CH679246A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon, gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1, ein Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines RNA-Proteolipidkomplexes, ein Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein von humanen malignen Zellen gebildetes RNA-Proteolipid und/oder gegen eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon, ein Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines monoklonalen Antikörpers, ein Verfahren zur Gewinnung von einer zu von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipid komplementären Desoxyribonucleinsäure (cDNA), ein Verfahren zur Herstellung einer einsträngigen cDNA, sowie die nach diesen Verfahren gewonnenen Substanzen und Verwendungen davon. 



  Ein Verfahren gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1 zur Gewinnung des RNA-Proteolipids und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon aus Seren von Patienten mit neoplastischen Erkrankungen und aus Zellkulturüberständen maligner Zellinien wurde von A. Wieczorek, C. Rhyner und L. Block in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:3455-3459 (5/1985) und von A. Wieczorek, V. Sitaramam, W. Machleidt, K. Rhyner, A. Perruchoud und L. Block in Cancer Research 47:6407-6412 (1 Dec. 1987) veröffentlicht. 



  Ein gereinigter polyklonaler Antikörper gegen das genannte RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon und dessen Gewinnung auf an sich bekannte Weise sind in diesen Veröffentlichungen erwähnt worden. 



  Generell ist die Technik zur Gewinnung grosser Mengen eines monoklonalen Antikörpers bekannt, doch ist ein als Mit tel zum Nachweis von humanen malignen Zellen oder zur Herstellung von solchen Mitteln brauchbarer monoklonaler Antikörper gegen das genannte RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon noch nicht bekannt. 



  Aufgabe der Erfindung ist es, mit Hilfe des genannten RNA-Proteolipids, einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon, eines Antikörpers dagegen, deren markierten Derivate oder einer dazu komplementären cDNA Mittel bereitzustellen, die in grossem Umfang für diagnostische Zwecke einsetzbar sind und insbesondere einen brauchbaren Test zur Diagnose von Krebs ermöglichen. 



  Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch die Bereitstellung von gereinigtem, von Zellen von Human-Neoplasien oder deren Abkömmlingen gebildetem RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon. Eine Körperflüssigkeit von neoplastisch erkrankten Patienten, vorzugsweise Blutserum, Pleura- oder Peritonealflüssigkeit, oder ein Extrakt von kultivierten humanen malignen Zellen epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs, oder noch ein Überstand einer Kultur solcher Zellen, wird dabei mindestens einer Kaliumbromid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzogen.

  Aus der zentrifugierten Flüssigkeit entnimmt man den Dichtebereich bei ca. 1,080, der an der Grenze zwischen den Dichtebereichen für  alpha -Lipoproteine (HDL) und für  beta -Lipoproteine (LDL) liegt und unterhalb 11 DEG C als opaleszente Bande erkennbar ist, um eine das RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon enthaltende Suspension zu gewinnen. Im Falle der Verwendung von Körperflüssigkeit verwendet man erfindungsgemäss diejenige von solchen Patienten, deren Serum kein immunochemisch nachweisbares Lipoprotein a enthält, und man unterzieht erfindungsgemäss die gewonnene Suspension einer Dekontamination durch Säulenchromatographie über Agarose, um sie von  alpha -Lipoproteinen (HDL) zu befreien.

  Vorzugsweise reinigt man die dekontaminierte Suspension weiter, in dem man sie über eine Affinitätssäule führt, die durch Kopplung von anti-Humanserumglobulinen an mit Cyanogenbromid aktivierter Agarose bereitgestellt worden ist, mit dem Zweck, weitere Anteile zumindest von Lipoproteinen und Serumalbuminen daraus zu beseitigen. Das RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon sind erfindungsgemäss verwendbar als Mittel oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon. 



  Man kann auch ein markiertes Derivat des RNA-Proteolipids und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon bereitstellen, indem man das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon kovalent an einen Liganden bindet. Vorzugsweise ist der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung. Das markierte Derivat ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon. 



  In einer weiteren Alternative wird die Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein von Zellen von Human-Neoplasien oder deren Abkömmlingen gebildetes RNA-Proteolipid und/oder gegen immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktionen davon. Erfindungsgemäss verwendet man dabei Klone von solchen Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon, und keinen mit Normalserum reagierenden Antikörper produzieren, wobei man die Hybridomzellen in vivo vermehren lassen kann. Der monoklonale Antikörper ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen  Peptidfraktion davon. 



  Man kann auch ein markiertes Derivat des monoklonalen Antikörpers bereitstellen, indem man diesen kovalent an einen Liganden bindet. Vorzugsweise ist der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung. Das markierte Derivat ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon. 



   In einer weiteren Alternative wird die Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung von einem von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipid komplementärer Desoxyribonucleinsäure (cDNA). Diese cDNA wird erfindungsgemäss gewonnen, indem man solche cDNA bildet, die der RNA aus dem RNA-Proteolipid komplementär ist, diese cDNA in einen Bakteriophagen bringt, Escherichia coli mit dem Bakteriophagen transformiert, die cDNA kloniert und isoliert. Vorzugsweise wandelt man diese cDNA in einsträngige cDNA um. Diese einsträngige cDNA ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon. 



  Das genannte RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon stellen einen makromolekularen Komplex dar, der zusammengesetzt ist aus hochmolekularer Ribonukleinsäure, Cholesterin, Phospholipiden, lipidgebundenen Zuckern und lipophilen Oligopeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 2200. Zur Vereinfachung der Beschreibung wird dieser Komplex, d.h. insbesondere das RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon, im nachfolgenden unter der Bezeichnung "RNA-Proteolipidkomplex" subsummiert. 



  Es wird angenommen, dass der Ursprung des RNA-Proteolipidkomplexes bei den malignen Zellen liegt. Dies ist begründet durch Versuche mit in vitro etablierten malignen Zel len, die das Proteolipid in den Kulturüberstand sezernieren. Experimentelle Untersuchungen an nackten Mäusen, denen verschiedene menschliche Tumoren als Xenografts implantiert wurden, haben gezeigt, dass der RNA-Proteolipidkomplex schon bei sehr kleinen Tumoren im Serum nachzuweisen ist. Die Bildung des RNA-Proteolipidkomplexes scheint hauptsächlich von der malignen Transformation der Zellen abhängig zu sein, da der RNA-Proteolipidkomplex bei Tieren mit normalen menschlichen Implantaten wie z.B. fetalen Lungenfragmenten nicht nachweisbar ist, obwohl diese Transplantate in den Empfängertieren wachsen. 



