TWI222516B

TWI222516B - Carrier-enzyme-protein complex and immunoassay kit comprising the same

Info

Publication number: TWI222516B
Application number: TW089127563A
Authority: TW
Inventors: Hirokazu Ohbayashi; Yuriko Kitano
Original assignee: Nichirei Kk
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2004-10-21
Also published as: KR100649378B1; AU778084B2; CA2328805A1; ZA200007776B; DK1111385T4; CN1300942A; EP1111385B1; US7235369B2; ATE468533T1; KR100709052B1; US6613564B2; DE60044420D1; HK1037728A1; NO20006481D0; DK1111385T3; EP1111385A2; AU7218400A; KR20060088864A; IL140413A0; CN100338465C

Description

1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1) 發明背景發明領域本發明係關於酵素、蛋白質以及載體複合物，其製備係包含兩種或多種分子之酵素，該兩種或多種酵素分子中至少一個可經由胺基或其它基團共軛結合至載體，例如·· 聚離胺酸、以及與其它物質（例如抗原）具特定的結合能力之蛋白質（例如抗體），使其能夠以高敏感度精確的測定微量的物質。本發明係關於酵素、蛋白質以及載體複合物，其製備係將具特定的結合能力之蛋白質共價鍵地聯結至共價鍵聯結至載體之酵素，並利用此複合物進行免疫測定，例如免疫組織化學以及酵素免疫分析法。其他相關技藝的描述由於最近免疫化學的進展，使免疫測定能廣汎的使用抗原-抗體反應高敏感度的偵測微量物質。目前有二種一般類型的免疫測定法，分別爲免疫組織染色以及酵素免疫分析法。免疫組織染色係指在組織中用識別抗原之抗體偵測特定的抗原。一般而言，識別特定抗原的抗體係與固定之組織，經包埋在石蠟之後，切成薄片的切片作反應；檢查抗體反應的存在與否，以測定抗原是否存在。與抗原進行第一次反應之抗體，一般而言稱爲一次抗體。當可發出視覺之信號或可發出儀器上可偵測到之信號的物質聯結至一次本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-4 - 1222516 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（2) 抗體時，信號強度代表一次抗體之含量，其係反應出切片上抗原之含量。爲了使物質發出信號，可使用螢光物質以及酵素。在免疫組織染色發展階段之早期，係使用螢光物質作爲發出該信號之物質。在本案例中，則是用螢光顯微鏡偵測螢光。其後，Nakane et al .發展出酵素—標記的抗體方法，其可用光學顯微鏡分析染色的影像。目前，一般係使用酵素作爲發出信號之物質。其係將一次抗體上聯結對應至呈色反應的酵素，加入酵素的發色物質以啓動免疫組織染色，呈色反應則相當於抗體之含量，換言之即對應至組織內之抗原量。然而一般而言，此方法無法得到充分的靈敏度〇目前大部分常用之方法稱爲抗生蛋白鏈菌素-生物素方法（SAB方法），換言之其係可放大一次抗體結合至抗原的信號，從而偵測信號。此方法包含先用一次抗體反應識別組織切片內專一的物質。然後用結合至一次抗體之二次抗體進行反應。一般而言，二次抗體爲確認以及鍵結至一次抗體之多株抗體。據此多數之二次抗體可結合至一次抗體。將多數生物素分子先聯結至二次抗體之各分子。酵素-共軛結合的抗生蛋白鏈菌素（酵素試劑）與一次抗體-生物素-共軛結合的二次抗體複合物反應。目前已知抗生蛋白鏈菌素可強烈地結合至生物素。因此可形成一次抗體-生物素-共軛結合二次抗體一酵素一共軛結合抗生蛋白鏈菌素之複合物。因爲共軛結合多數生物素分子的二 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -5- 1222516 A7 B7 五、發明説明（3) 次抗體之共軛聯結物可結合至各一次抗體之分子，因此依據方法共軛結合多數酵素分子的抗生蛋白鏈菌素之共軛聯結物可結合至各共軛結合生物素分子的二次抗體之共軛聯結物，所以可顯著地間接增加酵素結合至一次抗體的含量。結果，抗原在組織切片上可進行高敏感度之偵測。如先前之描述，S A B方法是能產生更強烈的信號的卓越方法，因爲許多酵素分子最後可經結合至一次抗體而結合至抗原。然而從本方法之另一觀點而言，有三個步驟 ’換言之須要進行一次抗體反應、二次抗體反應、以及酵素試劑反應。如先前之描述，S A B方法包括許多步驟，所以在臨床的應用上不能令人滿意，因此需要快速、簡單及高準確度的方法。因此，S A B方法須加以改良。另一種習知的免疫測定爲酵素免疫分析法（E I A ) 。如今將E I A代表性的原理以及程序說明如下。首先將識別測定所欲求之物質的抗體固定於載體，例如聚苯乙烯圓珠或微盤。接著用載體蛋白質例如白蛋白進行阻塞，然後加入內含預期測定物質（抗原）之溶液（樣品）。接著加入共軛結合酵素之抗原識別抗體（標記酵素的抗體）。換言之，在二種抗體之間夾住抗原。然後淸洗去除過量的標記酵素之抗體；加入酵素發色的受質進行呈色反應。因爲抗原量取決於酵素活性，所以比較內含已知濃度的抗原之呈色反應後可測定樣品中抗原之濃度。酵素免疫分析法之敏感度涉及許多因子，標記酵素抗體之品質是顯著因子之一。更明確的說，標記酵素的抗體具有更多酵素分子即本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —ϋ ϋϋ mi im— §_ι_ϋ ai-ϋ--Ian ·1_1 ϋϋ —kn ι_ιϋ ，- ·-ST»

