CN103675288B - 一种血小板标记物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血小板标记物，它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G？PAMAM。本发明还提供了前述血小板标记物的制备方法。本发明血小板标记物制备方法简单，可有效地标记血小板，应用前景良好。

Description

一种血小板标记物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种血小板标记物及其制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
血小板是体内血栓形成的关键成分之一，在心血管疾病（增殖、血栓形成和血栓栓塞）、炎症和部分肿瘤等多种病理生理进程中扮演重要角色。
然而，长期以来一直缺乏血小板的标记物，导致临床上难以直接有效检测血小板的聚集部位和聚集程度，使得血栓类疾病的研究停滞不前，因此，急需寻找一种血小板的标记物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种血小板标记物及其制备方法。
本发明血小板标记物，它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2～6GPAMAM。
PAMAM：聚酰胺-胺型树枝状高分子，是一种高度枝化的球状单分散大分子，其分子结构中心由中心核、重复单元以及末端基团构成，具有高度的几何对称性，其中心核为乙二胺结构，以中心核为起始中心，由丙烯酸甲酯等原料在外面接枝，每完成反应增长一代（Generation，简称G），每增长一代末端氨基数目增长一倍，2～6G PAMAM表示第二代～第六代聚酰胺-胺型树枝状高分子。
本发明制备前述血小板标记物的方法，具体步骤为：将2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G PAMAM。
所述2～6GPAMAM是由下述方法制备的：取PAMAM，溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60～80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2～6G PAMAM；其中，甲醇的用量为PAMAM的40～60倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.06～0.08倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2～2.3倍（v/w）。
优选地，所述甲醇的用量为PAMAM的50倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.07倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2.14倍（v/w）。
所述的血小板特异性抗体为抗CD41抗体。优选地，所述的抗CD41抗体为抗CD41单克隆抗体。
2～6G PAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为：取2～6G PAMAM，在室温下，加入（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体，反应1.5～2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5～1.5h，超过滤净化，即可；其中，2～6G PAMAM、（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比（v/w/w/w）为（30～50）：（0.18～0.20）：（0.003～0.005）：（0.18～0.20）。
优选地，所述2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）与血小板特异性抗体的反应时间是2小时，加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺后的反应时间是1h；所述2～6G PAMAM、（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比（v/w/w/w）为40：0.192：0.004：0.192。
所述荧光分子是波长为680nm的近红外光染料。
所述荧光分子标记的方法为：在2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005～0.0015倍重量（w/v）的荧光分子，暗光孵化0.5～1.5h，即可。优选地，所述荧光分子的用量为2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物的0.001倍（w/v）；所述暗光孵化时间为1h。
本发明血小板标记物的标记效果优良，可直接有效地鉴定血小板的聚集部位和聚集程度，进而检测临床血栓类疾病，同时，标记物的制备方法简单，成本低廉，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
说明书附图
图1 荧光显微镜显示标记的血小板，红色为本发明标记物标记的血小板
具体实施方式
名词解释：
sulfo-SMCC：（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）；N-ethylmaleimide：N-乙基顺丁烯二酰亚胺
PAMAM：聚酰胺-胺型树枝状高分子
实验材料：
PAMAM、甲醇、甲醇钠、丙烯酸甲酯、sulfo-SMCC、抗CD41单克隆抗体、N-ethylmaleimide、波长为680nm的近红外光染料均为市售品。
实施例1 本发明血小板标记物的制备
（1）2G～6G PAMAM的合成：
取1.4g PAMAM溶于70ml甲醇，加入100ul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入3ml丙烯酸甲酯。搅拌72小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G～6G PAMAM。
（2）2G～6G PAMAM与抗CD41单克隆抗体的结合：
取步骤（1）制得的2G～6G PAMAM40ul，在室温下，加入sulfo-SMCC40ul(4.8mg/mL)、抗CD41单克隆抗体20ul(200μg/ml)，反应2小时，剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul(4.8mg/mL)，反应1h，得到反应混合物；超过滤(MWCO100,000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗CD41单克隆抗体的2G～6G PAMAM。
（3）取步骤（2）得到的连接了抗CD41单克隆抗体的2～6GPAMAM20μL，加入20μl与波长为680nm的近红外光染料(50μg/ml，Invitrogen)，暗光孵化1小时，即得本发明血小板标记物。
实施例2 本发明血小板标记物的制备
（1）2G～6G PAMAM的合成：
取1.4g PAMAM溶于56ml甲醇，加入84ul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入2.8ml丙烯酸甲酯。搅拌60小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G～6G PAMAM。
（2）2G～6G PAMAM与抗CD41单克隆抗体的结合：
取步骤（1）制得的2G～6G PAMAM30ul，在室温下，加入sulfo-SMCC40ul(4.5mg/mL)、抗CD41单克隆抗体20ul(150μg/ml)，反应1.5小时，剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul(5.0mg/mL)，反应0.5h，得到反应混合物；超过滤(MWCO100,000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗CD41单克隆抗体的2G～6G PAMAM。
（3）取步骤（2）得到的连接了抗CD41单克隆抗体的2G～6G PAMAM20μL，加入20μl与波长为680nm的近红外光染料(25μg/ml，Invitrogen)，暗光孵化0.5小时，即得本发明血小板标记物。
实施例3 本发明血小板标记物的制备
（1）2G～6G PAMAM的合成：
取1.4g PAMAM溶于84ml甲醇，加入112ul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入3.22ml丙烯酸甲酯。搅拌60小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G～6G PAMAM。
（2）2G～6G PAMAM与抗CD41单克隆抗体的结合：
取步骤（1）制得的2G～6G PAMAM50ul，在室温下，加入sulfo-SMCC40ul(5.0mg/mL)、抗CD41单克隆抗体20ul(250μg/ml)，反应2.5小时，剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul(5.0mg/mL)，反应2h，得到反应混合物；超过滤(MWCO100,000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗CD41单克隆抗体的2G～6G PAMAM。
（3）取步骤（2）得到的连接了抗CD41单克隆抗体的2G～6G PAMAM20μL，加入20μl与波长为680nm的近红外光染料(75μg/ml，Invitrogen)，暗光孵化1.5小时，即得本发明血小板标记物。
以下根据具体的实验来说明本发明的有益效果：
实验例1 本发明管腔内激活的血小板标记物对小鼠血小板的标记
1、实验方法
1.1 小鼠血小板的分离
取小鼠静脉血，置于抗凝离心管中，静置30min后离心，800rpm李欣10min，上清液极为富含血小板的血浆。吸出上清液，置于干净试管中，3500rpm离心10min，弃去上清液，管底沉淀物为血小板，向试管中滴加50～100μl质量浓度为1%草酸铵溶液，以玻璃棒轻轻搅拌，再加入质量浓度为1%草酸铵溶液2～3ml，静置5min，使红细胞溶解。3500rpm离心10min，弃去伤情，加入血小板洗涤液(130mM NaCl，6mM葡萄糖，9mM NaHCO3，10mM柠檬酸钠，10mM Tris，3mM氯化钾，0.8mM磷酸二氢钾，0.9mMMgCl)并反复吹打，是成为血小板混悬液，3300rpm离心10min，弃去上清，加入少量血小板洗涤液并反复吹打使之成为混悬液。
将上述混悬液，用3.7%多聚甲醛固定在载玻片上，固定时间为30min。
1.2 小鼠血小板的标记
取经多聚甲醛固定的血小板，在含1mg/ml BSA的PBS溶液中孵育30mins，PBS连续洗涤3次，在黑暗加入含20μl实施例1制备的本发明血小板标记物，孵化1小时。
1.3 标记结果的观察
使用Leica DM750荧光倒置显微镜观察，所有图象在256×256像素和200毫秒的曝光时间条件下获得。图象使用Image J.软件分析。
2、结果
如图1所示，荧光倒置显微镜观察标记后的小鼠血小板呈红色，说明血小板被本发明血小板标记物标记。
实验结果说明，本发明血小板标记物可以有效标记血小板。
综上，本发明制备得到了能够有效标记血小板的标记物，可直接有效地鉴定血小板的聚集部位和聚集程度，进而检测临床血栓类疾病，同时，标记物的制备方法简单，成本低廉。

