰色发色剂选用BCIP/NBT，显色缓冲液为0.05Mol Tris-HCl；显色试剂的调制，先将显色缓冲液取2.5ml装于另一试管中，滴入发色剂两滴(每滴约50μl，以下同)，再滴入发色氧化反应剂一滴，轻轻上下翻转数次，混合后备用。可根据染色片子的数量按该比率配制。其用量的重量比为：显色缓冲液∶发色剂∶发色氧化反应剂＝50∶2∶1。
所述人乳腺癌组织为手术切除的组织标本，其取材规格为1×1×0.5mm，并在24～72小时内固定于10％中性福尔马林溶液中。
所述的人组织切片进行抗原性恢复处理，即将石蜡包埋的组织切片，经常规脱蜡后放入0.1M、pH6.2的枸橼酸溶液中，经微波装置加热处理迅速达到100℃沸腾后，降低照射力度保持90-98°、15～30分钟，然后取出容器放置室温20分钟再染色。
所述染色操作步骤如下：将所述组织切片用蒸馏水洗净后，适量3％过氧化氢水溶液处理10分钟后加非特异性蛋白阻断剂1-2滴，反应10分钟，吸掉反应液后不冲洗，根据组织的大小加初始抗体量从10μl至100μl调整，30分钟后，加连接抗体1-2滴30分钟，加酶标PAMAM试剂1-2滴30分钟，加已调制的显色试剂100μl，3-5分钟，以上各步骤之间均PBS洗3次每次3分，用干净的滤纸檫净组织周围的PBS，每一步都不能使组织干燥务必要保持组织的湿润，核染色，苏木素染核1分钟，脱水、透明、封片、显微镜观察，上述反应均在室温下进行。
所述染色结果判定如下：
0+：细胞膜为阴性或细胞膜染色阳性的癌细胞少于10％，单纯细胞浆染色性时判断为阴性；
1+：几乎很少有完整细胞膜阳性或有完整细胞膜染色阳性的癌细胞少于或等于全部癌细胞的10％；
2+：完整细胞膜弱-中度染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％；
3+：完整细胞膜强染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％；结果判定：0+，1+为阴性； 2+，3+为阳性。
由于本发明利用含氨功能基高分子PAMAM树突状物的生物特性标记抗体，所以将其用于乳腺癌的Her-2免疫组织化学的体外诊断，开辟了新的体外诊断学方法。这是一种在细胞或组织中某部位存在的特殊蛋白同相应的抗体进行免疫学反应，然后进行显微镜观察的诊断技术。PAMAM是被合成的一种纳米级树突状多聚物，Dendrimer由中间的核和向周围散发的分支组成。核决定整个分子及表面电荷的密度，其大小、形状及功能基团的放置都可以精确控制，在直径上呈现出可被较好控制的单分散性。同时，它还有较好的水溶性。经过反复的聚合反应，在其表面形成了高密度的氨基基团，在生理环境的pH时带正电性，可与带负电的抗体蛋白结合，明显提高检测的敏感性和特异性，这种体外诊断学方法优于现有技术中采用的其它普通方法。此外，HER-2表达的检测是对良性乳腺肿瘤恶性变的重要观察指标。本发明对Her2蛋白的测试是利用PAMAM来标记抗体，对乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断，不仅明显扩大染色可视性，提高免疫反应的特异性，敏感性，Her-2过度表达的检测更为准确，而且使与Her-2/neu蛋白过度表达患者能得到有效，及时的治疗，减少患者不必要的医疗费用支出，提高患者的生存质量和延长生存时间，使发生乳腺癌妇女的生存率增加，Her-2过度表达的体外诊断检测操作简便、对肿瘤早期诊断准确、稳定、有效。该体外诊断学方法与其它方法相比有分子量较小，更容易渗透，敏感度高的优点。
本发明试剂盒与Her-2多克隆抗体试剂盒[Herceptin Test]进行比较实验。
所用实验材料：原发性乳腺癌106例手术材料石蜡组织切片。使用该试剂盒进行免疫组织化学染色同时，用连续切片进行多克隆抗体试剂盒的检测，分别进行双盲判定，对其阳性和阴性病例统计学处理。其结果显示；该试剂盒与[Herceptin Test]的阳性一致率：42/50＝86.0％、该试剂盒与[Herceptin Test]的阴性一致率：56/56＝100％，本试剂盒与[Herceptin Test]的诊断一致率：(42+56)/(50+56)＝98/106＝92.4％。
结论：使用本试剂盒进行免疫组织化学染色可以得到良好染色结果，其细胞膜阳性染色明确，清晰，几乎无非特异性染色，可以容易获得准确的判断结果。与[Herceptin Test]的比较性研究显示有显著的相关性。虽然在阳性率，诊断率有不一致的病例存在，这与其他文献报道的Herciptin Test阳性而基因检查未见基因扩增的假阳性结果符合。因此，该试剂盒特异性更高，更准确。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步描述。
