DE3047654C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene
Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in
Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen gefundene
Antigene spezifisch sind, sowie die
Verwendung der so erhaltenen Antikörper zum Nachweis von Krebs nach
Anspruch 4. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen des
Verfahrens und die Ansprüche 5 bis 12 der Verwendung.
Frühere Untersuchungen bei Versuchstieren haben gezeigt,
daß in Tumoren Kernantigene und nukleoläre Antigene vorkommen,
die in tumorfreien Geweben nicht gefunden werden
(vgl. R. K. Busch und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 34,
Seite 2362, 1974; Yeoman und Mitarbeiter in "Proc. Natl.
Acad. Sci. USA" Band 73, Seite 3258 (1976); Busch und Busch
in "Tumori" Band 63, Seite 347 (1977); Davis und Mitarbeiter
in "Cancer Res." Band 38, Seite 1906 (1978) und Marashi
und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 39, Seite 59 (1979)).
Bei diesen früheren Untersuchungen wurden durch Immunisierung
von Kaninchen Antikörper gegen Nukleolen normaler und
neoplastischer Zellen von Ratten gewonnen (vgl. R. K. Busch
und Mitarbeiter a.a.O.; Busch und Busch a.a.O. und Davis und Mitarbeiter
a.a.O.). Durch die indirekte Immunofluoreszenzmethode
konnte bei den acetonfixierten Zellen eine helle nukleoläre
Fluoreszenz gezeigt werden. Es hat sich ferner gezeigt,
daß die Immunopräzipitinbanden in Ouchterlonygelen, die mit
aus Novikoffhepatom-Nukleolen von Ratten extrahierten Antiseren
gegen Novikoffhepatom-Nukleolenantigene erzeugt wurden,
sich von den entsprechenden Immunopräzipitinbanden, die
mit Lebernukleolenantigenen und Antilebernukleolenantiseren
gebildet wurden, unterscheiden (vgl. Busch und Busch a.a.O.).
Als Beleg für eine weitere Spezifizierung dient die Erkenntnis,
daß Antitumornukleolenantiserum mit absorbierten Leberkernextrakten
bei Novikoffhepatomasziteszellen, nicht dagegen
bei Leberzellen eine positive nukleoläre Fluoreszenz
zeigen. Umgekehrt ergibt Antilebernukleolenantiserum mit
absorbierten Tumornukleolenextrakten zwar bei Lebernukleolen
eine positive Fluoreszenz, nicht dagegen eine nachweisbare
Tumornukleolenfluoreszenz (vgl. Davis und Mitarbeiter a.a.O.)
Insoweit eine Immunofluoreszenzanalyse zeigt, daß bei acetonfixierten
Tumorabstrichen und normalen Rattenzellenabstrichen
(insbesondere nach Absorption der Antiseren mit
normalen Leberkernen und -nukleolen) Unterschiede feststellbar
sind, wurde versucht, diese Antiseren gegen Rattentumornukleolenantigene
zum Testen entsprechender Gewebeproben
aus menschlichen Tumoren auszunutzen. Untersuchungen
mit Antikörpern gegen Nagertumornukleolen zeigten, daß
bei menschlichen Tumornukleolen keine positive Immunofluoreszenz
feststellbar ist. Im Hinblick darauf wurde eine Versuchsreihe
zur Auffindung von Humannukleolenantigenen begonnen.
Dabei konnte in menschlichen Tumorgeweben mit Antiseren
und Antikörpern gegen diese neuen Humantumornukleolenpräparate
eine positive Immunofluoreszenz gefunden werden.
Bei diesen Untersuchungen wurden die Antikörper an Plazentakernsonikate
sowie fötales Kalbserum absorbiert (vgl. Busch
und Mitarbeiter "Cancer Res." Band 39, Seite 3024 (1979);
Davis und Mitarbeiter "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" Band 76,
Seite 892 (1979) und Smetana und Mitarbeiter in "Life Sci."
Band 25, Seite 227 (1979)).
Die vorliegende Erfindung beruht auf Untersuchungen bezüglich
der Ausnutzbarkeit dieser neuen Humannukleolenantigene zum
Nachweis eines breiten Bereichs von Humanneoplasmen.
Die folgende Tabelle I gibt eine Aufstellung derjenigen
menschlichen Tumore, bei denen mit den Antikörpern gegen
menschliche Tumornukleolen eine helle nukleoläre Immunofluoreszenz
feststellbar ist. Diese Untersuchungen stützen
die überraschende und unerwartete Erkenntnis, daß zahlreiche
menschliche Tumore gemeinsame nukleoläre Antigene bzw. Nukleolenantigene,
die mit Antiseren oder Immunoglobulinfraktionen
solcher Antiseren eine positive Immunofluoreszenz zeigen,
enthalten (vgl. Busch und Mitarbeiter a.a.O.).
- 1. Blase, Übergangszellen
- 2. Gehirn
Astrozytom
Glioblastom - 3. Dickdarm, Adenokarzinom (4)
Metastase: Leber
transplantierbares Karzinom (GW-39) - 4. ekkrine Drüse, Karzinom
- 5. Speiseröhre, Squamöses Zellkarzinom
- 6. Leber, Primärkarzinom
- 7. Lunge:
Adenokarzinom (2)
Haferzellen
Squamöse Zellen (5) - 8. Melanom, maligne, zerebrale Metastasen
- 9. Prostata, Adenokarzinom (4)
- 10. Haut: basales Zellkarzinom (2)
squamöses Zellkarzinom (7)
Metastase: Lymphknoten - 11. Magen, Adenokarzinom
Metastase: Leber
Metastase: Lymphknoten - 12. Schilddrüse, Karzinom (2)
- 1. Myoblastom, bösartig auf den Lippen
Metastase auf zervikalen Lymphknoten - 2. Osteogenes Sarkom (3), Biopsie, Gewebekultur,
- 3. Synovialsarkom
- 4. Lymphom (4), Nicht-Hodgkins
- 1. Hodgkins'sche Erkrankung (Reed Sternberg, 5)
- 2. Leukämie: CLL (5), haarige Zellen (Milz)
- 3. Lymphom, lymphozytisch, Milz
- 4. Multiples Myelom (5)
- 5. Mycosis fungoides
- 6. Akute myelozytische Leukämie (5)
- 7. Chronische myelozytische Leukämie (5)
- 8. Akute monozytische Leukämie (2)
- 1. Brustkarzinom
- 2. Dickdarmadenokarzinom
- 3. HeLa
- 4. HEp-2
- 5. Prostata, Karzinom (3)
- 6. Squamöses Zellkarzinom (3)
*) Die Zahlen in Klammern bedeuten die Anzahl der Fälle.