Claims (6)

1.一种血小板标记物，其特征在于：它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G PAMAM；
它是采用如下方法制备：
将2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G PAMAM；
所述2～6G PAMAM由下述方法制备：
将PAMAM溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60～80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2～6G PAMAM；
其中，甲醇的用量为PAMAM的40～60倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.06～0.08倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2～2.3倍（v/w）；
所述的血小板特异性抗体为抗CD41抗体；
所述2～6G PAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为：
取2～6G PAMAM，加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、血小板特异性抗体，反应1.5～2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5～1.5h，超过滤净化，即可；
其中，2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺的用量比（v/w/w/w）为（30～50）：（0.18～0.20）：（0.003～0.005）：（0.18～0.20）；
所述荧光分子是波长680nm的近红外光染料；
所述荧光分子标记的方法为：在2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005～0.0015倍（w/v）的荧光分子，暗光孵化0.5～1.5h，即可。
2.一种制备权利要求1所述血小板标记物的方法，其特征在于：其步骤如下：将2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2～6GPAMAM；
所述的血小板特异性抗体为抗CD41抗体；
所述2～6G PAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为：
取2～6G PAMAM，加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、血小板特异性抗体，反应1.5～2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5～1.5h，超过滤净化，即可；
其中，2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺的用量比（v/w/w/w）为（30～50）：（0.18～0.20）：（0.003～0.005）：（0.18～0.20）；
所述荧光分子是波长680nm的近红外光染料；
所述荧光分子标记的方法为：在2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005～0.0015倍（w/v）的荧光分子，暗光孵化0.5～1.5h，即可；
所述2～6G PAMAM由下述方法制备：
将PAMAM溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60～80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2～6G PAMAM；
其中，甲醇的用量为PAMAM的40～60倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.06～0.08倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2～2.3倍（v/w）。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述甲醇的用量为PAMAM的50倍（v/w），甲醇钠的用量为PAMAM的0.07倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2.14倍（v/w）。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抗CD41抗体为抗CD41单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐与血小板特异性抗体的反应时间是2小时，加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺后的反应时间是1h；
所述2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺的用量比（v/w/w/w）为40：0.192：0.004：0.192。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光分子的用量为2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物的0.001倍（w/v）；所述暗光孵化时间为1h。
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