  Bei Tumorpatienten nimmt die Konzentration des RNA-Proteolipidkomplexes im Serum mit dem Wachstum des Tumors zu. Nach chirurgischer Entfernung des Tumors geht die Konzentration des RNA-Proteolipidkomplexes mit einer Halbwertszeit von zwei Tagen auf nicht messbare Werte zurück. Bestrahlung oder Chemotherapie führen ebenfalls zu einer mit der Abnahme der Tumormasse einhergehenden Reduktion des RNA-Proteolipidkomplexes. Bei Auftreten von Rezidiven nach zunächst erfolgreicher Therapie kommt es zu einem Wiederanstieg des RNA-Proteolipidkomplexes im Serum. Demnach ist der RNA-Proteolipidkomplex als Verlaufsparameter für maligne Tumoren geeignet. Zusätzlich scheint der RNA-Proteolipidkomplex auch als Klinikparameter für maligne Erkrankungen verwendbar zu sein. Er zeigt eine hohe Sensitivität.

  Von 96 Fällen mit malignen Erkrankungen wurden 94 durch einfache Ultrazentrifugation des Patientenserums über den Kaliumbromid-Dichtegradienten als positiv befunden. Schon so zeigte sich also eine hohe Spezifizität. In 58 Fällen von nicht neoplastischen Erkrankungen und auch bei 46 gesunden Probanden konnte kein RNA-Proteolipidkomplex nachgewiesen werden. 



  In einem Blindtest wurde bei 102 Patienten mittels Auftrennung des Patientenserums durch Natriumdodecylsulfat-Gelchromatographie (Natriumdodecylsulfat = SDS) an Polyacrylamidgelen mit anschliessendem Elektro-Blot auf Nitrozellulose und dem erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper nach dem  RNA-Proteolipidkomplex gesucht. Unter den 102 Patientenseren befanden sich 30 Malignompatienten und 72 Patienten ohne maligne Erkrankung. Die Malignompatienten umfassten das ganze Spektrum maligner Erkrankungen, von der akuten Leukämie über maligne Lymphome bis zu allen Arten von soliden Tumoren wie Bronchuskarzinome, Mammakarzinome, Teratokarzinome, Hypernephrome oder Prostatakarzinom. 28 der 32 Malignome wurde mittels des Tests erkannt, was eine Sensitivität von 93% ergibt. Korrekt negativ waren 68 Patienten, was einer Spezifizität von 97% gleichkommt. 



  Mit Elektro-Blot und Sandwich-ELISA parallel geführte Tests ergaben bei über 100 Patienten eine Übereinstimmung von ca. 90%. 



  Im nachfolgenden wird die Erfindung anhand von Durchführungsbeispielen für die verschiedenen Verfahrensschritte näher erläutert. 


 Isolierung des RNA-Proteolipidkomplexes 
 



  Der RNA-Proteolipidkomplex kann auf bekannte Weise (vgl. Wieczorek et al., 1985, loc. cit.) aus dem Blutserum von Patienten mit neoplastischen Erkrankungen gewonnen werden. Es sollen aber nur Seren verwendet werden, die kein Lipoprotein a enthalten. Dieses kann mittels eines von der Firma Pharmacia vertriebenen immunchemischen Tests nachgewiesen werden. 



  Der RNA-Proteolipidkomplex kann auch aus Überständen etablierter, maligner Zellinien gewonnen werden. Es wurden von malignen humanen Zellen konditionierte Kulturmedien untersucht. Die aus menschlichen Tumoren angezüchteten und als permanente Linien etablierten Zellen wurden von Flow (Glasgow), Gibco (Bethesda) und Seromed (München) beschafft: HEp-2, Larynxkarzinom; KB, Mundbodenkarzinom; EB-2, Burkitt-Lymphom; HeLa, Zervixkarzinom; Jlll, Monozytenleukämie, Ht-1080, Fibrosarkom; RD, Rhabdomyosarkom; ohne Code, malignes Melanom der Haut. Als Kontrollen wurden verwendet: Hautfibroblasten zweier gesunder Erwachsener, Lymphozyten und Monozyten eines gesunden Erwachsenen sowie fetale menschliche Lungenzellen und Leberzellen von Flow (Glasgow). 



  Die im Monolayer wachsenden Zellen (HEp-2, KB, HeLa, HT-1080, RD, malignes Melanom, Hautfibroblasten, fetale Lungen- und Leberzellen) wurden im Eagle's Minimal Essential Medium, angereichert mit 1% nicht-essentieller Aminosäuren und 10%igem fetalem Rinderserum (Gibco) inkubiert. Einzelne Versuche wurden im serumfreien Medium von Neuman und Tytell (Gibco) mit und ohne Zusatz von LDL und HDL (100  mu g/ml) durchgeführt, um den Einfluss von Lipoproteinen auf die Zusammensetzung des RNA-Proteolipidkomplexes zu prüfen. 



  In konfluenten Monolayer (3. Tag nach dem Aussäen, 75 cm) wurden die Zellen mit 10 ml Medium 6, 12 und 24 h versetzt. Danach wurde der Überstand der Zellkultur abgesaugt und über Filter (Amicon XM50) 3fach konzentriert. 


 Isolierung der opaleszenten Fraktion 
 



   Nüchternserumproben wurden bei 4 DEG C aufbewahrt und innerhalb von drei Tagen untersucht. Zu 3 ml Serum wurden 1,05 g Kaliumbromid p.a. (Merck) zugewogen. Nach Lösung des Salzes unter leichtem Schwenken wurden die Proben in Ultraclear-Röhrchen eines Beckman SW41 Ausschwingrotors gefüllt. Darüber wurden 2 ml ein 20%igen Kaliumbromidlösung, 4 ml einer 8,5%igen Kaliumbromidlösung und 3,7 ml destillierten Wassers geschichtet. 