In tumorfreien Geweben, gutartigen Tumoren und bei entzündlichen
Zuständen sind in der Regel, wie die folgende Tabelle
II ausweist, negative Ergebnisse feststellbar (vgl. Busch
und Mitarbeiter a.a.O.).
- 1. Blase
- 2. Knochenmark (hämoblastische Formen, 5)*)
- 3. Brust
- 4. Leukozytenfilm im zentrifugierten Blut (3)
- 5. Gallenblase
- 6. Dünndarm, Lieberkühn'sche Krypten
- 7. Dickdarm
- 8. Niere
- 9. Leber (2)
- 10. Lunge (dem Tumor benachbartes Gewebe)
- 11. Lymphknoten
- 12. Lymphozyten (normal) (2)
- 13. Pankreas
- 14. Epiphyse
- 15. Hypophyse
- 16. Plazenta
- 17. Prostataphyse
- 18. Haut
- 19. Magen
- 20. Schilddrüse
- 1. Brust, Adenom
- 2. Nebenschilddrüse, Adenome (2)
- 3. Prostatadrüse, Hyperlasie (3)
- 4. Schilddrüse, Adenome (3)
- Knotiger Kropf (2)
- 1. Chronische Colitis ulcerosa
- 2. Glomerulonephitis
- 3. Granulom und Fibrose der Lunge
- 4. Leberzirrhose, Hepatitis
- 5. Lupus profundus (Milchdrüse und Haut)
- 6. Blasiger Hautausschlag
- 7. Magengeschwür
- 8. Entzündliche Hyperplasie-Lymphknoten (4)
- 9. Infektiöse Mononukleose (5)
- 1. Brustfibroblasten
- 2. Lymphozyten, PHA stimuliert
- *) Wie Tabelle 1
Diese zunächst mittels Immunofluoreszenz erhaltenen Ergebnisse
sind durch Immunoperoxidasemethoden erhärtet und verbreitert
worden.
Die vorliegende Erfindung geht nun von der zuvor erläuterten
überraschenden Erkenntnis aus, daß nämlich verschiedene menschliche
Krebszellen gemeinsame Nukleolenantigene aufweisen, die
jedoch nicht in normalen menschlichen Zellen vorkommen. Bei
diesen Antigenen handelt es sich um Proteine, denen eine
Gensteuerung oder eine sonstige Funktion zukommt und die die
Mitose an einer perichromosomalen Stelle überdauern.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, die in menschlichen Krebszellen
aufgefundenen gemeinsamen nukleolären bzw. Nukleolen-Antigene
zu reinigen und zu isolieren und damit spezifische
Antiseren zu reinigen und zu isolieren und damit spezifische
Antiseren bzw. Antikörper zu gewinnen. Die so erhaltenen
Antikörper werden dann zum immunologischen Nachweis von
Krebs verwendet.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch die in den
Ansprüchen definierten Maßnahmen erreicht.
Die Antigene wurden bei den verschiedensten menschlichen
Krebserkrankungen einschließlich Krebserkrankungen des
Zentralnervensystems, des Gastrointestinaltrakts, des Urogenitaltrakts,
der Lunge, der Haut, blutbildender Gewebe
und endokriner und exokriner Drüsen aufgefunden. Maligne
menschliche Zellen sind beispielsweise HeLa-Zellen, Prostatakarzinom,
sonstige Karzinome, Sarkome und hämatologische
Neoplasmen. Die Antigene können aus den Kernen oder Nukleolen
von menschlichen malignen Zellen extrahiert werden.
In den entsprechenden tumorfreien Geweben sind die Antigene
nicht auffindbar. Bei Durchführung solcher Diagnosemethoden
zum Nachweis maligner Zellen mit den erfindungsgemäß erhaltenen Antikörpern gab
es etwa 1% falscher negativer Ergebnisse und 3% falscher
positiver Ergebnisse. Diese falschen negativen Ergebnisse
kamen aus unbekannten Gründen bei nekrotischen Tumorgeweben
oder nicht-reaktionsfähigen Tumoren vor. Die falschen
positiven Ergebnisse wurden in zwei Fällen "präneoplastischer
Gewebe" erhalten. Ein schwachpositives Ergebnis kam
in gelegentlichen Herdbereichen bei "hyperplastischem Gewebe"
vor. Zwei herdpositive Bereiche wurden als "präneoplastische
Bereiche" oder neoplastischer Herdübergang bei entzündeten
Gastrointestinalgeweben identifiziert.
Die erfindungsgemäß isolierten Antigene liegen in einer Hauptart und
mindestens einer und möglicherweise mehrerer Antigenunterart(en) vor. Die
Hauptantigenart aus menschlichen Krebszellen besitzt (a) einen
diskreten isoelektrischen Punkt von 6,0 bis 6,7 und etwa
6,3, ermittelt durch isoelektrische Konzentration
bei einem pH-Wert von 3 bis 10 mittels eines Polyacrylamidgels;
(b) ein ungefähres Molekulargewicht von 50 000 bis
60 000 Dalton, ermittelt durch zweidimensionale Gelelektrophorese
unter Verwendung einer aus SDS (Natriumdodecylsulfat)
bestehenden zweiten Dimension; (c) es ist teilweise fest
an Kern- und Nukleolenribonukleoprotein gebunden und teilweise
in 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 8 löslich;
(d) es ist sowohl nukleolär als auch extranukleolär,
es bleibt jedoch in der Zellteilung "intranukleär" oder
chromosomenvergesellschaftet.
Die zweite erfindungsgemäße isolierte Antigenart besitzt einen pI-Wert
von etwa 6,0 (der in gleicher Weise wie bei der Hauptantigenart
ermittelt wurde) und ein Molekulargewicht von ebenfalls
50 000 bis 60 000 Dalton. Es ist möglich, daß diese zweite
Antigenart ein modifiziertes Produkt des Hauptantigens darstellt,
es wurde jedoch noch nicht bestimmt, ob es strukturverwandt
ist. Die Antigenunterart liegt in relativ geringerer
Konzentration vor als die Antigenhauptart.
Antigene finden sich auch in durch Ultrazentrifugieren der
Tris-Extrakte erhaltenen Nukleolen-Ribonukleoproteinteilchen
(vgl. die folgenden Ausführungen). Das in diesen Teilchen
enthaltene Antigen ist an Proteine und Ribonukleinsäure
fester gebunden als das Antigen in der tris-löslichen
Fraktion. Es ist noch nicht geklärt, warum die Antigene in
den Ribonukleoproteinteilchen identisch sind mit denen der
überstehenden Fraktion, ihre isoelektrischen Punkte sind jedoch
gleich und sie absorbieren die Antikörper (an die Antigene).
