DE3047654C2

DE3047654C2 -

Info

Publication number: DE3047654C2
Application number: DE3047654A
Authority: DE
Inventors: Harris Busch; Rose K. Busch; Ferenc Gyorkey; Phyllis Gyorkey; Frances M. Houston Tex. Us Davis; Karel Prag/Praha Cs Smetana
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1980-01-04
Filing date: 1980-12-17
Publication date: 1990-12-20
Also published as: PH18624A; IE50760B1; PH18636A; GR72850B; GB2067286A; SE8100011L; KR850001770B1; BE886935A; AR232046A1; GB2067286B; LU83015A1; PH18129A; ES498305A0; OA06713A; SE450665B; DK554980A; ZA807754B; FR2484650A1; NL8007128A; IT1172216B

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen gefundene Antigene spezifisch sind, sowie die Verwendung der so erhaltenen Antikörper zum Nachweis von Krebs nach Anspruch 4. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens und die Ansprüche 5 bis 12 der Verwendung.

Frühere Untersuchungen bei Versuchstieren haben gezeigt, daß in Tumoren Kernantigene und nukleoläre Antigene vorkommen, die in tumorfreien Geweben nicht gefunden werden (vgl. R. K. Busch und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 34, Seite 2362, 1974; Yeoman und Mitarbeiter in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" Band 73, Seite 3258 (1976); Busch und Busch in "Tumori" Band 63, Seite 347 (1977); Davis und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 38, Seite 1906 (1978) und Marashi und Mitarbeiter in "Cancer Res." Band 39, Seite 59 (1979)). Bei diesen früheren Untersuchungen wurden durch Immunisierung von Kaninchen Antikörper gegen Nukleolen normaler und neoplastischer Zellen von Ratten gewonnen (vgl. R. K. Busch und Mitarbeiter a.a.O.; Busch und Busch a.a.O. und Davis und Mitarbeiter a.a.O.). Durch die indirekte Immunofluoreszenzmethode konnte bei den acetonfixierten Zellen eine helle nukleoläre Fluoreszenz gezeigt werden. Es hat sich ferner gezeigt, daß die Immunopräzipitinbanden in Ouchterlonygelen, die mit aus Novikoffhepatom-Nukleolen von Ratten extrahierten Antiseren gegen Novikoffhepatom-Nukleolenantigene erzeugt wurden, sich von den entsprechenden Immunopräzipitinbanden, die mit Lebernukleolenantigenen und Antilebernukleolenantiseren gebildet wurden, unterscheiden (vgl. Busch und Busch a.a.O.).

Als Beleg für eine weitere Spezifizierung dient die Erkenntnis, daß Antitumornukleolenantiserum mit absorbierten Leberkernextrakten bei Novikoffhepatomasziteszellen, nicht dagegen bei Leberzellen eine positive nukleoläre Fluoreszenz zeigen. Umgekehrt ergibt Antilebernukleolenantiserum mit absorbierten Tumornukleolenextrakten zwar bei Lebernukleolen eine positive Fluoreszenz, nicht dagegen eine nachweisbare Tumornukleolenfluoreszenz (vgl. Davis und Mitarbeiter a.a.O.)

Insoweit eine Immunofluoreszenzanalyse zeigt, daß bei acetonfixierten Tumorabstrichen und normalen Rattenzellenabstrichen (insbesondere nach Absorption der Antiseren mit normalen Leberkernen und -nukleolen) Unterschiede feststellbar sind, wurde versucht, diese Antiseren gegen Rattentumornukleolenantigene zum Testen entsprechender Gewebeproben aus menschlichen Tumoren auszunutzen. Untersuchungen mit Antikörpern gegen Nagertumornukleolen zeigten, daß bei menschlichen Tumornukleolen keine positive Immunofluoreszenz feststellbar ist. Im Hinblick darauf wurde eine Versuchsreihe zur Auffindung von Humannukleolenantigenen begonnen. Dabei konnte in menschlichen Tumorgeweben mit Antiseren und Antikörpern gegen diese neuen Humantumornukleolenpräparate eine positive Immunofluoreszenz gefunden werden. Bei diesen Untersuchungen wurden die Antikörper an Plazentakernsonikate sowie fötales Kalbserum absorbiert (vgl. Busch und Mitarbeiter "Cancer Res." Band 39, Seite 3024 (1979); Davis und Mitarbeiter "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" Band 76, Seite 892 (1979) und Smetana und Mitarbeiter in "Life Sci." Band 25, Seite 227 (1979)).

Die vorliegende Erfindung beruht auf Untersuchungen bezüglich der Ausnutzbarkeit dieser neuen Humannukleolenantigene zum Nachweis eines breiten Bereichs von Humanneoplasmen.

Die folgende Tabelle I gibt eine Aufstellung derjenigen menschlichen Tumore, bei denen mit den Antikörpern gegen menschliche Tumornukleolen eine helle nukleoläre Immunofluoreszenz feststellbar ist. Diese Untersuchungen stützen die überraschende und unerwartete Erkenntnis, daß zahlreiche menschliche Tumore gemeinsame nukleoläre Antigene bzw. Nukleolenantigene, die mit Antiseren oder Immunoglobulinfraktionen solcher Antiseren eine positive Immunofluoreszenz zeigen, enthalten (vgl. Busch und Mitarbeiter a.a.O.).

Tabelle I Helle Nukleolenimmunofluoreszenz bei menschlichen Tumoren (aus Busch und Mitarbeiter (1979)) I. Karzinome

1. Blase, Übergangszellen
2. Gehirn
Astrozytom
Glioblastom
3. Dickdarm, Adenokarzinom (4)
Metastase: Leber
transplantierbares Karzinom (GW-39)
4. ekkrine Drüse, Karzinom
5. Speiseröhre, Squamöses Zellkarzinom
6. Leber, Primärkarzinom
7. Lunge:
Adenokarzinom (2)
Haferzellen
Squamöse Zellen (5)
8. Melanom, maligne, zerebrale Metastasen
9. Prostata, Adenokarzinom (4)
10. Haut: basales Zellkarzinom (2)
squamöses Zellkarzinom (7)
Metastase: Lymphknoten
11. Magen, Adenokarzinom
Metastase: Leber
Metastase: Lymphknoten
12. Schilddrüse, Karzinom (2)

II. Sarkome

1. Myoblastom, bösartig auf den Lippen
Metastase auf zervikalen Lymphknoten
2. Osteogenes Sarkom (3), Biopsie, Gewebekultur,
3. Synovialsarkom
4. Lymphom (4), Nicht-Hodgkins

III. Hämatologische Neoplasmen

1. Hodgkins'sche Erkrankung (Reed Sternberg, 5)
2. Leukämie: CLL (5), haarige Zellen (Milz)
3. Lymphom, lymphozytisch, Milz
4. Multiples Myelom (5)
5. Mycosis fungoides
6. Akute myelozytische Leukämie (5)
7. Chronische myelozytische Leukämie (5)
8. Akute monozytische Leukämie (2)

IV. Kulturen

1. Brustkarzinom
2. Dickdarmadenokarzinom
3. HeLa
4. HEp-2
5. Prostata, Karzinom (3)
6. Squamöses Zellkarzinom (3)

*) Die Zahlen in Klammern bedeuten die Anzahl der Fälle.

