JPH03158758A - デキストランを介して結合した二以上の物質の複合体及び該複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はデキストランを介して結合した二以上の物質の
複合体に関するものである。

（従来の技術） 近年、血液（血清）、尿等の生体試料中の微量の蛋白質
等の含有量を、抗体を使用して測定するいわゆる免疫測
定法が開発され、実際に使用されている。免疫測定法は
、例えば酵素等の検出可能な標識を結合した抗体（コン
ジュゲート；複合体）を使用し、測定対象とコンジュゲ
ートとの免疫反応を利用して実施されるものである。こ
の免疫ＤＪ定法においては、抗体と酵素等が結合した複
合体の性能が測定自体の精度を左右することがある。

従来の免疫測定法において使用されているコンジュゲー
トを製造する方法としては、例えば標識及び抗体を活性
化し、化学的な反応性を有する活性化物にしたうえでこ
れらを結合させる方法、グルタルアルデヒド等の低分子
架橋試薬を介して両者を結合させる方法等が知られてい
る。

（従来技術の課題） 標識及び抗体を活性化し、両者を結合させる方法におい
ては、標識及び抗体を活性化する操作において標識及び
／又は抗体の活性（標識においては例えば検出されるべ
きシグナルを生成する能力であり、抗体においては例え
ば抗原との特異性又は抗原との結合能力である）が劣化
又は消失する恐れがあり、また、標識と抗体の結合の比
率を制御し難いという課題もある。

グルタルアルデヒド等の低分子の架橋試薬を用いて標識
と抗体を結合させる方法においては、標識と抗体の反応
速度をコントロールすることが難解であり、十分な量の
コンジュゲートが製造される以前に反応が終了してしま
ったり、試薬と標識又は試薬と抗体の反応特異性が低い
場合には、標識又は抗体の活性部位に試薬が反応してし
まい、これらの活性が劣化又は消失してしまうという課
題がある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、これらの課題を解決する新規なコンジュ
ゲートの製造方法について検討を行った結果、デキスト
ランを介して標識（酵素）と抗体を結合させることでこ
れら課題を解決できることを見出だし本発明を完成させ
た。

即ち本発明は、アミノ酸残基を有する二辺上の物質とデ
キストランからなり、二辺上の物質は当該それぞれの物
質中のアミノ酸残基とデキストランとの結合によりデキ
ストランを介して間接的に結合しているデキストランを
介して結合した二辺上の物質の複合体であり、更にはデ
キストランを酸化し、アミノ酸残基を有する物質と反応
させ、次いで還元剤を生成物に接触させることからなる
デキストランを介して結合した複合体の製造方法である
。以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、当初免疫ｌｌｌ１ｊ定法におけるコンジュゲ
ートについて検討する過程でなされたものであるが、コ
ンジュゲート以外に適用することに制限はない。

本発明でいう物質とは、少なくとも−のアミノ酸残基を
存する物質であれば特別の制限はない。

例えば免疫ａｌｌ＋定法における物質として、種々の酵
素、抗原、抗体等が例示できる。免疫ΔＰ１定以外の分
野における物質としては、前記の例示はもちろん、種々
の蛋白質又はペプチド、ある種のホルモン等が例示でき
る。

本発明の複合体は、免疫測定法においてはコンジュゲー
トであり、その他の分野においては例えばアミノ酸残基
を有する薬剤と抗体からなる、いわゆるミサイル療法等
に使用可能な特異性の高い薬剤、二種類の薬剤からなる
ハイブリッド型治療薬等である。

デキストランとしては特別の制限はないが、物質中のア
ミノ酸残基との反応性を向上させるためには分子量が１
０．０００ダルトン以上のものを用いることが好ましく
、特に多数の物質を結合させて本発明の複合体を製造し
ようとする場合には分子量の大きいデキストランを使用
することが好ましい。

デキストランを酸化し、アミノ酸残基と反応し得るデキ
ストラン酸化物にする操作は、公知の手法により達成可
能であり、例えば過ヨウ素酸等の試薬を使用すれば良い
。

デキストラン酸化物とアミノ酸残基との反応は、単に両
者を適当な緩衝液中に共存させる操作によれば良く、特
別の制限はない。従って、本発明の複合体を製造する場
合には、まずデキストランを酸化し、アミノ酸残基を有
する物質と反応させてデキストラン酸化物とアミノ酸残
基を有する物質からなる複合体を製造し、次いで該複合
体と還元剤を接触させれば良い。結合させ様とする物質
が二辺上存在する場合にも、それら物質を一度に反応さ
せることが出来、その他に特別な操作を必要としない。

ここで、反応に供するデキストラン酸化物の量その分子
量及び反応に１共するアミノ酸残基を存する物質の量、
更にはこれらの反応時間等を制御することで製造された
複合体中の物質の比率を正確に制御することも可能であ
る。

（発明の効果） 本発明によれば、アミノ酸残基ををする物質の活性を劣
化又は消失させることなくこれらを結合させることが可
能である。しかも、本発明では、その複合体を製造する
場合に反応に供するデキストラン酸化物の量、分子量及
び反応に共するアミノ酸残基を有する物質の量、更には
これらの反応時間等を調整し制御することで、複合体中
の物質の比率を制御することが可能である。

本発明の複合体は、特に免疫測定法における標識結合抗
体（コンジュゲート）としてを用であり、精度の高い免
疫測定を可能とするものである。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

実施例　１ 分子量がそれぞれ１５，９００．４８万、２００万、５
００〜４０００万ダルトン（シグマ（米国）社製）及び
５〜７万、１７〜２０万ダルトン（平井化学社製）のデ
キストランを、Ｎａｋａｎｅらの方法（Ｎａｋａｎｅ、
Ｐ、に、、Ｋａｗａｏｉ、Ａ、　　　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　　　２２０．１０８４−
１０９１頁、１９７４年）に従い、各々２ｍｇに対して
２ｍ、？の過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、室温にて４
時間反応させて酸化した。

次いで、酸化されたデキストランに２ｍｇのエチレング
リコールを添加し、室温にて１時間インキュベートした
後、緩衝液Ａ（０，１Ｍ塩化ナトリウム、０，１Ｍリン
酸緩衝液ｐＨ７，０）に対して１日間透析した。

透析後のデキスラン酸化物に、ウシ小腸から調製した後
前記緩衝液Ａに１日間透析したアルカリ性フォスファタ
ーゼを０．５ｍｇ添加し、室温にて２日間放置して反応
させた。

反応終了後、得られた反応生成物に０．２５ｍｇのＮ　
ａ　Ｂ　Ｈ４を添加しデキストランを還元した。以上の
操作により得られた反応生成物をゲル濾適用カラム（東
ソー■製、Ｇ３０００ＳＷ）に添加し、１．　ｍ　ｌづ
つ分画した。

各分画についてアルカリフォスファターゼの活性を計１
定した。測定は、各分画を予め０．０１重二％の牛血清
アルブミンを含む水溶液にて１００００倍に希釈したも
のの２０μｌを使用し、これに１００μｌの１ｍＭバラ
ニトロフェニルリン酸を含む緩衝液（ｐＨ１０，ｏ）を
添加して室温にて６０分間反応させ、２００μｌの０．
１規定水酸化ナトリウムを添加し、酵素反応を停止した
後に４０５ｎｍの吸光度をΔＰＩ定することで行った。

結果を図１に示す。図１からは、使用したデキストラン
の分子量が大きいほど、アルカリ性フォスファターゼ活
性の発現は高分子の分画に移行することがわかる。

参考例　１ 分子量５００〜４０００万のデキストラン（シグマ社（
米国）製）を過ヨウ素酸ナトリウムにて酸化する際の反
応時間を１０分、３０分、１時間、４時間及び２日間と
した以外は実施例１と同様の実験を行った。

結果を図２に示す。図２からは、デキストランの酸化反
応時間を長くした方が反応生成物の高分子化が起こりや
すいことが分かる。

比較例　１ デキストラン酸化物の代わりに低分子架橋試薬であるグ
ルタルアルデヒドを０．２．０，０２、又は０．００２
ｍｇ使用した以外は実施例１と同様の実験を行った。

結果を図３に示す。図３からは、グルタルアルデヒドを
使用した場合には０．０２ｍｇのグルタルアルデヒドを
使用することでアルカリ性フすスファターゼ活性の発現
が高分子の分画に移行することがわかるが、その活性は
デキストランを使用した場合に比較すると小さいこと、
即ちアルカリ性フォスファターゼの失活が認められるこ
とがわかる（図１参照）。

実施例　２ 分子Ｑ５００〜４，０００万のデキストラン（シグマ社
（米国）製）を実施例１と同様の方法（酸化反応時間は
１時間、デキストランの量は０゜２５ｍｇ、エチレング
リコールの量は０．２５ｍｇ）で酸化し、次いでアルカ
リ性フォスファターゼＯ，ｉｍｇと０．０２５ｍｇのヒ
トβ２ミクログロビンに対するモノクローナル抗体（該
抗体は、公知の手法により調製した）を添加して室温に
て０．０．１７．１．４又は２８時間インキュベートし
た。次いで、０．０５ｍｇのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４を添加し
てデキストランを還元した後、実施例１と同様にして分
画を取得した後、■各分画中のアルカリ性ファスファタ
ーゼ活性及び■各分画中の複合体を免疫測定法における
フンシュゲートとして使用した場合の活性について測定
した。