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -6- 1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4) 可得到更強烈的信號，藉以在高敏感度下測定抗原。如先前之描述，免疫測定時標記酵素抗體的品質非常重要，可顯著地影響測定系統之敏感度或測定程序中步驟之數目。以下將說明許多種爲了達成高敏感度之標記酵素抗體所作的嘗試。其中許多努力包含在載體及抗體上聯接許多酵素分子。日本專利申請案公告ΓΡ—A 63503138( 1 9 8 8 )，將抗體聯結至共軛結合可偵測標記（例如：藥品、毒素、螯合物以及硼加合物衍生物）之載體。載體可使用胺基右旋聚醣；先將藥品，例如：馬索多酸（ methotoxate)，聯結至胺基右旋聚醣。此後，用過碘酸鈉與抗體糖鏈進行氧化反應產生醛基，將彼與胺基右旋聚醣之胺基反應，接著與氰基硼氫化鈉還原產生共價鍵的鍵結，以製備藥品、抗體、以及胺基右旋聚醣複合物。日本專利申請案公告JP — A3 — 1 58758 ( 1991)，將右旋聚醣與過碘酸鈉氧化；產生的醛基與鹼性磷酯酶之胺基及抗體反應，接著用硼氫化鈉還原，製備酵素、抗體以及右旋聚醣複合物。日本專利申請案公布號碼6 - 5 0 9 1 6 7 ( 1994)，將二乙烯基硕與聚合物例如右旋聚醣反應，引進乙烯基，接著與酵素及抗體反應，如此製備酵素、抗體以及右旋聚醣的複合物。由此類方法製備的所有錯合物，係直接聯接二種物質聚合形成之錯合物。所有由此類方法製備的錯合物較之不本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____ B7_五、發明説明（5) 用任何載體直接地聯結二種物質產生之錯合物爲佳。然而此類方法有下列之缺點。更明確的說是因爲二種物質結合至載體之數量有限，其中一個物質共軛結合的量較大，則另一物質軛結合的量則較小。若可克服此缺點，則可能得到較佳效能之複合物。本發明槪要如此本發明之目的係爲了克服上述的缺點，以提供新穎的高品質之酵素、蛋白質以及載體複合物。圖式簡單說明圖1顯示實施例9之結果，即實心圓（·）爲實施例 3製得的本發明複合物所得結果，空心圓（〇）爲習知方法製得的複合物所得結果。發明之詳細描述本案發明人硏究產生酵素、蛋白質以及載體複合物之方法後，得到高品質之酵素、蛋白質以及載體複合物。本案發明人發現先將酵素聯結至載體，再進一步的將蛋白質聯結至酵素即可完成以一目的。經硏究之後，最後達成本發明。換言之，本發明係關於酵素、蛋白質以及載體複合物 ’其製備係將兩種或多種酵素分子聯結至載體，以及將專一的結合至其它物質之蛋白質聯結上至少一個酵素分子。 I紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐) ' -8- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1222516 A7 B7 五、發明説明（6) 進一步的’本發明係關於酵素、蛋白質以及載體複合物，其製備係於相同蛋白質上進一步的直接聯接上，上述製備的結合其它物質之酵素、蛋白質及載體複合物。因此本發明之酵素、蛋白質及載體複合物中，酵素以及聯結至與特定其它物質結合的蛋白質之同一酵素，係各自共軛結合上許多的載體；或酵素、聯結至與特定其它物質結合的蛋白質之同一酵素，以及特定結合其它物質之蛋白質，係各自共軛結合的許多的載體。本發明將詳細描述於下。本發明之酵素-蛋白質複合物可應用於免疫組織化學以及酵素免疫分析法領域。然而本發明應用於其它領域並不受任何限制。依據本發明之載體係指蛋白質以及多糖，並無特定的限制。然而，宜使許多酵素分子聯結至載體，以提高免疫測定之敏感度。因此，（1 )分子量必須大到某些程度，以及（2 )具有反應性的官能基或本質上可能或可以有效的引入該反應性官能基以聯接至酵素。達成該目的之載體的實施例包括：肽聚合物及/或多糖，適當者之平均分子量爲5， 000至500， OOODa，更佳者爲 10， 000至300， OOODa，以凝膠過濾色層分析法之測定爲計。在此，該分子量範圍只是簡單的原則；分子量大於前述範圍，且在液體中不發生沉澱或沈降者亦可使用；以及分子量小於前述範圍者亦可使用，其限制條件爲可達成本發明之目的。依據本發明，例如內含兩個或多個具有結合能力之胺本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) %

