DE3047654A1

DE3047654A1 - Verfahren zum immunologischen nachweis von krebs in menschlichen gewebeschnitten, abstrichen und abblaetternden zytologischen praeparaten sowie dabei verwendete reagentien und diagnosemittel

Info

Publication number: DE3047654A1
Application number: DE19803047654
Authority: DE
Inventors: Harris Busch; Rose K. Busch; Frances M. Houston Tex. Davis; Ferenc Gyorkey; Phyllis Gyorkey; Karel Praha Smetana
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1980-01-04
Filing date: 1980-12-17
Publication date: 1981-09-10
Also published as: ES8206855A1; PT72301B; PH18765A; FR2484650A1; IL61641A0; ES498305A0; IL61641A; PH18624A; SE8100011L; PH18636A; BE886935A; FI810007L; GB2067286B; AR232046A1; DK554980A; IT1172216B; NO803910L; JPS56101553A; ZA807754B; PT72301A

Description

Henkel, Kern, Feuer ö Hinze! Patentanwälte Registered Representatives

before the

European Patent Office

Baylor College of Medicine Houston, Texas, V.St.A.

Möhistraße 37 D-8000 München 80

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid

D-4233F

17. Dez, 1980

Verfahren zum immunologischen Nachweis von Krebs in menschlichen Gewebeschnitten, Abstrichen und abblätternden zytologischen Präparaten sowie dabei verwendete Reagentien und Diagnosemittel

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft nukleoläre Antigene, die bei zahlreichen menschlichen Krebserkrankungen, nicht dagegen in den entsprechenden tumorfreien Geweben, nachweisbar sind und für diese(s) nukleoläre Antigen(e) spezifische Antikörper und Antiseren zu Diagnosezwecken.

Frühere Untersuchungen bei Versuchstieren haben gezeigt, daß in Tumoren Kernantigene und nukleoläre Antigene vorkommen, die in tumorfreien Geweben nicht gefunden werden (vgl. R. K. Busch und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 34, Seite 2362, 1974; Yeoman und Mitarbeiter in "Proc. Natl. Acad. Sei. USA" Band 73, Seite 3258 (1976); Busch und Busch in "Tumori" Band 63, Seite 347 (1977); Davis und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 38, Seite 1906 (1978) und Marashi und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 39, Seite 59 (1979)). Bei diesen früheren Untersuchungen wurden durch Immunisierung von Kaninchen Antikörper gegen Nukleolen normaler und neoplastischer Zellen von Ratten gewonnen (vgl. R. K. Busch und Mitarbeiter aaO ; Busch und Busch aaO und Davis und Mitarbeiter aaO). Durch die indirekte Immunofluoreszenzmethode konnte bei den acetonfixierten Zellen eine helle nukleoläre Fluoreszenz gezeigt werden. Es hat sich ferner gezeigt, daß die Immunopräzipitinbanden in Ouchterlonygelen, die mit aus Novikoffhepatom-Nukleolen von Ratten extrahierten Antiseren gegen Novikoffhepatom-Nukleolenantigene erzeugt wurden, sich von den entsprechenden Immunopräzipitinbanden, die mit Lebernukleolenantigtnen und Antilebernukleolenantiseren gebildet wurden, unterscheiden (vgl. Busch und Busch aaO).

Als Beleg für eine weitere Spezifizierung dient die Erkenntnis, daß Antitumornukleolenan.tiserum mit absorbierten Leberkernextrakten bei Novikoffhepatomasziteszellen, nicht dagegen bei Leberzellen eine positive nukleoläre Fluoreszenz zeigen. Umgekehrt ergibt Antilebernukleolenantiserum mit absorbierten Tumornukleolenextrakten zwar bei Lebernukleolen eine positive Fluoreszenz, nicht dagegen eine nachweisbare

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Tumornukleolenfluoreszenz (vgl. Davis und Mitarbeiter aaO).

Insoweit eine Immunofluoreszenzanalyse zeigt, daß bei acetonfixierten Tumorabstrichen und normalen Rattenzellenabstrichen (insbesondere nach Absorption der Antiseren mit normalen Leberkernen und -nukleolen) Unterschiede feststellbar sind, wurde versucht, diese Antiseren gegen-Rattentumornukleolenantigene zum Testen entsprechender Gewebeproben aus menschlichen Tumoren auszunutzen. Untersuchungen mit Antikörpern gegen Nagertumornukleolen zeigten, daß bei menschlichen Tumornukleolen keine positive Immunofluoreszenz feststellbar ist. Im Hinblick darauf wurde eine Versuchsreihe zur Auffindung von Humannukleolenantigenen begonnen. Dabei konnte in menschlichen Tumorgeweben mit Antiseren und Antikörpern gegen diese neuen Humantumornukleolenpräparate eine positive Immunofluoreszenz gefunden werden. Bei diesen Untersuchungen wurden die Antikörper an Plazentakernsonikate sowie fötales Kalbserum absorbiert (vgl. Busch und Mitarbeiter "Cancer Res." Band 39, Seite 3024 (1979); Davis und Mitarbeiter "Proc. Natl. Acad. Sei. USA" Band 76, Seite 892 (1979) und Smetana und Mitarbeiter in "Life Sei." Band 25, Seite 227 (1979)).

Die vorliegende Erfindung beruht auf Untersuchungen bezüglich der Ausnutzbarkeit dieser neuen Humannukleolenantigene zum Nachweis eines breiten Bereichs von Humanneoplasmen.

Die folgende Tabelle I gibt eine Aufstellung derjenigen menschlichen Tumore, bei denen mit den Antikörpern gegen menschliche Tumornukleolen eine helle nukleoläre Immunofluoreszenz feststellbar ist. Diese Untersuchungen stützen die überraschende und unerwartete Erkenntnis, daß zahlreiche menschliche Tumore gemeinsame nukleoläre Antigene bzw. Nukleolenantigene, die mit Antiseren oder Immunoglobulinfraktionen solcher Antiseren eine positive Immunofluoreszenz zeigen, enthalten (vgl. Busch und Mitarbeiter aaO).

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Tabelle I

Helle Nukleolenimmunofluoreszenz bei menschlichen Tumoren (aus Busch und Mitarbeiter (1979))

I. Karzinome

1. Blase, Ubergangszellen

2. Gehirn

Astrozytom
Glioblastom

3. Dickdarm, Adenokarzinom (4)

Metastase: Leber transplantierbares Karzinom (GW-39)

4. ekkrine Drüse, Karzinom

5. Speiseröhre, Squamöses Zellkarzinom

6. Leber, Primärkarzinom

7. Lunge:

Adenokarzinom (2) Haferzellen (oat cells) Squamöse Zellen (5)

8. Melanom, maligne, zerebrale Metastasen

9. Prostata, Adenokarzinom (4)

10. Haut: basales Zellkarzinom (2)

squamöses Zellkarzinom (7) Metastase: Lymphknoten

11. Magen, Adenokarzinom

Metastase: Leber Metastase: Lymphknoten

12. Schilddrüse, Karzinom (2)

II. Sarkome

1. Myoblastom, bösartig auf den Lippen

Metastase auf zervikalen Lymphknoten

2. Osteogenes Sarkom (3), Biopsie,

Gewebekultur, ^_003770745

3. Synovialsarkom

4. Lymphom (4), Nicht-Hodgkins

III. Hämatologische Neoplasmen

1. Hodgkins¹sehe Erkrankung (Reed Sternberg, 5)

2. Leukämie: CLL (5), haarige Zellen (Milz)

3. Lymphom, lymphozytisch, Milz

4. Multiples Myelom (5)

5. Mycosis fungoides

6. Akute myelozytische Leukämie (5)

7. Chronische myelozytische Leukämie (5)

8. Akute monozytische Leukämie (2)

IV. Kulturen

1. Burstkarzinom

2. Dickdarmadenokarzinom

3. HeLa

4. HEp-2

5. Prostata, Karzinom (3)

6. Squamöses Zellkarzinom (3)

* Die Zahlen in Klammern bedeuten die Anzahl der Fälle.

In tumorfreien Geweben, gutartigen Tumoren und bei entzündlichen Zuständen sind in der Regel, wie die folgende Tabelle II ausweist, negative Ergebnisse feststellbar (vgl. Busch und Mitarbeiter aaO).

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Tabelle II

Negative Immunofluoreszenz bei Humangeweben (aus: Busch und Mitarbeiter (1979))

I. Normale Gewebe

1. Blase

2. Knochenmark (hämoblastische Formen (lines), 5)*

3. Brust

4. Leukozytenfilm im zentrifugierten Blut (3)

5. Gallenblase

6. Dünndarm, Lieberkühn¹sehe Krypten

7. Dickdarm

8. Niere

9. Leber (2)

10. Lunge (dem Tumor benachbartes Gewebe)

11. Lymphknoten

12. Lymphozyten (normal (2)

13. Pankreas

14. Epiphyse

15. Hypophyse

16. Plazenta

17. Prostataphyse

18. Haut

19. Magen

20. Schilddrüse

II. Benigne wachsende Gewebe

1. Brust, Adenom

2. Nebenschilddrüse, Adenome (2)

3. Prostatadrüse, Hyperlasie (3)

4. Schilddrüse, Adenome (3) Knotiger Kropf (2)

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III. Entzündliche Erkrankungen

1. Chronische Colitis ulcerosa

2. Glomerulonephitis

3. Granulom und Fibröse der Lunge

4. Leberzirrhose, Hepatitis

5. Lupus profundus (Milchdrüse und Haut)

6. Blasiger Hautausschlag

7. Magengeschwür

8. Entzündliche Hyperplasie-Lymphknoten (4)

9. Infektiöse Mononukleose (5)

IV. Kulturen

1. Brustfibroblasten

2. Lymphozyten, PHA stimuliert

* Wie Tabelle 1

Diese zunächst mittels Immunofluoreszenz erhaltenen Ergebnisse sind durch Immunoperoxidasemethoden erhärtet und verbreitert worden.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden und unerwarteten Erkenntnis, daß in den verschiedensten menschlichen Krebszellen, jedoch nicht in normalen menschlichen Zellen, gemeinsame Nukleolenantigene vorkommen. Bei den Antigenen handelt es sich um Proteine, denen eine Gensteuerung oder eine sonstige Funktion zukommt und die die Mitose an einer perichromosomalen Stelle überdauern. Wesentliche Aspekte der Erfindung sind die Erkenntnis der in menschlichen Krebszellen gefundenen gemeinsamen Nukleolen-Antigene, die Isolierung und Reinigung der nukleolären Antigene bzw. Nukleolen-Antigene, die Gewinnung von für diese Antigene spezifischen Antiseren und Antikörpern, diagnostische Testmethoden unter Verwendung von für diese Antigene spezifischen Antise-

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ren und Antikörpern zum Nachweis menschlicher Krebszellen und ein Diagnosemittel mit Antikörpern und/oder Antiseren, die für diese Nukleolen-Antigene spezifisch sind.

Die Antigene wurden bei den verschiedensten menschlichen Krebserkrankungen einschließlich Krebserkrankungen des Zentralnervensystems, des Gastrointestinaltrakts, des Urogenitaltrakts, der Lunge, der Haut, blutbildender Gewebe und endokriner und exokriner Drüsen aufgefunden. Maligne menschliche Zellen sind beispielsweise HeLa-Zellen, Prostatakarzinom, sonstige Karzinome, Sarkome und hämatologische Neoplasmen. Die Antigene können aus den Kernen oder Nukleolen von menschlichen malignen Zellen extrahiert werden. In den entsprechenden tumorfreien Geweben sind die Antigene nicht auffindbar. Bei Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnosemethoden zum Nachweis maligner Zellen gab es etwa 1 % falscher negativer Ergebnisse und 3 % falscher positiver Ergebnisse. Diese falschen negativen Ergebnisse kamen aus unbekannten Gründen bei nekrotischen Tumorgeweben oder nicht-reaktionsfähigen Tumoren vor. Die falschen positiven Ergebnisse wurden in zwei Fällen "präneoplastischer Gewebe" erhalten. Ein schwachpositives Ergebnis kam in gelegentlichen Herdbereichen bei "hyperplastischem Gewebe" vor. Zwei herdpositive Bereiche wurden als "präneoplastische Bereiche" oder neoplastischer Herdübergang bei entzündeten Gastrointestinalgeweben identifiziert.

Die Antigene besitzen eine Hauptart und mindestens eine und möglicherweise mehrere Antigenunterart(en). Die Hauptantigenart aus menschlichen Krebszellen besitzt (a) einen diskreten isoelektrischen Punkt von 6,0 bis 6,7 und etwa 6,3, ermittelt durch isoelektrische Konzentration (focussing) bei einem pH-Wert von 3 bis 10 mittels eines Polyacrylamidgels; (b) ein ungefähres Molekulargewicht von 50000 bis 60000 Dalton, ermittelt durch zweidimensionale Gelelektrophorese unter Verwendung einer aus SDS (Natriumdodecylsulfat)

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bestehenden zweiten Dimension; (c) es ist teilweise fest an Kern- und Nukleolenribonukleoprotein gebunden und teilweise in 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 8 löslich; (d) es ist sowohl nukleolär als auch extranukleolär, es bleibt jedoch in der Zellteilung "intranukleär" oder chromosomenvergesellschaftet.

Die zweite nachgewiesene Antigenart besitzt einen pl-Wert von etwa 6,0 (der in gleicher Weise wie bei der Hauptantigenart ermittelt wurde) und ein Molekulargewicht von ebenfalls 50000 bis 60000 Dalton. Es ist möglich, daß diese zweite Antigenart ein modifiziertes Produkt des Hauptantigens darstellt, es wurde jedoch noch nicht bestimmt, ob es strukturverwandt ist. Die Antigenunterart liegt in relativ geringerer Konzentration vor als die Antigenhauptart.