In tumorfreien Geweben, gutartigen Tumoren und bei entzündlichen Zuständen sind in der Regel, wie die folgende Tabelle II ausweist, negative Ergebnisse feststellbar (vgl. Busch und Mitarbeiter a.a.O.).

Tabelle II Negative Immunofluoreszenz bei Humangeweben (aus: Busch und Mitarbeiter (1979)) I. Normale Gewebe

1. Blase
2. Knochenmark (hämoblastische Formen, 5)*)
3. Brust
4. Leukozytenfilm im zentrifugierten Blut (3)
5. Gallenblase
6. Dünndarm, Lieberkühn'sche Krypten
7. Dickdarm
8. Niere
9. Leber (2)
10. Lunge (dem Tumor benachbartes Gewebe)
11. Lymphknoten
12. Lymphozyten (normal) (2)
13. Pankreas
14. Epiphyse
15. Hypophyse
16. Plazenta
17. Prostataphyse
18. Haut
19. Magen
20. Schilddrüse

II. Benigne wachsende Gewebe

1. Brust, Adenom
2. Nebenschilddrüse, Adenome (2)
3. Prostatadrüse, Hyperlasie (3)
4. Schilddrüse, Adenome (3)
Knotiger Kropf (2)

III. Entzündliche Erkrankungen

1. Chronische Colitis ulcerosa
2. Glomerulonephitis
3. Granulom und Fibrose der Lunge
4. Leberzirrhose, Hepatitis
5. Lupus profundus (Milchdrüse und Haut)
6. Blasiger Hautausschlag
7. Magengeschwür
8. Entzündliche Hyperplasie-Lymphknoten (4)
9. Infektiöse Mononukleose (5)

IV. Kulturen

1. Brustfibroblasten
2. Lymphozyten, PHA stimuliert
*) Wie Tabelle 1

Diese zunächst mittels Immunofluoreszenz erhaltenen Ergebnisse sind durch Immunoperoxidasemethoden erhärtet und verbreitert worden.

Die vorliegende Erfindung geht nun von der zuvor erläuterten überraschenden Erkenntnis aus, daß nämlich verschiedene menschliche Krebszellen gemeinsame Nukleolenantigene aufweisen, die jedoch nicht in normalen menschlichen Zellen vorkommen. Bei diesen Antigenen handelt es sich um Proteine, denen eine Gensteuerung oder eine sonstige Funktion zukommt und die die Mitose an einer perichromosomalen Stelle überdauern.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, die in menschlichen Krebszellen aufgefundenen gemeinsamen nukleolären bzw. Nukleolen-Antigene zu reinigen und zu isolieren und damit spezifische Antiseren zu reinigen und zu isolieren und damit spezifische Antiseren bzw. Antikörper zu gewinnen. Die so erhaltenen Antikörper werden dann zum immunologischen Nachweis von Krebs verwendet.

Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch die in den Ansprüchen definierten Maßnahmen erreicht.

Die Antigene wurden bei den verschiedensten menschlichen Krebserkrankungen einschließlich Krebserkrankungen des Zentralnervensystems, des Gastrointestinaltrakts, des Urogenitaltrakts, der Lunge, der Haut, blutbildender Gewebe und endokriner und exokriner Drüsen aufgefunden. Maligne menschliche Zellen sind beispielsweise HeLa-Zellen, Prostatakarzinom, sonstige Karzinome, Sarkome und hämatologische Neoplasmen. Die Antigene können aus den Kernen oder Nukleolen von menschlichen malignen Zellen extrahiert werden. In den entsprechenden tumorfreien Geweben sind die Antigene nicht auffindbar. Bei Durchführung solcher Diagnosemethoden zum Nachweis maligner Zellen mit den erfindungsgemäß erhaltenen Antikörpern gab es etwa 1% falscher negativer Ergebnisse und 3% falscher positiver Ergebnisse. Diese falschen negativen Ergebnisse kamen aus unbekannten Gründen bei nekrotischen Tumorgeweben oder nicht-reaktionsfähigen Tumoren vor. Die falschen positiven Ergebnisse wurden in zwei Fällen "präneoplastischer Gewebe" erhalten. Ein schwachpositives Ergebnis kam in gelegentlichen Herdbereichen bei "hyperplastischem Gewebe" vor. Zwei herdpositive Bereiche wurden als "präneoplastische Bereiche" oder neoplastischer Herdübergang bei entzündeten Gastrointestinalgeweben identifiziert.

Die erfindungsgemäß isolierten Antigene liegen in einer Hauptart und mindestens einer und möglicherweise mehrerer Antigenunterart(en) vor. Die Hauptantigenart aus menschlichen Krebszellen besitzt (a) einen diskreten isoelektrischen Punkt von 6,0 bis 6,7 und etwa 6,3, ermittelt durch isoelektrische Konzentration bei einem pH-Wert von 3 bis 10 mittels eines Polyacrylamidgels; (b) ein ungefähres Molekulargewicht von 50 000 bis 60 000 Dalton, ermittelt durch zweidimensionale Gelelektrophorese unter Verwendung einer aus SDS (Natriumdodecylsulfat) bestehenden zweiten Dimension; (c) es ist teilweise fest an Kern- und Nukleolenribonukleoprotein gebunden und teilweise in 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 8 löslich; (d) es ist sowohl nukleolär als auch extranukleolär, es bleibt jedoch in der Zellteilung "intranukleär" oder chromosomenvergesellschaftet.

Die zweite erfindungsgemäße isolierte Antigenart besitzt einen pI-Wert von etwa 6,0 (der in gleicher Weise wie bei der Hauptantigenart ermittelt wurde) und ein Molekulargewicht von ebenfalls 50 000 bis 60 000 Dalton. Es ist möglich, daß diese zweite Antigenart ein modifiziertes Produkt des Hauptantigens darstellt, es wurde jedoch noch nicht bestimmt, ob es strukturverwandt ist. Die Antigenunterart liegt in relativ geringerer Konzentration vor als die Antigenhauptart.