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -9- 1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7) 基的肽類可適當地作爲載體。實施例之一包括具有胺基的肽類，例如包含至少一種胺基酸，其係選自：離胺酸、精胺酸，鳥胺酸、麩胺醯胺酸以及其它鹼性的胺基酸之肽類，此類胺基酸至少具有一種胺基，其係選自：α -胺基、 ε -胺基以及其它胺基。此外，特定實施例包括聚離胺酸其爲包含ε -胺基離胺酸之聚合物，以及包括離胺酸及其它胺基酸之各種肽類。後一肽聚合物之實施例包括：離胺酸以及甘胺酸之雜亂共聚物、離胺酸及絲胺酸之雜亂共聚物以及離胺酸以及麩胺酸之雜亂共聚物，其爲市售之各種分子量之雜亂共聚物。此外，具有醛基、胺基或其它活化基的多糖亦可作爲本發明之載體。多糖之實施例爲：類糊精、瓊脂糖、糊精以及可溶解的澱粉。具有醛基之多糖其製備係將多糖與過碘酸鈉反應後得之。可用已知的方法在多糖中引入胺基。例如，具有類糊精之胺基其製備係將類糊精與過碘酸鈉反應產生醛基，與二胺反應後用硼氫化鈉還原。可用已知的方法在多糖中引入活化的基團。例如，具有乙烯基之類糊精可用二乙烯基硕與類糊精反應後得之。所有任何具有兩個或多個胺基之酵素均可作爲依據本發明之酵素，且一般應用於免疫測定的酵素均可適當地使用。上述酵素並無特別之限制，其實施例爲辣根過氧化酶、鹼性磷酯酶、yS -半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶。依據本發明對其它物質具有特定結合能力的蛋白質包括（1)蛋白質、（2)蛋白質片段、以及（3)蛋白質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 1222516 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（8) 及蛋白質片段之混合物’更明確的包括能結合至特定抗原的抗體以及能結合至特定配體的受體，例如：單株抗體及多株抗體；卵白素以及抗生蛋白鏈菌素，其可專一的鍵結至生物素；蛋白質A以及蛋白質G，其可專一的鍵結至抗體；外原凝集素，其可專一的鍵結至糖鏈；以及玻尿酸一結合蛋白質，其可專一的鍵結至玻尿酸。進一步的，本發明中之蛋白質包括與特定物質結合之蛋白質片段。例如，蛋白質片段可爲抗體片段F(ab’ ）2、Fab’ 、及 F a b c ’ 。本發明中可與特定物質結合的蛋白質包括可與其它單一物質特定結合的蛋白質以及可與其它多數物質特定結合的蛋白質。依據本發明，可先製備載體及酵素複合物。例如，該方法包含修飾載體之胺基使形成硫醇基，以及攪拌產生的含酵素之載體與修飾自胺基之順丁烯二酸醯亞胺基團。因爲硫醇基以及順丁烯二酸醯亞胺基團可快速地共同反應並形成共價鍵的鍵結，故可製備共軛結合酵素的載體。爲了在載體胺基中引進硫醇基，可使用S -乙醯基氫硫醇基琥珀酸酐、η -琥珀醯亞胺基一 3 -（ 2 -吡啶基二硫醇基）丙酸酯（S P D Ρ )、以及S -乙醯基硫乙醇酸Ν -羥基琥珀醯亞胺（S A T A )等習知的方法。此類試劑可與胺基反應，而引入阻塞的硫醇基。此後，移除硫醇基上阻塞之保護基（用S -乙醯基氫硫醇基琥珀酸酐或 S A T A時用羥胺，或使用S P D P時用二硫蘇糖醇（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -11 - 1222516 A7 B7 五、發明説明（9) D T T )處理）以產生硫醇基。爲了將酵素之胺基引進順丁烯二酸醯亞胺基團，其可使用一個分子內具有順丁烯二酸醯亞胺基團以及琥珀醯亞胺酯基團之化合物。例如，可令人滿意地使用一端有順丁烯二酸醯亞胺基團以及另一端有N -羥基琥珀醯亞胺基團之二價交聯試劑。其實施例爲N -（ 6 -順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺（EMCS)以及N -（4 -順丁烯二酸醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀醯亞胺（ G Μ B S ) 〇除了上述之EMC S及GMB S之外，可使用以下描述之在一個分子中具有順丁烯二酸醯亞胺基團以及琥珀醯亞胺基團之化合物，其係包括（而非限制）·· N -琥珀醯亞胺基- N -順丁烯二酸醯亞胺基乙酸鹽：N -琥珀醯亞胺基一 4 一（ N —順丁烯二酸醯亞胺基）丁酸鹽；N -琥珀醯亞胺基- 6 -（ N -順丁烯二酸醯亞胺基）己酸酯； N -琥珀醯亞胺基- 4 -（ N -順丁烯二酸醯亞胺基甲基 )環己烷一 1 一羧酸酯·· N -琥珀醯亞胺基一 m -（N — 順丁烯二酸醯亞胺基）苯甲酸鹽；N -琥珀醯亞胺基-對一（N -順丁烯二酸醯亞胺基苯基）一 4 一丁酸鹽；N -磺基琥珀醯亞胺基- 4 -（ N -順丁烯二酸醯亞胺基甲基 )環己烷一 1—羧酸酯；N -琥珀醯亞胺基一 m -（N - 順丁烯二酸醯亞胺基）苯甲酸鹽；N -磺基琥珀醯亞胺基一對一（N -順丁烯二酸醯亞胺基苯基）一 4 一丁酸鹽；及其類似者。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -12- 1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（ljD 在本發明中因爲載體不須要額外地共軛結合至其它物質，所以製備之酵素及載體複合物中共軛結合的酵素分子越多越好。