In Fibrillen, wahrscheinlich des Kernribonukleoproteinnetzes,
vorhandene Nukleolenantigene sind durch
Immunlichtmikroskopie ebenfalls in Krebszellen sichbar.
Hierbei handelt es sich um extra-nukleoläre Strukturen, die
Elemente repräsentieren können, aus denen die Ribonukleoproteinteilchen
herrühren.
Es bleibt noch zu bestimmen, ob die Antigene eine Substanz
darstellen, die in Krebszellen in hohen Konzentrationen und
in krebsfreien Zellen in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden
ist oder ob es sich um fötale Antigene handelt, wie
sie bereits früher bei den Vergleichsstudien mit Kernantigenen
des Ratten-Novikoff-Hepatoms und normalen Rattenleberzellen
gefunden wurden (vgl. Yeoman und Mitarbeiter, 1976).
Sämtliche Maßnahmen zur Gewinnung und Analyse von Proben
menschlicher Gewebe, Blut und Serum menschlicher Tumore
und sonstiger Gewebe verdächtiger Krebspatienten entsprechen
den Vorschriften des Human Research Committee at Baylor
College of Medicine, Houston, Texas und angeschlossener
Krankenhäuser. Schnitte menschlicher Tumore wurden aus
Gefrierschnitten chirurgischer Probeentnahmen, durch
Biopsie oder aus konservierten cryostatischen Proben hauptsächlich
aus dem Department of Pathology from the Houston
Veterans Administration Medical Center, the Michigan Cancer
Foundation in Detroit, Michigan und vom Department für
Innere Medizin der Karl's-Universität in Prag, CSFR, erhalten.
Diese Schnitte werden durch indirekte Immunofluoreszenz-
und Immunoperoxidasetechniken auf die Anwesenheit
nukleolärer Antigene analysiert.
Erfindungsgemäß wird die Reinigung der Antigene erreicht durch eine sechsmalige
Extraktion der Kerne oder Nukleolen mit 8 mM Tris-HCl-Puffer/0,1 mM
PMSF bei einem pH-Wert von 8 im Verhältnis 20
Volumina (Extraktionsmittel) auf 1 Volumen Kerne oder Nukleolen.
Der Extrakt wird zunächst 10 min lang mit 27 000×g
und danach 16 h mit 100 000×g zentrifugiert. Zur Entfernung
von Verunreinigungen arbeitet man mit Ammoniumsulfat
bei 40%iger Sättigung. Die 40 bis 100% Ammoniumsulfatfraktion
wird durch Zentrifugieren gesammelt und gegen
20 mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 7,6 dialysiert.
Die Antigene werden auf 1×10 cm DE-52 Cellulosesäulen
chromatographiert. Die Antigene werden in der 0,15 M
NaCl/0,1 mM PMSF-Fraktion (pH-Wert 7,6) eluiert. Durch isoelektrische
Konzentrierung erhaltene Gele dienen
zur Identifizierung und Reinigung der Antigene. Sie
enthalten 4% Acrylamid/8M Harnstoff/2% Ampholine (pH-Wert
3,5 bis 10). Die Antigene mit pI-Werten von 6,3 bzw. 6,0
werden aus den Gelen ausgeschnitten. Auf SDS (Natriumdodecylsulfat)-Gelen
zeigt es sich, daß jedes dieser Antigene einen
Hauptfleck liefert.
HeLa-Zellkerne oder -Nukleolen erhält man durch Sammeln von
HeLa-Zellen aus Spinnerkultur-Flaschen (7 bis 8 l). Die
Zellen sollten sein und waren in log-Phase 7 bis 8×10⁵
Zellen/ml. Die Zellen werden 8 min lang zur Bildung von
Zellplättchen mit 800×g zentrifugiert. Die Zellplättchen
werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 M
NaCl, 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,2) durch mäßige Homogenisierung
mit einem lockeren Pistill suspendiert und danach
8 min lang mit 800×g zentrifugiert. Danach werden die
Zellen ein zweites Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
gewaschen, worauf die Zellplättchen gewogen werden.
Nun werden die Zellplättchen unter schwachem Homogenisieren
in 20 Volumina eines Reticulocytstandardpuffers eines
pH-Werts von 7,4 suspendiert und 30 min lang auf Eis quellen
gelassen. Nach 8minütigem Zentrifugieren mit 1000×g
werden die Zellen durch schwaches Homogenisieren in dem
Reticulocytstandardpuffer (RSB) plus 1/20 Volumen des handelsüblichen
Detergens Nonidet P 40 (10%in RSB) resuspendiert.
Das Endvolumen Nonidet beträgt 0,5%. Die Zellen
werden mit einem handelsüblichen Homogenisator
homogenisiert, bis sie brechen
und die Kerne freigegeben und von Zytoplasma befreit werden.
Danach werden die Zellen 8 min lang mit 1000×g zentrifugiert,
durch schwaches Homogenisieren in 0,88 M Saccharose,
0,5 mM Mg-Acetat (20×Gewicht-Volumen) homogenisiert
und 20 min lang mit 1500×g zentrifugiert. Das erhaltene
Pellet enthält die HeLa-Kerne, die in der geschilderten
Weise zur Gewinnung der Antigenextrakte herangezogen werden.
Kerne aus anderen malignen Humanzellen erhält man in entsprechender
Weise.
Zur Isolierung der Nukleolen wird das in der geschilderten
Weise erhaltene Kernpellet durch schwaches Homogenisieren
in 0,34 M Saccharose, 0,5 mM Mg-Acetat unter Verwendung
von 2 ml Saccharose pro Gramm der ursprünglichen Zellen
suspensiert. Die Kerne werden dann unter Verwendung eines
handelsüblichen Ultraschallgebers mittels
10 s dauerndem Entladungsstoß und 10 s Ruhe beschallt.
Die Gesamtdauer beträgt 60 bis 110 s. Die
freigesetzten Nukleolen werden mikroskopisch geprüft.
Zum Sichtbarmachen der Nukleolen werden sie mit Azure C
(in Form einer Lösung von 1% Azure C in 0,25 M Saccharose)
angefärbt. Das Präparat sollte nach beendeter Beschallung
kernfrei sein. Die beschallte Fraktion wird
mit dem dreifachen Volumen 0,88 M Saccharose (ohne Mg-Acetat)
unterlegt und 20 min lang mit 1500×g zentrifugiert.
Das hierbei erhaltene Pellet enthält die HeLa-Nukleolen,
die als das Immunogen verwendet werden können.
