DE2745237A1 - Mittel zur immunisierung und zum nachweis von speziellen krebsarten - Google Patents

Mittel zur immunisierung und zum nachweis von speziellen krebsarten

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DE2745237A1 DE19772745237 DE2745237A DE2745237A1 DE 2745237 A1 DE2745237 A1 DE 2745237A1 DE 19772745237 DE19772745237 DE 19772745237 DE 2745237 A DE2745237 A DE 2745237A DE 2745237 A1 DE2745237 A1 DE 2745237A1
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Description

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1Α-49
Patentanmeldung
Anmelder: Dr. Robert Harry Reid
910 Rivenoak, Birmingham Michigan 48008, U.S.A.
Titel: Mittel zur Immunisierung und zum
Nachweis von speziellen Krebsarten
809815/0806
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1Α-49 913
Beschreibung
Es hat sich gezeigt, daß Krebszellen ein spezifisches Oberflächenprotein besitzen, das als Glykoprotein vorliegt und das eine spezifische Immunreaktion bzw. Immunantwort der Zellen des Wirts gegenüber dem speziellen Krebs stimuliert, im folgenden ist ein Verfahren zur Identifizierung des spezifischen Zell-Oberflächenproteins angegeben und Verfahren zur Anwendung des Proteins oder vorzugsweise des aktiven Peptids zur Untersuchung auf spezielle Krebsarten und zur Immunisierung. Wenn das spezifische Zell-Oberflächenprotein für einen Krebs identifiziert worden ist, kann das N-terminale Tridecapeptid der aktive Teil des Peptids synthetisiert und zur Untersuchung und Immunisierung angewandt werden. Ferner ist das spezifische Zell-Oberflächenprotein und das aktive Peptid für Brustkrebs (ductal carcinom) identifiziert worden.
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Identifizierung von Krebszellen-Oberflächenproteinen für die spezifische zeilvermittelte Immunität und erlaubt die Synthese des aktiven Peptids und die Anwendung des synthetischen Peptids für Diagnoseverfahren und zur Immunisierung.
Lange Zeit wurde eine virenbedingte Ätiologie für Brustkrebs angenommen. Frühere Forscher haben ein übliches(common) Tumoroberflächen-Antigen (TSA) gefunden, das zu einer Kreuzimmunität bei durch Viren induzierten Tumoren bei Tieren (Hellstrom et al, Ann. rev. microbiol. 24, 373 (1970), Kline, Israel J.Med.Sci. 7, 111 (1971) etc.) führt im Gegensatz zu
*) (cellmediated immunity)
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Carcinogen-induzierten Tumoren (Frehn et al J. Nat. Cancer Inst. 18, 769 (1957) ). Die bei diesen Untersuchungen angewandten Zellreihen sind nicht virenbildend (Cailleau et al, J. Nat. Cancer Inst. 53, 661 (1974).
Sie besitzen jedoch zahlreiche Chromosomen-Markierungen (Seman et al, Cancer 37» 1814 (I976), Nelson-Kees et al, Science (1976) ). Daher scheint es, daß ein nicht replizierender üblicher DNS-Virus, in dem Chromosomensatz vorhanden ist, der für die malign Umwandlung verantwortlich ist und der ein Zelloberflächen-Produkt besitzt - das identifizierte Tumoroberflächen-aktive Protein. Eine andere Erklärung wäre ein nicht replizierender RNS-Virus, der über DNS-Transferase wirkt (Chopra et al, Cancer Res. 30, 2081 (1970). Das wäre auf RNS B-artige Virenteilchen zurückzuführen, die sich in einigen Brustkrebszellen und Frauenmilch finden (Rauscher et al, Cancer Medicine, Seite 15 (1973).
Die früheren Forscher haben keinen gemeinsamen Denominator für alle Krebszellen identifiziert, obwohl Glykoproteine in bestimmten Krebszellen identifiziert worden sind. Es wurde nun das Vorhandensein eines gemeinsamen TSA-Proteins bei Brustkrebs durch das erfindungsgemäße Verfahren gezeigt. Dieses Verfahren kann nun angewandt werden zur Identifizierung von TSA-Protein bei anderen Krebsarten. Wenn es einmal identifiziert ist, kann das Protein synthetisiert und für diagnostische Untersuchungen von Krebs und zur Immunisierung angewandt werden,
Ein identisches Protein wurde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf der Zelloberfläche von gesicherten Brustkrebs-Zellreihen (established ductal carcinoma cell lines) gefunden. Es zeigte sich, daß das Protein die folgende Aminosäuresequenz in Beziehung auf die ersten 27 Säurereste besitzt.