實施例之一描述如下。添加入大量過量的順丁烯二酸醯亞胺化試劑並與酵素及載體複合物反應，引進順丁烯二酸醯亞胺基團至幾乎所有殘留在複合物上之胺基。用此一相同酵素產生之複合物在此酵素上以保持一個或多個胺基的條件下進行硫醇化反應。接著利用殘留在在酵素上的胺基聯接特定的結合至其它物質的蛋白質。將硫醇化的酵素與引入順丁烯二酸醯亞胺基之酵素以及載體複合物共同反應。其後，殘留的順丁烯二酸醯亞胺基用含硫醇基之物質阻塞。應用於阻塞之含硫醇基物質的實施例爲：毓基乙醇、半胱胺氯化氫以及半胱胺酸。胺基僅存在於酵素以及載體複合物之硫醇化酵素上時，以巯基乙醇進行阻塞。胺基存在於酵素以及載體複合物之硫醇化酵素上且殘留有順丁烯一酸醯亞胺基時，以半胱胺氯化氫或半胱胺酸進行阻塞〇爲了共軛聯結以上說明之特定結合至其它物質的蛋白質至酵素及載體複合物，其係利用製備酵素及載體複合物之相同方法將硫醇基與順丁烯二酸醯亞胺基反應。例如將上述引入順丁烯二酸醯亞胺基的試劑與酵素及載體複合物上之肢基反應。另一方面將上述引入硫醇基的試劑與特定的結合至其它物質的蛋白質反應。然後將此二產物共同混合’即可製備酵素、特定的結合至其它物質的蛋白質及載本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 2ι〇χ297公着）" (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-13- 1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1) 體複合物。當S - S鍵結不涉及其它物質之結合，且其係存在於結合至特定其它物質的蛋白質時，S 一 S鍵結可用半胱胺氯化氫或用DTT還原，取代硫醇化作用因而產生硫醇基。當特定的結合至其它物質的蛋白質具有糖鏈時則可利用糖鏈。例如，用過碘酸鈉氧化特定的結合至其它物質的蛋白質之糖鏈產生醛基，並與酵素以及載體複合物上之胺基反應，接著利用還原作用共同共軛聯結二種物質。在製備酵素以及載體複合物時，當殘留在載體上之順丁烯二酸醯亞胺基最後用巯基乙醇阻塞後，完成製備的複合物爲特定結合至其它物質的蛋白質，係可單獨共軛結合至酵素之複合物。在製備酵素以及載體複合物時，當殘留在載體上之順丁烯二酸醯亞胺基最後用半胱胺氯化氫或半胱胺酸阻塞後，其他完成製備的複合物實施例爲特定的結合至其它物質的蛋白質係共軛結合至酵素及載體之複合物〇本發明具體實施例之一中，產生酵素、蛋白質以及載體複合物之方法係使用聚- 1 -離胺酸作爲載體，過氧化酶作爲酵素以及抗體片段F ( a b ’ ）2作爲特定的結合至其它物質的蛋白質，並描述如下。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-14- 1222516 Α7 Β7 五、發明説明（作反應，在載體中引進硫醇基（製備載體一 SH)。載體並未完全的硫醇化，載體上仍留下某些自由胺基。 2 .將製備的共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的過氧化酶 FMC S與辣根過氧化酶（p〇d )反應以製備共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的過氧化酶（Μ - P ◦ D )。 3 .製備P〇D -聚一 1 一離胺酸複合物1 共同攪拌共軛結合硫醇基的載體以及Μ - P 0 D，共同反應製備複合物（載體一 S - Μ - POD)。於反應之後，殘留的順丁烯二酸醯亞胺基用巯基乙醇阻塞。經由此反應，在載體（複合物）中引入許多S - MP〇D以及 SH基團，並含有自由胺基。 4 ·製備共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的複合物添加入大量過量的FMC S溶液，與第3項中得到之複合物反應，將順丁烯二酸醯亞胺基引進所有複合物上之胺基。經由此反應，可得到帶有許多S - Μ - P〇D、順丁烯二酸醯亞胺基之載體（複合物），於EMC S結合至 5 Η基後水解EMC S之N -羥基琥珀醯亞胺酯可產生 C〇〇Η基團。 5 .製備共軛結合硫醇基的過氧化酶 S -乙醯基硫乙醇酸- Ν -羥基琥珀醯亞胺酯與本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15- 1222516 A7 _____ B7 _ 五、發明説明（作 P〇D反應，然後產生的反應混合物與羥胺後可在P〇D 中引入硫醇基。在此案例中，反應在P 0 D ( S Η — Ρ〇D - Ν Η 2 )可保持自由胺基之條件下進行。 6 .製備POD —聚一 1 一離胺酸複合物2 經S Η — P 0 D — Ν Η 2與第4項得到之複合物反應，將硫醇化過氧化酶引入順丁烯二酸醯亞胺基並聯結至載體。其後，殘留的順丁烯二酸醯亞胺基用巯基乙醇處理，轉化殘留的順丁烯二酸醯亞胺基至◦ Η基團。經由此反應，可得到引入許多S— M—POD、許多M— S — POD — NH2、C〇〇H基團以及〇H基團之載體（酵素複合物） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) % 訂

7 .製備具有共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的P 〇 D之 P〇D —聚一 1 —離胺酸複合物2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製將E M C S溶液與第6項得到之酵素複合物反應，將複合物中Ρ ◦ D之胺基順丁烯二酸醯亞胺化。製備具有許多S— M— P〇D 、許多MS-POD— M、C〇〇H基團、以及〇Η基團的複合物。 8 ·製備還原的抗體片段將山羊抗-老鼠免疫球蛋白G用胃蛋白酶處理得到 F ( a b ’ ）2片段；將半胱胺氯化氫與F ( a b ’ ）2片段反應，得到還原的抗體片段（S Η - F a b ’ ）。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1222516 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（ι)ι 9·製備酵素、抗體及載體複合物共冋擾泮速原的抗體片段以及第7項之複合物，將抗體片段聯結至P 0 D之順丁烯二酸醯亞胺基。經由此反應，可得到引入許多S-M— P〇D、許多M— S — P〇D —M— S — Fab’ 、許多M— S — P〇D— Μ、 C〇〇H基團、以及〇H基團之共軛結合載體（酵素一抗體複合物）。視須要，產生的載體可進一步的用锍基乙醇處理，轉化Μ - S - P 0 D - Μ之未變的順丁烯二酸醯亞胺基至◦ Η基，從而阻塞順丁烯二酸醯亞胺基。本發明之酵素、蛋白質以及載體複合物是上述結構中首度成功的產品，由於在載體上有極大量的酵素，可產生強烈之呈色反應。此外因爲酵素上可共軛結合其它物質特定結合之蛋白質，雖然許多酵素分子佔據載體之表面，許多特定的結合至其它物質的蛋白質分子可聯結至複合物；因此，極度加大了其他物質之結合容量。因爲本發明酵素、蛋白質以及載體複合物中存在許多特定的結合至其它物質的蛋白質分子，所以即使是微量測定物質亦可被酵素、蛋白質及載體複合物捕獲及結合。當測定物質聯結至任何分子或蛋白質分子片段，因爲許多酵素分子聯結至酵素、蛋白質以及載體複合物所以可產生非常強烈的呈色反應。依據本發明，換言之，即使是微量的物質亦可在高敏感度下偵測以及測定。因此，本發明能夠精確的進行測定。據此，使用本複合物可組裝成卓越的測 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -17- 1222516 A7 B7 五、發明説明（作定組套。依據本發明可產生酵素、蛋白質以及載體複合物，此外，聚離胺酸不可先用EMC S處理（會發生沉澱導致聚離胺酸不適用），但可先用S -乙醯基氫硫醇基琥珀酸酐處理以將載體上一部分的胺基修飾成硫醇基（其係共軛結合至順丁烯二酸醯亞胺化之酵素），接著用大量過量的 E M C S處理進行順丁烯二酸醯亞胺化以及羧化反應，後續的與硫醇基基團-共軛結合的酵素反應，最後將許多酵素分子聯結至載體，即使共軛結合的酵素分子最初數目很少，但不會發生沉澱或沈降。達成明顯的效應，使許多酵素分子在溶液狀態下聯結至載體。據此，本發明具有卓越的效應可在微量的樣品或極度稀釋樣品中準確地測定物質。實施例本發明將用以下之實施例作更詳細之描述。但本發明並不受限於此類實施例。實施例1 製備酵素及載體複合物共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的過氧化酶，其製備如下。將20毫克FMCS溶於〇 . 6毫升二甲基甲醯胺（ D M F )，添加入溶於2 . 4毫升0 . 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度7 . 5 )之1 0 0毫克辣根過氧化酶，在室溫下反應3 0分鐘。然後將反應混合物用Sephadex 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X；297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18- 1222516 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（1& G 2 5 (產自Pharmacia Co .)進行凝膠過濾，得到之瀘液在4 0 3 n m下進行吸光測定；收集具有吸光吸收峰之濾液溶析份，用超過濾濃縮。共軛結合硫醇基的聚離胺酸，其製備如下。將6毫克 5 -乙醯基氫硫醇基琥珀酸酐溶於2 〇微升之D M F，添加入溶於1毫升0 · 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度 6 . 5 )之5毫克聚一 L 一離胺酸溴化氫（產自sigma Co·;平均分子量爲37，60 0 Da)，在30°C下反應 2 0分鐘。其後，在產生的反應混合物中添加入 100微升0 · 1莫耳濃度Tr i s 一 HC1緩衝溶液（酸鹼度7) 、1 0微升0 · 1莫耳濃度EDTA (酸鹼度 7 )、以及1 0 〇微升1莫耳濃度羥胺（酸鹼度7 )，在 3 0°C下反應5分鐘。然後將反應混合物用Sephadex G 2 5進行凝膠過濾；收集在2 3 0 n m下具有吸光吸收峰之濾液溶析份，用超過濾濃縮。在此案例中，所有胺基並未修飾成硫醇基。將共軛結合順丁烯二酸醯亞胺的過氧化酶以及共軛結合硫醇基的聚- L -離胺酸混合，在4 °C下反應1 8小時。在產生的反應混合物中添加入1/10倍體積0.1 莫耳濃度巯基乙醇，在3 0 °C下反應2 0分鐘；此後將反應混合物用 Ultrogel AcA44 (產自 Biosepla，Co.) 進行凝膠過瀘；在4 0 3 n m下測量各溶析份之吸光。辣根過氧化酶以及聚- L -離胺酸複合物存在於高分子量之濾液溶析份中。於超過濾濃縮溶析份至3毫升之後’將緩 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) if 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -19- 1222516 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 衝溶液交換成0 . 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度 7.5)。複合物中辣根過氧化酶之含量爲20毫克。此稱爲酵素及載體複合物1。將溶於0 · 7 5毫升DMF之5 0毫克EMC S添加至複合物中，在室溫下反應3 0分鐘。將產生的產物用 Sephadex G2 5進行凝膠過濾；收集在4 0 3 nm下具有吸光吸收峰之濾液溶析份，用超過濾濃縮。此稱爲共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基團的酵素及載體複合物1。在此案例中，所有之胺基被修飾成順丁烯二酸醯亞胺基，而硫醇基被轉換成羧基基團。共軛結合硫醇基的辣根過氧化酶，其製備如下。將溶於0 . 5毫升DMF之2 . 5毫克S —乙醯基氫硫醇基硫乙醇酸- N羥基琥珀醯亞胺酯（S A T A )添加至溶於2 · 5毫升0 . 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度7 . 5 )之1 0 0毫克辣根過氧化酶，在室溫下反應 3 0分鐘。此後在反應混合物中加入1 0 0微升0 . 1莫耳濃度EDTA (酸鹼度7)、以及0 · 5毫升Μ羥胺（酸鹼度7 )，在室溫下反應5分鐘。將反應混合物用 Sephadex G 2 5進行凝膠過濾；收集在4 0 3 n m下具有吸光吸收峰之濾液溶析份並濃縮。用已知描述於】ournal of Immunoassay，4 ( 3 )，ρ . 2 0 9 — 3 2 7 的方法測定共軛結合硫醇基的辣根過氧化酶中硫醇基之數目。計算得知存在於一個辣根過氧化酶分子中硫醇基之數目爲 1 · 3。存在於一個辣根過氧化酶分子中胺基之數目爲η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} .衣· 、?!

-20- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222516 A7 ___B7_ 五、發明説明（1)& 個或更多。因此，証實在上述的條件之下製備的共軛結合硫醇基的辣根過氧化酶中至少有一個胺基。共同混合共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物1以及共軛結合硫醇基的辣根過氧化酶，在4 °C下反應1 8小時。在產生的反應混合物中添加入1 / 1 0倍體積〇 · 1莫耳濃度锍基乙醇，在30 °C下反應20分鐘 ;此後將反應混合物用Ultrogel A c A 4 4 (產自 Biosepla，Co .)進行凝膠過濾；接著在4 0 3 n m下測量吸光。複合物存在於高分子量之濾液溶析份中。此稱爲酵素及載體複合物2。共同混合共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物1以及共軛結合硫醇基的辣根過氧化酶，在4 °C下反應1 8小時；其後，在產生的反應混合物中添加入1 / 1 0倍體積0 · 1莫耳濃度半胱胺氯化氫，接著用說明如上之相同方法純化。產生的複合物稱爲酵素及載體複合物 3。在任何酵素以及載體複合物2以及酵素及載體複合物 3中共軛結合辣根過氧化酶的量爲4 0毫克。實施例2 製備1之酵素、二次抗體及載體複合物用已知的方法製備山羊抗-老鼠免疫球蛋白G之 F(ab’ ）2片段。山羊抗一老鼠免疫球蛋白G之Fab’ ’其製備方法如下。將55微升0.1莫耳濃度半胱胺氯化氫溶於內含5毫莫耳濃度EDTA之〇.1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度6 )，將其添加至溶於0 . 5毫升 i紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-21 - 1222516 A7 B7 五、發明説明（1)3 0 · 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度6 )之5毫克山羊抗一老鼠免疫球蛋白GF(ab’ ）2，在37。(：下反應 1 · 5小時。將反應混合物用Sephadex G 2 5進行凝膠過濾；收集在2 8 0 n m下具有吸光吸收峰之濾液溶析份並用超過濾濃縮。共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物2 ’其製備如下。將1 0毫克溶於3 7 5微升DMF之 E M C S添加入溶於1 . 5毫升0 _ 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度7 . 5)之5毫克酵素及載體複合物2，在室溫下反應3 0分鐘。將反應混合物用Sephadex G 2 5進行凝膠過瀘；收集在4 0 3 nm下具有吸光吸收峰之濾液溶析份並用超過濾濃縮。共同混合共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物2以及山羊抗-老鼠免疫球蛋白G之F a b’ ，在 4 t：下反應1 8小時、於反應之後，加入反應溶液1 / 1 0倍體積之0 . 1莫耳濃度锍基乙醇，在3 0 °C下反應 2 0分鐘；此後將反應混合物用Ultrogel A c A 4 4 (產自Biosepla，Co .)進行凝膠過濾。在2 8 0 n m及4 0 3 n m下測量吸光。具有二吸收峰之高分子量濾液溶析份爲酵素、Fab’及載體複合物。實施例3 製備2之酵素、二次抗體及載體複合物共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素以及載體複合物 3其製備如下。將溶於3 7 5微升DMF之1 〇毫克本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 1222516 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（2]b EMCS添加入溶於1·5毫升〇.1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度7 · 5)之5毫克酵素以及載體複合物3 ，在室溫下反應3 0分鐘。此後’將反應混合物用Sephadex G 2 5進行凝膠過濾；收集在4 0 3 n m下具有吸光吸收峰之濾液溶析份並用超過濾濃縮。山羊抗-老鼠免疫球蛋白G之Fab’其製備係用說明如上之相同方法，混合共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物3，在4°C下反應1 8小時。於反應之後，加入體積1/10倍反應溶液體積之〇 · 1莫耳濃度锍基乙醇，在3 0 °C下反應2 0分鐘；此後將反應混合物用 Ultrogel AcA44 (產自 Biosepla，Co_ )進行凝膠過濾。在2 8 0 n m及4 0 3 n m下測量吸光。具有二吸收峰之高分子量瀘液溶析份爲酵素、F a b ’及載體複合物。實施例4 製備1之酵素、一次抗體以及載體複合物用已知的方法，將兔子抗- p 5 3基因產物抗體（產自Nichirei Corp .)用胃蛋白酶水解，以製備兔子抗一 p53基因產物F(ab’ ）2片段。兔子抗—p53基因產物F a b ’之製備係用下列之方法。將溶於內含5毫莫耳濃度EDTA之〇 . 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度6 )之5 5微升〇 . 1莫耳濃度半胱胺氯化氫添加至溶於0 . 5毫升0 . 1莫耳濃度磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度6 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .hr

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1222516 A7 B7 五、發明説明（2)1 )之5毫克兔子抗一 ρ53基因產物F (ab’ ）2，在 3 7 C下反應1 . 5小時。將反應混合物用Sephadex G 2 5進行凝膠過濾；收集在2 8 0 nm下具有吸光吸收峰之濾液溶析份並用超過濾濃縮。共同混合如此製備的兔子抗—P 5 3基因產物Fab’以及實施例3相同之方法得到的共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物 3，在4 °C下反應1 8小時。於反應之後，加入體積1 / 1 0倍產生的反應溶液體積之0 . 1莫耳濃度巯基乙醇，接著在3 0°C下反應2 0分鐘；其後將反應混合物用 Ultrogel AcA44 (產自 Biosepla，Co·)進行凝膠過濾。在2 8 0 n m及4 0 3 n m下測量吸光；具有二吸收峰之高分子量濾液溶析份爲酵素、F a b ’及載體複合物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

I ϋ— Τ . * 、-口經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施例5 製備2之酵素、一次抗體以及載體複合物共軛結合硫醇基的抗一 C D 3 4單株抗體（產自Nichir ei Corp .)，其製備如下。將溶於5 0微升DMF之 0 . 1毫克SATA添加入溶於1毫升PBS之5毫克抗一 CD 3 4單株抗體，在室溫下反應3 0分鐘。此後，在產生的反應混合物中添加入1 0微升0 . 1 莫耳濃度EDTA(酸鹼度7)、以及100微升1莫耳濃度羥胺（酸鹼度7)，在室溫下反應5分鐘。產生的產物用Sephadex G 2 5凝膠過濾純化。共同混合如此製備的共軛結合硫醇基的抗- C D 3 4單株抗體以及實施例3

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -24- 1222516 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（2、之相同方法得到之共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素以及載體複合物3，在4 °C下反應1 8小時。於反應之後，加入體積爲1/10倍產生的反應溶液體積之0 · 1莫耳濃度锍基乙醇，接著在3 0 °C下反應2 0分鐘；其後，將反應混合物用 Ultrogel A c A 4 4 (產自 Biosepla，Co · )進行凝膠過濾。在2 8 0 n m及4 0 3 n m下測量吸光 ;具有二吸收峰之高分子量濾液溶析份爲酵素、單株抗體及載體複合物。實施例6 製備酵素以及抗生蛋白鏈菌素複合物共軛結合硫醇基的抗生蛋白鏈菌素，其製備如下。將溶於2 5 0微升DMF之〇 . 2 5毫克SATA添加至溶於2 . 5毫升0 . 1 Μ磷酸鈉緩衝溶液（酸鹼度7 . 5 ) 之2 5毫克抗生蛋白鏈菌素，在室溫下反應3 0分鐘。此後，產生的反應混合物中添加入5 0微升0 . 1莫耳濃度 E D T A (酸鹼度7 )以及2 0 0微升1莫耳濃度羥胺（酸鹼度7)，在室溫下反應5分鐘。產生的產物用 Sephadex G 2 5凝膠過濾純化。共同混合如此製備的共軛結合硫醇基的抗生蛋白鏈菌素以及實施例3之相同方法得到的共軛結合順丁烯二酸醯亞胺基的酵素及載體複合物，在4 °C下反應1 8小時。於反應之後，加入體積1 / 1 0 倍產生的反應溶液體積之0 . 1莫耳濃度酼基乙醇，接著在3 0 °C下反應2 0分鐘；其後，將反應混合物用Ultrogel A c A 4 4 (產自Biosepla，Co .)進行凝膠過濾。在 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .kr 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25- 1222516 A7 B7 五、發明説明（2]& 2 8 0 n m及4 0 3 n m下測量吸光；具有二吸收峰之高 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 分子量濾液溶析份爲酵素、抗生蛋白鏈菌素及載體複合物〇實施例7 依據免疫組織化學法比較實施例3之酵素、抗體及載體複合物以及習見的方法製備的酵素標記的抗體’ 並與SAB方法比較

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用抗—LCA單株抗體（產自Nichirei Corp.)作爲一次抗體，染色腸組織切片。首先，將石蠟包埋的組織切成片狀的薄片，置於載玻片玻璃上。此後移除石鱲，進行過氧化酶處理；將如此製備的樣品與一次抗體在室溫下反應一小時，接著用P B S徹底漂洗，從而製備一次抗體 -結合的樣品。逐滴加入二次抗體。使用之二次抗體爲實施例3製備的酵素、F a b’以及載體複合物，濃度爲6 微克/毫升之Fab’濃度。另一分別地實驗之二次抗體爲相同濃度，使用習見的方法直接標記氧化酶的F a b ’ 。習見的標記方法係依據Journal of Immunoassay，4 ( 3 )，P · 2 0 9 — 3 2 7，其中之材料以及試劑均與實施例3相同。各上述的二案例中，結合一次抗體樣品中的一次抗體與二次抗體在室溫下反應3 0分鐘。在S A B方法中，使用生物素-標記的抗-老鼠多株抗體（產自Nichirei Corp ·)作爲二次抗體。在此案例中，結合一次抗體的樣品中的一次抗體與二次抗體反應1 0 分鐘，接著漂洗，然後逐滴加入過氧化酶-標記的抗生蛋本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -26- u225l6 A7 B7 五、發明説明（白鏈菌素（產自Nichirei Corp .)，反應5分鐘。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於反應之後，徹底漂洗各上述的三個案例；產生的樣品中逐滴加入受質溶液（二胺基對二胺基聯苯，過氧化氫 )進行反應，然後用蒸餾水沖洗、密封以及用顯微鏡觀察〇結果展示於以下之表1。實施例3製備的酵素、二次抗體以及載體複合物顯著的優於習見的方法製備的標記酵素的抗體。此外，實施例3製備的酵素、二次抗體以及載體複合物亦較包含放大程序之S A B方法卓越。表 1 樣品染色強度 A 土 B + + + C 十經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A :用習見方法之標記酵素的抗體 B :實施例3 C之酵素、二次抗體及載體複合物 C ·· S A B方法實施例8 依據免疫組織化學比較實施例4製備的酵素、一次抗體以及載體複合物與S A B方法 S A B方法中之一次抗體係使用兔子抗一 p 5 3多株抗體（產自Nichirei Corp_ )作爲材料經實施例4製備之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- -27- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222516 A7 B7 五、發明説明（亦一次抗體。首先石蠟包埋的胃癌組織切成片狀的薄片，置於載玻片玻璃上。此後，移除石蠟，並移除過氧化酶；將如此製備的樣品在室溫下與一次抗體反應一小時。之後用 p B S徹底漂洗，結合一次抗體的樣品在室溫下與生物素標記的抗一兔子多株抗體（產自Nichirei Corp.)反應 1 0分鐘。於漂洗之後，逐滴加入過氧化酶-標記的抗生蛋白鏈菌素，反應分鐘。另一分別地實驗中，將實施例4製備的酵素、一次抗體及載體複合物（酵素、F a b’及載體複合物）與上述製備的樣品在室溫下反應一小時，酵素-抗體複合物之濃度爲2微克/毫升之Fab’濃度。於徹底漂洗之後，上述各二種案例中，在產生的樣品中逐滴加入受質溶液（二胺基對二胺基聯苯，過氧化氫）進行呈色反應，然後用蒸餾水沖洗，密封以及用顯微鏡觀結果使用酵素、一次抗體以及載體複合物得到的染色強度即等於包含放大程序之S A B方法得到之強度。實施例9 依據酵素免疫分析法比較實施例3製備的酵素、二次抗體以及載體複合物以及習見的方法製備的標記酵素的抗體將1 0 0微升之山羊抗-老鼠免疫球蛋白G在濃度爲 1 0微克/毫升下加入9 6孔微量滴定盤，在室溫下反應 2小時。微量滴定盤用生理食鹽水沖洗，接著加入2 0〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） ~ -28- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222516 A7 B7 五、發明説明（2)5 微升1%牛血淸白蛋白，反應2小時。加入1 〇〇微升老鼠免疫球蛋白G(〇至1， 000微微克/毫升濃度），反應2小時並用生理食鹽水沖洗。然後在如此製備的微纛滴定盤中加入1 0 0微升實施例3製備的酵素、二次抗體及載體複合物，濃度爲0 . 5微克/毫升以抗體量爲計（即抗體濃度），或1 0 0微升習見的方法製備的標記酵素的抗體，濃度爲2微克/毫升以抗體量爲計，反應3 0分鐘。產生的微量滴定盤可進一步的用生理食鹽水沖洗，接著加入1 0 0微升受質溶液（四甲基對二胺基聯苯，過氧化氫）反應1 5分鐘。加入5 0微升1 N硫酸終止反應。用微盤計讀器測量呈色反應之程度。如展示於圖1 ，結果顯示得自實施例3製備的酵素、二次抗體以及載體複合物較之習見的方法製備的標記酵素的抗體，在較小的體積下具更強烈的呈色反應。圖1顯示上述的結果。圖中之橫座標爲老鼠免疫球蛋白G之濃度；以及縱座標爲4 5 0 nm吸光。實心圓爲實施例3製備的酵素、抗體以及載體複合物，而空心圓爲習見的方法製備的標記酵素的抗體。本發明之優點本發明之酵素、蛋白質以及載體複合物尤其是適用於作爲標記酵素的抗體（一次抗體或二次抗體）進行免疫組織化學以及酵素免疫分析法，並能夠在高敏感度下進行免疫測定。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項存填寫本頁)

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Claims

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92. 年 π A y] A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍第891 27563號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國93年5月6日修正 1 . 一種載體-酵素一蛋白質複合物，包含 (1 )載體，其可溶於含水液體中； (2 )酵素，且兩個或多個酵素分子係聯結至載體（ 1 );以及 (3 )蛋白質，其結合至少一種選自下列的物質：抗原、抗體、抗體片段、糖鏈、玻尿酸、與生物素，其中此蛋白質聯結至第（2 )項之該兩個或多個酵素分子中的至少一個分子，以及其中該蛋白質不直接聯結至該載體。 2 .如申請專利範圍第1項之複合物，其中載體之平均分子量爲5， 000至500， OOODa ，此係以凝膠過濾色層分析法測定。 3 .如申請專利範圍第1項之複合物，其中載體之平均分子量爲10，000至300，OOODa，此係以凝膠過濾色層分析法測定。 4 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體具有兩個或多個胺基。 5 _如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體係選自以下群體中： (a )肽聚合物，其具有兩個或多個鹼性的胺基；以及（

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 1222516 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 b)多糖’其具有一或多個引入的活化基團，其中該活化基團選自：胺基、醛基以及乙烯基。 6 ·如申請專利範圍第χ項之複合物，其中之載體包 A flic聚合物，其具有兩個或多個鹼性的胺基 7 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體包含聚離胺酸。 8 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體包含多糖，且該多糖包含一或多個醛基。 9 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體包含多糖，且該多糖包含一或多個胺基。 1 0 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之載體包含多糖，且該多糖包含一或多個乙烯基。 1 1 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之酵素包含辣根過氧化酶。 1 2 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之酵素包含鹼性磷酯酶。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 3 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之酵素包含/3 -半乳糖苷酶。 1 4 .如申請專利範圍第1項之複合物，其中之酵素包含葡萄糖氧化酶。 1 5 .如申請專利範圍第1項之複合物，其中的蛋白質包含抗原。 1 6 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中的蛋白質包含抗體或抗體片段。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 2 - 1222516 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 1 7 ·如申請專利範圍第1頂之複合物，其中之蛋白質包含多株抗體或單株抗體。 1 8 ·如申請專利範圍第1頂之複合物，其中之蛋白質包含選自F (ab’ ）2、Fab’以及Fabc’中的至少一個抗體片段。 1 9 .如申請專利範圍第1頂之複合物，其中之蛋白質包含結合至糖鏈之蛋白質。 2 0 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中的蛋白質包含結合至玻尿酸之蛋白質。 2 1 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中之蛋白質包含結合至生物素之蛋白質。 2 2 ·如申請專利範圍第1項之複合物，其中的蛋白質包含卵白素或抗生蛋白鏈菌素。 2 3 . —種包含如申請專利範圍第1項之複合物的免疫測定組套。 2 4 ·如申請專利範圍第2 3項之免疫測定組套，其中之組套是免疫組織染色法或酵素免疫分析法，或二者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）