  Die Proben wurden 16 h bei 4 DEG C mit 38 000 rpm in einer Beckman Ultrazentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen unter einer im Abstand von 30 cm vom oberen Rand angeordneten Lichtquelle (Wolframglühbirne) gegen einen Metallschirm beobachtet und photographiert. Der RNA-Proteolipidkomplex flotiert im Kaliumbromid-Gradienten zwischen  alpha -Lipoprotein (HDL2 = "high-density lipoprotein 2") und  beta -Lipoprotein (LDL = "low-density lipoprotein"). Er stellt sich in diesem Gradienten dar als eine scharfe opaleszente Bande die zwischen der orangefarbenen LDL-Bande und der gelben HDL2-Bande lokalisiert ist, wobei die Opaleszenz nur bei tiefen Temperaturen (4-11 DEG C) zu beobachten ist. In einigen Fällen erschien die opaleszente Fraktion als Doppelbande, wobei die beiden Banden ca. 1 mm voneinander entfernt waren. 



  VLDL, LDL und die opaleszente Bande wurden nacheinander von oben abgesaugt. Die HDL-Banden und der lipoproteinfreie Unterstand wurden ebenfalls gesammelt. In Serumproben, die keine opaleszenten Bande zeigten, wurde die äquivalente Fraktion des Gradienten abgesaugt. Unter Verwendung eines metallischen Hintergrundes war die opaleszente Fraktion am deutlichsten sichtbar. Das Opaleszenzphänomen ist temperaturabhängig. Nach Aufwärmen der Röhrchen auf Zimmertemperatur nimmt die Erkennbarkeit der Bande deutlich ab. Die Proben wurden deshalb innerhalb von 10 min betrachtet und die Banden markiert. Im elektronenmikroskopischen Bild erscheinen die Partikel (20-28 nm) grösser als LDL (19-21 nm). 



  Im Falle vom Überstand von Zellkulturen wurden 3 ml-Proben davon der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzogen (vgl. Redgrave et al., Anal. Biochem. 65:42-49, 1975), wie es im vorangehenden für die Serumproben angegeben wurde. 



  Schwimmende Zellen (EB-2, Jlll, Lymphzyten, Monozyten) wurden im RPMI 1640 Medium, angereichert mit 10%igem fetalen Rinderserumalbumin in Konzentrationen von 10<6>, 10<7> und 10<8> Zellen/ml in 10 ml-Kulturen 6, 12 und 24 h inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand wie oben behandelt. 



  Die opaleszente Bande enthält nach einer ersten Ultrazentrifugation noch kontaminierende Serumproteine, die ca. 10% der Gesamtmenge darstellen. Deshalb wird zumindest eine zweite Ultrazentrifugation auf einem Kaliumbromid-Dichtegradienten durchgeführt, denn um den RNA-Proteolipidkomplex in der opaleszenten Bande möglichst gut von kontaminierenden Serumproteinen zu befreien. 



  Eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographie über 4%ige Agarose erlaubt eine Abtrennung von kontaminierenden HDL2, die wegen ihres geringeren Molekulargewichtes längere Retentionszeiten zeigen als der RNA-Proteolipidkomplex. 



  Eine noch weitere Reinigung gelingt durch Passage des RNA-Proteolipidkomplexes über eine Affinitätssäule, die durch Kopplung von anti-Humanserumglobulinen an cyanogenbromidaktivierte Agarose hergestellt wird. 


 Gewinnung von Oligopeptiden aus dem RNA-Proteolipidkomplex 
 



  Zur lyophilisierten opaleszenten Bande wurden 2 ml Chloroform/Methanol/Wasser (50:50:10) zugegeben und die gelöste Fraktion wurde mit 6 ml Diethylether gefällt. Die einzelnen Peptide wurden auf Celluloseplatten in 70%igem n-Propanol aufgetrennt, nach Anfärben der Banden mit Ninhydrin ausgekratzt und dann mit Chloroform/Methanol/ Wasser (50:50:10) eluiert. 


 Gewinnung von monospezifischen Antikörpern 
 gegen den RNA-Proteolipidkomplex 
 



  Der RNA-Proteolipidkomplex als Antigen wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 150  mu g/ml Peptid verdünnt. Kaninchen wurden dreimal mit je 50  mu l  dieser Lösung in Abständen von je einer Woche unter Zusatz von komplettem Freundschen Adjuvans (1:1) immunisiert. Die Injektionen erfolgten in die Innenseiten der Oberschenkel. Nach sechs Wochen wurden die Tiere entblutet. Die Antikörper wurden gereinigt (vgl. Wieczorek et al., 1985, loc. cit.). 


 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern 
 gegen den RNA-Proteolipidkomplex 
 



  BALB/C-Mäuse wurden durch drei Injektionen von je 0,5 ml mit je 50  mu g der Peptidfraktion in PBS unter Zugabe von je 0,5 ml kompletten Freundschen Adjuvans immunisiert. Die Injektionen wurden an den Tagen 0, 7 und 14 subkutan durchgeführt. Eine weitere Booster-Injektion wurde am 28. Tag durchgeführt. 



  Die Milz der Tiere wurde eine Woche nach der letzten Injektion entnommen, um Milzzellen mit Maus-Myelomzellen zu fusionieren, wobei solche Myelomzellen verwendet wurden, die das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) nicht haben und deshalb in einem selektiven Kulturmedium (HAT-Medium) nicht überleben. 



  Nach dem Verfahren von Köhler und Milstein, 1975, wurden 10<8> Milzzellen mit 3 x 10<7> Maus-Myelomzellen P3-X63-Ag8.653 (Kearney, 1979) in 1,5 ml einer Lösung von 50 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 (Merck, Darmstadt) und 9,7% Dimethylsulfoxid in Eagle's Minimal Essential Medium vermischt. Nach der Fusion wurden die Zellen auf 960 Vertiefungen von Mikrotiterplatten verteilt und im  selektiven Medium Littlefields HAT-Medium (Littlefield, 1964) zusammen mit je 10<4> Mäuseperitonealmakrophagen als Feeder-Zellen gezüchtet, wobei die Hybridomzellen überleben. Nach zehn Tagen im HAT-Medium wurde im RPMI 1640 HT-Medium weiter kultiviert. 



  Die Zellkulturüberstände der Hybridomzellen wurden darauf untersucht, ob sie die gewünschten monoklonalen Antikörper enthalten. Dabei wurde ein Dot-Blot-ELISA verwendet. 