../3 809815/0806
1
Glycin		 - Asparagin 27 - Threonin 13 - Isoleucin - 5
Valin		 10 15 Prolin 25
Aspartinsäure - Prolin Aspartin Threonin Glutamin
Alanin - Valin oder - Glutamin - Leucin - säure säure oder
Asparagin säure Glutamin
20
Threonin Tyrosin - Glycin - Glutamin- -
säure oder
Glutamin
Aspartin- Isoleucin - Isoleucin - Glutamin- -
säure oder säure oder
Asparagin Glutamin
Aspartin- Leucin - Leucin
säure oder
Asparagin
Glycin
Ferner hat es sich gezeigt, daß das N-terminale Tridecapeptid meist, wenn nicht immer, die aktiven Stellen des Proteins enthält. Daher kann das Tridecapeptid synthetisiert und angewandt werden zur Diagnose von Brustkrebs oder zur Immunisierung. Ferner ist bekannt, daß die Kohlenhydratgruppe des Glykoproteins an das Protein entweder an dem Aspargin-in 2-Stellung oder dem Aspartinsäurerest in 10-Stellung gebunden ist, was anzeigt, daß ein Octapeptid synthetisiert werden kann, das die aktiven Stellen des Tridecapeptids umfaßt.
Allgemein ist das Verfahren zur Identifizierung des neoplastischen Zelloberflächen-Antigen-Proteins für spezifische zellvermittelte Immunität das folgende: Zunächst werden die neoplastischen Zellen zur Analyse abgetrennt und in einer wäßrigen Lösung suspendiert, in der die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten bleibt. Bei einer bevorzugten Arbeitsweise werden die neoplastischen Zellen in KCl mit Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Man läßt die Lösung sich dann absetzen, und die das Glykoprotein enthaltende Lösung wird von den agglutinierten Zellen entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird dann mit phosphatgepufferter Lösung dialysiert, wobei
die
die biologische Aktivität der Glykoproteine von den neoplastischen Zellen entfernt wurden, erhalten bleibt.
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..Λ
Die Glykoproteine mit mehr als 60 % Kohlenhydratgruppen werden dann von der Lösung durch Extraktion mit heißem Phenol abgetrennt. Dieses Verfahren umfaßt die Behandlung der Lösung mit erhitztem Phenol, Abkühlen der Lösung und Trennung der Phenolschicht und der wäßrigen Lösung. Es hat sich gezeigt, daß das spezifische Oberflächen-Antigen-Protein besser in Wasser löslich ist als in Phenol und daher das Oberflächen-Antigen in die wäßrige Phase geht. Das Phenol wird dann von der Probe entfernt. Die Probe wird dann lyophilisiert und der Niederschlag mit eisgekühltem Alkohol behandelt. Der Niederschlag wird dann zur weiteren Verarbeitung entfernt. Er enthält jetzt nur einen Concavalin-A-Rezeptor, nämlich das spezifische TSA-Protein.
Das TSA-Protein wird dann nach dem Concavalin A-Verfahren entfernt, das ein Waschen bzw. Spülen der das TSA-Protein enthaltenden Lösung über eine Oberfläche, die Concavalin-A enthält, umfaßt. Hierdurch wird das Protein an das Concavalin-A gebunden. Das TSA-Protein kann dann durch eine Zuckerlösung verdrängt werden. Das TSA-Protein wird aus der Zuckerlösung entfernt. Schließlich kann die Aminosäuresequenz des TSA-Proteins nach üblichen Verfahren der Protein-Chemie bestimmt werden.
