KR850001770B1 - 인체 암 항원에 대한 특이항체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

인체 암 항원에 대한 특이항체의 제조방법
본 발명은 광범위한 인체암에서 발견되나 상응하는 비종양 조직에서는 발견되지 않는 인항원에 대한 특이항체의 제조방법에 관한 것이다.
실험동물의 초기 조사결과에 종양중의 핵 및 인에서 비종양 조직에서는 발견되지 않는 항원이 존재함이 알려졌다(R.K Busch et al, Cancer Res. 34, 2362 1974 ; Yeoman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 3258, 1976 ; Busch and Busch, Tumori 63, 347, 1977 ; Davis et al, Cancer Res. 38, 1906, 1978 ; Marashi et al, Cancer Res. 39, 59, 1979 참조). 본 발명자들은 초기연구에서 토끼를 면역시켜 쥐의 정상 세포 및 종양세포의 인에 대한 항체를 제조하였다(상기의 R.K. Busch et al, 상기의 Busch and Busch, 상기의 Davis et al). 밝은 인 형광은 간접면역 형광법에 의해 아세톤-고정세포에서 확인되었다. 또한 쥐의 노비코프(Novikoff) 간암 인으로부터 추출된 노비코프 간암 인 항원에 대한 항혈청으로 생성된 오크터로니겔(Ouchterlony gel)중의 면역침강소 밴드는 간 인 항원과 항간 인 항혈청으로 생성된 상응하는 면역 침강소 밴드와 다르다는 것도 발견했다(상기의 Busch and Busch).
또한 간핵 추출물에 흡수시킨 항종양 인 항혈청이 노비코프 간암복수 세포에서 양성인 형광을 생성할 때 특이성이 나타났으나 간세포에서는 나타내지 않았다. 역으로 종양인 추출물에 흡수시킨 항간 인 항혈청은 검출할 수 있는 종양인 형광을 생성하지 않았으나 간인에서는 양성 형광을 생성했다(상기의 데이브스 등).
아세톤-고정 종양도말표본 및 정상쥐세포 도말표본에서(특히 정상간 핵 및 인에 항혈청을 흡수시킨 후) 차이점이 관찰될 수 있음이 면역형광 분석에서 나타났기 때문에, 이들 항혈청을 인체종양에서 유도된 상응하는 조직시료 시험에서 쥐종양인 항원에 이용하려는 시도가 행해졌다. 설치류 종양인에 대한 항체에 관한 연구에서 양성 면역형광은 인체 종양인에서는 발견되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 관점에서 본 발명자들은 인체 인 항원을 찾으려는 일련의 새로운 연구를 시작했다. 이 연구에서 새로운 인체종양 표본에 대한 항혈청 및 항체를 함유하는 인체종양 조직에서 양성 면역형광이 발견되었다. 이들 연구에서 항체를 태반핵 초음파 처리물 및 태생 송아지혈청에 흡수시킨다(Busch et al, 39, 3024, 1979 ; Davis et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 892, 1979 ; Smetana et al, Life Sci, 25,227, 1979 참조).
본 발명은 광범위한 인체종양을 검출하기 위하여 이들 새로운 인체 인 항원을 이용하도록 고안된 연구에서부터 유래된다.
다음 표 I은 밝은 인 면역형광이 인체 종양인에 대한 항체와 함께 발견되는 인체종양의 개요를 나타낸다. 이들 연구에서 많은 인체종양이 항혈청이나 항혈청의 면역 글로블린 단편과 함께 양성 면역 형광을 나타내는 통상의 인항원을 함유한다는 경이롭고도 예기치 않은 발견이 뒷받침 되었다(상기의 Busch et al).
[표 I]
Figure kpo00001
비종양조직, 양성종양 및 염증 상태에서 일반적으로 다음 표 Ⅱ에 제시된 바와 같이 음성의 결과가 수득된다 : (상기의 Busch 등)
[표 Ⅱ]
Figure kpo00002
* 괄호안의 숫자는 환자의 수를 나타낸다.
원래 면역 형광으로 얻어진 이들 결과는 면역 퍼옥시다아제 방법으로 입증 및 확장되었다.
본 발명은 통상적인 인 항원이 인체 정상세포에서 발견되지 않고 인체 암세포의 넓은 범위에 걸쳐 발견된다는 경이롭고도 예기치 않은 발견에 근거를 두고 있다. 항원은 유전자조절 또는 기타의 작용을 가지는 단백질이며 염색체주위에 위치하여 유사분열을 통해 지속된다. 본 발명의 요지는 인체 암세포에서 발견된 통상적인 항원의 발견, 인 항원의 분리 및 정제, 이들 항원의 특이적인 항혈청 및 항체의 생성, 인체 암세포검출을 위한 이들 항원에 대해 특히적인 항혈철 및 항체를 사용하는 진단시험법 및 이를 인항원에 특이적인 항체 또는 항혈청 또는 둘 다를 함유하는 진단용구 등이다.
항원은 중추신경계, 위장관, 성뇨기관, 폐, 피부, 혈액형성조직 및 내분비 및 외분비선 암을 포함하여 광범위한 인체 암에서 발견되었다. 예를 들어, 악성인체 세포에는 헬라세포, 전립선암, 기타 암종, 육종 및 혈액학적 신생물 등이 포함된다. 항원은 인체의 악성종양 세포의 핵 또는 인으로부터 추출될 수 있다. 항원은 상응하는 비종양 조직에서는 발견되지 않았다. 악성종양 세포를 발견하기 위해 본 발명의 진단방법을 사용시 약 1%의 의음성 및 3%의 의양성이 검출되었다. 의음성은 괴사종양조직 또는 원인불명의 비반응성인 종양을 표시한다. 의양성은 "발암전 조직" 및 "비후조직" 중 의소부위에서의 약한 샹성을 나타낸다. 양성인 두 국소부위는 "발암전부위" 또는 위장관 염증조직중 국소신생물 변형으로 확인되었다.
항원은 주성분 및 적어도 하나 및 가능하게는 그 이상의 부성분을 함유한다. 인체암 세포의 주항원종은 (a) 등전점이 불연속적으로 6.0 내지 6.7이며 pH3 내지 10인 폴리아크릴아미드겔로 측정할 때 등전점이 약 6.3이며 (b)SDS(나트륨 도데실설페이트)를 사용하는 2차원겔 전기영동에 의해 측정할 때 분자량이 약 50,000 내지 60,000달턴이고 (c) 일부가 핵 및 인 RNP에 밀접하게 결합되며 일부는 pH8인 0.01M트리스 HCl에 용해하고 (d) 인 및 인 외부양쪽에 존재하나 세포 분열동안 핵내 또는 관련 염색체에 남아 있다.
검출된 제2항원종은PI가 약 6.0(대다수 항원종과 동일한 조작에 의해 검출됨)이며 그의 분자량도 50,000 내지 60,000달턴이다. 이것은 주항원의 변형된 생성물을 나타내나 이것이 구조적으로 관련있는지의 여부는 결정되지 않았다. 부항원종은 주항원종보다 비교적 소량의 농도로 존재한다.
항원들은 트리스 추출물의 초원심분리에 의해 수득된 인 리보뉴클레오프로테인(RNP) 입자중에도 존재한다. 이들 입장중에 존재하는 항원은 트리스 가용성 분획중의 항원보다 프로테인 및 리보핵산(RNA)에 보다 밀접하게 결합되어 있다. RNP 입자중의 항원이 상청분획중에 있는 항원과 동일한지의 여부는 아직 명백하지 않으나, 그들의 등전점은 같으며 이들은 항원에 대한 항체를 흡수한다. 핵 리보뉴클레오프로테인상의 원섬유(fibril)중에 존재하는 인 항원은 암세포중에서도 면역-광현미경학적 분석에 의해 확인된다. 이들은 RNP입자가 유도되는 원소들을 나타내는 외인구조이다.
항원이 암세포중에 고농도로 존재하며 비암성 세포중에는 매우 저농도롤 존재하는 물질인지 또는 쥐의 노비코프 간암 및 정상래트 간세포의 핵항원에 대한 비교 연구에서 이미 발견된 바의 태생항원 인지의 여부가 결정되어야 할 것으로 남아 있다. (참조 Yeoman et al, 1976)
인체 종양의 조직, 혈액 및 혈청과 의심되는 암환자의 기타조직의 시료를 수득하여 분석하는 모든 단계가 텍사스, 휴스톤, 베일러 의과대학에 있는 인체연구위원회 및 부속병원에 의해 허가되었다. 인체종양의 절편은 주로 휴스톤 베테랑즈 어드미니스트레이션 메디칼센터와 미시간, 디트로이트에 있는 미시간캔서, 파운데이션의 병리과 및 체코슬로바키아 프라하에 있는 차알즈 유니버시티, 내과로부터 외과적표본을 동결 절편하여 수득하거나 생검 또는 저온 유지된 표본으로부터 수득한다. 이들 절편들은 간접 면역 형광 및 면역 퍼옥시다아제 기법에 의해 인 항원 존재유무가 검정된다.
항원의 정제는 핵 또는 인을 핵 또는 인 1용적부에 대해 20용적부의 10mM 트리스 HCl/0.1mM PMSF/pH8과 같이 처음에 27,000×g로 10분간 원심분리한뒤 100,000×g로 16시간동안 원심 분리시킨다. 40%포화도의 황산암모늄을 사용하여 오염물을 제거한다. 40 내지 100% 황산암모늄 분획을 원심 분리시켜 모으고 20mM 트리스 HCl/pH7.6에 대해 투석시킨다. 항원을 DE-52 셀룰로오즈칼럼(1×10㎝)상에 크로마토그라피시킨다. 항원은 0.15M NaCl/0.1mM PMSF/pH7.6 분획에서 용출된다. 등전점 겔을 사용하여 항원을 확인 및 정제한다. 이들은 4% 아크릴아미드/8M 요소/2%암폴린(pH 3.5-10)을 함유한다. 각각PI6.3 및 6.0인 항원들을 각각 겔로부터 절단한다. SDS(나트륨 도데실 설페이트) 겔상에서 이들 항원 각각에 대한 한개의 주 반점이 발견된다.
헬라세포 핵 또는 인은 스핀너 배양병(7 내지 8리터)으로부터 헬라세포를 수집함으로써 제조된다. 세포는 대수기(log phase)에서 7 내지 8×105세포/㎖ 이어야 하며 실제 이와 같았다. 세포펠렛을 물렁한 테프론 주걱으로 균질화시킴으로써 인산염 완충식염수(PBS ; 0.15M NaCl, 0.01M 포스페이트 pH7.2)에 현탁시키고 800×g로 8분간 원심 분리시킨다. 세포를 PBS로 또한번 세척하고 세포 펠렛의 무게를 측정한다. 세포 펠렛을 20부피의 망상적혈구 표준완충액(pH7.4)(RSB) 에 완화하게 균질화시켜 현탁시킨 다음 30분간 얼음상에서 팽창시킨다. 다음에 세포를 1000×g로 8분간 원심분리시켜 완화하게 균질화시키면서 RSB완충액+
Figure kpo00003
부피의 청정제 노니델(Nonidet) p40(RSB 중 10%)에 다시 현탁시킨다. 노니델의 최종부피는 0.5%이다. 세포를 다운스(Dounce)호모지나이저로 20 내지 60 스트로우크로 세포가 분쇄되어 핵이 방출되고 세포질이 제거될 때까지 균질화시킨다. 다음에 세포를 1000×g로 8분간 원심 분리시켜 0.88M 슈크로오즈, 0.5mM Mg아세데이트(20×중량-용량)에 완화하게 균질화시킴으로써 재현탁시키고 1500×g로 20분간 원심 분리시킨다. 생성된 펠렛은 아래 설명된 항원추출물 제조에 사용되는 헬라핵을 함유한다. 다른 인체 악성 종양세포의 핵도 유사한 방법으로 수득할 수 있다.
인을 분리하기 위하여 상기와 같이 제조된 핵펠렛을 완화하게 균질화시키면서 원세포 1그램에 대해 2㎖의 슈크로즈를 사용하는 0.5mM Mg아세테이트, 0.34M의 슈크로즈에 현탁시킨다. 핵을 10초 폭발후 10초 휴식시킴으로써 브란슨 소니파이어(Branson sonifier)로 초음파 처리시킨다. 소요되는 총 시간은 60 내지 110초이다. 방출된 인은 현미경검사에 의해 추적한다. 인을 육안 관찰하기 위하여 아주르 씨이.(Azure C ; 0.25M 슈크로즈중 1% 아주르 씨이를 함유하는 용액)로 염색한다. 제제는 초음파처리가 끝날 무렵에 핵이 제거되어야 한다. 3용적비의 Mg아세테이트가 없는 0.88M 슈크로즈 하부에 초음파 처리된 분획을 깔고 1,500×g로 20분간 원심 분리시킨다. 생성된 펠렛은 면역원으로 사용될 수 있는 헬라 인을 함유한다.
상기 조작(Busch and Smetana, 1970 참조)에 따라 만족할 정도로 정제하고 광현미경학적 분석으로 이들 제제의 질이 근본적으로 만족할 만 함이 확인되었다. 그러나, 전자현미경학적 분석에서 염색질과 핵오염물이 존재함이 확인되었다. 이들 제제를 정제함에 있어 주문제점은 배양물중 원헬라 세포의 양이 한정되어 있어 재정제단계 회수가 제한된다는 점이다. 선행 연구에서 사용된 0.5 내지 1g양 보다는 오히려 5 내지 10g의 헬라세포 제제로부터 제조된 인이 적절한 정제를 막기 위한 충분한 물질을 제공해 준다. 헬라세포의 증식 및 태반핵의 분리조건은 이미 보고된 것(데이비스 등 1979 참조)과 근본적으로 동일하다.
헬라트리스 추출물은 헬라핵을 NaCl-EDTA 완충액 10×중량/용적, 1g 핵/ 10㎖ 완충액에 현탁시킴으로써 제조한다(완충액 : 0.075M NaCl, 0.025M Na EDTA/pH8, 1mM PMSF). 페닐메틸서포닐플루오라이드(PMSF)는 이소프로필 알콜중 100mM의 농도롤 제조한다. 이것을 추출전 각 용액에 가한다. 현탁액을 다운렛상에서 2회이상 상기 공정을 반복한다. NaCl-EDTA 추출물은 본 항원조작에는 사용되지 않으므로 폐기시킨다. 핵 펠렛을 10×중량/용적 0.01M 트리스-HCl, 1mM PMSF에 현탁시키고 다운스 호모지나이저로 20스트로우크로 균질화시킨다. 0.01M 트리스-HCl의 pH는 7 내지 9가 만족할만 하나 pH8을 사용한다. 상청액을 합쳐서 얼음상에 모은다. 트리스 추출동안, 핵이 파괴되며 염색질이 유리된다. 핵 분쇄를 현미경검사로 추적한다. 펠렛을 트리스 완충액에 재현탁시키고 핵을 얼음상에서 15분간 팽윤시킨다. 다음에 "다운스" 호모지나이저로 20 스트로우크로 균질화시키고 12,00×g로 10분간 원심 분리시킨다. 상청액을 모은다. 펠렛을 재현탁시키며 펠렛은 백색 솜털상 외관을 가진다. 다시 "다운스" 호모지나이저를 사용하여 20스트로우크로 균질화시키고 27,000×g로 30분간 원심 분리시킨다. 상청액을 모아서 트리스 추출물로부터 이미 수득한 상청액과 합친다.
트리스 추출물을 아미콘(Amicon)UM-10 또는 PM-10 디아플로(Diaflo)막으로 농축시킨다. 일반적으로 초기부피는 약 50㎖이며 이를 4 내지 5㎖까지 농축시킨다. 프로테인의 최종농도는 4 내지 5㎎/㎖이다. 토끼를 본 트리스 추출물로 면역시킬 수 있다.
상기 조작에 따라서 헬라 인 및 기타인체 악성 종양세포의 핵 또는 인으로부터 추출물을 제조할 수 있다.
트리스 면역원을 수득하기 위해서 상기에서 제조된 250μl의 트리스 추출물(4 내지 5mg/ml)을 250μl의 PBS로 희석한다. 이를 하기 인 면역원에 대해 기술된 바의 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)와 합친다.
항체는 다음과 같이 헬라세포 인 제제로 토끼를 면역화시킴으로써 제조한다. 헬라 인의 중량(20 내지 30㎎, 습윤중량)을 측정하고 0.5㎖의 0.01M 인산염 완충액 식염수(pH7.2)에 균등하게 현탁시킨다. 다음에 이 현탁액을 다음과 같이 0.6㎖의 프로인트 완전 보조제(GIBCO)와 혼합한다 : 현탁된 인을 5㎖ 주사기에 넣고 프로인트 보조제를 다른 주사기에 넣는다. 각 주사기에 끝이 제거된 18게이지의 바늘을 부착시킨다. 다음 바늘을 폴리에틸렌 튜브(내경 0.047, Clay-Adams) 한 조각을 사용하여 연결시킨다. 주사기의 내용물을 제제가 농후해져서 튜브를 통해 힘을 가하기 어려울 때까지 혼합시킨다.
토끼의 등을 면도하고 상기에서 제조된 헬라세포인 제조물을 6개 부위에 0.1㎖/부위씩 피내 주사한다. 남아있는 0.4 내지 0.5㎖를 반은 피하(상부등상의 물렁물렁한 피부밑)로 반은 근육내(대퇴근내)주사한다. 주사액은 3주동안 일주일에 한번씩 매회 같은 양의 인을 주입한다. 최초 출혈은 면역시키고 3주후 7내지 10일간 일어난다. 토끼귀 컵(벨코) 및 진공펌프를 사용하여 채혈한다. 채혈된 혈액(45 내지 50㎖)을 실온에서 3 내지 4시간동안 응고시킨다. 튜브로부터 혈청부분을 제거시키고 1000g로 30분간 원심 분리시킨다(이로써 어떠한 유리적혈구도 침전된다). 투명한 혈청을 모은뒤 흡수(또는 흡수조작직전까지 동결시킴)시킨다. 혈액응고물을 철야 냉동시킨다. 이 물질로부터 추가로 수 ㎖의 혈청이 유리된다. 각 출혈물로부터 수득된 혈청은 간접 면역 형광조작에 의해 인 항체의 존재유무를 분석한다.
기타의 비인간숙주(예 : 염소, 양, 말, 닭 등)는 인체 악성종양 세포인 제제로 면역화시켜서 본 발명의 인항원에 대한 항혈청 또는 항체를 수득할 수 있다. 항혈청은 비인간 숙주동물을 인체 악성 종양세포 핵 또는 인 추출물(예 : 트리스 추출물)로 면역화시킴으로써 제조할 수도 있다.
항 인 항혈청의 흡수는 토끼 항혈청을 20% 정상인체 혈청 및 20% 태생 송아지혈청(GIBCO)에 초기 흡수시킴으로써 수행한다. 20%의 정상인간 혈청을 토끼 항혈청(4㎖/20㎖)에 가하여 37℃의 진탕 수욕중에서 1시간동안 배양시킨다. 플로스크를 회수하여 20% 태생 송아지혈청(4.8㎖/24㎖)을 가하고 37℃의 진탕 수욕중에서 1시간동안 배양시킨다. 플라스크를 회수하여 15분마다 완화하게 진탕시켜 혼합하면서 실온에서 1시간 더 배양시킨다. 다음에 15,000×g로 30분간 원심 분리시키고(흡수된 혈청) 상청액을 회수한다. 흡수된 혈청을 혈청의 (NH4)2SO4침전에 대해 후술되는 공정에 따라 면역 글로블린(Ig) 형태로 전환시킨다.
정상인 혈청 및 태생 송아지혈청에 흡수시킨 인 항혈청으로부터 수득한 Ig 제제를 정상인 조직(태반 또는 간)에 흡수시킨다. pH7.2(10 내지 15㎎ 프로테인/㎖)중 동용적의 태반 핵 초음파 처리물을 흡수된 인 면역글로 블린(10㎖ Ig+10㎖ 핵초음파 처리물)에 가하고 37℃ 진탕 수욕중에서 1시간동안 배양시킨다. 15분마다 플라스크를 완화하게 진탕시켜 혼합하면서 실온에서 1시간 더 배양시킨 뒤 15,000×g로 30분간 원심 분리시킨다. 상청액을 수집한 다음 흡수된 Ig를 (NH4)2SO4로 다시 침전시킨다. 이 Ig는 최종 항체생성물로 사용하거나 다음과 같이 디에틸 아미노에틸(DEAE) 셀룰로오즈 크로마토그라피에 의해 더 정제할 수 있다 :
0.01M 인산염 완충식염수(pH7.2)에 함유된 Ig를 0.0175M 인산염완충액(pH6.3, 식염부재)에 대해 투석시킨다. 투석후 2,500×g로 20분간 원심 분리시킨다. 상청액을 DEAE칼럼(셀룰로오즈 1그램당 20㎎의 프로테인, 왓트만 DE52)에 가한다. IgG 를 0.0175M 인산염 완충액으로 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출시킨 후 IgG분획을 0.01M 인산염 완충식염수(pH7.2)에 대해 투석시킨다.
면역화가 시작되기전 토끼(또는 기타 비인간 숙주동물)를 출혈시켜 얻어지는 면역전 혈청으로 이루어진 대조혈청에 대해서 동일한 조작을 수행한다.
토끼 면역글로블린 Ig는 다음과 같이 제조한다. 포화(NH4)2SO4용액(760g/l)을 제조하고 동부피의 냉포화(NH4)2SO4를 항혈청에 교반하면서 적가한다. 백색침전이 생성되며 생성된 침전을 냉소에서 자기 교반기상에서
Figure kpo00004
내지 2시간동안 응집시킨다. 침전된 항혈청을 3000×g로 20분간 원심 분리시킨다. 상청액을 제거하고 펠렛을 pH7.2(원혈청의 약 1/2용적)의 PBS에 재현탁시킨다. 용해시킨 펠렛을 투석백에 넣고 철야 냉소에서 (자기 교반기로 교반시키면서) 100용적부의 PBS에 대해 투석시킨다. 다음날 아침 투석백을 새로 만든 PBS(100용적부)에 넣고 6시간동안 투석을 계속한다. 면역그로블린을 조심스럽게 투석백으로부터 회수하여 2500×g로 20분간 원심 분리시킨다. 다음에 상청액을 수집한다.
면역 형광에 대해 전술된 조작(RK Busch et al, 1974 ; Hilgers et al, 1972)을 이 연구에서 다음과 같이 사용한다. 1 : 50으로 희석된 항인 항혈청 150μl을 아세톤 고정된 헬라세포 또는 고정된 조직표본(Hilgers et al, 1972 ; RK Busch et al, 1974로부터)상에 넣는다. 조직표본이 슬라이드의 대부분을 커버할 경우에는 150μl 이상의 항혈청을 사용해야 할 필요가 있을 수도 있다. 항혈청(As)의 희석은 항체(Ab)의 역가에 의거하여 수행한다. 기타의 희석방법을 사용할 경우 As 또는 Ab가 너무 희석되어서 공지의 양성세포(예: 헬라)에 대한 양성반응을 나타내지 못하게 될 수 있다. 슬라이드를 습한 체임버에서 45 내지 50분간 37℃로 배양시킨다(습한 체엄버는 습한 종이타월을 가한 커다란 페트리접시로 구성될 수 있다). 배양후, PBS를 서서히 가해서 항혈청을 슬라이드로부터 세척하고 슬라이드를 슬라이드 홀더속에 넣고 PBS중에서 1시간 동안 세척한다. PBS를 3회, 즉 15분, 30분 및 45분에 각각 바꾼다. 슬라이드를 PBS로부터 회수하여 증류수 또는 탈이온수중에 신속히 상하로 움직이면서 10회 담갔다 뺀다. 지나치게 건조되지 않도록 조심하면서 슬라이드를 헤어드라이어의 찬공기로(2내지3분) 건조시킨다. 1 : 10으로 희석된 형광 표지된 염소항 토끼 항혈청(Hyland 또는 Cappel) 150μι를 슬라이드 위에 놓고 습한 체임버중에서 실온으로 30 내지 35분간 배양시킨다. 제2항체를 PBS로 완화하게 세척하여 슬라이드로부터 회수한다. 다음에 슬라이드를 PBS중에서 1시간동안 3회 즉, 15, 30분, 각각 PBS를 바꾸면서 세척하거나 처음 15분간 세척한 후, 새로 만든 PBS에 넣고 철야 냉장고에 보관한다. PBS로 마지막 세척한 후, 슬라이드를 신속히 상하로 움직이면서 10회 탈이온수 또는 증류수속에 담구었다가 헤어드라이어의 찬공기로(2 내지 3분) 건조시킨다. 글리세롤과 PBS의 1:1용액을 세포 또는 조직표본에 가하고 커버슬림으로 덮는다. 표본은 커버슬립을 투명한 매니큐어와 같은 밀폐제로 밀폐시켜서 냉소에 보관하면 수개월간 보존할 수 있다. 다음에 슬라이드를 형광 현미경으로 검사한다. 인 형광은 면역전 면역글로블린 또는 면역전 IgG 분획에서는 관찰되지 않았다. 사용되는 기타 면역학적 기술은 상기 연구에서 사용된 것과 동일하다(Kendall, 1938, Lowry et al, 1951 ; Dale and Latner, 1969 ; Laurell, 1972 ; Wallace et al, 1974 ; Marashi et al, 1979). 면역 형광의 인위치를 분석하기 위해 샘플을 형광 관찰하는 동안 상 수축조명을 켰다 껐다 한다.
상기와 같은 형광-표지된 염소 항토끼법(Fluorescein-labeled goat antirabbit) 대신에, 면역퍼옥시다아제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 150μl의 퍼옥시다아제 표지된 염소항 토끼 1 : 10 또는 1 : 20 희석액을 가한다. 편재된 퍼옥시다아제 활성은 광 또는 전자현미경 검사를 위한 다수의 산화 환원염색 시스템에 의해 확인할 수 있다. 기타의 효소는 간접법용 표지물로 작용할 수 있으며 퍼옥시다아제 및 기타 효소는 1차항체를 표지함으로써 직접 사용할 수 있다.
카노프스키 배양 배지(Karnofsky's incubation medium)는 다음과 같이 제조된다 : 충분량의 디아미노벤지딘(시그마)을 평량하고 농도가 0.5㎎/㎖가 되도록 0.05M 트리스-HCl(pH7.6)에 형탁시킨다. 0.05M트리스-HCl 완충액중 0.02%의 과산화수소용액을 제조한다. 0.5mg/mι의 DAB롸 0.02% H2O2를 1 : 1 비율로 혼합한다.(이 용액은 용시매번 새로 제조하며 제조하는동안 차게 유지한다). 슬라이드에 200 내지 300ul의 DAB 및 H2O2혼합물을 가하고 습한 체임버중에서 실온으로 30분간 배양시킨다.
배양후 0.1M NaCl에 가한 0.05M 트리스 HCl(pH 7.6) 완충액으로 슬라이드를 세척하여 DAB 및 H2O혼합물을 제거한다. 완충액으로 슬라이드를 세척하여 DAB 및 H2O혼합물을 제거한다. 슬라이드를 0.1M NaCl에 가한 0.05M 트리스 HCl(pH7.6)로 10분간씩 2회 세척한다. 단계 11 내지 14에서 기술된 바와같이 슬라이드 제조공정을 마친다(단 PBS는 트리스 HCl로 대치시킨다). 완성된 스라이드를 광현미경으로 검사한다.
면역형광용 헬라세포 슬라이드는 다음과 같이 제조한다. 고정된 헬라 세포의 원료는 헬라 배양병으로부터 왕성히 자라는 세포를 회수하여 PBS(pH7.2)로 세척함으로써 제조한다. 세포를 최소한 1.5×106세포/㎖가 되도록 현탁시킨다. 헬라세포 현탁액 1적을 각 세척된 슬라이드(이때 슬라이드는 세제로 닦고, 증류수나 탈이온 수로 헹구어서 알콜로 닦고 다시 헹군뒤 헤어드라이어의 열공기로 건조시킨다)에 놓고 약간 편뒤 실온(또는 냉소에서 철야)에서 건조시킨다. 건조된 세포는 슬라이드를 4℃에서 12분간 아세톤속에 넣어둠으로써 고정된다. 슬라이드는 다이아몬드 포인트 글래스 마킹 펜슬로 번호를 매긴다. 슬라이드는 면역형광용 양성대조군으로 사용한다.
본 연구에서 인 항원은 비종양조직에서 발견되는 것이 아니고 종양세포중에 존재한다는 것이 확인된다. 초기 연구에서는 인체 종양세포 배양물 및 부검 또는 생검시료로부터 얻은 표본중 밝은 인 형광은 이중 항체기법(간접 면역형광)에 의해 생성되며 상응하는 결과가 일련의 비종양조직에서는 수득되지 않았다.(Davis et al, 1979). 후자의 연구에서 60가지 이상의 악성종양이 연구되었으며 여러가지의 조직 대조군도 평가되었다. 외배엽, 내배엽 및 중배엽 기원의 광범위계열의 악성종양에서도 하나 또는 그 이상의 통상적인 항원이 존재한다는 것은 대단히 관심을 끄는 일이다(표 I).
[실시예 1]
정상조직
17개의 비종양조직에서는 항혈청 또는 항체를 여러가지 고정된 세포표본과 함께 배양시킨 후 인 형광은 나타나지 않았다. 이 조작에 의해서 피부의 말피기층, 골수세포 및 리버쿤선 모두 면역형광을 나타내지 않았다는 것이 특히 흥미롭다. 더우기, 신생물에 인접한 여러가지 비종양조직도 음성이었으며 이들은 여러 형태의 조직들을 포함한다. 여러 형태의 갑상선종을 포함하여 평가된 양성종양 그룹도 음성이었다(표 Ⅱ).
[실시예 2]
염증장해
염증반응이 이들 항원의 외관과 관련되는지의 여부를 확실시하기 위하여 8가지 유형의 염증조직에 대한 연구가 이루어졌다. 이들중 대부분에서 연구된 세포의 인중 어떠한 주목할만한 형광도 없었다. 그러나 궤양성 대장염 및 위궤양 표본에서 양성인 형광을 나타내는 절편이 발견되었다. 명백히, 3개의 궤양성 대장염 절편중 둘은 음성었고 하나는 뚜렷한 양성인 형광을 나타냈다. 위궤양에서 검정된 두 절편중 하나는 양성인 형광을 나타냈다. 이들 결과는 이들 장해가 악성으로 변화된다는 공지된 경향의 관점에서 볼때 특히 흥미롭다. 헤마톡실린 에오진-염색된 절편에서 이들 슬라이드의 병소양성 및 음성부위 둘다를 관찰하는 것은 특히 흥미롭다. 이들은 유사분열뿐 아니라 상피내면의 축적을 나타내는 이들 장해의 진정한 부위가 있다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 이들 세포가 발암전 상태장해 또는 암종을 구성할 수 있음을 제시한다. 이들 형광부위의 발견은 감염된 병소를 외과적 처리할 경우 국소 또는 보다 전반적으로 할 것인가를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
[실시예 3]
인골물
위 상피에는 각 세포중에 형광항체의 비특이적 편재를 나타내는 것으로 추측되는 비인 형광부위가 있다. 소장선에는, 항체의 비특이적 편재가 응집형태로 일어나는 것 같다. 대부분의 경우에 0.45um밀리포아 여과기로 항체를 미리 여과하여 이들 응집물을 제거한다. 인 형광에 대해 음성인 유방조직의 시료에서 작은 비특이적 면역형광 반점이 세포 형태학적인 면에서 특별한 국소화 양상을 갖지 않으며 전체적으로 분포되어 있다. 이들 매우 작은 비특이적 침전물의 직경은 4 내지 6um인 핵과 인중 인 직경에 비교해 0.5 내지 0.1um이었다.
[실시예 4]
세포 사이클 기간중 형광
인 형광은 간기 인중에서 쉽게 볼 수 있다. 간기에서 인 형광은 뚜렷한 실체로서 볼 수 는 없으나, 염색체들 사이 및 핵과 세포질 사이의 경계부위에서 볼 수 있다. 인은 대개 간기동안에 사라지며 rRNS합성이 전기후반에 중지되므로 그러한 세포에서 인 형광을 뚜렷한 실체로 볼수 없는 것은 놀랄만한 것이 아니다(Tan 및 Lerner, 1972). 그러나 면역 형광 생성물의 잔유물이 유사분열을 통해 지속된다고 하는 발전은(인 생성물이라기보다는 오히려) 인 하부구조물 이후 성설적으로 지속되는 항원을 함유함을 암시한다.
[실시예 5]
악성 종양 음성
일련의 악성종양에서 음성부위는 슬라이드 전체를 통해 다양한 범위에서 발견된다. 일반적으로 이들은 신생물의 괴사 또는 종기가 생기 부위와 상관관계가 있다. 뇌종양의 시료에서 어떠한 양성 형광도 나타내지 못한 집단은 괴사 부위였으며, 많은 백혈구가 존재하나 한정된 구조는 없었다. 뇌로 전이된 선암은 양성 형광을 나타내지 않았으며, 그 이유는 분명치 않다. 연구된 63개 종양중 61개가 양성인 형광을 나타냈기 때문에 연구된 시리즈중 97%가 양성이다. 이와같은 연구를 일련의 유방, 전립선, 폐 및 혈액학적 종양암을 포함하는 300개 인체암 표본에 걸쳐 수행한 결과 아주 유사한 결과가 얻어졌다.
[실시예 6]
표지
항체를 확인하기 위한 직접 면역화학적 방법에는 일차항체에 다음 표지물중 하나 이상으로 표지하는 방법이 포함된다.125I,131I,14C 또는3H과 같은 방서선 자동사진 검사용 방사성 동위원소, 플루오레세인 또는 테트라메틸 로다민과 같은 형광현미경 분석용 형광염료 형광 또는 광학현미경에 의한 검출용 형광생성물 또는 채색물을 생성하거나 전자현미경에 의한 확인용 전자 농후 생성물을 생성하는 효소 또는 페리틴과 같은 직접 전자현미경 육안관찰용 전자 농후분자 등.
간접 면역화학적 방법에는 2차항체 또는 1차항체에 대한 특이적 결합단백을 형광염료, 전자 농후화합물, 광, 형광 또는 전자현미경 검사에 의해 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소 또는 방서선자동 사진검사에 의해 검출할 수 있는 방서성 동위원소로 표지하는 방법이 포함된다.
항체를 육안 관찰하기 위한 간접 면역 화학적 방법에는 혼성 항체제조의 일부가 인항원(혼성 1차항체) 또는 1차항체(혼상 2차항체)에 대해 특이적이며 일부가 상기 단락에서 언급된 것과 같은 표지물에 대해 특이적인 혼성 1차 또는 2차항체 또는 항체 단편(F(ab')2)을 사용하는 것이 포함된다.
표지된 결합항체 및 비결합 항체들은 진단용구로 분포시키기 위해 인산염 완충식염수(PBS) 또는 기타 완충 현탁화제중에 따로따로 포장할 수 있다. 적당한 현탁화제에는 글리세린, 헤파린 또는 슈크로즈가 포함된다. 적당한 완충액에는 바르비탈완충액, 모르폴린완충액, MOPS-3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산, 헤페스-N-2-하이드록시에틸 피페라진-N-2-에탄설폰산, 트리스 카보네이트 등이 포함된다.

Claims (1)

  1. 비인간 숙주동물을 등전점이 약 6.0 내지 6.7이고, 분자량이 약 50,000 내지 약 60,000달턴이며, pH8의 0.01M 트리스 HCl에 가용성이고, 주로 인에 편재되는 주성분과 부성분을 함유하는 항원으로 면역시키고 면역된 동물로부터 항체를 수득함을 특징으로 하여, 인체 암세포의 인 및 핵에 존재하는 항원에 대한 특이항체를 제조하는 방법.
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