  Alle ELISA wurden in paralellen Reihen an in Mikrotiterplatten plazierten Nitrozellulosescheibchen (Bio-Rad, Richmond, CA) durchgeführt. 0,5  mu l der RNA-Proteolipidkomplex-Lösung (10  mu g/ml Peptid) wurden auf jedes Scheibchen getropft, mit 100  mu l 3%igem Rinderserumalbumin blockiert und mit 100  mu l der Zellkulturüberstände zwei h bei 37 DEG C inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Scheibchen mit 100  mu l mit einem auf 1:10 000 verdünnten, mit Peroxidase markierten Zweitantikörper (Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) inkubiert. Nach 1 h wurde erneut gewaschen und mit 0,1% 4-Chloronaphtol in 20%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid entwickelt. 



   Hybridomüberstände, die ein Signal mit gereinigtem RNA Proteolipidkomplex ergaben, jedoch kein Signal mit gepooltem Normalserum ergaben, wurden ausgewählt und die zugehörigen Hybridomlinien weiter kultiviert. Beim ersten Test erwiesen sich 37 Klone als positiv. Diese Klone wurden erneut getestet, und zwar bezüglich der Reaktivität gegen gepooltes Normalserum (20 Probanden), das 1:10 verdünnt aufgetropft wurde (je 0,5  mu l). Es verblieben acht Klone, die gegen den RNA-Proteolipidkomplex, jedoch nicht gegen gepooltes Normalserum reagierten. Diese Klone wurden auf ihre Fähigkeit getestet, zwischen 20 normalen Seren und 10 Tumorseren zu unterscheiden (Karzinome der Bronchien, der Mamma, des Magens, des Colons, des Rektums, des Pankreas, der Niere, Knochensarkom, Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom). Es verblieben drei Klone, die mit allen Tumorseren, nicht aber mit Normalseren reagierten.

  Diese Klone, bezeichnet als AK33 (IgM), AK37 (IgG3) und AK52  (IgG3), befinden sich beim Institut für Anatomie (Prof. Dr. P. Groscurth), Universität Zürich-Irchel (Schweiz). 



  Grosse Mengen der gewünschten monoklonalen Antikörper können durch Vermehrung der Hybridomzellen in vivo gewonnen werden. BALB/C-Mäuse wurden intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan (Carl Roth) gespritzt. Nach einer Woche wurden 2 bis 5 x 10<4> klonierte Hybridomzellen intraperitoneal gespritzt. Aszites wurde nach 8 bis 10 Tagen entnommen und 30 min bei 4 DEG C mit 6000 rpm zentrifugiert (Sorvall, G4-Rotor). Zur Isolierung der gewünschten Antikörper wurde flottierendes Fett und Pristan abgesaugt und gesättigte Ammoniumsulfatlösung dem debrisfreien Überstand unter Rühren bis zur Halbsättigung zugetropft.

  Die derart ausgefällte rohe Immunglobulinfraktion wurde mit 0,1 M Tris-HCl (pH 8,2) über DEAE Affi-Gel Blue (Bio-Rad) nach Angaben des Herstellers chromatographiert, die Immunglobulinfraktionen wurden gereinigt und über Filter (Amicon XM50) konzentriert. 


 Markierung des monoklonalen Antikörpers 
 mit Peroxidase 
 



  Es wurde die Methode von Nakane, 1974, angewandt. 10 mg Peroxidase (Serva, Heidelberg) wurden in 1,25 ml destilliertem Wasser gelöst und 250  mu l Natriumperjodat (43 mg/ml) zugefügt. Nach 20 min Rühren bei Raumtemperatur wurden 30  mu l Ethylenglykol zugefügt. Nach weiteren 10 min bei Raumtemperatur wurde die Probe mit 1 mM Natriumacetat (pH 4,4) auf 10 ml verdünnt und über Filter (Amicon PM10) auf 1 ml konzentriert. Parallel dazu wurden 8 mg Antikörper in 1,18 ml 0,2 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst und 0,82 ml davon der Peroxidaselösung zugefügt. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde die Probe im Eisbad abgekühlt und 500  mu l Natriumborhydrid in Wasser (3,8 mg/ml) zugefügt. Das Konjugat wurde über eine Sephadex-300-Säule (Pharmacia) unter Elution mit 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) gereinigt.

  Die Markierung mit <1><2><5>I wurde mit der Chloramin-T-Methode nach Shepard, 1976 durchgeführt. 


 Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes 
 mittels ELISA 
 



  Für einen direkten ELISA wurden die Seren mit 0,5% Natrium-Deoxycholat in PBS in Proportionen 1:10, 1:100, 1:1000 und 1:10 000 verdünnt und 100  mu l-Proben in Polystyrol-Mikrotiterplatten (Linbro) pipettiert. Die Inkubation wurde bei 37 DEG C durchgeführt, weil bei der hohen Deoxycholatkonzentration ein Teil der Seren bei Raumtemperatur geliert. Nach 2 h wurden zur Blockierung 20  mu l 3%igem Rinderserumalbumin in PBS zugegeben. Nach 1 h wurde mit PBS gewaschen und 100  mu l des mit Peroxidase markierten monoklonalen Antikörpers (1:1000 der Stammlösung) in 1%igem Rinderserumalbumin zugefügt, dann wurde 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde ein Farbentwicklungspuffer zugegeben, bestehend aus 1 mg/ml Azino-bis-3-ethyl-benzthiazolin-sulfonsäure (ABTS, Serva) in TBS mit 0,015% Wasserstoffperoxid. Die Extinktionen wurden nach 15 min bei 405 nm gemessen.

  Zur Standardisierung wurde eine Lösung von 1  mu g Proteolipidpeptid in 1 ml TBS verwendet. 



  Für ein Sandwich-ELISA wurden die monoklonalen Antikörper auf 10 ng/ml mit PBS verdünnt. Davon wurden Aliquote von 200  mu l in Vertiefungen von Mikrotiterplatten pipettiert. Die Inkubation wurde 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Danach wurde nacheinander mit PBS und mit 0,05%igem Tween 20 in PBS gewaschen und 2 h 10%igem Rinderserumalbumin unter Zusatz von 10%iger Sucrose in PBS inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Platten mit Parafilm abgedeckt und bis zur Verwendung bei 4 DEG C aufbewahrt. Die mit dem Fängerantikörper beschichteten Platten wurden wie beim direkten ELISA mit verdünnten Seren inkubiert. Nach 2 h bei 37 DEG C wurde mit PBS gewaschen und 50  mu l des konjugierten Antikörpers zugegeben. Inkubation, Waschen und Entwicklung erfolgten wie beim direkten ELISA. 