Wenn das neoplastische Zelloberflächen-Antigen-Protein für spezifische zeilvermittelte Immunität einmal identifiziert ist, kann das aktive Peptid synthetisiert und für diagnostische Verfahren oder zur Immunisierung angewandt werden. Wie oben angegeben, hat es sich nun gezeigt, daß das Tridecapeptid die aktiven Stellen des TSA-Proteins enthält. Ferner wird angenommen, daß bei den meisten, wenn nicht bei allen Krebsarten, die aktiven Stellen des Proteins sich an 8 Aminosäuren finden. Die Immunisierung würde dann die Synthetisierung von mindestens 8 Aminosäuren in entsprechender Sequenz des N-terminalen Tridecapeptids des neoplastischen Zelloberflächen-Antigen-Proteins für die spezifische zeilvermittelte Immunität umfassen, das identifiziert werden kann durch das
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oben angegebene Verfahren. Das Peptid wird dann mit einem Adjuvans konjugiert, das für das zu immunisierende Versuchstier bzw. die Person nicht toxisch ist. Schließlich wird das Konjugat dem Wirt injiziert, um eine spezifische Immunität gegenüber dem Peptid hervorzurufen, was zu einer Immunität des Wirts gegen den spezifischen Krebs führt. Das Peptid kann auch angewandt werden, um Krebs zu identifizieren, indem man ein Antiserum in einem heterologen Tier bildet, das Antiserum mit einer Markierung konjugiert und die auf Krebs zu untersuchenden Zellen oder das Serum mit dem Konjugat nach Standard-Verfahren behandelt. Zum Beispiel können, wenn die Markierungssubstanz ein radioaktives Element ist, übliche radioimmunologische Verfahren angewandt werden. Schließlich kann das aktive bzw. wirksame Peptid bei üblichen Hauttests angewandt werden,' um die Immunität eines Versuchstieres bzw. einer Person gegenüber einem speziellen Krebs zu bestimmen. Der Hauttest umfaßt die Injektion des spezifischen Peptids oder seines Konjugats unter die Haut oder intradermal. Der Injektionsbereich wird dann auf eine verzögerte Reaktion hin untersucht. Wenn eine Reaktion auftritt, besitzt der Patient Immunität gegen den speziellen Krebs und, je nach dem Grad der Reaktion, kann die Immunität durch die oben angegebene Immunisierung erhöht oder gesteigert werden.
Die Erfindung wird im folgenden näher beschrieben: Das Verfahren der Isolierung und Identifizierung von TSA-Proteinen für eine spezielle zellvermittelte Immunität wird im folgenden in Beziehung auf Brustkrebs (Mamacarcinom, Ductuscarcinom) beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, daß im wesentlichen das gleiche Verfahren oder ein identisches Verfahren angewandt werden kann zur Isolierung und identifizierung des neoplastischen Zelloberflächen-Antigen-Proteins für spezielle zellvermittelte Immunität oder für jede Krebsart, Es wird angenommen, daß jede Krebsart ein einzigartiges TSA-Protein für die spezielle zellvermittelte Immunität besitzt.
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Wie unten beschrieben, kann, wenn erst einmal das TSA-Protein identifiziert ist, das aktive Peptid synthetisiert und für diagnostische Versuche für den speziellen Krebs oder zur Immunisierung angewandt werden.
Es ist selbstverständlich, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die biologische Aktivität des Glykoproteins erhalten bleibt, die für das weitere und näher beschriebene Verfahren erforderlich ist. Bei dem speziellen Test auf Brustkrebs wurden Brustkrebszellen, die in Gewebeeinzelschichten gewachsen waren, mit Verseneentfernt, gewaschen und in einer Konzentration von ungefähr 10 Zellen/30 ml Medium suspendiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifu-
(pelletiertj gieren zu einer Perle geformt. Sie wurden dann zweimal mit Salzlösung gewaschen, wieder zu einer Perle geformt, die Salzlösung entfernt und 8 ml kalte 3m KCl Lösung mit 0,005m Kaliumphosphatpuffer zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden dann mit ungefähr 2 ml 3m KCl-Lösung mit Kaliumphosphatpuffer in einem 125 ml Erlenmayer-Kolben gewaschen. Die Kolben wurden dann auf eine Schüttelvorrichtung gestellt und ungefähr 16 Stunden bei 4°C geschüttelt. Dann wurde die Lösung abgesaugt, wobei die agglutinierten Zellen zurückblieben. Die abgesaugte Lösung wurde mit 40 000g 60 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 200 Volumina entionisiertes Wasser bei 4°C 60 Minuten zweimal dialysiert. Die Probe wurde dann 48 Stunden dialysiert, wobei mit Kaliumphosphat gepufferte Salzlösung zweimal gewechselt wurde (0,15m Salzlösung und 0,01m Kaliumphosphat). Es wurde festgestellt, daß bei diesem Verfahren das ülykoprotein in Lösung bleibt und seine biologische Aktivität bis zu 6 Monaten bei 40C beibehält.