Antigene finden sich auch in durch Ultrazentrifugieren der Tris-Extrakte erhaltenen Nukleolen-Ribonukleoproteinteilchen (vgl. die folgenden Ausführungen). Das in diesen Teilchen enthaltene Antigen ist an Proteine und Ribonukleinsäure fester gebunden als das Antigen in der tris-löslichen Fraktion. Es ist noch nicht geklärt, warum die Antigene in den Ribonukleoproteinteilchen identisch sind mit denen der überstehenden Fraktion, ihre isoelektrischen Punkte sind jedoch gleich und sie absorbieren die Antikörper (an die Antigene). In Fibrillen, wahrscheinlich des Kernribonukleoproteinnetzes, vorhandene Nukleolenantigene sind durch Immunlichtmikroskopie ebenfalls in Krebszellen sichbar. Hierbei handelt es sich um extra-nukleoläre Strukturen, die Elemente repräsentieren können, aus denen die Ribonukleoproteinteilchen herrühren.

Es bleibt noch zu bestimmen, ob die Antigene eine Substanz darstellen, die in Krebszellen in hohen Konzentrationen und in krebsfreien Zellen in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist oder ob es sich um fötale Antigene handelt, wie sie bereits früher bei den Vergleichsstudien mit Kernantigenen des Ratten-Novikoff-Hepatoms und normalen Rattenleberzellen gefunden wurden (vgl. Yeoman und Mitarbeiter, 1976).

Sämtliche Maßnahmen zur Gewinnung und Analyse von Proben menschlicher Gewebe, Blut und Serum menschlicher Tumore und sonstiger Gewebe verdächtiger Krebspatienten entsprechen den Vorschriften des Human Research Committee at Baylor College of Medicine, Houston, Texas und angeschlossener Krankenhäuser. Schnitte menschlicher Tumore wurden aus Gefrierschnitten chirurgischer Probeentnahmen, durch Biopsie oder aus konservierten cryostatischen Proben hauptsächlich aus dem Department of Pathology from the Houston Veterans Administration Medical Center, the Michigan Cancer Foundation in Detroit, Michigan und vom Department für Innere Medizin der Karl's-Universität in Prag, CSFR, erhalten. Diese Schnitte werden durch indirekte Immunofluoreszenz- und Immunoperoxidasetechniken auf die Anwesenheit nukleolärer Antigene analysiert.

Erfindungsgemäß wird die Reinigung der Antigene erreicht durch eine sechsmalige Extraktion der Kerne oder Nukleolen mit 8 mM Tris-HCl-Puffer/0,1 mM PMSF bei einem pH-Wert von 8 im Verhältnis 20 Volumina (Extraktionsmittel) auf 1 Volumen Kerne oder Nukleolen. Der Extrakt wird zunächst 10 min lang mit 27 000×g und danach 16 h mit 100 000×g zentrifugiert. Zur Entfernung von Verunreinigungen arbeitet man mit Ammoniumsulfat bei 40%iger Sättigung. Die 40 bis 100% Ammoniumsulfatfraktion wird durch Zentrifugieren gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 7,6 dialysiert. Die Antigene werden auf 1×10 cm DE-52 Cellulosesäulen chromatographiert. Die Antigene werden in der 0,15 M NaCl/0,1 mM PMSF-Fraktion (pH-Wert 7,6) eluiert. Durch isoelektrische Konzentrierung erhaltene Gele dienen zur Identifizierung und Reinigung der Antigene. Sie enthalten 4% Acrylamid/8M Harnstoff/2% Ampholine (pH-Wert 3,5 bis 10). Die Antigene mit pI-Werten von 6,3 bzw. 6,0 werden aus den Gelen ausgeschnitten. Auf SDS (Natriumdodecylsulfat)-Gelen zeigt es sich, daß jedes dieser Antigene einen Hauptfleck liefert.

HeLa-Zellkerne oder -Nukleolen erhält man durch Sammeln von HeLa-Zellen aus Spinnerkultur-Flaschen (7 bis 8 l). Die Zellen sollten sein und waren in log-Phase 7 bis 8×10⁵ Zellen/ml. Die Zellen werden 8 min lang zur Bildung von Zellplättchen mit 800×g zentrifugiert. Die Zellplättchen werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,2) durch mäßige Homogenisierung mit einem lockeren Pistill suspendiert und danach 8 min lang mit 800×g zentrifugiert. Danach werden die Zellen ein zweites Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, worauf die Zellplättchen gewogen werden. Nun werden die Zellplättchen unter schwachem Homogenisieren in 20 Volumina eines Reticulocytstandardpuffers eines pH-Werts von 7,4 suspendiert und 30 min lang auf Eis quellen gelassen. Nach 8minütigem Zentrifugieren mit 1000×g werden die Zellen durch schwaches Homogenisieren in dem Reticulocytstandardpuffer (RSB) plus 1/20 Volumen des handelsüblichen Detergens Nonidet P 40 (10%in RSB) resuspendiert. Das Endvolumen Nonidet beträgt 0,5%. Die Zellen werden mit einem handelsüblichen Homogenisator homogenisiert, bis sie brechen und die Kerne freigegeben und von Zytoplasma befreit werden. Danach werden die Zellen 8 min lang mit 1000×g zentrifugiert, durch schwaches Homogenisieren in 0,88 M Saccharose, 0,5 mM Mg-Acetat (20×Gewicht-Volumen) homogenisiert und 20 min lang mit 1500×g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet enthält die HeLa-Kerne, die in der geschilderten Weise zur Gewinnung der Antigenextrakte herangezogen werden. Kerne aus anderen malignen Humanzellen erhält man in entsprechender Weise.

Zur Isolierung der Nukleolen wird das in der geschilderten Weise erhaltene Kernpellet durch schwaches Homogenisieren in 0,34 M Saccharose, 0,5 mM Mg-Acetat unter Verwendung von 2 ml Saccharose pro Gramm der ursprünglichen Zellen suspensiert. Die Kerne werden dann unter Verwendung eines handelsüblichen Ultraschallgebers mittels 10 s dauerndem Entladungsstoß und 10 s Ruhe beschallt. Die Gesamtdauer beträgt 60 bis 110 s. Die freigesetzten Nukleolen werden mikroskopisch geprüft. Zum Sichtbarmachen der Nukleolen werden sie mit Azure C (in Form einer Lösung von 1% Azure C in 0,25 M Saccharose) angefärbt. Das Präparat sollte nach beendeter Beschallung kernfrei sein. Die beschallte Fraktion wird mit dem dreifachen Volumen 0,88 M Saccharose (ohne Mg-Acetat) unterlegt und 20 min lang mit 1500×g zentrifugiert. Das hierbei erhaltene Pellet enthält die HeLa-Nukleolen, die als das Immunogen verwendet werden können.