分画中のアルカリ性フォスファターゼ活性については実
施例１と同様にして、コンジュゲートとしての活性につ
いては以下の様に測定した。

まず、固相としてポリエチレン製マイクロタイタープレ
ート（ヌンク社製）に２００μｌの１０μｇ　／　ｍ　
ｌの抗ヒトβ２ミクログロブリンウサギ抗体（該抗体は
、公知の手法により調製した）を吸着して固定化し、牛
血清アルブミンにてブロッキング処理した後、各ウェル
に２０μｍの１１００ｎ／ｍｌのヒトβ２ミクログロブ
リン（森永生科学研究所製）、０．１ｆｆｉＱ％の牛血
清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、１
０μｌの分画を添加し３時間インキュベートした。次い
で０．０５容量％のツイーン２０を含むリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）で各ウェルを洗浄し、２００μｌの１ｍＭ
パラニトロフェニルリン酸を含む緩衝液（ｐＨ１０，０
）を添加して室温にて４時間反応させ、１００μｌの０
．１規定水酸化ナトリウムを添加して酵素反応を停止し
た後に４０５ｎｍの吸光度をＭ１定することで行った。

各両分中の、アルカリ性フォスファターゼ活性について
の結果を図４に、コンジュゲートとしての活性について
の結果を図５に示す。

図４からは、抗体、酵素及びデキストラン酸化物の接触
時間が長いほど高分子側で活性が見られ、反応時間とと
もにデキストランを介して酵素と抗体が結合することが
分かる。図５からは、酵素、抗体及びデキストラン酸化
物の反応時間とともにコンジュゲート活性が増加するこ
とが分かる。

実施例　３ 分子量５００〜４０００万ダルトンのデキストランを使
用して、実施例１と同様（酸化反応時間は１時間であり
、デキストラン及びエチレングリコールの瓜は５ｍｇで
ある）にして酸化した。

次いで、０．８ｍｇのアルカリ性フォスファターゼ、０
．２ｍｇの抗ヒトβ２ミクログロブリンマウスモノクロ
ーナル抗体をこれに添加し、室温にて２日間インキュベ
ートした後、Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４を添加して還元した。

反応生成物を実施例１と同様のカラムに添加して高分子
量分画を分取し、コンジュゲート分画とした。

コンジュゲート分画について２８０ｎｍの吸光度を７！
Ｐｊ定し、ＯＤが０．００１となる様に０゜１重量％の
ウシ血清アルブミン及び０．０５容量％のツイーン２０
を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７゜５）にて希釈した後、実
施例２でコンジュゲート活性を測定したのと同様にして
測定を行った。ΔＰＪ定に際しては、それぞれ０．１２
．５．５０．２００　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌ　濃度のヒト
β２ミクログロブリン溶液を使用した。

結果を図６に示す。図６からは、本発明の複合体（コン
ジュゲート）を使用することによりヒトβ２ミクログロ
ブリンの免疫測定法が実施可能なことが分かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１の結果を示すものである。 横軸にはカラムクロマトグラフィーにより得られた両分
のフラクション番号を、縦軸は４０５ｎｍの吸光度を示
す。図中、αつは分子量１５９００の、ｋ込は５〜７万
の、Ｄ［は１７〜２０万の１１は４８万の、Ａ−Ａは２
００万のそして）１は５００〜４０００万のデキストラ
ンを使用した場合について示すものである。 第２図は、本発明の参考例の結果を示すものである。図
中、αりは酸化時間が１０分の、フ込は３０分の４計口
は１時間の、Ｅ・は４時間の、モしてにムは２日の場合
を示すものである。 第３図は、本発明の比較例の結果を示すものである。図
中Ｇつはグルタルアルデヒドを０．２ｍｇ使用した場合
の、へ込は０．０２ｍｇ使用した場合の、そしてＤｏは
０．００２ｍｇ使用した場合の結果を示すものである。 第４図は、本発明の実施例２の結果（アルカリ性フォス
ファターゼ活性）を示すものである。 図中００は抗体、アルカリ性フォスファターゼ及びデキ
ストランを０時間接触させた場合、Δムは０．１７時間
接触させた場合、］口は１時間接触させた場合、）１は
４時間接触させた場合、モしてＡ−Ａは４８時間接触さ
せた場合についての結果を示すものである。 第５図は本発明の実施例２の結果（コンジュゲート活性
）を示すものであり、図中の記号については第４図と同
様である。 第６図は本発明の実施例３の結果を示すものである。横
軸はヒトβ２ミクログロブリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、
縦軸は２８０ｎｍでの吸光度を示すものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸残基を有する二以上の物質とデキストラ
   ンからなり、二以上の物質は当該それぞれの物質中のア
   ミノ酸残基とデキストランとの結合によりデキストラン
   を介して間接的に結合しているデキストランを介して結
   合した二以上の物質の複合体。
2. （２）少なくとも一方の物質が免疫グロブリンのいずれ
   かのクラスに属するものであり、他の物質が酵素である
   請求項第（１）項記載の複合体。
3. （３）デキストランを酸化し、アミノ酸残基を有する物
   質と反応させ、次いで還元剤を生成物に接触させること
   からなるデキストランを介して結合した複合体の製造方
   法。