Das aus der Oberfläche der neoplastischen Zellen durch das oben beschriebene hyperosmolare Kaliumchloridverfahren eluierte TSA-Protein wird dann mit heißem Phenol weiterbehandelt. Es wurde festgestellt, daß das spezifische Oberflächen-
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antigen oder TSA-Protein besser in V/asser löslich ist als in Phenol. Bei diesem Verfahren wird damit das spezifische Oberflächenantigen zusammen mit anderen Glykoproteinen mit mehr als 60 % Kohlenhydratanteil abgetrennt. Das allgemeine Verfahren der Extraktion mit heißem Phenol wurde bereits zur Extraktion von UN 3 angewandt (Girard, Methods in Enzymology, Band XII, Seite 581 (1973). Dort ist das Verfahren auf die Isolierung von UNS beschränkt und die Isolierung von TSA-Glykoproteinen wird daher nicht nahegelegt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden 21 ml Probe zu 20 ml 88 % Phenol bei 60°C gegeben. Das Gemisch wurde dann heftig mit der Hand im Wasserbad bei einer Temperatur von 600C 30 Minuten geschüttelt. Die Lösung wurde dann in Zentrifugengläser gegeben, in Eis vorgekühlt und 10 Minuten stehengelassen. Die Zentrifugengläser wurden dann 5 Minuten bei 0 C mit 1000g zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wäßrige Phase bildete dabei die obere Schicht und die phenolische Phase die untere. Die wäßrige Phase und die weißliche Zwischenphase werden dann durch Ansaugen abgetrennt und die phenolische Phase verworfen. Die Phenolextraktion wird mit der wäßrigen und der Zwischenphase mit 13 ml 88-l/j-igem heißen Phenol bei 60°C wiederholt. Die Probe wird erneut 2 Minuten mit der Hand in einem Wasserbad von 60°C geschüttelt und sofort in Ueagensgläser gegeben, die in Eis vorgekühlt sind und 10 Minuten stehengelassen. Die Zentrifugengläser mit der Probe werden erneut 5 Minuten bei 0 C mit 1000g zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Wieder werden die wäßrige Phase und die Zwischenphase durch ^nsaugen abgetrennt und die phenolische Phase verworfen. Das oben beschriebene Phenol-Extraktions-Verfahren wird nochmals mit der wäßrigen Phase und der Zwischenphase unter Verwendung von 10 ml 88-%igem heißen Phenol wiederholt, wobei wie oben im Wasserbad bei 600C geschüttelt wird, das Gemisch stehenbleibt und zentrifugiert wird.
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Die wäßrige Phase und die Zwischenphase werden dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird in 20 ml 95-%igem Alkohol, der mit Trockeneis gekühlt ist, suspendiert und gleiche Anteile in 4 Zentrifugengläser gegeben, die vorgekühlt worden sind. Die Proben werden dann 5 Minuten bei O0C mit 1000g zentrifugiert und der Alkohol abgesaugt und das gesamte Verfahren insgesamt dreimal wiederholt. Der weiße Niederschlag wird dann
in eine dünne Schicht gebracht und im Vakuum an der Luft getrocknet. Die getrocknete Probe wird in CMM-Puffer, pH 7,6 in einer Menge von ungefähr 5 ml/Glas, jedoch ausreichend, um eine vollständige Lösung zu erreichen, gelöst. Die Proben werden dann in Dialyse beutel gegeben und gegen CMM-Puffer, pH 7,6 48 Stunden gegen das ungefähr 200-fache des Volumens bei 4°C dialysiert, wobei zweimal gewechselt wird. Die Proben werden dann lyophilisiert und das lyophilisierte Produkt in 1,3 ml CMM-Puffer, pH 7,6, gelöst. Ungefähr 0,3 ml werden dann zur Proteinbestimmung entnommen und der verbleibende ml gegen CMM-Puffer, pH 7,6, in dem 200-fachen Volumen bei 4°C 48 Stunden mit 2 Wechseln dialysiert.
Das Produkt enthält nunmehr nur einen Concanavalin A-Rezeptor, der nach dem Concavalin A-Rezeptor-Verfahren abgetrennt werden kann. Das allgemeine Verfahren der Isolierung eines Concanralin A-Hezeptors ist beschrieben in Biochemistry, Band 14, Nr. 1, S. 109 (1975). Dieses Verfahren wurde jedoch noch nicht angewandt zur Isolierung von spezifischem TSA-Protein. Es hat sich nun gezeigt, daß die Kombination der Extraktion mit heißem Phenol und der Extraktion des Concavalin Α-Rezeptors das neoplastische Zelloberflächen-Antigen-Protein isoliert. Allgemein umfaßt das Concanavalin A-Verfahren das Waschen der Lösung von Glykoproteinen über (surfrose) Perlen mit Concanavalin A. Das spezifische Oberflächen-Antigen bindet sich an das Concanavalin A und der Rest der Lösung wird von den Perlen abgewaschen. Dann wird das Oberflächen-Antigen von dem Concanavalin A mit Zucker, wie Cx-Methylglucosid, verdrängt.