Nach dem geschilderten Verfahren (vgl. Busch und Smetana, 1970) läßt sich üblicherweise eine akzeptable Reinigung erreichen. Die Lichtmikroskopie zeigt, daß die Qualität der erhaltenen Präparate im wesentlichen genügt. Eine elektronenmikroskopische Analyse zeigt jedoch die Anwesenheit von Chromatin und Kernverunreinigungen. Das Schlüsselproblem im Hinblick auf eine angemessene Reinigung dieser Präparate ist die begrenzte Menge ursprünglicher HeLa-Zellen in den Kulturen, die die Anzahl der Rückreinigungsschritte begrenzt. Aus 5 bis 10 g HeLa-Zellpräparaten gewonnene Nukleolen liefern anders als bei der bisherigen Verwendung von 0,5 bis 1 g HeLa-Zellpräparaten ausreichend Material für eine angemessene Reinigung. Die Bedingungen für die Züchtung der HeLa-Zellen und die Isolierung von Plazentakernen sind im wesentlichen die gleichen wie bei dem bekannten Verfahren (vgl. Davis und Mitarbeiter 1979).

Den HeLa-Tris-Extrakt erhält man durch Suspendieren der HeLa-Kerne in einem NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Puffer (10×Gewicht/Volumen, 1 g Kerne/10 ml Puffer; Puffer: 0,075 M NaCl, 0,025 M Na-Äthylendiamintetraessigsäure/pH-Wert 8, 1 mM PMSF). Das Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wird mit Isopropanol auf eine Konzentration von 100 mM eingestellt. Es wird jeder Lösung vor der Extraktion zugefügt.

Die Suspension wird mit einem handelsüblichen Homogenisator homogenisiert und 5 min lang mit 3000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt. Die geschilderten Extraktionsmaßnahmen werden mit dem Kernpellet noch zweimal wiederholt. Der NaCl-Äthylendiamintetraessigsäure-Extrakt wird bei den vorliegenden Antigenarbeiten nicht verwendet, folglich wird er verworfen. Das Kernpellet wird in 10×Gewicht/Volumen 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 8 und in Anwesenheit von 1 mM PMSF suspendiert und mittels eines handelsüblichen Homogenisators homogenisiert. Es reicht allerdings auch ein 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7 bis 9. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und auf Eis aufbewahrt. Während der Tris-Extraktionen brechen die Kerne, wobei Chromatin freigesetzt wird. Das Brechen der Kerne wird mikroskopisch überwacht. Nun wird das Pellet in dem Tris-Puffer resuspendiert, worauf die Kerne 15 min lang auf Eis quellen gelassen werden. Danach erfolgt erneut eine Homogenisierung mittels des handelsüblichen Homogenisators. Nach 10minütigem Zentrifugieren mit 12 000×g wird die überstehende Flüssigkeit abgegossen und aufbewahrt. Das Pellet wird resuspendiert. Es besitzt ein weißliches flaumiges Aussehen. Es erfolgt eine erneute Homogenisierung mittels des handelsüblichen Homogenisators. Danach wird 30 min lang mit 27 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und mit den vorherigen überstehenden Anteilen der Tris-Extrakte vereinigt.

Die Tris-Extrakte werden dann mittels einer handelsüblichen Ultrafiltrations-Membran konzentriert. In der Regel beträgt das Volumen zu Beginn etwa 50 ml, nach der Konzentration 4 bis 5 ml. Die Endkonzentration an Protein beträgt etwa 4 bis 5 mg/ml. Mit diesem Tris-Extrakt kann das Kaninchen immunisiert werden.

Mit Hilfe der geschilderten Maßnahmen können auch aus HeLa-Nukleolen und Kernen oder Nukleolen anderer maligner Humanzellen Extrakte bereitet werden.

Für das Tris-Immunogen werden mit 250 µl PBS eine 250 µl-Verdünnung des Tris-Extrakts (4 bis 5 mg/ml) hergestellt. Diese Verdünnung wird, wie für das Nukleolenimmunogen noch beschrieben werden wird, mit dem Freund'schen Hilfsmittel vereinigt.

Antikörper erhält man, wie folgt, durch Immunisierung von Kaninchen mit HeLa-Zellen-Nukleolen-Präparaten. Die HeLa-Nukleolen werden abgewogen (20 bis 30 mg Naßgewicht) und gleichmäßig in 0,5 ml 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung eines pH-Wertes von 7,2 suspendiert. Danach werden sie mit 0,6 ml Freund'schen Kompletthilfsmittels gemischt. Zu diesem Zweck werden die suspendierten Nukleolen in eine 5 ml-Spritze aufgezogen, das Freund'sche Hilfsmittel wird in eine zweite Spritze aufgezogen. An jede Spritze wird eine Nadel Nr. 18, von der die Spritze entfernt worden war, angebracht. Danach werden die Nadeln mit einem Stück Polyäthylenschlauch verbunden. Nun werden die Spritzeninhalte miteinander gemischt, bis das Präparat dick wird und es Schwierigkeiten bereitet, es durch den Schlauch zu treiben.

Nachdem das Versuchskaninchen auf dem Rücken rasiert worden war, erhält es an sechs Stellen intradermale Injektionen (0,1 ml/Stelle). Die restlichen 0,4 bis 0,5 ml werden halbsubkutan, d. h. unter die lose Haut an den Schultern, und halbintramuskulär in den Oberschenkelmuskel injiziert. Drei Wochen lang werden einmal pro Woche ähnliche Mengen an Nukleolen injiziert. Das erste Mal wird 7 bis 10 Tage nach der dritten Immunisierungswoche Blut abgezapft. Zum Sammeln des Blutes bedient man sich eines handelsüblichen Kaninchenohrbechers und einer Vakuumpumpe. Das Blut (etwa 45 bis 50 ml) wird 3 bis 4 h lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen. Nach Entfernen des Serumteils aus dem Rohr wird es 30 min lang bei 1000×g zentrifugiert (hierbei werden sämtliche freien roten Blutkörperchen wegsedimentiert). Das klare Serum wird gesammelt und dann absorbiert (oder bis zur Durchführung der Absorption gefroren gehalten). Der Blutpfropfen kann über Nacht im Kühlschrank gelagert werden. Hierbei werden einige weitere ml Serum freigegeben. Das Serum aus jeder Blutentnahme wird nun durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse auf die Anwesenheit von Nukleolenantikörpern hin untersucht.