Nach dem geschilderten Verfahren (vgl. Busch und Smetana,
1970) läßt sich üblicherweise eine akzeptable Reinigung
erreichen. Die Lichtmikroskopie zeigt, daß die Qualität
der erhaltenen Präparate im wesentlichen genügt. Eine
elektronenmikroskopische Analyse zeigt jedoch die Anwesenheit
von Chromatin und Kernverunreinigungen. Das Schlüsselproblem
im Hinblick auf eine angemessene Reinigung dieser
Präparate ist die begrenzte Menge ursprünglicher HeLa-Zellen
in den Kulturen, die die Anzahl der Rückreinigungsschritte
begrenzt. Aus 5 bis 10 g HeLa-Zellpräparaten gewonnene
Nukleolen liefern anders als bei der bisherigen
Verwendung von 0,5 bis 1 g HeLa-Zellpräparaten ausreichend
Material für eine angemessene Reinigung. Die Bedingungen
für die Züchtung der HeLa-Zellen und die Isolierung von
Plazentakernen sind im wesentlichen die gleichen wie bei
dem bekannten Verfahren (vgl. Davis und Mitarbeiter 1979).
Den HeLa-Tris-Extrakt erhält man durch Suspendieren der HeLa-Kerne
in einem NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Puffer
(10×Gewicht/Volumen, 1 g Kerne/10 ml Puffer; Puffer:
0,075 M NaCl, 0,025 M Na-Äthylendiamintetraessigsäure/pH-Wert
8, 1 mM PMSF). Das Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
wird mit Isopropanol auf eine Konzentration von 100 mM eingestellt.
Es wird jeder Lösung vor der Extraktion zugefügt.
Die Suspension wird mit einem handelsüblichen Homogenisator
homogenisiert und
5 min lang mit 3000×g zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wird gesammelt. Die geschilderten Extraktionsmaßnahmen
werden mit dem Kernpellet noch zweimal wiederholt.
Der NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Extrakt wird
bei den vorliegenden Antigenarbeiten nicht verwendet,
folglich wird er verworfen. Das Kernpellet wird in 10×Gewicht/Volumen
0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von
8 und in Anwesenheit von 1 mM PMSF suspendiert und mittels
eines handelsüblichen Homogenisators
homogenisiert. Es reicht allerdings auch
ein 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7 bis 9. Die
überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und auf Eis aufbewahrt.
Während der Tris-Extraktionen brechen die Kerne, wobei
Chromatin freigesetzt wird. Das Brechen der Kerne wird
mikroskopisch überwacht. Nun wird das Pellet in dem Tris-Puffer
resuspendiert, worauf die Kerne 15 min lang auf Eis
quellen gelassen werden. Danach erfolgt erneut eine Homogenisierung
mittels des handelsüblichen Homogenisators.
Nach 10minütigem
Zentrifugieren mit 12 000×g wird die überstehende Flüssigkeit
abgegossen und aufbewahrt. Das Pellet wird resuspendiert.
Es besitzt ein weißliches flaumiges Aussehen. Es
erfolgt eine erneute Homogenisierung mittels des handelsüblichen
Homogenisators. Danach wird 30 min lang mit 27 000×g
zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt
und mit den vorherigen überstehenden Anteilen der Tris-Extrakte
vereinigt.
Die Tris-Extrakte werden dann mittels einer handelsüblichen
Ultrafiltrations-Membran konzentriert. In der Regel
beträgt das Volumen zu Beginn etwa 50 ml, nach der Konzentration
4 bis 5 ml. Die Endkonzentration an Protein beträgt
etwa 4 bis 5 mg/ml. Mit diesem Tris-Extrakt kann das Kaninchen
immunisiert werden.
Mit Hilfe der geschilderten Maßnahmen können auch aus HeLa-Nukleolen
und Kernen oder Nukleolen anderer maligner Humanzellen
Extrakte bereitet werden.
Für das Tris-Immunogen werden mit 250 µl PBS eine 250 µl-Verdünnung
des Tris-Extrakts (4 bis 5 mg/ml) hergestellt.
Diese Verdünnung wird, wie für das Nukleolenimmunogen noch
beschrieben werden wird, mit dem Freund'schen Hilfsmittel
vereinigt.
Antikörper erhält man, wie folgt, durch Immunisierung von
Kaninchen mit HeLa-Zellen-Nukleolen-Präparaten. Die HeLa-Nukleolen
werden abgewogen (20 bis 30 mg Naßgewicht) und
gleichmäßig in 0,5 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung
eines pH-Wertes von 7,2 suspendiert. Danach werden
sie mit 0,6 ml Freund'schen Kompletthilfsmittels gemischt.
Zu diesem Zweck werden die suspendierten Nukleolen in eine
5 ml-Spritze aufgezogen, das Freund'sche Hilfsmittel
wird in eine zweite Spritze aufgezogen. An jede Spritze
wird eine Nadel Nr. 18, von der die Spritze entfernt worden
war, angebracht. Danach werden die Nadeln mit einem Stück
Polyäthylenschlauch verbunden. Nun werden die Spritzeninhalte
miteinander gemischt, bis das Präparat dick wird und
es Schwierigkeiten bereitet, es durch den Schlauch zu treiben.
Nachdem das Versuchskaninchen auf dem Rücken rasiert worden
war, erhält es an sechs Stellen intradermale Injektionen
(0,1 ml/Stelle). Die restlichen 0,4 bis 0,5 ml werden halbsubkutan,
d. h. unter die lose Haut an den Schultern, und
halbintramuskulär in den Oberschenkelmuskel injiziert.
Drei Wochen lang werden einmal pro Woche ähnliche Mengen
an Nukleolen injiziert. Das erste Mal wird 7 bis 10 Tage
nach der dritten Immunisierungswoche Blut abgezapft. Zum
Sammeln des Blutes bedient man sich eines handelsüblichen
Kaninchenohrbechers und einer Vakuumpumpe. Das Blut (etwa
45 bis 50 ml) wird 3 bis 4 h lang bei Raumtemperatur gerinnen
gelassen. Nach Entfernen des Serumteils aus dem Rohr
wird es 30 min lang bei 1000×g zentrifugiert (hierbei
werden sämtliche freien roten Blutkörperchen wegsedimentiert).
Das klare Serum wird gesammelt und dann absorbiert
(oder bis zur Durchführung der Absorption gefroren
gehalten). Der Blutpfropfen kann über Nacht im Kühlschrank
gelagert werden. Hierbei werden einige weitere
ml Serum freigegeben. Das Serum aus jeder Blutentnahme
wird nun durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse auf
die Anwesenheit von Nukleolenantikörpern hin untersucht.
Andere nichtmenschliche Wirte, z. B. Ziegen, Schafe, Pferde,
Geflügel und dgl., können mit malignen Humanzellennukleolenpräparaten
immunisiert werden, um die Bildung
der erfindungsgemäßen Antiseren oder Antikörper gegen
Nukleolenantigene zu provozieren. Antiseren erhält man
auch durch Immunisierung nichtmenschlicher Wirttiere mit
Extrakten, z. B. dem Tris-Extrakt, maligner Humanzellenkerne
oder -nukleolen.