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Speziell wurden bei dem erfindungsgemäßeri Test 1 ml der Probe in CMM-Puffer auf eine Säule mit einer Concanavalin A-(suforse) , die 10 cm lang war und einen Durchmesser von 9 mm besaß aufgebracht. Die Säule wurde mit 15 ml CMM-Puffer gewaschen und die auslaufende Flüssigkeit bei 280 mn überwacht. Das Glykoprotein wurde dann mit dem Q-Methylglucosid oder Methyl-Ot-d-glucopyranosid in CMM-Puffer unter Verwendung von ungefähr 50 bis 100 ml eluiert. Die Probe wurde 6 Tage gegen das 40-fache Volumen CMM-Puffer bei A0C mit einem Wechsel dialysiert. Die Proben wurden dann gegen destilliertes Wasser von 4°C ungefähr 8 Stunden dialysiert. Das Produkt wurde schließlich in ungefähr 100 ml Volumen lyophilisiert.
Nach dem obigen Verfahren fand sich ein identisches Protein auf den Zelloberflächen verschiedener gesicherter Brustkrebszellen. Das Protein wurde durch hyperosmolare Behandlung mit 3m KCl eluiert und anschließend isoliert, und es zeigte sich, daß es bezüglich der ersten 27 Aminosäurereste die folgende Sequenz besaß:
1 Asparagin 27 - Threonin 13 - Isoleucin - 5 15 Prolin 25
Glycin Valin c ι
Aspartinsäure
a (\ f* V*		 - Glutamin - Prolin - Leucin - Valin
10		 Threonin Glutamin
Alanin - VJKJlKr X
Asparagin		 säure Aspartin säure odei
säure Glutamin
Tyrosin - Glutamin- - 20
Threonin - Glycin säure oder
Glutamin
Isoleucin - Isoleucin - Glutamin- -
Aspartin- säure oder
säure oder Glutamin
Asparagin Leucin - Leucin -
Aspartin- -
säure oder
Asparagin
Glycin
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../10
Das Üuctuscarcinom-Zell-Oberflächen-Antigen-Protein oder TSA-Protein wurde untersucht mit Hilfe von zirkulierenden Lymphocyten unter Anwendung des Untersuchungsverfahrens der indirekten Hemmung der Makrophagen Wanderung (Thor et al, Nature 219, 5155 (1968), Rocklin et al, In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity, Bloom & Glade, Ed. (Academic Press, New York, 1971) und Adams et al, J. Nat. Cancer Inst. 56, 1119 (1976) ). Der Versuch zur Hemmung der Makrophagen Wanderung hat sich als zuverlässiges in vitro-Verfahren zur Untersuchung der zeilvermittelten Immunität erwiesen (George et al, Proc. Exp. Biol. Med. 111, 514 (1962)). Eine sehr deutlich positive Reaktion zeigte sich bei Patienten mit Ductuscarcinom gegenüber dem TSA-Protein aus den Krebszellen. Das TSA-Protein aus Zellreihen, die kein Ductuscarcinom enthielten, führten nicht zu einer Hemmung der Wanderung bei Vergleichsversuchen. Ferner zeigten gesunde Frauen, Patientinnen mit Fibromatose mit Zystenbildung (fibrozystische Erkrankung) der Brust, Epifcbelzellen-Carcinom der Lunge und Colon- bzw. Rectum-Adenocarcinom keine deutlich positive Reaktion, wenn ihre Lymphozyten unter Anwendung von Mehrfach**0sS§r Brustkrebsreihen untersucht wurden. Daher kann gesagt werden, daß das Brustkrebs-Zell-Oberflächen-Antigen für spezifische zeilvermittelte Immunität einzigartig ist für Brustkrebs.
Nachdem die Aminosäuresequenz der ersten 27 Reste bestimmt worden ist, wurde das N-terminale Tridecapeptid synthetisiert, um zu bestimmen, ob das Tridecapeptid die aktive Stelle bzw. die aktiven Stellen enthält. Es wurde das Syntheseverfahren angewandt, das beschrieben ist in The
her— Proteins by Finn & Hofmann, 3. Ausg., Bd. 2, ausgegeben von Neurath & Hill (1976). Das synthetische N-terminale Tridecapeptid wurde mit zirkulierenden Lymphozyten unter Anwendung des indirekten Makrophagen-Wanderungshemmtests untersucht. Bei diesem Versuch löste das synthetische Peptid die MIF-Bildung bei Lymphozyten von Patienten mit Brustkrebs aus. Bei
../11 809815/0806
einein Vergleich der Ergebnisse dieser Versuche mit den Versuchen unter Anwendung des TSA-Proteins zeigte es sich, daß die Wirksamkeit des Tridecapeptids ungefähr 50-mal so groß war, was ein Hinweis darauf ist, daß vermutlich nur eine Antigenstelle existiert, die in dem N-terminalen Tridecapeptid des TSA-Proteins vorliegt.
Ferner legen die Veröffentlichungen von Salvinand et al, Int. Arch. Allergy 31, 366 (1967) und Spitler et al, J. Exp. Med. 136, 156 (1972) nahe, daß der tatsächliche Antigen-aktive Bereich des N-terminalen Tridecapeptids eine Lange von 8 Aminosäureeinheiten besitzt. Ferner wird, wie oben angegeben, angenommen, daß die Kohlenhydratgruppe des Glykoproteins an das Tridecapeptid entweder an das Aspargin in 2-Stellung oder die Aspartinsäure in 10-Stellung gebunden ist. So kann ein Octapeptid synthetisiert werden, daß die aktiven Stellen enthält. Wenn z.B. die Kohlenhydratgruppe an das Glykoprotein über das Asparagin gebunden ist, kann die Sequenz 3 bis 10, k bis 11, 5 bis 12 oder 6 bis 13 sein. Wahlweise kann, wenn die Kohlenhydratgruppe an die Aspartinsäure gebunden ist, das Octapeptid 1 bis 8 oder 2 bis 9 sein. So wird angenommen, daß das Peptid mindestens 8 Aminosäurereste in der richtigen Sequenz des Tridecapeptids enthalten sollte.
Nachdem das aktive Peptid isoliert und identifiziert worden ist, kann es synthetisiert oder direkt für klinische Untersuchungen auf den speziellen Krebs und zur Immunisierung gegen diesen Krebs angewandt werden.
Die klinischen oder diagnostischen Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Glykoproteins sind bekannt. Zum Beispiel wurde Human-Chorion-Gonadotropin bei der Schwangerschaft sehr früh nachgewiesen und wird jetzt als diagnostischer Test auf Schwangerschaft angewandt. Die Konzentration von HCG sowohl in dem mütterlichen Blut als auch im Urin erreicht ein
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Maximum während der ersten drei Monate der Schwangerschaft und sinkt anschließend während der späteren Schwangerschaft auf einen niedrigeren Gehalt ab. Das Vorhandensein von HCG, das ebenfalls ein Glykoprotein ist, wird durch übliche radioimmunologische Verfahren bestimmt. Das übliche Verfahren ist kurz folgendes: Das für das Peptid oder Glykoprotein spezifische Antiserum wird gebildet durch serienmäßige Injektion des Glykoproteins oder Peptids an ein heterologes Tier, üblicherweise Kaninchen. Dem Tier wird dann das Blut entnommen und das Antiserum extrahiert und gereinigt (Naughton et al, Cancer Research, Band 35, S.1887 (1975). Wenn ein radioaktives Isotop zur Markierung angewandt wird, wie Jod 125, Jod 131 oder Tritium, wird das Antiserum mit dem radioaktiven Isotop konjugiert.
Wenn ein Doppel-Antikörper-Verfahren angewandt wird, muß das zweite Antiserum zu dem ersten Antiserum spezifisch sein. Wenn z.B. das erste Wirtstier ein Kaninchen ist, wird Antikaninchen-y-Globulin angewandt. Zum Beispiel wird Kaninchen-Immuno-^T-Globulin G(IgG) einem zweiten Wirtdbier, wie einem Schaf oder einer Ziege, injiziert. Dem zweiten Wirtstier wird dann Blut entnommen und das Antikaninchen-Y-Globulin extrahiert, gereinigt und durch Konjugation mit der jeweiligen Markierungssubstanz markiert. Verfahren zur Konjugierung von Fluorescein und Radiojod mit Antikaninchen-V-Globulin sind beschrieben in Methods in Enzymology, Watkins, Academic Press (1975). Wahlweise können das Tridecapeptid oder das aktive Octapeptid direkt mit der nachweisbaren Markierungssubstanz auf ähnliche Weise konjugiert werden.
Das klinische Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines speziellen Krebses würde dann abhängen von der jeweiligen Markierungssubstanz (z.B. Fluorescein, Radiojod usw.) und der zu untersuchenden Probe. Zum Beispiel können Körper-
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flüssigkeiten, wie Blut und Urin usw., auf das Vorhandensein des Glykoproteins mit Hilfe radioimmunologischer Verfahren unter Anwendung eines radioaktiven Elements untersucht werden. Bei einem Zelltest kann der Doppel-Antikörper-Test angewandt werden unter Verwendung einer sichtbaren Nachweissubstanz, wie Fluorescein. Wenn Fluorescein als Markierung angewandt wird, besteht das Verfahren darin, daß man entsprechend verdünntes Antiserum, das zu dem Tridecapeptid oder dem aktiven Octapeptid spezifisch ist, zu der zu untersuchenden Probe zugibt. Die Probe wird dann inkubiert und gespült, z.B. mit PBS. Nach dem Waschen können die Objektträger direkt auf das Vorhandensein von Fluorescein untersucht werden, wenn ein einfaches Antikörperverfahren angewandt wird. Wenn das Doppel-Antikörper- Verfahren angewandt wird, wird der zweite Antikörper mit dem Fluorescein, wie beschrieben, konjugiert. Nach der Behandlung mit dem ersten Antiserum wird das mit Fluorescein konjugierte zweite Antiserum zugegeben. Die Objektträger werden inkubiert, gewaschen und untersucht, vorzugsweise mit Hilfe eines UV-Mikroskops. Wenn Fluoreszens auftritt, ist das Glykoprotein vorhanden und das Vorliegen des speziellen Krebses wird bestätigt. Ein ähnliches Verfahren wird bei radioimmunologischen Untersuchungen angewandt, mit der Ausnahme, daß das Vorhandensein des Glykoproteins durch Messung mit einem Geigerzähler bestimmt wird.
Ähnlich ist das Verfahren der Immunisierung oder Isoimmunisierung gegen ein spezifisches Glykoprotein bekannt. Zum Beispiel haben Talwar et al, Band 13» Nr. 2 (15 Papiere) 125-258 (Febr. 1976) die ß-Untereinheit von HCG mit dem Adjuvans ,Tetanus-Toxoid in diskreten molekularen Verhältnissen konjugiert und das Konjugat Frauen im gebährfähigen Alter zur immunologischen Schwangerschaftsverhütung injiziert. Bei dem von Talway beschriebenen Test führte das Konjugat bei allen untersuchten Tieren und Frauen zur Bildung von Antisera gegen die ß-Untereinheit von HCG und Tetanus-Toxoid. Ausführliche klinische und toxokologische Untersuchungen von Talwar et al bewiesen, daß das Konjugat für die Anwendung beim Menschen
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sicher und wirksam zur Bildung von Antikörpern war.
So kann das synthetische Peptid, wie das Tridecapeptid oder das wirksame Octapeptid, mit einem Adjuvans, wie einem Hapten, einschließlich Tetanus-Toxoid, synthetisiert werden. Die Verfahren der Konjugierung mit einem Hapten sind angegeben in Cinader et al, Ur. J. Exp. Pathol. 36:515-529 (1955). Das Konjugat wird dann der Person oder dem Versuchstier injiziert und führt zur Bildung von Antisera gegen das spezifische Peptid und stimuliert die spezifische Immunität.
Eine Person kann somit gegen eine bestimmte Krebsart immunisiert werden, indem man das N-terminale Tridecapeptid oder das wirksame Octapeptid des neoplastischen Zell-Oberflächen-Antigen-Proteins für die spezifische zeilvermittelte Immunität synthetisiert. Das Peptid wird dann mit einem für den Wirt nicht toxischen Adjuvans konjugiert und das Konjugat der Person injiziert, vorzugsweise serienmäßig, um die spezifische Immunität gegenüber dem Peptid bei dem Y/irt zu stimulieren.
Schließlich ist es von Bedeutung, die Immunität eines Patienten klinisch zu bestimmen, unabhängig davon, ob er wie oben immunisiert worden ist oder nicht. Zum Beispiel entwickelt eine Frau mit Brustkrebs Antikörper gegen das spezifische TSA-Protein. Das übliche Verfahren der Behandlung von Brustkrebs besteht in einer Ausschneidung der Krebszellen. Die Patientin kann dann eine Immunität entwickelt haben, die die restlichen Krebszellen zerstört. In einigen Fällen hat die Patientin jedoch eine nicht ausreichende Immunität oder gar keine Immunität entwickelt, was eine weitere Behandlung erforderlich macht. Es wurden zwei Versuche entwickelt zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern zu dem TSA-Protein bzw. zur Isoimmunisierung.
Der Hauttest umfaßt die Injektion des spezifischen Peptids, vorzugsweise des synthetischen Peptids oder seines
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- ν? - At
Konjugats unter die Haut oder intradermal. Der Injektionsbereich wird dann auf eine verzögerte Reaktion untersucht, z.B. nach 24 Stunden. V/enn eine Reaktion eintritt, besitzt der Patient Immunität, je nach dem Grad der Reaktion kann die Immunität durch die oben erwähnte Immunisierung erhöht werden. Wahlweise können auch die Körperflüssigkeiten des Patienten, auf das Vorhandensein von Antikörpern untersucht werden, indem man das Peptid mit einer nachweisbaren Markierung, wie Fluorescein oder Radiojod, konjugiert. Die Körperflüssigkeiten werden dann, wie oben beschrieben, behandelt und auf die Markierungssubstanz untersucht. V/enn man die Markierungssubstanz findet, besteht Immunität. Wenn ein radioimmunologisches Bestimmungsverfahren angewandt wird, kann die Immunität des Patienten quantitativ bestimmt werden.
üin Verfahren zur Isolierung des TSA-Proteins von neoplastischem Zell-Oberflächen-Antigen-Protein für die zellvermittelte Immunität ist angegeben. Dieses Verfahren erhält die biologische Aktivität des Proteins und erlaubt eine Identifizierung der Aminosäuresequenz. Das wirksame Peptid von Brustkrebs wurde auch identifiziert als das N-terminale Tridecapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz.
1 - Asparagin - Threonin - Isoleucin 5
Glycin - Valin - Glutamin - Leucin - Valin 10
Alanin säure - Aspartin
- Tyrosin - Prolin säure
Threonin
Dieses Verfahren wird auch angewandt zur Identifizierung des wirksamen Peptids von anderen Krebsarten und erlaubt die Synthese des aktiven Peptids für jeden speziellen Krebs.
Das wirksame synthetische Peptid kann dann angewandt werden als klinisches oder diagnostisches Hilfsmittel zum Nachweis des Vorhandenseins eines speziellen Krebses mit Hilfe üblicher in vitro- oder in vivo-Verfahren. Ferner kann das wirksame
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Peptid oder vorzugsweise das mit einem Adjuvans konjugierte Peptid einem Patienten injiziert werden zur Stimulierung einer spezifischen humoralen und zellvermittelten Immunität gegenüber dem TSA-Protein und damit gegen die spezielle Krebsart. Schließlich kann das Peptid angewandt werden, um die Immunität eines Patienten nach einer Operation oder Immunisierung zu bestimmen.
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Claims (7)

  1. Patentansprüche
    1A Mittel zur Immunisierung und zum Nachweis von speziellen Ki^ebsarten bzw. der Immunität gegen solche Krebsarten, dadurch gekennzeichnet , daß es das spezifische Zeiloberflächen-Antigen-Protein oder dessen biologisch
    Tri-
    wirksamen Teil, insbesondere ein decapeptid oder einen Antikörper dazu enthält.
  2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der wirksame Teil des überflächen-Antigen-Proteins mindestens 8 Aminosäuren in entsprechender Sequenz von dem N-terminalen Tridecapeptid umfaßt.
  3. 3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Oberflächenprotein bzw. der wirksame Teil davon an ein nicht-toxisches Adjuvans gekuppelt ist.
  4. 4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Tridecapeptid für Brustkrebs die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
    1
    Glycin - Asparagin - Threonin
    Alanin - Valin - Glutaminsäure
    Threonin - Tyrosin - Prolin
    - Isoleucin
    - Leucin
    - Valin 1(
    - Aspartinsäure
  5. 5. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1
    bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Aminosäuresequenz des Zelloberflächen-Proteins bestimmt und das Protein bzw. den wirksamen Bestandteil davon synthetisiert und gegebenenfalls das erhaltene Produkt einem heterologen Tier injiziert und das Antiserum gewinnt.
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    ORIGINAL INSPECTED
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des Zelloberflächen-Antigen-Proteins a) die neoplastischen Zellen gewinnt, b) die Glykoproteine abtrennt und in wäßriger Lösung suspendiert, c) Glykoproteine mit mehr als 60 % Kohlenhydratgruppen durch Extraktion mit heißem Phenol aus der Lösung abtrennt, diese mit Alkohol behandelt und kühlt, d) aus dem Niederschlag das überflächen-Antigen-Protein durch Bindung an Concavalin A und Verdrängung des Proteins mit einer Zuckerlösung gewinnt, von der Zuckerlösung abtrennt und e) in dem erhaltenen neoplastischen Zelloberflächen-Antigen-Protein die Aminosäuresequenz bestimmt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man die neoplastischen Zellen zur Erhaltung der biologischen Aktivität der Glykoproteine in mit Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert, wobei man die neoplastischen Zellen in mit Phosphat gepufferter KCl-Lösung wäscht, die Lösung sich absetzen läßt, die überstehende Flüssigkeit von den agglutinierten Zellen entfernt und gegen eine mit Phosphat gepufferte Lösung dialysiert.
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