Andere nichtmenschliche Wirte, z. B. Ziegen, Schafe, Pferde, Geflügel und dgl., können mit malignen Humanzellennukleolenpräparaten immunisiert werden, um die Bildung der erfindungsgemäßen Antiseren oder Antikörper gegen Nukleolenantigene zu provozieren. Antiseren erhält man auch durch Immunisierung nichtmenschlicher Wirttiere mit Extrakten, z. B. dem Tris-Extrakt, maligner Humanzellenkerne oder -nukleolen.

Die Absorption von Antinukleolärantiserum erfolgt derart, daß zunächst das Kaninchenantiserum mit 20% Normalhumanserum und 20% fötalem Kalbserum absorbiert wird. Zu diesem Zweck wird 20%iges Normalhumanserum zu dem Kaninchenantiserum (4 ml/20 ml) zugegeben, worauf das Ganze 1 h lang in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Nach Herausnahme des Kolbens aus dem Wasserbad wird 20%iges fötales Kalbserum (4,8 ml/24 ml) zugegeben, worauf erneut 1 h lang in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Danach wird der Kolben aus dem Wasserbad herausgenommen und 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der Kolbeninhalt alle 15 min durch schwaches Verquirlen durchgemischt wird. Danach wird der Kolbeninhalt 30 min lang mit 15 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, d. h. das absorbierte Serum, wird entfernt und aufbewahrt. Unter Durchführung der im folgenden für die (NH₄)₂SO₄-Fällung des Serums beschriebenen Maßnahmen wird das absorbierte Serum in die Immunoglobulin (Ig)-Form umgewandelt.

Das Immunoglobulinpräparat aus dem Nukleolenantiserum, das mit Normalhumanserum und fötalem Kalbserum absorbiert wurde, wird nun mit normalem Humangewebe, Plazenta oder Leber, absorbiert. Zu diesem Zweck wird das absorbierte Nukleolenimmunoglobulin (10 ml Ig plus 10 ml des beim Beschallen angefallenen Kernpräparats) mit einem gleichen Volumen von beim Beschallen angefallenem Plazentakernpräparat in PBS 7,2 (10 bis 15 mg Protein/ml) versetzt, worauf das Ganze 1 h lang in einem 37°C warmen Rüttelwasserbad inkubiert wird. Danach wird das Ganze eine weitere h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der Kolbeninhalt alle 15 min lang durch leichtes Durchquirlen gemischt wird. Schließlich wird der Kolbeninhalt 30 min lang bei 15 000×g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt, worauf das absorbierte Ig, wie beschrieben, mit (NH₄)₂SO₄ umgefällt wird. Dieses Ig kann als endgültiges Antikörperprodukt verwendet oder durch Diäthylaminoäthylcellulosechromatographie weiter gereinigt werden.

Das in der 0,01 M phosphatgepufferten Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,2 enthaltene Ig wird gegen 0,0175 M Phosphatpuffer eines pH-Werts von 6,3 (ohne physiologische Kochsalzlösung) dialysiert. Nach der Dialyse wird es 20 min lang mit 2500×g zentrifugiert. Nun wird die überstehende Flüssigkeit auf die Diäthylaminoäthylcellulosesäule gegossen (20 mg Protein pro g Cellulose). Das IgG wird aus der Säule mit dem 0,0175 M Phosphatpuffer eluiert. Nach dem Eluieren wird die IgG-Fraktion gegen die 0,01 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,2 dialysiert.

Dieselben Maßnahmen werden mit dem Kontrollserum durchgeführt. Das Kontrollserum besteht aus Präimmunserum, das aus dem Kaninchen oder einem sonstigen nichtmenschlichen Wirttier abgenommenen Blut vor Beginn der Immunisierung gewonnen wurde.

Kaninchenimmunoglobulin Ig erhält man wie folgt: eine kalte gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung (760 g/l) wird unter Rühren im gleichen Volumen zu dem Antiserum zutropfen gelassen. Der hierbei ausfallende Niederschlag wird zum Zusammenballen 1,5 bis 2 h lang mittels eines Magnetrührers in der Kälte gerührt. Danach wird das ausgefallene Antiserum 20 min lang mit 3000×g zentrifugiert. Nach Entfernen der überstehenden Flüssigkeit wird das Pellet im etwa halben Volumen (des ursprünglichen Serums) PBS eines PH-Werts von 7,2 resuspendiert. Das löslichgemachte Pellet wird in einen Dialysebeutel gefüllt und über Nacht in der Kälte unter Rühren mit einem Magnetrührer gegen 100 Volumina PBS dialysiert. Am folgenden Morgen wird der Dialysebeutel in frisches PBS (100faches Volumen) gelegt und die Dialyse 6 h lang fortgesetzt. Hierauf wird das Immunoglobulin sorgfältig aus dem Dialysebeutel entfernt und 20 min lang mit 2500 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt.