Die Absorption von Antinukleolärantiserum erfolgt derart,
daß zunächst das Kaninchenantiserum mit 20% Normalhumanserum
und 20% fötalem Kalbserum absorbiert wird. Zu diesem
Zweck wird 20%iges Normalhumanserum zu dem Kaninchenantiserum
(4 ml/20 ml) zugegeben, worauf das Ganze 1 h lang
in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Nach
Herausnahme des Kolbens aus dem Wasserbad wird 20%iges
fötales Kalbserum (4,8 ml/24 ml) zugegeben, worauf erneut
1 h lang in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird.
Danach wird der Kolben aus dem Wasserbad herausgenommen
und 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der
Kolbeninhalt alle 15 min durch schwaches Verquirlen durchgemischt
wird. Danach wird der Kolbeninhalt 30 min lang
mit 15 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit,
d. h. das absorbierte Serum, wird entfernt und aufbewahrt.
Unter Durchführung der im folgenden für die (NH₄)₂SO₄-Fällung
des Serums beschriebenen Maßnahmen wird das absorbierte Serum
in die Immunoglobulin (Ig)-Form umgewandelt.
Das Immunoglobulinpräparat aus dem Nukleolenantiserum,
das mit Normalhumanserum und fötalem Kalbserum absorbiert
wurde, wird nun mit normalem Humangewebe, Plazenta
oder Leber, absorbiert. Zu diesem Zweck wird das absorbierte
Nukleolenimmunoglobulin (10 ml Ig plus 10 ml des
beim Beschallen angefallenen Kernpräparats) mit einem
gleichen Volumen von beim Beschallen angefallenem Plazentakernpräparat
in PBS 7,2 (10 bis 15 mg Protein/ml)
versetzt, worauf das Ganze 1 h lang in einem 37°C warmen
Rüttelwasserbad inkubiert wird. Danach wird das Ganze eine
weitere h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der Kolbeninhalt
alle 15 min lang durch leichtes Durchquirlen
gemischt wird. Schließlich wird der Kolbeninhalt 30 min
lang bei 15 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
wird gesammelt, worauf das absorbierte Ig, wie
beschrieben, mit (NH₄)₂SO₄ umgefällt wird. Dieses Ig kann
als endgültiges Antikörperprodukt verwendet oder durch
Diäthylaminoäthylcellulosechromatographie weiter gereinigt
werden.
Das in der 0,01 M phosphatgepufferten Kochsalzlösung eines
pH-Werts von 7,2 enthaltene Ig wird gegen 0,0175 M Phosphatpuffer
eines pH-Werts von 6,3 (ohne physiologische Kochsalzlösung)
dialysiert. Nach der Dialyse wird es 20 min
lang mit 2500×g zentrifugiert. Nun wird die überstehende
Flüssigkeit auf die Diäthylaminoäthylcellulosesäule
gegossen (20 mg Protein pro g Cellulose). Das IgG wird
aus der Säule mit dem 0,0175 M Phosphatpuffer eluiert.
Nach dem Eluieren wird die IgG-Fraktion gegen die 0,01 M
phosphatgepufferte Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,2
dialysiert.
Dieselben Maßnahmen werden mit dem Kontrollserum durchgeführt.
Das Kontrollserum besteht aus Präimmunserum, das
aus dem Kaninchen oder einem sonstigen nichtmenschlichen
Wirttier abgenommenen Blut vor Beginn der Immunisierung
gewonnen wurde.
Kaninchenimmunoglobulin Ig erhält man wie folgt: eine kalte
gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung (760 g/l) wird unter Rühren
im gleichen Volumen zu dem Antiserum zutropfen gelassen.
Der hierbei ausfallende Niederschlag wird zum Zusammenballen
1,5 bis 2 h lang mittels eines Magnetrührers in der
Kälte gerührt. Danach wird das ausgefallene Antiserum 20 min
lang mit 3000×g zentrifugiert. Nach Entfernen der überstehenden
Flüssigkeit wird das Pellet im etwa halben Volumen
(des ursprünglichen Serums) PBS eines PH-Werts von 7,2
resuspendiert. Das löslichgemachte Pellet wird in einen
Dialysebeutel gefüllt und über Nacht in der Kälte unter
Rühren mit einem Magnetrührer gegen 100 Volumina PBS dialysiert.
Am folgenden Morgen wird der Dialysebeutel in
frisches PBS (100faches Volumen) gelegt und die Dialyse
6 h lang fortgesetzt. Hierauf wird das Immunoglobulin sorgfältig
aus dem Dialysebeutel entfernt und 20 min lang mit
2500 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt.
Die Immunofluoreszenzanalyse wird gemäß dem von Busch und
Mitarbeitern 1974 und Hilgers und Mitarbeiteren 1972 beschriebenen
Verfahren wie folgt durchgeführt: 150 µl Antinukleolenantiserum,
das auf 1 : 50 verdünnt worden war, werden auf
acetonfixierte HeLa-Zellen oder fixierte Gewebeproben (vgl.
Hilgers und Mitarbeiter 1972 und Busch und Mitarbeiter 1974)
aufgebracht. Wenn die Gewebeprobe einen großen Abschnitt
des Objektträgers bedeckt, kann es erforderlich sein, mehr
als 150 µl zu verwenden. Die Verdünnung des Antiserums)(As)
hängt vom Antikörper (Ab)-Titer ab. Weitere Verdünnungen
können bis zu dem Punkt, an welchem As- und Ab-Verdünnungen
zu stark verdünnt werden, um ein positives Ansprechen
auf bekannte positive Zellen (beispielsweise HeLa-Zellen)
feststellen zu können, verwendet werden. Die Objektträger
werden in einer feuchten Kammer 45 bis 50 min lang bei einer
Temperatur von 37°C inkubiert. Die feuchte Kammer kann
aus einer großen Petrischale, in die ein feuchtes Papiertuch
einbebracht wurde, bestehen. Nach der Inkubation wird
das Antiserum durch vorsichtige Zugabe von PBS vom Objektträger
abgewaschen. Danach werden die Objektträger in einen
Objektträgerhalter gestellt und 1 h lang in PBS gewaschen.
Das PBS wird dreimal, nämlich nach 15, 30 bzw. 45 min
gewechselt. Hierauf werden die Objektträger aus dem
PBS herausgenommen und zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen
in destilliertes oder entionisiertes Wasser getaucht.