  Für einen indirekten ELISA wurden die mit Antikörper beschichteten Platten 2 h mit je 5 ng RNA-Proteolipidkomplex und 50  mu l des 1:10 mit PBS verdünnten Testserums inkubiert. 



  Der Nachweis erfolgte mit Antikörper, der mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiert worden war. Es wurde auch mit Biotin markierter Antikörper verwendet, in diesem Fall wurde das Biotin mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat nachgewiesen. 


 Markierung des monoklonalen Antikörpers 
 mit Jod 125 
 



  In einer ersten Reihe von Experimenten wurden, zur Markierung des RNA-Proteolipidkomplexes über die Hydroxylgruppen der Tyrosinreste, zu 1 mCi <2><2><5>I (in einer Konzentration von 17 Ci/Mol vorliegend) 10  mu g RNA-Proteolipidkomplex und 88  mu g Chloramin-T in je 25  mu l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) zugegeben. Nach 1 min wurden 100  mu l einer Lösung von 2,4 g/l Natriummetabisulfit im gleichen Puffer und anschliessend 200  mu l einer Lösung von 10 g/l Kaliumjodid im gleichen Puffer zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde auf eine 1 cm x 10 cm Sephadex-G15-Säule appliziert und mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) eluiert. 



  In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden, zur Markierung des gereinigten Peptids über die Hydroxylgruppen der Tyrosinreste, zu 1 mCi <1><2><5>I (in einer Konzentration von 17 Ci/Mol vorliegend) 5  mu g gereinigtes Peptid und 88  mu g Chloramin-T in je 25  mu l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) zugegeben. Nach 1 min wurden 100  mu l einer Lösung von 2,4 g/l Natriummetabisulfit im gleichen Puffer und anschliessend 200  mu l einer Lösung von 10 g/l Kaliumjodid im gleichen Puffer zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde auf eine 1 cm x 10 cm Sephadex-615-Säule appliziert und mit 50 mM eines zusätzlich 0,05% Tween 80 enthaltenden Phosphatpuffers (pH 8,0) eluiert. 



   In beiden Reihen von Experimenten betrugen die erzielten Aktivitäten 7000 bis 12 000 cpm/ng. 


 Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes 
 mittels Radio-Immuno-Assay 
 



  Polyvinylplatten (Costar) wurden mit dem Antikörper wie beim vorangehend beschriebenen Nachweis mittels ELISA beschichtet (20 ng Immunglobulin pro Vertiefung), die Blockierung und Aufbewahrung der Platten erfolgte ebenfalls wie dort beschrieben. Je 1 ng des wie vorangehend beschrieben radioaktiv markierten Antigens (ca. 10 000 cpm in 50  mu l) wurden pro Vertiefung mit je 50  mu l des mit PBS auf 1:10 bis 1:1000 verdünnten Serums inkubiert. Nach 4 Stunden bei Zimmertemperatur wurde sechsmal mit PBS gewaschen. Die einzelnen Vertiefungen wurden ausgeschnitten und im Szintillationsverfahren gezählt. Die Resultate wurden in pg des verdrängten <1><2><5>I ausgedrückt. 


 Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes 
 mittels Elektro-Immuno-Blot und Western-Blot 
 



  Serumaliquote von 3  mu l wurden mit 3  mu l 1%igem SDS in 0,1 N Tris-Acetatpuffer (pH 8,0) vermischt und 6 h bei 37 DEG C inkubiert. Dann wurden die Proben auf Polyacrylamidgradientengelen (2-16%, Pharmacia) aufgetrennt (70 mA, 8 h). Danach wurden die Gele mit Nitrozellulose bedeckt und die aufgetrennten Moleküle mit Hilfe von 50 mM Tris-Glycinpuffer (pH 8,3) entweder elektrophoretisch (beim Elektro-Immuno-Blot) oder durch Diffusion (beim Western-Blot) auf die Nitrozellulose übertragen. Die Nitrozelluloseblätter wurden mit 3%igem Rinderserumalbumin blockiert. Die Blätter wurden 2 h mit den monoklonalen Antikörpern in 1%igem Rinderserumalbumin und nach Waschen mit PBS 1 h in mit Peroxidase markierten Antikörpern gegen Mäuse-IgG inkubiert.

  Nach erneutem Waschen erfolgte die Farbentwicklung mit 0,1% 4-Chloronaphtol in 20%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid. 


 Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes in Zellen und Gewebeschnitten mittels Immuno-Fluoreszenz, Immuno-Histochemie oder Immuno-Goldmarkierung 
 



  Für den morphologischen Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes wurden unfixierte oder mit 2%igem Paraformaldehyd vorfixierte Zellen und Gewebeschnitte (Gefrier-, Paraffin- oder Plastik-Schnitte), mit verschiedenen Verdünnungen der vorstehend aufgeführten monoklonalen Antikörper mit 1%igem Rinderalbumin in PBS, bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Inkubation von 12 h bei 4 DEG C wurden die Proben dreimal in PBS gewaschen. 



  Für die Immuno-Fluoreszenz wurden die Präparate dann mit einem gegen Maus-Immunglobuline gerichteten und mit Fluorescein-Isothiocyanat oder mit Rhodamin markierten Zweitantikörper (Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) (Verdünnung 1:50) 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Danach wurden die Proben mehrmals gewaschen und, wenn sie noch nicht vorfixiert waren, mit 2%igem Formaldehyd in PBS nachfixiert. Die mit Polyvinylalkohol eingedeckten Präparate wurden in einem mit einer Auflichtfluoreszenzeinheit versehenen Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von spezifischen Filtern untersucht. 



  Für die Immuno-Histochemie wurden die Präparate mit einem gegen Maus-Immunglobuline gerichteten und mit Peroxydase markierten sekundären Antikörper (Verdünnung 1:50) für 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Präparate mit 0,02%igem Wasserstoffperoxid als Substrat und mit 3'-3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid oder auch mit 3-Amino-9-ethyl-carbazol als Chromogen inkubiert. Der positive Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes äusserte sich in einer durch das Reaktionsprodukt bestimmten Farbänderung der Zellen bzw. der Gewebe. 



  Für die Immuno-Goldmarkierung wurden mit kolloidalem Gold (5 nm) gekoppelte und gegen Maus-Immunglobuline gerich tete Antiseren als sekundäre Antikörper verwendet. Die Goldmarkierung wird anschliessend durch Silberlösungen (intense-LM, Jannssen) verstärkt. 