Die Immunofluoreszenzanalyse wird gemäß dem von Busch und Mitarbeitern 1974 und Hilgers und Mitarbeiteren 1972 beschriebenen Verfahren wie folgt durchgeführt: 150 µl Antinukleolenantiserum, das auf 1 : 50 verdünnt worden war, werden auf acetonfixierte HeLa-Zellen oder fixierte Gewebeproben (vgl. Hilgers und Mitarbeiter 1972 und Busch und Mitarbeiter 1974) aufgebracht. Wenn die Gewebeprobe einen großen Abschnitt des Objektträgers bedeckt, kann es erforderlich sein, mehr als 150 µl zu verwenden. Die Verdünnung des Antiserums)(As) hängt vom Antikörper (Ab)-Titer ab. Weitere Verdünnungen können bis zu dem Punkt, an welchem As- und Ab-Verdünnungen zu stark verdünnt werden, um ein positives Ansprechen auf bekannte positive Zellen (beispielsweise HeLa-Zellen) feststellen zu können, verwendet werden. Die Objektträger werden in einer feuchten Kammer 45 bis 50 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Die feuchte Kammer kann aus einer großen Petrischale, in die ein feuchtes Papiertuch einbebracht wurde, bestehen. Nach der Inkubation wird das Antiserum durch vorsichtige Zugabe von PBS vom Objektträger abgewaschen. Danach werden die Objektträger in einen Objektträgerhalter gestellt und 1 h lang in PBS gewaschen. Das PBS wird dreimal, nämlich nach 15, 30 bzw. 45 min gewechselt. Hierauf werden die Objektträger aus dem PBS herausgenommen und zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen in destilliertes oder entionisiertes Wasser getaucht. Danach werden die Objektträger mittels eines Gebläses oder Haartrockners 2 bis 3 min lang mit kalter Luft getrocknet, wobei darauf geachtet wird, daß keine Übertrocknung stattfindet. Nun werden auf die Objektträger 150 µl von mit Fluoreszein markiertem Ziegenantikaninchenantiserum (Hyland oder Cappel), das auf 1 : 10 verdünnt worden war, aufgebracht, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 30 bis 35 min in der feuchten Kammer inkugiert wird. Durch vorsichtiges Waschen mit PBS wird auch der zweite Antikörper vom Objektträger entfernt, worauf die Objektträger 1 h lang mit PBS gewaschen werden. Die Waschflüssigkeit wird hierbei nach 15, 30 bzw. 45 min gewechselt. Andererseits können die Objektträger nach 15minütigem Waschen in frisches PBS gelegt und darin über Nacht im Kühlschrank belassen werden. Nach der letzten Wäsche mit PBS werden die Objektträger zehnmal unter raschem Auf- und Abbewegen in entionisiertes oder destilliertes Wasser getaucht. Schließlich werden sie mit Kaltluft 2 bis 3 min lang mit Hilfe eines Gebläses oder Haartrockners getrocknet. Nun werden auf die Zellen oder die Gewebeprobe eine 1 : 1-Lösung von Glycerin und PBS aufgebracht und die Objekte mit einem Deckglas bedeckt. Wenn das Deckglas mit Hilfe eines Dichtungsmittels, z. B. klarem Nagellack, mit dem Objektträger verbunden und das Ganze kühl gelagert wird, kann das Präparat mehrere Monate lang aufbewahrt werden. Schließlich wird das Präparat mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Bei dem Präimmunoglobulin oder bei Präimmun-IG-Fraktionen ist keine Nukleolenfluoreszenz feststellbar.

Die anderen immunologischen Techniken entsprechen den von Kendall 1938, Lowry und Mitarbeitern 1951, Dale und Latner 1969, Laurell 1972, Wallace und Mitarbeitern 1974 und Marashi und Mitarbeitern 1979 beschriebenen Techniken. Zur Analyse der Nukleolen-Immunofluoreszenzlokalisierung werden Präparate während der Fluoreszenzbeobachtung in Phasenkontrastbeleuchtung ein- und ausgeschaltet.

Anstelle des mit Fluoreszein markierten Ziegenantikaninchenantiserums kann man sich auch der Immunoperoxidasemethode bedienen. So werden beispielsweise 150 µl von mit Peroxidase markiertem Ziegenantikaninchenantiserum, das auf 1 : 10 oder 1 : 20 verdünnt worden war, zugegeben. Die lokalisierte Peroxidaseaktivität läßt sich mit Hilfe einer Reihe von Redoxfarbstoffsystemen zur licht- oder elektronenmikroskopischen Prüfung nachweisen. Als Markierungen für eine indirekte Methode können auch andere Enzyme herangezogen werden. Ferner können Peroxidase und andere Enzyme bei einem direkten Verfahren eingesetzt werden, indem der primäre Antikörper markiert wird. Die Herstellung des Karnofsky'schen Inkubationsmediums geschieht wie folgt: nach dem Abwiegen wird eine genügende Menge Diaminobenzidin in 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6 suspendiert, um die Konzentration auf 0,5 mg/ml einzustellen. Danach wird in dem 0,05 M Tris-HCl-Puffer eine 0,02%ige Wasserstoffperoxidlösung zubereitet. Die 0,5 mg/ml enthaltende Diaminobenzidinsuspension und die 0,02%ige H₂O₂-Lösung werden im Verhältnis 1 : 1 gemischt. Diese Mischung wird bei Gebrauch jeweils frisch zubereitet und während ihrer Zubereitung kühl gehalten. 200 bis 300 µl des erhaltenen Gemischs werden auf den Objektträger aufgebracht, worauf das Ganze bei Raumtemperatur 30 min lang in einer feuchten Kammer inkubiert wird.

Nach der Inkubation wird das Diaminobenzidin/H₂O₂-Gemisch vom Objektträger mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6, dem 0,1 M NaCl zugefügt worden war, abgewaschen. Die Objektträger werden 10 min lang in 0,05 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6, der 0,1 M an NaCl war, gewaschen. Die Endbehandlung der Objektträger erfolgt wie in Stufen 11 bis 14 (wobei jedoch anstelle des PBS Tris-HCl verwendet wird). Die fertigen Präparate werden unter einem Lichtmikroskop untersucht.

Objektträger mit HeLa-Zellen zur Immunofluoreszenzanalyse werden wie folgt hergestellt: durch Entfernen und Waschen aktiv wachsender Zellen aus der HeLa-Kulturflasche mit PBS eines pH-Werts von 7,2 wird ein Vorrat an fixierten HeLa-Zellen gewonnen. Die Zellen werden derart suspendiert, daß die Konzentration mindestens 1,5×10⁶ Zellen/ml beträgt. 1 Tropfen der HeLa-Zellensuspension wird auf jeden gewaschenen Objektträger (mit einem Detergens gesäubert, mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen, mit Alkohol gesäubert, gespült und mit Heißluft aus einem Haartrockner getrocknet) aufgebracht, sich etwas ausbreiten gelassen und dann bei Raumtemperatur oder in der Kälte über Nacht trocknen gelassen. Die getrockneten Zellen werden fixiert, indem die Objektträger 12 min bei einer Temperatur von 4°C in Aceton gelegt werden. Danach werden die Objektträger mit einem Glasmarkierungsstift mit Diamantspitze numeriert. Die Objektträger dienen als positive Vergleichsproben für die Immunofluoreszenzanalyse.