Danach werden die Objektträger mittels eines Gebläses
oder Haartrockners 2 bis 3 min lang mit kalter Luft
getrocknet, wobei darauf geachtet wird, daß keine Übertrocknung
stattfindet. Nun werden auf die Objektträger
150 µl von mit Fluoreszein markiertem Ziegenantikaninchenantiserum
(Hyland oder Cappel), das auf 1 : 10 verdünnt worden
war, aufgebracht, worauf das Ganze bei Raumtemperatur
30 bis 35 min in der feuchten Kammer inkugiert wird. Durch
vorsichtiges Waschen mit PBS wird auch der zweite Antikörper
vom Objektträger entfernt, worauf die Objektträger
1 h lang mit PBS gewaschen werden. Die Waschflüssigkeit
wird hierbei nach 15, 30 bzw. 45 min gewechselt. Andererseits
können die Objektträger nach 15minütigem Waschen
in frisches PBS gelegt und darin über Nacht im Kühlschrank
belassen werden. Nach der letzten Wäsche mit PBS
werden die Objektträger zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen
in entionisiertes oder destilliertes Wasser getaucht.
Schließlich werden sie mit Kaltluft 2 bis 3 min lang
mit Hilfe eines Gebläses oder Haartrockners getrocknet.
Nun werden auf die Zellen oder die Gewebeprobe eine 1 : 1-Lösung
von Glycerin und PBS aufgebracht und die Objekte mit
einem Deckglas bedeckt. Wenn das Deckglas mit Hilfe eines
Dichtungsmittels, z. B. klarem Nagellack, mit dem Objektträger
verbunden und das Ganze kühl gelagert wird, kann
das Präparat mehrere Monate lang aufbewahrt werden. Schließlich
wird das Präparat mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Bei dem Präimmunoglobulin oder bei Präimmun-IG-Fraktionen
ist keine Nukleolenfluoreszenz feststellbar.
Die anderen immunologischen Techniken entsprechen den
von Kendall 1938, Lowry und Mitarbeitern 1951, Dale und
Latner 1969, Laurell 1972, Wallace und Mitarbeitern 1974
und Marashi und Mitarbeitern 1979 beschriebenen Techniken.
Zur Analyse der Nukleolen-Immunofluoreszenzlokalisierung
werden Präparate während der Fluoreszenzbeobachtung in
Phasenkontrastbeleuchtung ein- und ausgeschaltet.
Anstelle des mit Fluoreszein markierten Ziegenantikaninchenantiserums
kann man sich auch der Immunoperoxidasemethode
bedienen. So werden beispielsweise 150 µl von mit Peroxidase
markiertem Ziegenantikaninchenantiserum, das auf 1 : 10
oder 1 : 20 verdünnt worden war, zugegeben. Die lokalisierte
Peroxidaseaktivität läßt sich mit Hilfe einer Reihe von
Redoxfarbstoffsystemen zur licht- oder elektronenmikroskopischen
Prüfung nachweisen. Als Markierungen für eine indirekte
Methode können auch andere Enzyme herangezogen werden.
Ferner können Peroxidase und andere Enzyme bei einem
direkten Verfahren eingesetzt werden, indem der primäre
Antikörper markiert wird. Die Herstellung des Karnofsky'schen
Inkubationsmediums geschieht wie folgt: nach dem Abwiegen
wird eine genügende Menge Diaminobenzidin in 0,05 M Tris-HCl-Puffer
eines pH-Werts von 7,6 suspendiert, um die Konzentration
auf 0,5 mg/ml einzustellen. Danach wird in dem
0,05 M Tris-HCl-Puffer eine 0,02%ige Wasserstoffperoxidlösung
zubereitet. Die 0,5 mg/ml enthaltende Diaminobenzidinsuspension
und die 0,02%ige H₂O₂-Lösung werden im Verhältnis
1 : 1 gemischt. Diese Mischung wird bei Gebrauch jeweils
frisch zubereitet und während ihrer Zubereitung kühl
gehalten. 200 bis 300 µl des erhaltenen Gemischs werden
auf den Objektträger aufgebracht, worauf das Ganze bei
Raumtemperatur 30 min lang in einer feuchten Kammer inkubiert
wird.
Nach der Inkubation wird das Diaminobenzidin/H₂O₂-Gemisch
vom Objektträger mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts
von 7,6, dem 0,1 M NaCl zugefügt worden war, abgewaschen.
Die Objektträger werden 10 min lang in 0,05 M Tris-HCl-Puffer
eines pH-Werts von 7,6, der 0,1 M an NaCl war, gewaschen.
Die Endbehandlung der Objektträger erfolgt wie in Stufen
11 bis 14 (wobei jedoch anstelle des PBS Tris-HCl verwendet
wird). Die fertigen Präparate werden unter einem Lichtmikroskop
untersucht.
Objektträger mit HeLa-Zellen zur Immunofluoreszenzanalyse
werden wie folgt hergestellt: durch Entfernen und Waschen
aktiv wachsender Zellen aus der HeLa-Kulturflasche mit PBS
eines pH-Werts von 7,2 wird ein Vorrat an fixierten HeLa-Zellen
gewonnen. Die Zellen werden derart suspendiert, daß
die Konzentration mindestens 1,5×10⁶ Zellen/ml beträgt.
1 Tropfen der HeLa-Zellensuspension wird auf jeden gewaschenen
Objektträger (mit einem Detergens gesäubert, mit
destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen, mit
Alkohol gesäubert, gespült und mit Heißluft aus einem Haartrockner
getrocknet) aufgebracht, sich etwas ausbreiten
gelassen und dann bei Raumtemperatur oder in der Kälte über
Nacht trocknen gelassen. Die getrockneten Zellen werden
fixiert, indem die Objektträger 12 min bei einer Temperatur
von 4°C in Aceton gelegt werden. Danach werden die Objektträger
mit einem Glasmarkierungsstift mit Diamantspitze
numeriert. Die Objektträger dienen als positive Vergleichsproben
für die Immunofluoreszenzanalyse.
Die Untersuchungen haben gezeigt, daß in Tumorzellen, nicht
dagegen in tumorfreien Geweben, nukleoläre Antigene bzw.
Nukleoantigene enthalten sind. Voruntersuchungen zeigten,
daß sowohl in Zellkulturen, in menschlichen Tumoren
und in Autopsie- oder Biopsieproben nach der Doppelantikörpermethode
(indirekte Immunofluoreszenz) eine helle
Nukleolenfluoreszenz auftritt. Ein entsprechendes Ergebnis
erreicht man nicht bei einer Reihe von tumorfreien Geweben
(vgl. Davis und Mitarbeiter 1979). Bei späteren Untersuchungen
wurden mehr als maligne Tumore untersucht
und die verschiedensten Gewebevergleichsproben beurteilt.