  Zur Kontrolle der verschiedenen Immunozytologischen Verfahren wurden die Präparate anstelle des primären Antikörpers entweder mit PBS oder mit durch den RNA-Proteolipidkomplex absorbierten Antikörper behandelt. 


 Herstellung der cDNA 
 



  Die mRNA aus dem Komplex wurde durch Entfernung der Lipide und lipophilen Peptide mit Chloroform/Methanol, mit 70%igem Ethanol und schliesslich mit Phenol-SDS gereinigt und zur reversen Transkription verwendet. 



  2  mu g-Proben der gereinigten mRNA wurden in 4  mu l Wasser gelöst und dann einem Reaktionsansatz beigegeben, der wie folgt zusammengestellt worden war: 18,5  mu l Wasser, 2  mu l Oligodeoxythymidin-Primer (12-18, Sigma), 2  mu l 1 M KCl, 4  mu l 10 mM Deoxythymidintriphosphat (Pharmacia), 4  mu l 0,5 M Tris-HCl (pH 8,1), 40 mM MgCl, 20 mM Dithiothreitol, 4  mu l Ribonukleaseinhibitor (250  mu g/ml), 2  mu l Reverse Transcriptase (avian myeloblastosis virus, 4 E/ml, Pharmacia). 



  Die Inkubation wurde in einem Polypropylen-Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml) 2 h bei 42 DEG C durchgeführt. Danach wurden die Proben 3 min bei 100 DEG C erhitzt, im Eisbad gekühlt und während 2 s bei 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem folgenden Reaktionsansatz versetzt: 20,5  mu l Wasser, 8  mu l 1 M HEPES-KOH (pH 6,9), 6,5  mu l M KCl, 2,5,  mu l 0,1 M MgCl, 1,6  mu l 0,1 M Dithiothreitol, 0,8  mu l 10 mM Deoxythymidintriphosphat, 16 Einheiten Klenow Polymerase (Boehringer). 



  Der Ansatz wurde 1 h bei 15 DEG C inkubiert. Nach einer weiteren Inkubation bei 65 DEG C während 5 min wurden die Proben auf Eis gekühlt und während 2 s mit 10 000 g zentrifugiert. Zum Überstand wurde der folgende Ansatz zugegeben: 400  mu l 30 mM Natriumacetat (pH 4,5), 250 mM NaCl, 1 mM Zinksulfat,  5% Glycerin, 20  mu l S1 Nuklease (1 E/ul, Sigma). Die Proben wurden 1 h bei 37 DEG C inkubiert. Danach wurden 60  mu l 100 mM Tris/100 mM EDTA zugegeben. Schliesslich wurden 500  mu l Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (49,5:49,5:1) zugegeben. Die Proben wurden geschüttelt und während 1 min bei 12 000 g zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues Propylenröhrchen (4,5 ml) überführt und das Phenol durch 4faches Ausschütteln mit Diethylether (je 2 ml) entfernt. Schliesslich wurden 3 ml Ethanol zugegeben.

  Die Proben wurden geschüttelt, 2 h bei -70 DEG C inkubiert und 20 min bei 12 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die cDNA-Proben bei -20 DEG C aufbewahrt. 


 Ligation der cDNA mit M13-Phagen 
 



   Als Phagenvektor wurde M13 mp8 (Messing, 1983, Amersham, Wirt E. Coli JM 101) verwendet. Diese erprobten und leicht zu handhabenden Phagen erwiesen sich dafür geeignet, grosse Mengen von cDNA für Hybridisierungstests herzustellen. 



  Die Vektor-DNA wurde in parallelen Ansätzen mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Pst I geschnitten. 50 ng des Vektors in 1  mu l Wasser wurden mit 10  mu l des Reaktionspuffers (Bam HI: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Merkaptoethanol, 100  mu g/ml Rinderserumalbumin; Pst I: wie oben mit 50 mM NaCl) versetzt und 3 h bei 37 DEG C inkubiert. Danach wurden 50  mu l 10 mM Tris-HCl (pH 9,2), 0,2 mM MgCl, 2 E alkalische Phosphatase (Kälberdarm, Sigma) in 10  mu l zugegeben. Die Inkubation wurde 1 h bei 37 DEG C durchgeführt, dann wurden 50  mu l 50 mM EDTA/50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und schliesslich mit 100  mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (49,5:49,5:1) zugegeben. Die obere Phase wurde in ein neues Propylenröhrchen (4,5 ml) überführt und das Phenol durch 4faches Ausschütteln mit Diethylether (je 2 ml) entfernt. Schliesslich wurden 3 ml Ethanol zugegeben.

  Die Proben wurden geschüttelt, 2 h bei -70 DEG C inkubiert und 20 min bei  12 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Vektor-DNA bei -20 DEG C aufbewahrt. 



  Die cDNA wurde mit Linkern der genannten Endonukleasen ligiert. Verwendet wurden der Bam HI-Linker 5 min pd(CGGATCCG), und der Pst I-Linker 5 min pd(GCTGCAGC) von Pharmacia. 



  20 ng des Linkers wurden in 5  mu l Wasser gelöst und mit dem folgenden Ansatz versetzt: 1  mu l 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1  mu l 10 mM EDTA, 2  mu l 0,5 M NaCl, 50 ng cDNA in 1  mu l Wasser. Die Inkubation wurde zuerst 2 min bei 65 DEG C, dann 30 min bei 42 DEG C durchgeführt. Nach Kühlung auf Eis wurden 70  mu l Wasser, 20  mu l 150 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl, 6 mM EDTA, 5  mu l Dithiothreitol, 10 mM ATP, 1  mu l E. Coli DNA-Ligase (5 E/ mu l, Sigma) beigegeben. Die Inkubation wurde 3 h bei 14 DEG C durchgeführt. Danach wurden 50  mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der cDNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt. 



  Die mit Linkern flankierte cDNA wurde in den genannten Puffern 30 min bei 37 DEG C mit den Endonukleasen Bam HI und Pst I hydrolysiert. Danach wurden 50  mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der cDNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt. 



  40  mu g der geschittenen Vektor-DNA und 40  mu g der flankierten cDNA wurden in je 5  mu l Wasser gelöst, kombiniert und mit dem folgenden Ansatz versetzt: 2  mu l 150 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM ATP, 2 E DNA-Polymerase vom Escherichia Coli (2  mu l). Die Inkubation wurde 6 h bei 14 DEG C durchgeführt. Der gesamte Ansatz wurde für die Transformation der Zellen vom Escherichia Coli verwendet. 