Die Untersuchungen haben gezeigt, daß in Tumorzellen, nicht dagegen in tumorfreien Geweben, nukleoläre Antigene bzw. Nukleoantigene enthalten sind. Voruntersuchungen zeigten, daß sowohl in Zellkulturen, in menschlichen Tumoren und in Autopsie- oder Biopsieproben nach der Doppelantikörpermethode (indirekte Immunofluoreszenz) eine helle Nukleolenfluoreszenz auftritt. Ein entsprechendes Ergebnis erreicht man nicht bei einer Reihe von tumorfreien Geweben (vgl. Davis und Mitarbeiter 1979). Bei späteren Untersuchungen wurden mehr als maligne Tumore untersucht und die verschiedensten Gewebevergleichsproben beurteilt. Es ist von großem Interesse, daß die verschiedensten malignen Tumore ektodermalen, endodermalen oder mesodermalen Ursprungs ein oder mehrere gemeinsames (gemeinsame) Nukleolenantigen(e) enthalten (Tabelle I).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Normale Gewebe: bei 17 tumorfreien Geweben ist nach der Inkubation der Antiseren oder Antikörper mit den verschiedensten fixierten Zellpräparaten keine Nukleolenfluoreszenz feststellbar. Es ist von besonderem Interesse, daß weder die Malipigische Hautschicht noch die Zellen des Knochenmarks noch die Lieberkühn'sche Krypten bei diesen Maßnahmen eine positive Immunofluoreszenz zeigen. Darüber hinaus sind die verschiedensten Neoplasmen benachbarte tumorfreie Gewebe ebenfalls negativ. Hierbei wurden die verschiedensten Gewebearten untersucht. Es wurde eine Gruppe benigner Tumore einschließlich verschiedener Arten von Schilddrüsenadenomen untersucht. Hierbei wurden ebenfalls negative Ergebnisse erzielt (vgl. Tabelle II).

Beispiel 2

Entzündliche Verletzungen bzw. Läsionen: Um sicherzustellen, ob ein entzündliches Ansprechen zum Auftreten dieser Antigene in Beziehung steht, wurden 8 Arten entzündlicher Gewebe untersucht. Bei den meisten dieser Gewebe war keine Fluoreszenz in den Nukleolen der untersuchten Zellen feststellbar. Es fanden sich jedoch Abschnitte in Proben ulzerativer Colitis und von Magengeschwüren, die eine positive Nukleolenfluoreszenz zeigten. Zwei oder drei Schnitte der ulzerativen Colitis waren negativ, einer zeigte eine definitive positive Nukleolenfluoreszenz. Bei den Magengeschwüren zeigte einer der beiden analysierten Schnitte eine positive Nukleolenfluoreszenz. Diese Ergebnisse sind insbesondere im Hinblick auf die bekannte Neigung dieser Läsionen, eine maligne Änderung zu erfahren, von Interesse. Von speziellem Interesse war es auch, sowohl die positiven als auch negativen Herdbereiche dieser Präparate in den hämatoxylineosingefärbten Schnitten zu untersuchen. Diese zeigten in der Tat Bereiche in diesen Läsionen, die nicht nur mitotische Erscheinungen sondern auch eine Anhäufung der Epitheliaauskleidung aufweisen. Somit ist es naheliegend, daß diese Zellen präneoplastische Läsionen oder ein Karzinom in situ darstellen. Es ist möglich, daß das Auffinden dieser fluoreszierenden Bereiche eine Entscheidungshilfe bezüglich einer entweder lokalen oder mehr generalisierten chirurgischen Resektion der betroffenen Läsionen bietet.

Beispiel 3

Artifakten: Im Magenepithel gibt es in jeder Zelle einen Fluoreszenzbereich, der nichtnukleolär ist. Offensichtlich handelt es sich hierbei um eine nichtspezifische Lokalisierung des fluoreszierenden Antikörpers. In einer Krypte des Dünndarms tritt offensichtlich eine nichtspezifische Lokalisierung des Antikörpers in Form von Aggregaten auf. In den meisten Fällen lassen sich diese Aggregate durch Vorfiltrieren der Antikörper durch ein 0,45 µm Filter beseitigen. In einer Probe Brustgewebe, die bezüglich einer Nukleofluoreszenz negativ war, waren kleine nichtspezifische immunolfuoreszierende Flecken ohne spezielle Lokalisierungsmerkmale bezüglich der Zellmorphologie allgemein verteilt. Die Durchmesser dieser sehr kleinen nichtspezifischen Ausfällungen betragen 0,5 bis 0,1 µm im Vergleich zu den Nukleolen-Durchmessern in den Kernen und Nukleolen, die 4 bis 6 µm betragen.

Beispiel 4

Floureszenz während der Phasen des Zellzyklus: Die Nukleolenfluoreszenz war in den Interphasennukleoen ohne weiteres sichtbar. In der Metaphase war die Nukleolenfluoreszenz nicht als abgegrenzte Einheit sondern zwischen den Chromosomen und in dem angrenzenden Bereich zwischen dem Kern und dem Cytoplasma sichtbar. Insoweit die Nukleole während der Metaphase im wesentlichen verschwindet und die rRNS-Synthese in der späten Prophase aufhört, war es nicht überraschend, daß die Nukleolenfluoreszenz in solchen Zellen nicht als abgegrenzte Einheit sichtbar war (Tan und Lerner 1972). Die Erkenntnis, daß Reste der immunofluoreszierenden Produkte die gesamte Mitose überdauern, legt jedoch die Vermutung nahe, daß die nukleolären Substrukturen anders als die nukleolären Produkte die Antigene, die epigenetisch "überleben" enthalten.

Beispiel 5

Negative Ergebnisse bei malignen Tumoren: In der Reihe maligner Tumore haben sich bei den Objektpräparaten negative Bereiche verschiedener Ausmaße gezeigt. In der Regel stimmten diese mit entweder nekrotischen oder abgeeiterten Teilen des Neoplasmas überein. Bei einer Gehirntumorprobe war die Masse, die keine positive Fluoreszenz aufwies, nekrotisch. Es waren zahlreiche Leukozyten vorhanden, eine abgegrenzte Struktur fehlte jedoch. Ein Adenokarzinom, das Metastasen ins Gehirn ausgesandt hatte, zeigte keine positive Fluoreszenz, die Gründe hierfür konnten nicht geklärt werden. Da jedoch von 63 untersuchten Tumoren 61 eine positive Nukleolenfluoreszenz zeigten, waren 97% der Reihenuntersuchung positiv. Diese Untersuchungen sind nun auf über 300 menschliche Krebsarten einschließlich einer Reihe von Krebsarten der Brust, Prostata und Lunge sowie hämatologischen Tumoren, mit ähnlichen Ergebnissen ausgedehnt.