图1是本发明的一种显微镜下Her-2染色结果判定图谱。
具体实施方式：
以下结合实施方式对本发明作进一步描述。该试剂盒内容物中包括非特异性蛋白阻断剂，鼠抗人的初始抗体，羊抗鼠的单克隆连接抗体，酶标PAMAM试剂，由发色氧化反应剂、发色剂、显色缓冲液调配成的显色试剂等。操作时要依次滴入各试剂，其用量的重量比为：非特异性蛋白阻断剂∶初始抗体∶连接抗体∶酶标PAMAM试剂∶显色试剂＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。可根据实际使用情况，按上述比例在每盒内分装20人份、50人份、100人份等剂量的各试剂。
按每盒50人份制备乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒
非特异性蛋白阻断剂是由动物血清组成，将羊、马、兔等动物，抽取其正常血后，分离血清后取得备用。其作用是非特异性阻断人组织切片中交叉蛋白反应。6ml/盒
初始抗体是针对人体乳腺癌组织中特异性Her-2抗原所制备的鼠抗人的特异性单克隆抗体。10ul-100ul/例，2ml/盒。
连接抗体是由羊抗鼠的抗体组成，充当特异性初始抗体与显色试剂之间的连接桥梁。6ml/盒。
酶标PAMAM试剂是用来标记抗体的，PAMAM是一种纳米级树状多聚物，其表面有高密度的氨基基团，在生理环境的pH时带正电性，与带负电的抗体蛋白结合，酶标PAMAM试剂是由辣根过氧化物酶标记的抗体与带正电荷的PAMAM Dendrimer混合，在室温条件下反应10～15分钟制成，二者的混合浓度为0.1～10∶1摩尔比。可稳定溶解于缓冲液中。6ml/盒。
发色氧化反应剂是由03％过氧化氢水溶液组成。2ml/盒。
发色剂可根据显色的需要选用以下试剂中的一种，即棕色发色剂选用DAB(3，3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，红色发色剂选用AEC(3-amino-9ethylcarbazole)，紫兰色发色剂选用BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium)。3ml/盒。
显色缓冲液选用0.05Mol的Tris-HCl缓冲液等。6ml/盒
实施例一：本发明用于组织切片免疫组织化学染色诊断的具体操作步骤如下：
1、合成PAMAM Dendrimer。
PAMAM Dendrimer由0代至10代，其分子直径在10至130之间，属于纳米尺度的分子。其合成是采用分支法，即分子由核心部分开始向外生长。根据树木分枝的规律将预先制好的单体按放射状的顺序、分支的枝梢再接分支，依次重复组合起来。以乙二胺(EDA)为引发核，第1步反应(a)与丙烯酸甲酯(MA)通过Michael加成反应生成1个四元酯[称为0.5代(G)]；第2步反应(b)四元酯与过量的乙二胺发生氨解反应生成1个四元酰胺化合物(称为1代)。重复(a)、(b)Michael加成和氨解的反应步骤，即可得到不同代数的PAMAM树状大分子化合物。合成产物均用FT2IR、FAB2MS、1H NMR和13CNMR进行结构表征。以下是PAMAM合成反应路线。
不同pH值PAMAM对增溶的影响不同，不同质量浓度的PAMAM溶液对增溶试验也产生5.0代PAMAM不同质量浓度。通过实验证明在较大的pH值范围内和不同的缓冲条件(水、PBS、0.5mmol/L NaCl等)下稳定存在，并不解离。
2、制备Her-2抗原。
人乳腺癌手术切除的Her-2强阳性新鲜肿瘤组织提取总RNA，用按Her-2的cDNA序列设计引物，进行PCR扩增得到人PCR片段，纯化后用双酶切开与同样双切酶的表达质粒Pet42b进行连接，得到重组原核表达质粒，然后将该质粒转入大肠杆菌进行扩增，经测序验证后，提取重组原核表达质粒，并以其转化表达菌BL21。将BL21接种于LB培养液中37℃培养扩增。收集菌体于缓冲液中，经超声波破菌后，离心、洗脱、收集。用WESTERN印迹检测纯化后的样品。纯度：96.0％ 。
制备初始抗体：取抗Her-2工作细胞库杂交瘤细胞2*107/只，腹腔注射经石蜡油预先致敏的BALB/c小鼠，10-14天后抽取腹水。
纯化：硫酸铵沉淀、A蛋白-Sepharose亲和层析交换分离方法从杂交瘤细胞株培养液中分离纯化抗Her-2单克隆抗体。
抗体的效价：经ELISA法测定培养上清液中抗体亲和力，达到最大的结合50％所需腹水单抗的浓度为7.5×10-6，亲和常数Ka＝1.3×105mol-1。利用罗氏公司的亚类测定试剂盒，检测3株阳性杂交瘤细胞的培养上清液，用间接ELISA法检测细胞培养上清液和腹水的单抗效价可达10-5，腹水经纯化后ELISA法检测抗体效价为10-6。
抗体特异性：蛋白印记分析测到分子量为185dp的带，和抗体经免疫组织化学染色显示特异性强、反应敏感。而不与非Her-2蛋白质结合。重组可溶性抗原Her-2常规免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与MOPC-21衍生的，分泌IgG分子(K轻链)的BALB/c骨髓瘤细胞融合制备抗体，筛选、纯化抗体、A蛋白-Sepharose亲和层析交换分离。
3、制备非特异性蛋白阻断剂。
非特异性蛋白阻断剂由动物血清组成，将羊、马、兔等动物，抽取其正常血后，分离血清后取得备用。
4、制备连接抗体。
连接抗体是常规制备的由羊抗鼠的抗体组成。
5、制备酶标PAMAM试剂。
由辣根过氧化物酶标记的抗体或抗体片段与上述步骤1(合成PAMAMDendrimer)中所制作的带正电荷的PAMAM Dendrimer以0.1～10∶1摩尔比率的浓度混合，室温条件下反应10-15分钟，制成酶标PAMAM试剂。这是一个使PAMAM与辣根过氧化物酶标记的抗体混合在一起的极好比率及顺序，是简单、有效，稳定、非化学的结合方法。该方法比化学或其他方法有效或更有效。
6、人乳腺癌组织的固定。
手术切除的组织离体的瞬间就开始发生各种变化，如组织自体溶解，腐败等。固定的目的就是使这种变化立即停止，保存其形态学特点和抗原性。手术切除的组织被立刻切成1×1×0.5mm的组织标本，固定于常规10％中性福尔马林溶液中。最佳固定方法和时间范围是24-72小时。少于24小时固定不充分，超过72小时抗原性开始减弱。
7、病理组织蜡块的适用。
经过中性缓冲福尔马林液固定，用于常规处理的和石蜡包埋的组织，适用该试验。不推荐酒精和其它福尔马林代用品。
8、抗原性恢复处理。
石蜡包埋的组织切片，经脱蜡后放入0.1M、pH6.2枸橼酸水溶液中，经微波装置加热处理迅速达到100℃沸腾后，降低照射力度保持90-98℃、15-30分钟，然后取出容器放置室温20分钟左右再染色，使其抗原性恢复，增加染色强度。
9、显色试剂的调制。
使用显色试剂前，将显色缓冲液取2.5ml装于另一试管中，滴入发色剂两滴(每滴约50μl，以下同)，再滴入发色氧化反应剂一滴，轻轻上下翻转数次，混合后备用。可根据染色片子的数量按该比率配制。其用量的重量比为：显色缓冲液∶发色剂∶发色氧化反应剂＝50∶2∶1∶。
10、染色操作步骤。
上述组织切片用蒸馏水洗净后，适量3％过氧化氢水溶液处理10分钟后加非特异性蛋白阻断剂1-2滴，反应10分钟，吸掉反应液后不冲洗，根据组织的大小加初始抗体量从10μl至100μl调整，30分钟后，加连接抗体1-2滴30分钟，加酶标PAMAM试剂1-2滴30分钟，加已调制的显色试剂100μl，3-5分钟，以上各步骤之间均PBS洗3次每次3分，用干净的滤纸檫净组织周围的PBS，每一步都不能使组织干燥务必要保持组织的湿润，核染色，苏木素染核1分钟，脱水、透明、封片、显微镜观察，上述反应均在室温下进行。
11、本试验可适用于人工和自动染色。本试验可在配套的自动染色仪上自动操作。
12、染色结果判定。
0+：细胞膜为阴性或细胞膜染色阳性的癌细胞少于10％(单纯细胞浆染色性时判断为阴性)
1+：几乎很少有完整细胞膜阳性或有完整细胞膜染色阳性的癌细胞少于或等于全部癌细胞的10％
2+：完整细胞膜弱-中度染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％
3+：完整细胞膜强染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％
结果判定：0+、1+为阴性，2+、3+为阳性(详见图1)。
实施例二：
本抗体还适用于肿瘤穿刺脱落细胞检查。癌组织肿瘤穿刺细胞涂片染色或载玻片上细胞培养；穿刺细胞均匀涂在载玻片上待干燥后立即固定于10％中性福尔马林溶液中10分钟。载玻片上细胞培养因癌细胞附着于玻片上，可以直接放入固定液中10分钟。蒸馏水洗净后，直接进入实施例一中的第8步骤，改用0.3％的过氧化氢甲醇溶液(H2O2；1ml：甲醇；99ml)阻断内源酶，室温30分钟反应后PBS洗净3次。以后的其他步骤同实施例一。
实施例三：
本试剂盒还可用于其他各种癌组织诊断Her-2的表达情况的检测。方法同
实施例一。
Claims (10)
1、一种乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：盒内容物中包括阻断人组织切片中交叉蛋白反应非特异性染色的非特异性蛋白阻断剂，与人体组织抗原结合的鼠抗人的初始抗体，能与初始抗体连接的羊抗鼠的单克隆连接抗体，用来标记单克隆连接抗体、具有扩大视觉效果、提高敏感性的酶标PAMAM试剂，通过相互协同作用提高显微镜观察染色效果的由发色氧化反应剂、发色剂、显色缓冲液调配成的显色试剂，操作时依次滴入的各试剂用量的重量比为：非特异性蛋白阻断剂∶初始抗体∶连接抗体∶酶标PAMAM试剂∶显色试剂＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。
2、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述用于非特异性阻断人组织切片中交叉蛋白反应的非特异性蛋白阻断剂，由动物血清组成。
3、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述初始抗体是针对人体乳腺癌组织中特异性Her-2抗原所制备的鼠抗人的特异性单克隆抗体。
4、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述用于特异性初始抗体与显色试剂之间的连接桥梁的连接抗体是由羊抗鼠的抗体组成。
5、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述用来标记抗体的酶标PAMAM试剂中的PAMAM是一种纳米级树状多聚物，其表面有高密度的氨基基团，在生理环境的pH时带正电性，与带负电的抗体蛋白结合，酶标PAMAM试剂是由辣根过氧化物酶标记的抗体与带正电荷的PAMAM Dendrimer混合，在室温条件下反应10～15分钟制成，二者的混合浓度为0.1～10∶1摩尔比。
6、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述显色试剂中的发色氧化反应剂由03％过氧化氢水溶液组成，棕色发色剂选用DAB，红色发色剂选用AEC，紫兰色发色剂选用BCIP/NBT，显色缓冲液为0.05Mol的Tris-HCl；显色试剂的调制，先将显色缓冲液取2.5ml装于另一试管中，滴入发色剂两滴(每滴约50μl，以下同)，再滴入发色氧化反应剂一滴，轻轻上下翻转数次，混合后备用，可根据染色片子的数量按该比率配制，其用量的重量比为：显色缓冲液∶发色剂∶发色氧化反应剂＝50∶2∶1。
7、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述人乳腺癌组织为手术切除的组织标本，其取材规格为1×1×0.5mm，并在24～72小时内固定于10％中性福尔马林溶液中。
8、根据权利要求1或7所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述的人组织切片进行抗原性恢复处理，即将石蜡包埋的组织切片，经常规脱蜡后放入0.1M、pH6.2的枸橼酸溶液中，经微波装置加热处理迅速达到100℃沸腾后，降低照射力度保持90-98°、15～30分钟，然后取出容器放置室温20分钟再染色。
9、根据权利要求8所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述染色操作步骤如下：将所述组织切片用蒸馏水洗净后，适量3％过氧化氢水溶液处理10分钟后加非特异性蛋白阻断剂1-2滴，反应10分钟，吸掉反应液后不冲洗，根据组织的大小加初始抗体量从10μl至100μl调整，30分钟后，加连接抗体1-2滴30分钟，加酶标PAMAM试剂1-2滴30分钟，加已调制的显色试剂100μl，3-5分钟，以上各步骤之间均PBS洗3次每次3分，用干净的滤纸檫净组织周围的PBS，每一步都不能使组织干燥务必要保持组织的湿润，核染色；苏木素染核1分钟，脱水、透明、封片、显微镜观察，上述反应均在室温下进行。
10、根据权利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫组织化学诊断试剂盒，其特征在于：所述染色显微镜下观察结果判定如下：
若细胞膜为阴性或细胞膜染色阳性的癌细胞少于10％，单纯细胞浆染色性时判断为阴性，则为0+；
若几乎很少有完整细胞膜阳性或有完整细胞膜染色阳性的癌细胞少于或等于全部癌细胞的10％，则为1+；
若完整细胞膜弱-中度染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％，则为2+；
若完整细胞膜强染色阳性的癌细胞大于或等于全部癌细胞的10％，则为3+：
染色结果判定：0+，1+为阴性；2+，3+为阳性。
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