 Klonen und Isolierung der rekombinanten DNA 
 



  Die Wirtszellen (Escherichia Coli JM 101) wurden auf  Glukose-Minimalmedium-Agar ausgestrichen, das pro Liter 15 g Agar (Gibco), 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0,5 g NaCl, 1 ml 1M MgSO4, 1 ml 0,1 M CaCl2, 1 ml 1 M Thiamin und 10 ml 20%ige Glukose enthielt. Nach 24 h Inkubation wurde eine der Kolonien in 10 ml Kulturmedium, enthaltend pro Liter 16 g Baktotrypton (Gibco), 10 g Hefeextrakt (Sigma) und 5 g NaCl, gegeben und über Nacht inkubiert. 2 ml dieser Kultur wurden zu 30 ml des angegebenen Flüssigmediums zugegeben. Zu einer weiteren Kultur (20 ml) wurde ein Tropfen der Übernachtkultur zugegeben. Die Kulturen wurden bei 37 DEG C inkubiert. Nach 6 h wurden die Zellen der 30 ml-Kultur abzentrifugiert (5000 g, 5 min). Die Zellen wurden in kaltem 50 mM CaCl2 suspendiert und 3 h bei 0 DEG C gehalten, dann 5 min bei 5000 g abzentrifugiert und in 2 ml 50 mM CaCl2 suspendiert.

  Zu 0,2-ml Aliquoten dieser Zellsuspension wurden die vorangehend beschriebenen Ligationsmixturen zugegeben und die Proben 3 h bei 0 DEG C inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen 3 min bei 42 DEG C inkubiert und wieder ins Eisbad befördert. Inzwischen wurden 0,3  mu l-Aliquote der 20-ml-Kultur mit 30  mu l Isopropylthiogalaktosid (100 mM) und 30  mu l 2%igem Bromochlorindoylgalaktosid in Dimethylformamid versetzt. Dieser Ansatz wurde mit den transformierten Zellen (0,2 ml) kombiniert und mit einer bei 42 DEG C gehaltenen Agarlösung versetzt, die pro Liter 10 g Baktotrypton, 8 g NaCl und 8 g Agar enthielt. Diese Lösung wurde sofort auf Agarplatten gegossen (pro Liter 10 g Baktotrypton, 8 g NaCl, 12 g Agar). 



  Nach 24 h wurden durchschnittlich 240 Plaques beobachtet. Etwa 5% davon waren blau, d.h. sie enthielten den selbstligierten Vektor, der keine cDNA enthält. Die farblosen Plaques wurden mit sterilisierten Zahnstochern in je 2 ml des oben angegebenen Flüssigmediums überführt und über Nacht inkubiert. Das beschriebene Verfahren ist eine modifizierte Ausführungsweise bekannter Verfahren (Messing, 1983, Gray et al. 1983). 



  Die Kulturen der individuellen Plaques wurden zentrifugiert (5000 g, 5 min). Die Überstände (1,6 ml) wurden mit  0,3 ml 20%igem Polyethylenglykol (MG 6000-8000, Sigma) versetzt und 20 min bei 22 DEG C inkubiert. Nach Zentrifugation (10 000 g, 5 min) wurde der Überstand verworfen. Reste der Polyethylenglykollösung wurden mit Filterpapier entfernt. Die Phagen wurden in 100  mu l 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA suspendiert. Danach wurden 50  mu l Phenol/ Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben. Die Proben wurden geschüttelt und 5 min bei 10 000 g zentrifugiert. Die oberen Phasen wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der rekombinanten DNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt. 



  Die DNA-Präzipitate wurden in 100 mM Tris-Acetat/1 mM EDTA gelöst und 10  mu l-Aliquote in 1%igen Agarose-Gelen im gleichen Puffer aufgetrennt (40 mA, 30 min). Die Gele wurden 15 min in 1  mu g/ml Ethidiumbromid inkubiert und im langwelligen UV-Licht betrachtet (300 nm). 


 Markierung der rekombinanten DNA 
 



   Mit dem Ziel, eine Routineanwendung zu ermöglichen, wurde eine Hybridisierungstechnik mit nichtradioaktiv markierter DNA verwendet. Es wurde das von Sigma entwickelte Verfahren (Technical Bulletin No. PROBE-2, 6-87) verwendet, bei dem die Hydroxylgruppe des Cytosins sulfoniert wird und danach immunchemisch nachweisbar ist. Zur Sulfonierung wurden die von Sigma in der genannten Veröffentlichung angegebenen Reagenzien A und B verwendet. Laut Angaben von Sigma unterliegen diese Reagentien einem Patentschutz. 



  Die DNA wird in einer Konzentration von 0,5  mu g/ml in destilliertem Wasser gelöst, 10 min bei 100 DEG C erhitzt und dann sofort im Eisbad gekühlt. Zu 100  mu l dieser Lösung werden 50  mu l Lösung A und 12,5  mu l Lösung B zugegeben. Nach 12 h Inkubation wurden 350  mu l Ethanol zugegeben. Nach Kühlung auf -20 DEG C über eine wurde die DNA abzentrifugiert (14 000 g, 20 min) und in einem 0,75 M physiologische Kochsalzlösung mit  Natriumcitrat (SSC von Sigma), 0,75 M Denhards Lösung (Sigma) und 1  mu g/ml 50%iges Formamid enthaltenden Hybridisierungspuffer gelöst. 



  Der RNA-Proteolipidkomplex aus den Seren wurde durch Affinitätsabsorption vorgereinigt. 1 ml-Proben der unverdünnten Seren wurden versetzt mit 250  mu l 3 M SSC und 150  mu l  1%iges Nonidet P-40. In die Röhrchen wurden Stücke Polyuridinpapier gelegt (0,5 x 1 cm, Hybond-mAP, Amersham) und die Proben 12 h inkubiert. Der RNA-Proteoplipidkomplex wird dabei durch das Detergens labilisiert, so dass die Polyadenylkette der im RNA-Proteoplipidkomplex enthaltenen mRNA an die papiergebundene Polyuridinkette binden kann. 