Beispiel 6 Markierung

Direkte immunochemische Methoden zur Sichtbarmachung der Antikörper umfassen eine Markierung des primären Antikörpers mit mindestens einer der folgenden Markierungen: Radioisotope zur Autoradiographie, wie ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C oder ³H, fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoreszein oder Tetramethylrhodamin zur Fluoreszenzmikroskopie, Enzyme, die fluoreszierende oder farbige Produkte zum Nachweis durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie liefern oder die elektronendichte Produkte zum Nachweis durch Elektronen mikroskopie bilden oder elektronendichte Moleküle, wie Ferritin, zur direkten elektronenmikroskopischen Sichtbar machung.

Indirekte immunochemische Methoden umfassen eine Markierung des zweiten Antikörpers oder eines sonstigen Binde proteins, das für den ersten Antikörper spezifisch ist, mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einer elektronen dichten Verbindung, einem Enzym, das ein durch licht-, fluoreszenz- oder elektronenmikroskopische Analyse nach weisbares Produkt liefert oder ein durch Autoradiographie bestimmbares Radioisotop.

Indirekte immunochemische Methoden zum Sichtbarmachen der Antikörper beinhalten eine Anwendung primärer oder sekundärer Hybridantikörper oder Antikörperfragmente (F(ab′)₂), wobei ein Teil der Hybridantikörperzubereitung für die Nukleolenantigene (hybrider primärer Antikörper) oder für den primären Antikörper (hybrider zweiter Antikörper) und ein (anderer) Teil für eine Markierung der genannten Art spezifisch ist.

Markierte konjugierte und nichtkonjugierte Antikörper können getrennt in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalz lösung oder in sonstigen gepufferten Suspendiermitteln zum Vertrieb als Diagnoseeinheit untergebracht sein. Geeignete Suspendiermittel sind Glycerin, Heparin oder Saccharose. Geeignete Puffer sind Barbitalpuffer, Morpholinpuffer, MOPS-3-(N-morpholino)propansulfonsäure, Hepes-N-2- hydroxyäthylpiperazin-N-2-äthansulfonsäure, tris-Carbonat und dgl.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, die für in Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen gefundene Antigene spezifisch sind, durch Immunisierung von (nicht-human) Wirtssäugetieren mit in Nukleolen und Kernen von menschlichen Krebszellen auftretenden Antigenen und Ernten der Antikörper der immunisierten Wirtssäugetiere, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Immunisierung Antigene verwendet, die (a) einen diskreten isoelektrischen Punkt von 6,0 bis 6,7 aufweisen, ermittelt durch isoelektrische Konzentration bei einem pH-Wert von 3 bis 10 mittels eines Polyacrylamidgels; (b) ein Molekular gewicht von 50 000 bis 60 000 Dalton aufweisen, ermittelt durch zweidimensionale Gelelektrophorese unter Verwendung einer aus SDS (Natriumdodecylsulfat) bestehenden zweiten Dimension; (c) teilweise fest an Kern- und Nukleolenribonukleoprotein gebunden und teilweise in 0,01 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8 löslich; (d) sowohl nukleolär als auch extranukleolär, jedoch in der Zellteilung "intranukleär" oder chrommosomenvergesell schaftet sind, wobei die Antigene gereinigt werden durch

a) sechsmalige Extraktion der Kerne oder Nukleolen mit 8 mM Tris-HCl-Puffer/0,1 mM PMSF bei einem pH-Wert von 8,
b) Zentrifugation des Extrakts zunächst 10 min lang mit 27 000 × g und danach 16 h mit 100 000 × g,
c) zur Entfernung von Verunreinigungen Sättigung mit Ammoniumsulfat bei 40%,
d) Sammeln der 40 bis 100% Ammoniumsulfatfraktion durch Zentrifugieren und Dialyse gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Werts von 7,6,
e) Chromatographie der Antigene auf DE-52 Cellulosesäulen und einer Elution in der 0,15 M NaCl/0,1 mM PMSF- Fraktion (pH-Wert 7,6) und
f) isoelektrische Konzentrierung in Gelen, bestehend aus 4% Acrylamid/8 M Harnstoff/2% Ampholine (pH-Wert 3,5 bis 10), wobei die Antigene mit pI-Werten von 6,3 bzw. 6,0 aus den Gelen geschnitten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper gewinnt, deren Bildung durch aus malignen Humanzellen in Form von HeLa-Zellen, Karzinomen, Sarkomen und hämatologischen Neoplasmen isolierte Nukleolen ausge löst wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper gewinnt, deren Bildung durch aus menschlichen Prostatakarzinomzellen isolierte Nukleolen ausgelöst wurde.

4. Verwendung der Antikörper, hergestellt nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 zum immunologischen Nachweis von Krebs in menschlichen Gewebeschnitten, Abstrichen und Ab blätternden zytologischen Präparaten, dadurch gekenn zeichnet, daß man das Untersuchungsmaterial mit den Anti körpern in Berührung bringt und die Lokalisierung dieser Antikörper in den Nukleolen maligner Zellen, jedoch nicht in denjenigen normaler Zellen aufzeigt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lokalisierung der Antikörper mittels immunochemischer Maßnahmen direkt oder indirekt sichtbar macht.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die primären Antikörper mit einem durch Autoradiographie nachweisbaren Radioisotop, einem durch Fluoreszenzmikroskopie nachweisbaren fluoreszierenden Farbstoff, einem Enzym, das ein durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie nachweisbare fluoreszierendes oder farbiges Produkt liefert, einem Enzym, das ein durch Elektronenmikroskopie nachweisbares elektronen dichtes Produkt liefert und/oder einem durch direkte Sichtbarmachung auf elektronenmikroskopischem Wege nach weisbaren elektronendichten Molekül markiert.

7. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Radioisotop ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C und/oder ³H verwendet.

8. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszierenden Farbstoff Fluoreszein und/oder Tetramethylrhodamin einsetzt.

9. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein durch Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie nachweisbare fluoreszierendes oder farbiges Produkt lieferndes Enzym Peroxidase, β-Galactosi dase, alkalische Phosphatase oder Cytochrom C einsetzt.

10. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als zur direkten Sichtbarmachung auf elektronenmikroskopischem Wege nachweisbare elektronen dichtes Molekül Ferritin, Hämocyanin, Virusteilchen oder Latexkügelchen verwendet.

11. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den immunologischen Nachweis von Krebs durch indirekte immunochemische Darstellung der Antikörper führt, wobei man markierte zweite Anti körper und/oder sonstige für die primären Antikörper oder deren Modifikationen spezifische Bindeproteine mit verwendet.

12. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man nur Bruchstücke (F(ab′)₂) der Antikörper verwendet.