Antigene finden sich auch in durch Ultrazentrifugieren der Tris-Extrakte erhaltenen Nukleolen-Ribonukleoproteinteilchen (vgl. die folgenden Ausführungen). Das in diesen Teilchen enthaltene Antigen ist an Proteine und Ribonukleinsäure fester gebunden als das Antigen in der tris-löslichen Fraktion. Es ist noch nicht geklärt, warum die Antigene in den Ribonukleoproteinteilchen identisch sind mit denen der überstehenden Fraktion, ihre isoelektrischen Punkte sind jedoch gleich und sie absorbieren die Antikörper (an die Antigene) . In Fibrillen, wahrscheinlich des Kernribonukleoproteinnetzes, vorhandene Nukleolenantigene. sind durch Immunlichtmikroskopie ebenfalls in Krebszellen sichtbar. Hierbei handelt es sich um extra-nukleoläre Strukturen, die Elemente repräsentieren können, aus denen die Ribonukleoproteinteilchen herrühren.

Es bleibt noch zu bestimmen, ob die Antigene eine Substanz darstellen, die in Krebszellen in hohen Konzentrationen und in krebsfreien Zellen in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist oder ob es sich um fötale Antigene handelt, wie sie bereits früher bei den Vergleichsstudien mit Kernantigenen des Ratten-Novikoff-Hepatoms und normalen Rattenleber-

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zellen gefunden wurden (vgl. Yeoman und Mitarbeiter, 1976).

Sämtliche Maßnahmen zur Gewinnung und Analyse von Proben menschlicher Gewebe, Blut und Serum menschlicher Tumore und sonstiger Gewebe verdächtiger Krebspatienten entsprechen den Vorschriften des Human Research Committee at Baylor College of Medicine, Houston, Texas und angeschlossener Krankenhäuser. Schnitte menschlicher Tumore wurden aus Gefrierschnitten chirurgischer Probeentnahmen, durch Biopsie oder aus konservierten cryostatischen Proben hauptsächlich aus dem Department of Pathology from the Houston Veterans Administration Medical Center, the Michigan Cancer Foundation in Detroit, Michigan und vom Department für Innere Medizin der Karl¹s-Universität in Prag, CSSR, erhalten. Diese Schnitte werden durch indirekte Immunofluoreszenz- und Immunoperoxidasetechniken auf die Anwesenheit nukleolärer Antigene analysiert.

Die Reinigung der Antigene erreicht man durch sechsmalige Extraktion der Kerne oder Nukleolen mit 8 itiM Tris-HCl-Puffer/0,1 mM PMSF bei einem pH-Wert von 8 im Verhältnis 20 Volumina (Extraktionsmittel) auf 1 Volumen Kerne oder Nukleolen. Der Extrakt wird zunächst 10 min lang mit 27000 χ g und danach 16h mit 100000 χ g zentrifugiert. Zur Entfernung von Verunreinigungen arbeitet man mit Ammoniumsulfat bei 40 %iger Sättigung. Die 40 bis 100 % Ammoniumsulfatfraktion wird durch Zentrifugieren gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6 dialysiert. Die Antigene werden auf 1 χ 10 cm DE-52 Cellulosesäulen chromatographiert. Die Antigene werden in der 0,15M NaCl/0,1 mM PMSF-Fraktion (pH-Wert 7,6) eluiert. Durch isoelektrische Konzentrierung (focusing) erhaltene Gele dienen zur Identifizierung und Reinigung der Antigene. Sie enthalten 4 % Acrylamid/8M Harnstoff/2 % Ampholine (pH-Wert 3,5 bis 10). Die Antigene mit pl-Werten von 6,3 bzw. 6,0 werden aus den Gelen ausgeschnitten. Auf SDS(Natriumdodecylsulfat)-Gelen zeigt es sich, daß jedes dieser Antigene einen Hauptfleck liefert.

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HeLa-Zellkerne oder -Nukleolen erhält man durch Sammeln von HeLa-Zellen aus Spinnerkultur-Flaschen (7 bis 8 1). Die Zellen sollten sein und waren in log-Phase 7 bis 8x10 Zellen/ml. Die Zellen werden 8 min lang zur Bildung von Zellplättchen mit 800 χ g zentrifugiert. Die Zellplättchen werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,2) durch mäßige Homogenisierung mit einem lockeren Pistill suspendiert und danach 8 min lang mit 800 χ g zentrifugiert. Danach werden die Zellen ein zweites Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, worauf die Zellplättchen gewogen werden. Nun werden die Zellplättchen unter schwachem Homogenisieren in 20 Volumina eines Reticulocytstandardpuffers eines pH-Werts von 7,4 suspendiert und 30 min lang auf Eis quellen gelassen. Nach 8-minütigem Zentrifugieren mit 1000 χ g werden die Zellen durch schwaches Homogenisieren in dem Reticulocytstandardpuffer (RSB) plus 1/20 Volumen des handelsüblichen Detergens Nonidet P40 (10 % in RSB) resuspendiert. Das Endvolumen Nonidet beträgt 0,5 %. Die Zellen werden mit einem handelsüblichen Homogenisator (Dounce Homogenizer 20-60 strokes) homogenisiert, bis sie brechen und die Kerne freigegeben und von Zytoplasma befreit werden. Danach werden die Zellen 8 min lang mit 1000 χ g zentrifugiert, durch schwaches Homogenisieren in 0,88 M Saccharose, 0,5 itiM Mg-Acetat (20 χ Gewicht-Volumen) homogenisiert und 20 min lang mit 1500 χ g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet enthält die HeLa-Kerne, die in der geschilderten Weise zur Gewinnung der Antigenextrakte herangezogen werden. Kerne aus anderen malignen Humanzellen erhält man in entsprechender Weise.

Zur Isolierung der Nukleolen wird das in der geschilderten Weise erhaltene Kernpellet durch schwaches Homogenisieren in 0,34 M Saccharose, 0,5 mM .Mg-Acetat unter Verwendung von 2 ml Saccharose pro Gramm der ursprünglichen Zellen suspendiert. Die Kerne werden dann unter Verwendung eines

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handelsüblichen Ultraschallgebers (Branson sonifier) mittels 10s dauerndem Entladungsstoß und 10s Ruhe beschallt (sonicate). Die Gesamtdauer beträgt 60 bis 110 s. Die freigesetzten Nukleolen werden mikroskopisch geprüft. Zum Sichtbarmachen der Nukleolen werden sie mit Azure C (in Form einer Lösung von 1 % Azure C in 0,25 M Saccharose) angefärbt. Das Präparat sollte nach beendeter Beschallung (sonication) kernfrei sein. Die beschallte Fraktion wird mit dem dreifachen Volumen 0,88 M Saccharose (ohne Mg-Acetat) unterlegt und 20 min lang mit 1500 χ g zentrifugiert. Das hierbei erhaltene Pellet enthält die HeLa-Nukleolen, die als das Immunogen verwendet werden können.

Nach dem geschilderten Verfahren (vgl. Busch und Smetana, 1970) läßt sich üblicherweise eine akzeptable Reinigung erreichen. Die Lichtmikroskopie zeigt, daß die Qualität der erhaltenen Präparate im wesentlichen genügt. Eine elektronenmikroskopische Analyse zeigt jedoch die Anwesenheit von Chromatin und Kernverunreinigungen. Das Schlüsselproblem im Hinblick auf eine angemessene Reinigung dieser Präparate ist die begrenzte Menge ursprünglicher HeLa-Zellen in den Kulturen, die die Anzahl der Rückreinigungsschritte begrenzt. Aus 5 bis 10 g HeLa-Zellpräparaten gewonnene Nukleolen liefern anders als bei der bisherigen Verwendung von 0,5 bis 1 g HeLa-Zellpräparaten ausreichend Material für eine angemessene Reinigung. Die Bedingungen für die Züchtung der HeLa-Zellen und die Isolierung von Plazentakernen sind im wesentlichen die gleichen wie bei dem bekannten Verfahren (vgl. Davis und Mitarbeiter 1979).

Den HeLa-Tris-Extrakt erhält man durch Suspendieren der He-La-Kerne in einem NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Puffer (10 χ Gewicht/Volumen, 1 g Kerne/10 ml Puffer; Puffer: 0,075 M NaCl, 0,025 M Na-Äthylendiamintetraessigsäure/pH-Wert 8, 1 mM PMSF). Das Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wird mit Isopropanol auf eine Konzentration von 100 mM eingestellt. Es wird jeder Lösung vor der Extraktion zugefügt.

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Die Suspension wird mit einem handelsüblichen Homogenisator (Dounce homogenizer 20 strokes) homogenisiert und 5 min lang mit 3000 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt. Die geschilderten Extraktionsmaßnahmen werden mit dem Kernpellet noch zweimal wiederholt. Der NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Extrakt wird bei den vorliegenden Antigenarbeiten nicht verwendet, folglich wird er verworfen. Das Kernpellet wird in 10 χ Gewicht/Volumen 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts-von 8 und in Anwesenheit von 1 mM PMSF suspendiert und mittels eines handelsüblichen Homogenisators (Dounce homogenizer for 20 strokes) homogenisiert. Es reicht allerdings auch ein 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7 bis 9. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und auf Eis aufbewahrt. Während der Tris-Extraktionen brechen die Kerne, wobei Chromatin freigesetzt wird. Das Brechen der Kerne wird mikroskopisch überwacht. Nun wird das Pellet in dem Tris-Puffer resuspendiert, worauf die Kerne 15 min lang auf Eis quellen gelassen werden. Danach erfolgt erneut eine Homogenisierung mittels des handelsüblichen Homogenisators (Dounce homogenizer for 20 strokes). Nach 10-minütigem Zentrifugieren mit 12000 χ g wird die überstehende Flüssigkeit abgegossen und aufbewahrt. Das Pellet wird resuspendiert. Es besitzt ein weißliches flaumiges Aussehen. Es erfolgt eine erneute Homogenisierung mittels des handelsüblichen Homogenisators. Danach wird 30 min lang mit 27000 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und mit den vorherigen überstehenden Anteilen der Tris-Extrakte vereinigt.

Die Tris-Extrakte werden dann mittels einer handelsüblichen Ultrafiltrations-Membran konzentriert. In der Regel beträgt das Volumen zu Beginn etwa 50 ml, nach der Konzentration 4 bis 5 ml. Die Endkonzentration an Protein beträgt etwa 4 bis 5 mg/ml. Mit diesem Tris-Extrakt kann das Kaninchen immunisiert werden.

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Mit Hilfe der geschilderten Maßnahmen können auch aus HeLa-Nukleolen und Kernen oder Nukleolen anderer maligner Humanzellen Extrakte bereitet werden.

Für das Tris-Immunogen werden mit 250 μΐ PBS eine 250 ul-Verdünnung des Tris-Extrakts (4 bis 5 mg/ml) hergestellt. Diese Verdünnung wird, wie für das Nukleolenimmunogen noch beschrieben werden wird, mit dem Freund¹sehen Hilfsmittel vereinigt.

Antikörper erhält man, wie folgt, durch Immunisierung von Kaninchen mit HeLa-Zellen-Nukleolen-Präparaten. Die HeLa-Nukleolen werden abgewogen (20 bis 30 mg Naßgewicht) und gleichmäßig in 0,5 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung eines pH-Wertes von 7,2 suspendiert. Danach werden sie mit 0,6 ml Freund¹sehen Kompletthilfsmittels gemischt. Zu diesem Zweck werden die suspendierten Nukleolen in eine 5 ml-Spritze aufgezogen, das Freund'sehe Hilfsmittel wird in eine zweite Spritze aufgezogen. An jede Spritze wird eine Nadel Nr. 18, von der die Spitze entfernt worden war, angebracht. Danach werden die Nadeln mit einem Stück Polyäthylenschlauch verbunden. Nun werden die Spritzeninhalte miteinander gemischt, bis das Präparat dick wird und es Schwierigkeiten bereitet, es durch den Schlauch zu treiben.

Nachdem das Versuchskaninchen auf dem Rücken rasiert worden war, erhält es an sechs Stellen intradermale Injektionen (0,1 ml/Stelle). Die restlichen 0,4 bis 0,5 ml werden halbsubkutan, d. h. unter die lose Haut an den Schultern, und halbintramuskulär in den Oberschenkelmuskel injiziert. Drei Wochen lang werden einmal pro Woche ähnliche Mengen an Nukleolen injiziert. Das erste Mal wird 7 bis 10 Tage nach der dritten Immunisierungswoche Blut abgezapft. Zum Sammeln des Blutes bedient man sich eines handelsüblichen Kaninchenohrbechers und einer Vakuumpumpe. Das Blut (etwa 45 bis 50 ml) wird 3 bis 4 h lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen. Nach Entfernen des Serumteils aus dem Rohr

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wird es 30 min lang bei 1000 χ g zentrifugiert (hierbei werden sämtliche freien roten Blutkörperchen wegsedimentiert). Das klare Serum wird gesammelt und dann absorbiert (oder bis zur Durchführung der Absorption gefroren gehalten). Der Blutpfropfen kann über Nacht im Kühlschrank gelagert werden. Hierbei werden einige weitere ml Serum freigegeben. Das Serum aus jeder Blutentnahme wird nun durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse auf die Anwesenheit von Nukleolenantikörpern hin untersucht.

Andere nichtmenschliche Wirte, z. B. Ziegen, Schafe, Pferde, Geflügel und dgl., können mit malignen Humanzellennukleolenpräparaten immunisiert werden, um die Bildung der erfindungsgemäßen Antiseren oder Antikörper gegen Nukleolenantigene zu provozieren. Antiseren erhält man auch durch Immunisierung nichtmenschlicher Wirttiere mit Extrakten, z. B. dem Tris-Extrakt, maligner Humanzellenkerne oder -nukleolen.

Die Absorption von Antinukleolärantiserum erfolgt derart, daß zunächst das Kaninchenantiserum mit 20 % Normalhumanserum und 20 % fötalem Kalbserum absorbiert wird. Zu diesem Zweck wird 20 %iges Normalhumanserum zu dem Kaninchenantiserum (4 ml/20 ml) zugegeben, worauf das Ganze 1 h lang in einem 3 7⁰C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Nach Herausnahme des Kolbens aus dem Wasserbad wird 20 %iges fötales Kalbserum (4,8 ml/24 ml) zugegeben, worauf erneut 1 h lang in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Danach wird der Kolben aus dem Wasserbad herausgenommen und 1 weitere h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der Kolbeninhalt alle 15 min durch schwachen Verquirlen durchgemischt wird. Danach wird der Kolbeninhalt 30 min lang mit 15000 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, d. h. das absorbierte Serum, wird entfernt und aufbewahrt. Unter Durchführung der im folgenden für die (NH₄)₂SO₄-Fällung des Serums beschriebenen Maßnahmen wird das absorbierte Serum in die Immunoglobulin (Ig)-Form umgewandelt.

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Das Immunoglobulinpräparat aus dem Nukleolenantiserum, das mit Normalhumanserum und fötalem Kalbserum absorbiert wurde, wird nun mit normalem Humangewebe, Plazenta oder Leber, absorbiert. Zu diesem Zweck wird das absorbierte Nukleolenimmunoglobulin (10 ml Ig plus 10 ml des beim Beschallen angefallenen Kernpräparats) mit einem gleichen Volumen von beim Beschallen angefallenem Plazentakernpräparat in PBS 7,2 (10 bis 15 mg Protein/ml) versetzt, worauf das Ganze 1 h lang in einem 37⁰C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Danach wird das Ganze eine weitere h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der KoI-beninhalt alle 15 min lang durch leichtes Durchquirlen gemischt wird. Schließlich wird der Kolbeninhalt 30 min lang bei 15000 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt, worauf das absorbierte Ig, wie beschrieben, mit (NH₄)₂ ^SO4 umgefällt wird. Dieses Ig kann als endgültiges Antikörperprodukt verwendet oder durch Diäthylaminoäthylcellulosechromatographie weiter gereinigt werden.

Das in der 0,01 M phosphatgepufferten Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,2 enthaltene Ig wird gegen 0,0175 M Phosphatpuffer eines pH-Werts von 6,3 (ohne physiologische Kochsalzlösung) dialysiert. Nach der Dialyse wird es 20 min lang mit 2500 χ g zentrifugiert. Nun wird die überstehende Flüssigkeit auf die Diäthylaminoäthylcellulosesäule gegossen (20 mg Protein pro g Cellulose). Das IgG wird aus der Säule mit dem 0,0175 M Phosphatpuffer eluiert. Nach dem Eluieren wird die IgG-Fraktion gegen die 0,01 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,2 dialysiert.

Dieselben Maßnahmen werden mit dem Kontrollserum durchgeführt. Das Kontrollserum besteht aus Präimmunserum, das aus dem Kaninchen oder einem sonstigen nichtmenschlichen Wirttier abgenommenen Blut vor Beginn der Immunisierung gewonnen wurde.

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■Χι-

Kanincheniimnunoglobulin Ig erhält man wie folgt: eine kalte gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung (760 g/l) wird unter Rühren im gleichen Volumen zu dem Antiserum zutropfen gelassen. Der hierbei ausfallende Niederschlag wird zum Zusammenballen 1,5 bis 2 h lang mittels eines Magnetrührers in der Kälte gerührt. Danach wird das ausgefallene Antiserum 20 min lang mit 3000 χ g zentrifugiert. Nach Entfernen der überstehenden Flüssigkeit wird das Pellet im etwa halben Volumen (des ursprünglichen Serums) PBS eines pH-Werts von 7,2 resuspendiert. Das löslichgemachte Pellet wird in einen Dialysebeutel gefüllt und über Nacht in der Kälte unter Rühren mit einem Magnetrührer gegen 100 Volumina PBS dialysiert. Am folgenden Morgen wird der Dialysebeutel in frisches PBS (100-faches Volumen) gelegt und die Dialyse 6 h lang fortgesetzt. Hierauf wird das Immunoglobulin sorgfältig aus dem Dialysebeutel entfernt und 20 min lang mit 2 500 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt.

Die Immunofluoreszenzanalyse wird gemäß dem von Busch und Mitarbeitern 1974 und Hilgers und Mitarbeitern 1972 beschriebenen Verfahren wie folgt durchgeführt: 150 μΐ Antinukleolenantiserum, das auf 1:50 verdünnt worden war, werden auf acetonfixierte HeLa-Zellen oder fixierte Gewebeproben (vgl. Hilgers und Mitarbeiter 1972 und Busch und Mitarbeiter 1974) aufgebracht. Wenn die Gewebeprobe einen großen Abschnitt des Objektträgers bedeckt, kann es erforderlich sein, mehr als 150 μΐ zu verwenden. Die Verdünnung des Antiserums (As) hängt vom Antikörper (Ab)-Titer ab. Weitere Verdünnungen können bis zu dem Punkt, an welchem As- und Ab-Verdünnungen zu stark verdünnt werden, um ein positives Ansprechen auf bekannte positive Zellen (beispielsweise HeLa-Zellen) feststellen zu können, verwendet werden. Die Objektträger werden in einer feuchten Kammer 4 5 bis 50 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Die feuchte Kammer kann aus einer großen Petrischale, in die ein feuchtes Papiertuch eingebracht wurde, bestehen. Nach der Inkubation wird

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das Antiserum durch vorsichtige Zugabe von PBS vom Objektträger abgewaschen. Danach werden die Objektträger in einen Objektträgerhalter gestellt und 1 h lang in PBS gewaschen. Das PBS wird dreimal, nämlich nach 15, 30 bzw. 45 min gewechselt. Hierauf werden die Objektträger aus dem PBS herausgenommen und zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen in destilliertes oder entionisiertes Wasser getaucht. Danach werden die Objektträger mittels eines Gebläses oder Haartrockners 2 bis 3 min lang mit kalter Luft getrocknet, wobei darauf geachtet wird, daß keine Übertrocknung stattfindet. Nun werden auf die Objektträger 150 μΐ von mit Fluoreszein markiertem Ziegenantikaninchenantiserum (Hyland oder Cappel), das auf 1:10 verdünnt worden war, aufgebracht, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 30 bis 35 min in der feuchten Kammer inkubiert wird. Durch vorsichtiges Waschen mit PBS wird auch der zweite Antikörper vom Objektträger entfernt, worauf die Objektträger 1 h lang mit PBS gewaschen werden. Die Waschflüssigkeit wird hierbei nach 15, 30 bzw. 45 min gewechselt. Andererseits können die Objektträger nach 15-minütigem Waschen in frisches PBS gelegt und darin über Nacht im Kühlschrank belassen werden. Nach der letzten Wäsche mit PBS werden die Objektträger zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen in entionisiertes oder destilliertes Wasser getaucht. Schließlich werden sie mit Kaltluft 2 bis 3 min lang mit Hilfe eines Gebläses oder Haartrockners getrocknet. Nun werden auf die Zellen oder die Gewebeprobe eine 1:1-Lösung von Glycerin und PBS aufgebracht und die Objekte mit einem Deckglas bedeckt. Wenn das Deckglas mit Hilfe eines Dichtungsmittels, z. B. klarem Nagellack, mit dem Objektträger verbunden und das Ganze kühl gelagert wird, kann das Präparat mehrere Monate lang aufgewahrt werden. Schließlich wird das Präparat mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Bei dem Präimmunimmunoglobulin oder bei Präimmun-IgG-Fraktionen ist keine Nukleolenfluoreszenz feststellbar.

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-is-

Die anderen immunologischen Techniken entsprechen den von Kendali 1938, Lowry und Mitarbeitern 1951, Dale und Latner 1969, Laurell 1972, Wallace und Mitarbeitern 1974 und Marashi und Mitarbeitern 1979 beschriebenen Techniken. Zur Analyse der Nukleolen-Immunofluoreszenzlokalisierung werden Präparate während der Fluoreszenzbeobachtung in Phasenkontrastbeleuchtung ein- und ausgeschaltet.

Anstelle des mit Fluoreszein markierten Ziegenantikaninchenantiserums kann man sich auch der Immunoperoxidasemethode bedienen. So werden beispielsweise 150 μΐ von mit Peroxidase markiertem Ziegenantikaninchenantiserum, das auf 1:10 oder 1:20 verdünnt worden war, zugegeben. Die lokalisierte Peroxidaseaktivität läßt sich mit Hilfe einer Reihe von Redoxfarbstoffsystemen zur licht- oder elektronenmikroskopischen Prüfung nachweisen. Als Markierungen für eine indirekte Methode können auch andere Enzyme herangezogen werden. Ferner können Peroxidase und andere Enzyme bei einem direkten Verfahren eingesetzt werden, indem der primäre Antikörper markiert wird. Die Herstellung des Karnofsky¹sehen Inkubationsmediums geschieht wie folgt: nach dem Abwiegen wird eine genügende Menge Diaminobenzidin in 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6 suspendiert, um die Konzentration auf 0,5 mg/ml einzustellen. Danach wird in dem 0,05 M Tris-HCl-Puffer eine 0,02 %ige Wasserstoffperoxidlösung zubereitet. Die 0,5 mg/ml enthaltende Diaminobenzidinsuspension und die 0,02 %ige H-CU-Lösung werden in Verhältnis 1:1 gemischt. Diese Mischung wird bei Gebrauch jeweils frisch zubereitet und während ihrer Zubereitung kühl gehalten. 200 bis 300 μΐ des erhaltenen Gemischs werden auf den Objektträger aufgebracht, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 30 min lang in einer feuchten Kammer inkubiert wird.

Nach der Inkubation wird das ■Diaminobenzidin/H₂0₂-Gemisch vom Objektträger mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts

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von 7,6, dem 0,1 M NaCl zugefügt worden war, abgewaschen. Die Objektträger werden 10 min lang in 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6, der 0,1 M an NaCl war, gewaschen. Die Endbehandlung der Objektträger erfolgt wie in Stufen 11 bis 14 (wobei jedoch anstelle des PBS Tris-HCl verwendet wird). Die fertigen Präparate werden unter einem Lichtmikroskop untersucht.

Objektträger mit HeLa-Zellen zur Immunofluoreszenzanalyse werden wie folgt hergestellt: durch Entfernen und Waschen aktiv wachsender Zellen aus der HeLa-Kulturflasche mit PBS eines pH-Werts von 7,2 wird ein Vorrat an fixierten HeLa-Zellen gewonnen. Die Zellen werden derart suspendiert, daß die Konzentration mindestens 1,5 χ 10 Zellen/ml beträgt. 1 Tropfen der HeLa-Zellensuspension wird auf jeden gewaschenen Objektträger (mit einem Detergens gesäubert, mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen, mit Alkohol gesäubert, gespült und mit Heißluft aus einem Haartrockner getrocknet) aufgebracht, sich etwas ausbreiten gelassen und dann bei Raumtemperatur oder in der Kälte über Nacht trocknen gelassen. Die getrockneten Zellen werden fixiert, indem die Objektträger 12 min bei einer Temperatur von 4⁰C in Aceton gelegt werden. Danach werden die Objektträger mit einem Glasmarkierungsstift mit Diamantspitze numeriert. Die Objektträger dienen als positive Vergleichsproben für die Immunofluoreszenzanalyse.

Die Untersuchungen haben gezeigt, daß in Tumorzellen, nicht dagegen in tumorfreien Geweben, nukleoläre Antigene bzw. Nukleolenantigene enthalten sind. Voruntersuchungen zeigten, daß sowohl in Zellkulturen, in menschlichen Tumoren und in Autopsie- oder Biopsieproben nach der Doppelantikörpermethode (indirekte Immunofluoreszenz) eine helle Nukleolenfluoreszenz auftritt. Ein entsprechendes Ergebnis erreicht man nicht bei einer Reihe von tumorfreien Geweben (vgl. Davis und Mitarbeiter 1979). Bei späteren Untersuchungen wurden mehr als 60 maligne Tumore untersucht und die verschiedensten Gewebevergleichsproben beurteilt. Es ist von großem Interesse, daß die verschiedensten malig-

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nen Tumore ektodermalen, endodermalen oder mesodermalen Ursprungs ein oder mehrere gemeinsames (gemeinsame) Nukleolenantigen(e) enthalten (Tabelle I).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Normale Gewebe: Bei 17 tumorfreien Geweben ist nach der Inkubation der Antiseren oder Antikörper mit den verschiedensten fixierten Zellpräparaten keine Nukleolenfluoreszenz feststellbar. Es ist von besonderem Interesse, daß wede;r die Malpigische Hautschicht noch die Zellen des Knochenmarks noch die Lieberkühn'sehen Krypten bei diesen Maßnahmen eine positive Immunofluoreszenz zeigen. Darüber hinaus sind die verschiedensten Neoplasmen benachbarte tumorfreie Gewebe ebenfalls negativ. Hierbei wurden die verschiedensten Gewebearten untersucht. Es wurde eine Gruppe benigner Tumore einschließlich verschiedener Arten von Schilddrüsenadenomen untersucht. Hierbei wurden ebenfalls negative Ergebnisse erzielt (vgl. Tabelle II).

Beispiel 2

Entzündliche Verletzungen bzw. Läsionen: Um sicherzustellen, ob ein entzündliches Ansprechen zum Auftreten dieser Antigene in Beziehung steht, wurden 8 Arten entzündlicher Gewebe untersucht. Bei den meisten dieser Gewebe war keine Fluoreszenz in den Nukleolen der untersuchten Zellen feststellbar. Es fanden sich jedoch Abschnitte in Proben ulzerativer Colitis und von Magengeschwüren, die eine positive Nukleolenfluoreszenz zeigten. Zwei oder drei Schnitte der ulzerativen Colitis waren negativ, einer zeigte eine definitive positive Nukleolenfluoreszenz. Bei den Magenge-

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schwüren zeigte einer der beiden analysierten Schnitte eine positive Nukleolenfluoreszenz. Diese Ergebnisse sind insbesondere im Hinblick auf die bekannte Neigung dieser Läsionen, eine maligne Änderung zu erfahren, von Interesse. Von speziellem Interesse war es auch, sowohl die positiven als auch negativen Herdbereiche dieser Präparate in den hämatoxylineosingefärbten Schnitten zu untersuchen. Diese zeigten in der Tat Bereiche in diesen Läsionen, die nicht nur mitotische Erscheinungen sondern auch eine Anhäufung der Epithelialauskleidung (lining) aufweisen. Somit ist es naheliegend, daß diese Zellen präneoplastische Läsionen oder ein Karzinom in situ darstellen. Es ist möglich, daß das Auffinden dieser fluoreszierenden Bereiche eine Entscheidungshilfe bezüglich einer entweder lokalen oder mehr generalisierten chirurgischen Resektion der betroffenen Läsionen bietet.

Beispiel 3

Artifakten: Im Magenepithel gibt es in jeder Zelle einen Fluoreszenzbereich, der nichtnukleolär ist. Offensichtlich handelt es sich hierbei um eine nichtspezifische Lokalisierung des fluoreszierenden Antikörpers. In einer Krypte des Dünndarms tritt offensichtlich eine nichtspezifische Lokalisierung des Antikörpers in Form von Aggregaten auf. In den meisten Fällen lassen sich diese Aggregate durch Vorfiltrieren der Antikörper durch ein 0,4 5 μπι Filter beseitigen. In einer Probe Brustgewebe, die bezüglicher einer Nukleolenfluoreszenz negativ war, waren kleine nichtspezifische immunofluoreszierende Flekken ohne spezielle Lokalisierungsmerkmale bezüglich der Zellmorphologie allgemein verteilt. Die Durchmesser dieser sehr kleinen nichtspezifischen Ausfällungen betragen 0,5 bis 0,1 um im Vergleich zu den Nukleolen-Durchmessern in den Kernen und Nukleolen, die 4 bis 6 \xm betragen.

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Beispiel 4

Fluoreszenz während der Phasen des Zellzyklus: Die Nukleolenfluoreszenz war in den Interphasennukleolen ohne weiteres sichtbar. In der Metaphase war die Nukleolenfluoreszenz nicht als abgegrenzte Einheit sondern zwischen den Chromosomen und in dem angrenzenden Bereich zwischen dem Kern und dem Cytoplasma sichtbar. Insoweit die Nukleo-Ie während der Metaphase im wesentlichen verschwindet und die rRNS-Synthese in der späten Prophase aufhört, war es nicht überraschend, daß die Nukleolenfluoreszenz in solchen Zellen nicht als abgegrenzte Einheit sichtbar war (Tan und Lerner 1972). Die Erkenntnis, daß Reste der immunofluoreszierenden Produkte die gesamte Mitose überdauern, legt jedoch die Vermutung nahe, daß die nukleolären Substrukturen anders als die nukleolären Produkte die Antigene, die epigenetisch "überleben" enthalten.

Beispiel 5

Negative Ergebnisse bei malignen Tumoren: In der Reihe maligner Tumore haben sich bei den Objektpräparaten negative Bereiche verschiedener Ausmaße gezeigt. In der Regel stimmten diese mit entweder nekrotischen oder abgeeiterten Teilen des Neoplasmas überein. Bei einer Gehirntumorprobe war die Masse, die keine positive Fluoreszenz aufwies, nekrotisch. Es waren zahlreichen Leukozyten vorhanden, eine abgegrenzte Struktur fehlte jedoch. Ein Adenokarzinom, das Metastasen ins Gehirn ausgesandt hatte, zeigte keine positive Fluoreszenz, die Gründe hierfür konnten nicht geklärt werden. Da jedoch von 63 untersuchten Tumoren 61 eine positive Nukleolenfluoreszenz zeigten, waren 97 % der Reihenuntersuchung positiv. Diese Untersuchungen sind nun auf über 300 menschliche Krebsarten einschließlich einer Reihe von Krebsarten der Brust, Prostata und Lunge sowie hämatologischen Tumoren, mit ähnlichen Er-

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gebnissen ausgedehnt.

Beispiel 6

Markierung: Direkte immunochemische Methoden zur Sichtbarmachung der Antikörper umfassen eine Markierung des primären Antikörpers mit mindestens einer der folgenden Markierungen: Radioisotope zur Autoradiographie, wie I·,· I,

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C oder H, fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoreszein

oder Tetramethylrhodamin zur Fluoreszenzmikroskopie, Enzyme, die fluoreszierende oder farbige Produkte zum Nachweis durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie liefern oder die elektronendichte Produkte zum Nachweis durch Elektronenmikroskopie bilden oder elektronendichte Moleküle, wie Ferritin, zur direkten elektronenmikroskopischen Sichtbarmachung.

Indirekte immunochemische Methoden umfassen eine Markierung des zweiten Antikörpers oder eines sonstigen Bindeproteins, das für den ersten Antikörper spezifisch ist, mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einer elektronendichten Verbindung, einem Enzym, das ein durch licht-, fluoreszenz- oder elektronenmikroskopische Analyse nachweisbares Produkt liefert oder ein durch Autoradiographie bestimmbares Radioisotop.

Indirekte immunochemische Methoden zum Sichtbarmachen der Antikörper beinhalten eine Anwendung primärer oder sekundärer Hybridantikörper oder Antikörperfragmente (F(ab¹) ^) , wobei ein Teil der Hybridantikörperzubereitung für die Nukleolenantigene (hybrider primärer Antikörper) oder für den primären Antikörper (hybrider zweiter Antikörper) und ein (anderer) Teil für eine Markierung der genannten Art spezifisch ist.

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Markierte konjugierte und nichtkonjugierte Antikörper können getrennt in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung oder in sonstigen gepufferten Suspendiermitteln zum Vertrieb als Diagnoseeinheit untergebracht sein. Geeignete Suspendiermittel sind Glycerin, Heparin oder Saccharose. Geeignete Puffer sind Barbitalpuffer, Morpholinpuffer, MOPS-3-(N-morpholino)propansulfonsäure, Hepes-N-2-hydroxyäthylpiperazin-N-2-äthansulfonsäure, tris-Carbonat und dgl.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zum immunologischen Nachweis von Krebs in

menschlichen Gewebeschnitten, Abstrichen und abblätternden zytologischen Präparaten unter Verwendung von Antikörpern, deren Bildung von Nukleolen maligner Humajizellen oder von Extrakten von Kernen oder Nukleolen solcher Zellen ausgelöst ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Untersuchungsmaterial mit den Antikörpern in Berührung bringt und die Lokalisierung dieser Antikörper in den Nukleolen maligner Zellen, nicht dagegen normaler Zellen, aufzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch aus malignen Humanzellen in Form von HeLa-Zellen, Karzinomen, Sarkomen und hämatologischen Neoplasmen isolierte Nukleolen ausgelöst wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch aus HeLa-Zellen oder menschlichen Prostatakarzinomzellen isolierte Nukleolen ausgelöst wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch Extrakte von Kernen oder Nukleolen maligner Humanzellen in Form von HeLa-Zellen, Karzinomen, Sarkomen und hämatologischen Neoplasmen ausgelöst wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch Extrakte von Kernen oder Nukleolen von HeLa-Zellen oder mensch-

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lichen Prostatakarzinomzellen ausgelöst wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch Extrakte von Kernen oder Nukleolen maligner Humanzellen, welche bei der Extraktion mittels eines 0,01 M Tris-HCl-Puffers bei einem pH-Wert von 7 bis 9 angefallen sind, ausgelöst wurde.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, deren Bildung durch Extrakte von Kernen oder Nukleolen aus HeLa-Zellen oder Humanprostatakarzinom, welche bei der Extraktion mittels eines 0,01 M Tris-HCl-Puffers bei einem pH-Wert von 7 bis 9 angefallen sind, ausgelöst wurde.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antikörperlokalisierung durch direkte oder indirekte immunochemische Maßnahmen aufzeigt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man (beim immunologischen Krebsnachweis mittels Antikörpern) die primären Antikörper mit einem durch Autoradiographie nachweisbaren Radioisotop, einem durch Fluoreszenzmikroskopie nachweisbaren fluoreszierenden Farbstoff, einem Enzym, das ein durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie nachweisbares fluoreszierendes oder farbiges Produkt liefert, einem Enzym, das ein durch Elektronenmikroskopie nachweisbares elektronendichtes Produkt liefert und/oder einem durch direkte Sichtbarmachung auf elektronenmikroskopischem Wege nachweisbares, elektronendichtes Molekül markiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
det.

man als Radioisotop I, I, C und/oder H verwen-

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11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszierenden Farbstoff Fluoreszein und/oder Tetramethylrhodamin verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie nachweisbares, fluoreszierendes oder farbiges Produkt lieferndes Enzym Peroxidase, ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Cytochrom C verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als durch direkte Sichtbarmachung auf elektronenmikroskopischem Wege nachweisbares elektronendichtes Molekül Ferritin, Hämocyanin, Virusteilchen oder Latexkügelchen verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den immunologischen Nachweis von Krebs durch indirekte immunochemische Darstellung der Antikörper führt, wobei man markierte zweite Antikörper und/oder sonstige für die primären Antikörper oder deren Modifikationen spezifische Bindeproteine mitverwendet.

15. Verfahrer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungsmittel einen fluoreszierenden Farbstoff, eine elektronendichte Verbindung, ein Enzym, das ein durch licht-, fluoreszenz- oder elektronenmikroskopische Prüfung nachweisbares Produkt liefert, und/oder ein durch Autoradiographie nachweisbares Radioisotop verwendet.

16. Indirektes immunochemisches Verfahren zur Sichtbarmachung der Antikörper von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man primäre oder sekundäre Antikörper und/oder Antikörperbruchstücke (F (ab¹ J₂). zum Einsatz bringt, wobei ein Teil des Hybridantikörperpräparats für die nukleolären Antigene (hybrider primärer Antikörper) oder für den primären Antikörper (hybrider sekundärer Antikörper)

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und ein Teil für ein Markierungsmittel in Form einer elektronendichten Verbindung zum elektronenmikroskopischen Nachweis, eines Enzyms, welches ein durch Licht-, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie nachweisbare Produkte liefert, oder eines zur Autoradiographie markierten Radioisotops spezifisch sind.

17. Verfahren zum immunologischen Nachweis von Krebs in menschlichen Gewebeschnitten, Abstrichen und abblätternden zytologischen Präparaten unter Verwendung von Antikörpern, deren Bildung von Nukleolen maligner Humanzellen oder von Extrakten von Kernen oder Nukleolen solcher Zellen ausgelöst ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Untersuchungsmaterial mit dem modifizierten Antikörpern oder Antikörperbruchstücken in Berührung bringt und die Lokalisierung der modifizierten Antikörper oder Antikörperbruchstücke lediglich in den Nukleolen der malignen Humanzellen, jedoch nicht in den Nukleolen normaler Zellen, mittels direkter und/oder indirekter immunochemischer Maßnahmen durch Licht-, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie oder Autoradiographie aufzeigt.

18. Mit menschlichen Krebszellen vergesellschaftete Antigene mit Hauptarten und Unterarten, dadurch gekennzeichnet, daß die Hauptarten folgende Eigenschaften aufweisen:

a) einen pl-Wert bei isoelektrischer Konzentration

(focussing) von etwa 6,0 bis 6,7;

b) ein Molekulargewicht von etwa 50000 bis etwa 60000 Dalton;

c) Löslichkeit in 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8 und

d) vornehmliche Lokalisierung in den Nukleolen.

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19. Hauptantigenart nach Anspruch 18 in praktisch reiner Form.

20. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen gefundene Antigene spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet, daß man (Nicht-Human-)Wirtsäugetiere mit den Antigenen nach Anspruch 18 immunisiert und aus den immunisierten Säugetieren die Antikörper erntet.

21. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in Nukleolen von menschlichen Krebszellen gefundene Antigene spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet, daß man (Nicht-Human-)Wirtsäugetiere mit den Antigenen nach Anspruch 26 immunisiert und die Antikörper der immunisierten Säugetiere erntet.

22. Verfahren zur Gewinnung und Isolierung nukleolärer Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antigene mit 0,01 μ Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7 bis 9 aus Kernen oder Nukleolen menschlicher Krebszellen extrahiert.

23. Kernpräparat in Form von Tris-HCl-Pufferextrakten von Kernen oder Nukleolen aus menschlichen Krebszellen.

24. Verfahren zum Reinigen nukleolärer Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß man sie nach und nach durch Ammoniumsulfatfällung, DEAE-Säulenchromatographie, Sephadexgelabtrennung, Kationenaustausch und Calciumphosphatgelchromatographie sowie präparative isoelektrisch* Konzentration (focussing) reinigt.

25. Verfahren zum Reinigen von aus (Nichthuman)-Wirtsäugetieren, bei denen eine Immunisierung mit nukleolären Antigenen erfolgte, geernteten Antikörpern.

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26. Diagnosemittel, dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper, die für in menschlichen Krebszellen gefundene nukleoläre Antigene spezifisch sind und eine durch Licht-, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie, durch indirekte Testverfahren oder durch Autoradiographie nachweisbare Markierung aufweisen, in einem gepufferten Suspendiermittel oder in Lösung enthält.

27. Diagnosemittel, enthaltend nicht-markierte primäre Antikörper, die für in malignen menschlichen Krebszellen gefundene nukleoläre Antigene spezifisch sind, in einem gepufferten Suspendiermittel oder in Lösung sowie geeianet markierte oder nicht-markierte Reagenzien zum Nachweis der primären Antikörper in fixierten malignen menschlichen Zellen mittels Licht-, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie oder Autoradiographie.

28. Mit menschlichen Krebszellen vergesellschaftete Antigene nach Anspruch 18, hergestellt nach dem Verfahren des Anspruchs 22.

29. Hauptantigenart nach Anspruch 19, hergestellte nach dem Verfahren des Anspruchs 24.

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