Es ist von großem Interesse, daß die verschiedensten malignen
Tumore ektodermalen, endodermalen oder mesodermalen
Ursprungs ein oder mehrere gemeinsames (gemeinsame) Nukleolenantigen(e)
enthalten (Tabelle I).
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Normale Gewebe: bei 17 tumorfreien Geweben ist nach der Inkubation
der Antiseren oder Antikörper mit den verschiedensten
fixierten Zellpräparaten keine Nukleolenfluoreszenz
feststellbar. Es ist von besonderem Interesse, daß weder
die Malipigische Hautschicht noch die Zellen des Knochenmarks
noch die Lieberkühn'sche Krypten bei diesen Maßnahmen
eine positive Immunofluoreszenz zeigen. Darüber hinaus
sind die verschiedensten Neoplasmen benachbarte tumorfreie
Gewebe ebenfalls negativ. Hierbei wurden die verschiedensten
Gewebearten untersucht. Es wurde eine Gruppe benigner
Tumore einschließlich verschiedener Arten von Schilddrüsenadenomen
untersucht. Hierbei wurden ebenfalls negative Ergebnisse
erzielt (vgl. Tabelle II).
Entzündliche Verletzungen bzw. Läsionen: Um sicherzustellen,
ob ein entzündliches Ansprechen zum Auftreten dieser Antigene
in Beziehung steht, wurden 8 Arten entzündlicher Gewebe
untersucht. Bei den meisten dieser Gewebe war keine
Fluoreszenz in den Nukleolen der untersuchten Zellen feststellbar.
Es fanden sich jedoch Abschnitte in Proben ulzerativer
Colitis und von Magengeschwüren, die eine positive
Nukleolenfluoreszenz zeigten. Zwei oder drei Schnitte der
ulzerativen Colitis waren negativ, einer zeigte eine definitive
positive Nukleolenfluoreszenz. Bei den Magengeschwüren
zeigte einer der beiden analysierten Schnitte
eine positive Nukleolenfluoreszenz. Diese Ergebnisse
sind insbesondere im Hinblick auf die bekannte Neigung
dieser Läsionen, eine maligne Änderung zu erfahren, von
Interesse. Von speziellem Interesse war es auch, sowohl
die positiven als auch negativen Herdbereiche dieser Präparate
in den hämatoxylineosingefärbten Schnitten zu untersuchen.
Diese zeigten in der Tat Bereiche in diesen
Läsionen, die nicht nur mitotische Erscheinungen sondern
auch eine Anhäufung der Epitheliaauskleidung
aufweisen. Somit ist es naheliegend, daß diese Zellen präneoplastische
Läsionen oder ein Karzinom in situ darstellen.
Es ist möglich, daß das Auffinden dieser fluoreszierenden
Bereiche eine Entscheidungshilfe bezüglich einer
entweder lokalen oder mehr generalisierten chirurgischen
Resektion der betroffenen Läsionen bietet.
Artifakten: Im Magenepithel gibt es in jeder Zelle einen
Fluoreszenzbereich, der nichtnukleolär ist. Offensichtlich
handelt es sich hierbei um eine nichtspezifische
Lokalisierung des fluoreszierenden Antikörpers. In einer
Krypte des Dünndarms tritt offensichtlich eine nichtspezifische
Lokalisierung des Antikörpers in Form von
Aggregaten auf. In den meisten Fällen lassen sich diese
Aggregate durch Vorfiltrieren der Antikörper durch ein
0,45 µm Filter beseitigen. In einer Probe Brustgewebe,
die bezüglich einer Nukleofluoreszenz negativ war,
waren kleine nichtspezifische immunolfuoreszierende Flecken
ohne spezielle Lokalisierungsmerkmale bezüglich der
Zellmorphologie allgemein verteilt. Die Durchmesser dieser
sehr kleinen nichtspezifischen Ausfällungen betragen
0,5 bis 0,1 µm im Vergleich zu den Nukleolen-Durchmessern
in den Kernen und Nukleolen, die 4 bis 6 µm betragen.
Floureszenz während der Phasen des Zellzyklus:
Die Nukleolenfluoreszenz war in den Interphasennukleoen
ohne weiteres sichtbar. In der Metaphase war die Nukleolenfluoreszenz
nicht als abgegrenzte Einheit sondern zwischen
den Chromosomen und in dem angrenzenden Bereich zwischen
dem Kern und dem Cytoplasma sichtbar. Insoweit die Nukleole
während der Metaphase im wesentlichen verschwindet und
die rRNS-Synthese in der späten Prophase aufhört, war es
nicht überraschend, daß die Nukleolenfluoreszenz in solchen
Zellen nicht als abgegrenzte Einheit sichtbar war
(Tan und Lerner 1972). Die Erkenntnis, daß Reste der immunofluoreszierenden
Produkte die gesamte Mitose überdauern,
legt jedoch die Vermutung nahe, daß die nukleolären Substrukturen
anders als die nukleolären Produkte die Antigene,
die epigenetisch "überleben" enthalten.
Negative Ergebnisse bei malignen Tumoren:
In der Reihe maligner Tumore haben sich bei den Objektpräparaten
negative Bereiche verschiedener Ausmaße gezeigt.
In der Regel stimmten diese mit entweder nekrotischen oder
abgeeiterten Teilen des Neoplasmas überein. Bei einer Gehirntumorprobe
war die Masse, die keine positive Fluoreszenz
aufwies, nekrotisch. Es waren zahlreiche Leukozyten
vorhanden, eine abgegrenzte Struktur fehlte jedoch. Ein
Adenokarzinom, das Metastasen ins Gehirn ausgesandt hatte,
zeigte keine positive Fluoreszenz, die Gründe hierfür
konnten nicht geklärt werden. Da jedoch von 63 untersuchten
Tumoren 61 eine positive Nukleolenfluoreszenz zeigten,
waren 97% der Reihenuntersuchung positiv. Diese Untersuchungen
sind nun auf über 300 menschliche Krebsarten einschließlich
einer Reihe von Krebsarten der Brust, Prostata
und Lunge sowie hämatologischen Tumoren, mit ähnlichen Ergebnissen
ausgedehnt.
Direkte immunochemische Methoden zur Sichtbarmachung
der Antikörper umfassen eine Markierung des primären
Antikörpers mit mindestens einer der folgenden Markierungen:
Radioisotope zur Autoradiographie, wie ¹²⁵I, ¹³¹I,
¹⁴C oder ³H, fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoreszein
oder Tetramethylrhodamin zur Fluoreszenzmikroskopie, Enzyme,
die fluoreszierende oder farbige Produkte zum Nachweis
durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie liefern oder
die elektronendichte Produkte zum Nachweis durch Elektronen
mikroskopie bilden oder elektronendichte Moleküle, wie
Ferritin, zur direkten elektronenmikroskopischen Sichtbar
machung.
Indirekte immunochemische Methoden umfassen eine Markierung
des zweiten Antikörpers oder eines sonstigen Binde
proteins, das für den ersten Antikörper spezifisch ist,
mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einer elektronen
dichten Verbindung, einem Enzym, das ein durch licht-,
fluoreszenz- oder elektronenmikroskopische Analyse nach
weisbares Produkt liefert oder ein durch Autoradiographie
bestimmbares Radioisotop.
Indirekte immunochemische Methoden zum Sichtbarmachen der
Antikörper beinhalten eine Anwendung primärer oder sekundärer
Hybridantikörper oder Antikörperfragmente (F(ab′)₂),
wobei ein Teil der Hybridantikörperzubereitung für die
Nukleolenantigene (hybrider primärer Antikörper) oder für
den primären Antikörper (hybrider zweiter Antikörper) und
ein (anderer) Teil für eine Markierung der genannten Art
spezifisch ist.
Markierte konjugierte und nichtkonjugierte Antikörper können
getrennt in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalz
lösung oder in sonstigen gepufferten Suspendiermitteln
zum Vertrieb als Diagnoseeinheit untergebracht sein. Geeignete
Suspendiermittel sind Glycerin, Heparin oder Saccharose.
Geeignete Puffer sind Barbitalpuffer, Morpholinpuffer,
MOPS-3-(N-morpholino)propansulfonsäure, Hepes-N-2-
hydroxyäthylpiperazin-N-2-äthansulfonsäure, tris-Carbonat
und dgl.
Claims (12)
1. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in
Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen gefundene
Antigene spezifisch sind, durch Immunisierung von
(nicht-human) Wirtssäugetieren mit in Nukleolen und Kernen
von menschlichen Krebszellen auftretenden Antigenen und
Ernten der Antikörper der immunisierten Wirtssäugetiere,
dadurch gekennzeichnet, daß man zur
Immunisierung Antigene verwendet, die (a) einen diskreten
isoelektrischen Punkt von 6,0 bis 6,7 aufweisen, ermittelt
durch isoelektrische Konzentration bei einem pH-Wert von
3 bis 10 mittels eines Polyacrylamidgels; (b) ein Molekular
gewicht von 50 000 bis 60 000 Dalton aufweisen, ermittelt
durch zweidimensionale Gelelektrophorese unter
Verwendung einer aus SDS (Natriumdodecylsulfat) bestehenden
zweiten Dimension; (c) teilweise fest an Kern- und
Nukleolenribonukleoprotein gebunden und teilweise in
0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8 löslich;
(d) sowohl nukleolär als auch extranukleolär, jedoch in
der Zellteilung "intranukleär" oder chrommosomenvergesell
schaftet sind,
wobei die Antigene gereinigt werden durch
- a) sechsmalige Extraktion der Kerne oder Nukleolen mit 8 mM Tris-HCl-Puffer/0,1 mM PMSF bei einem pH-Wert von 8,
- b) Zentrifugation des Extrakts zunächst 10 min lang mit 27 000 × g und danach 16 h mit 100 000 × g,
- c) zur Entfernung von Verunreinigungen Sättigung mit Ammoniumsulfat bei 40%,
- d) Sammeln der 40 bis 100% Ammoniumsulfatfraktion durch Zentrifugieren und Dialyse gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6,
- e) Chromatographie der Antigene auf DE-52 Cellulosesäulen und einer Elution in der 0,15 M NaCl/0,1 mM PMSF- Fraktion (pH-Wert 7,6) und
- f) isoelektrische Konzentrierung in Gelen, bestehend aus 4% Acrylamid/8 M Harnstoff/2% Ampholine (pH-Wert 3,5 bis 10), wobei die Antigene mit pI-Werten von 6,3 bzw. 6,0 aus den Gelen geschnitten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man Antikörper gewinnt, deren Bildung durch aus malignen
Humanzellen in Form von HeLa-Zellen, Karzinomen, Sarkomen
und hämatologischen Neoplasmen isolierte Nukleolen ausge
löst wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man Antikörper gewinnt, deren Bildung durch aus
menschlichen Prostatakarzinomzellen isolierte Nukleolen
ausgelöst wurde.
4. Verwendung der Antikörper, hergestellt nach dem Verfahren
der Ansprüche 1 bis 3 zum immunologischen Nachweis von
Krebs in menschlichen Gewebeschnitten, Abstrichen und Ab
blätternden zytologischen Präparaten, dadurch gekenn
zeichnet, daß man das Untersuchungsmaterial mit den Anti
körpern in Berührung bringt und die Lokalisierung dieser
Antikörper in den Nukleolen maligner Zellen, jedoch nicht
in denjenigen normaler Zellen aufzeigt.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Lokalisierung der Antikörper mittels immunochemischer
Maßnahmen direkt oder indirekt sichtbar macht.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß man die primären Antikörper mit einem
durch Autoradiographie nachweisbaren Radioisotop, einem
durch Fluoreszenzmikroskopie nachweisbaren fluoreszierenden
Farbstoff, einem Enzym, das ein durch Fluoreszenz-
oder Lichtmikroskopie nachweisbare fluoreszierendes
oder farbiges Produkt liefert, einem Enzym, das ein
durch Elektronenmikroskopie nachweisbares elektronen
dichtes Produkt liefert und/oder einem durch direkte
Sichtbarmachung auf elektronenmikroskopischem Wege nach
weisbaren elektronendichten Molekül markiert.
7. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Radioisotop ¹²⁵I, ¹³¹I,
¹⁴C und/oder ³H verwendet.
8. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man als fluoreszierenden Farbstoff
Fluoreszein und/oder Tetramethylrhodamin einsetzt.
9. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man als ein durch Fluoreszenz- oder
Lichtmikroskopie nachweisbare fluoreszierendes oder
farbiges Produkt lieferndes Enzym Peroxidase, β-Galactosi
dase, alkalische Phosphatase oder Cytochrom C einsetzt.
10. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man als zur direkten Sichtbarmachung
auf elektronenmikroskopischem Wege nachweisbare elektronen
dichtes Molekül Ferritin, Hämocyanin, Virusteilchen
oder Latexkügelchen verwendet.
11. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man den immunologischen Nachweis von Krebs
durch indirekte immunochemische Darstellung der
Antikörper führt, wobei man markierte zweite Anti
körper und/oder sonstige für die primären Antikörper
oder deren Modifikationen spezifische Bindeproteine
mit verwendet.
12. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche
4 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man nur
Bruchstücke (F(ab′)₂) der Antikörper verwendet.
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