  Das Serum wurde abpipettiert und die Papierstücke dreimal mit je 2 ml 0,5 M NaCl, danach mit 2 ml 70%igem Ethanol und dann mit 2 ml kaltem destiliertem Wasser gewaschen. Danach wurden 1,5 ml heisses Wasser (80 DEG C) zugegeben, das Papierstück herausgenommen, die Lösung gekühlt, mit 200  mu l 1 M Natriumacetat und 5 ml Ethanol versetzt und auf -20 DEG C gekühlt. Die auf solche Weise partiell gereinigte mRNA wurde abzentrifugiert (14 000 g, 20 min), in 50  mu l 50 mM Tris-HCl gelöst, 5 min auf 90 DEG C erhitzt und dann sofort im Eisbad gekühlt. 



  1  mu l-Aliquote der obigen mRNA wurden auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham) getropft. Nach Trocknung der Membran wurde diese invertiert auf einen UV-Transluminator (LKB) gelegt. Nach 20 min wurde die Membran 2 h mit beschallter Lachsspermien-DNA (1  mu g/ml im vorstehend angegebenen Hybridisierungspuffer) prähybridisiert. Für 1 cm Membran wurden bei allen Inkubationsschritten 100  mu l Lösung verwendet. Nach Waschen mit 0,5 M NaCl wurde die sulfonierte DNA zugegeben (1  mu g/ml Hybridisierungspuffer) und 20 h bei 42 DEG C inkubiert. Danach wurde erneut mit 0,5 M NaCl gewaschen und die Blockierlösung, enthaltend 20% Magermilchpulver, 0,05% Tween 20, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), zugegeben. 



   Nach 1 h wurde der monoklonale Antikörper gegen die sulfonierte DNA (Sigma) 1:300 im Blockierpuffer verdünnt. Nach  1 h wurde mit 100 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 0,5 M NaCl gewaschen und dann mit Peroxidase markierter Zweitantikörper Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) 1:500 im Blockierpuffer verdünnt. Nach weiterer 1 h wurde erneut mit 100 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 0,5 M NaCl gewaschen und die Membran in die Farbentwicklerlösung getaucht (0,1% 4-Chloronaphtol in 4%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid). Nach 10 min wurde die Membran mit PBS gewaschen und getrocknet. Die Intensität der Farbflecken wurde mit derjenigen von Farbflecken von gereinigtem und vorquantifiziertem RNA-Proteolipidkomplex verglichen. 

Claims (26)

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon, bei welchem man eine Körperflüssigkeit von neoplastisch erkrankten Patienten oder einen Extrakt von kultivierten humanen malignen Zellen epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs, oder einen Überstand einer Kultur solcher Zellen, mindestens einer Kaliumbromid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzieht und aus der zentrifugierten Flüssigkeit den Dichtebereich bei ca.

1,080 entnimmt, welcher an der Grenze zwischen den Dichtebereichen für alpha -Lipoproteine, HDL, und für beta -Lipoproteine, LDL liegt und unterhalb 11 DEG C als opaleszente Bande erkennbar ist, um eine das RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon enthaltende Suspension zu gewinnen, dadurch gekennzeichnet, dass man im Falle der Verwendung von Körperflüssigkeit diejenige von solchen Patienten verwendet, deren Serum kein immunochemisch nachweisbares Lipoprotein a enthält, und dass man die gewonnene Suspension einer Dekontamination durch Säulenchromatographie über Agarose unterzieht, um sie von alpha -Lipoproteinen, HDL, zu befreien.

2.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die dekontaminierte Suspension weiter reinigt, indem man sie über eine Affinitätssäule führt, die durch Kopplung von anti-Humanserumglobulinen an mit Cyanogenbromid aktivierter Agarose bereitgestellt worden ist, um weitere Anteile zumindest von Lipoproteinen und Serumalbuminen zu beseitigen.

3. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2 gewonnener RNA-Proteolipidkomplex, enthaltend das gereinigte RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.

4. Verwendung des RNA-Proteolipidkomplexes nach Anspruch 3 als Mittel zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.

5.

Verwendung des RNA-Proteolipidkomplexes nach Anspruch 3 zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.

6. Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines RNA-Proteolipidkomplexes, dadurch gekennzeichnet, dass man einen RNA-Proteolipidkomplex nach dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 herstellt und ihn kovalent an einen Liganden bindet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung ist.

8. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 6 oder 7 gewonnenes markiertes Derivat eines RNA-Proteolipidkomplexes.

9.

Verwendung eines markierten Derivats eines RNA-Proteolipidkomplexes nach Anspruch 8 als Mittel zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.

10. Verwendung eines markierten Derivats eines RNA-Proteolipidkomplexes nach Anspruch 8 zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder gegen eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.

11.

Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein von humanen malignen Zellen gebildetes RNA-Proteolipid und/oder gegen eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Klone von solchen Hybridomzellen verwendet, die einen monoklonalen Antikörper gegen den RNA-Proteolipidkomplex nach Anspruch 3 und keinen mit Normalserum reagierenden Antikörper produzieren.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hybridomzellen in vivo vermehren lässt.

13. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 11 oder 12 gewonnener monoklonaler Antikörper.

14. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 13 als Mittel zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.

15.

Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 13 zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.

16. Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass man den monoklonalen Antikörper nach dem Verfahren nach Anspruch 11 oder 12 herstellt und ihn kovalent an einen Liganden bindet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung ist.

18. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 16 oder 17 gewonnenes markiertes Derivat eines monoklonalen Antikörpers.

19.

Verwendung eines markierten Derivats nach Anspruch 18 als Mittel zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.

20. Verwendung eines markierten Derivats nach Anspruch 18 zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.

21. Verfahren zur Gewinnung von einer zu von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipid nach Anspruch 3 komplementären Desoxyribonucleinsäure (cDNA), dadurch gekennzeichnet, dass man solche cDNA bildet, die der RNA aus dem RNA-Proteolipidkomplex nach Anspruch 3 komplementär ist, diese cDNA in einen Bakteriophagen bringt, Escherichia coli mit dem Bakteriophagen transformiert, die cDNA kloniert und isoliert.

22.

Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 21 gewonnene cDNA.

23. Verfahren zur Herstellung einer einsträngigen cDNA, dadurch gekennzeichnet, dass man eine cDNA nach dem Verfahren nach Anspruch 21 herstellt und in einsträngige cDNA umwandelt.

24. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 23 gewonnene einsträngige cDNA.

25. Verwendung der einsträngigen cDNA nach Anspruch 24 als Mittel zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids.

26. Verwendung der einsträngigen cDNA nach Anspruch 24 zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids.