ES2342146T5

ES2342146T5 - Complejo de enzima y proteína

Info

Publication number: ES2342146T5
Application number: ES00127351.5T
Authority: ES
Inventors: Hirokazu Ohbayashi; Yuriko Kitano
Original assignee: Nichirei Biosciences Inc
Current assignee: Nichirei Biosciences Inc
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2014-05-27
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: EP1111385A2; DK1111385T3; US20010005583A1; IL140413A0; US20040002146A1; HK1037728A1; EP1111385B2; EP1111385B1; JP2001181299A; NO20006481L; US7235369B2; CN1300942A; ES2342146T3; KR20060088864A; ZA200007776B; AU778084B2; ATE468533T1; NO20006481D0; CA2328805A1; NZ508945A

Description

Complejo de enzima y proteína

5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un complejo de enzima, proteína y portador preparado mediante la conjugación de

10 una proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias a un enzima conjugado covalentemente con un portador, y el complejo se utiliza para el inmunoensayo, tal como inmunohistoquímica e inmunoensayo enzimático, y un método para la producción del mismo.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

15 Debido a los recientes avances en la inmunoquímica, se ha utilizado ampliamente un inmunoensayo capaz de detectar una cantidad traza de una sustancia a una sensibilidad elevada mediante la utilización de una reacción de antígeno-anticuerpo. En la actualidad, dos campos de tipos generales de inmunoensayo son la inmunohistotinción y el inmunoensayo enzimático.

20 La inmunohistotinción es un medio para detectar un antígeno específico sobre un tejido con un anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno. Generalmente se somete un anticuerpo que reconoce un antígeno específico a una reacción sobre una sección delgada obtenida de un bloque preparado mediante fijación de un tejido y la posterior inclusión del tejido en parafina; mediante el examen de la presencia o ausencia del anticuerpo reaccionado

25 puede determinarse la presencia del antígeno. El anticuerpo que se deja reaccionar en primer lugar con el antígeno generalmente se denomina anticuerpo primario. Al conjugar una sustancia que emite una señal detectable visualmente o con un aparato, con el anticuerpo primario, la intensidad de la señal indica la cantidad del anticuerpo primario, que corresponde, a su vez, a la cantidad del antígeno en la sección. A modo de sustancia que emite la señal para alcanzar el fin, puede mencionarse una sustancia fluorescente y un enzima. En una etapa temprana del

30 desarrollo de la inmunohistotinción, se utilizaba una sustancia fluorescente como sustancia que emitía dicha señal. En este caso, resultaba necesario un microscopio de fluorescencia para detectar la fluorescencia.

Posteriormente, un método de anticuerpo marcado enzimáticamente fue desarrollado por Nakane et al., que permitió el análisis de la imagen teñida con un microscopio óptico. En la actualidad generalmente se utiliza un enzima como

35 sustancia emisora de señal. Para llevar a cabo la inmunohistotinción, puede llevarse a cabo una reacción de color correspondiente a la actividad de un enzima en caso de encontrarse conjugado con un anticuerpo primario, mediante la adición de una sustancia cromogénica al enzima, y la reacción de color corresponde a la cantidad del anticuerpo, es decir la cantidad de antígeno presente en el tejido. Sin embargo, generalmente, en ningún caso puede recuperarse una sensibilidad suficiente mediante la utilización de dicho método.

40 El método utilizado más comúnmente en la actualidad se denomina método de estreptavidina-biotina (método SAB), es decir un medio para amplificar la señal de un anticuerpo primario unido a un antígeno, detectando de esta manera la señal. El método comprende en primer lugar someter un anticuerpo primario que reconoce una sustancia específica en una sección de tejido a reacción con el mismo. A continuación, un anticuerpo secundario que se une al

45 anticuerpo primario se somete a reacción con el mismo. Generalmente, el anticuerpo secundario es un anticuerpo policlonal que reconoce y se une al anticuerpo primario. De acuerdo con lo anterior, se une una pluralidad de moléculas del anticuerpo secundario al anticuerpo primario. Preliminarmente se conjuga una pluralidad de moléculas de biotina a cada molécula de anticuerpo secundario. Se permite que reaccione estreptavidina conjugada con enzima (reactivo enzimático) con el complejo de anticuerpo primario-anticuerpo secundario conjugado con biotina.

50 Es conocido que la estreptavidina puede unirse fuertemente a la biotina. Por lo tanto, se forma un complejo de anticuerpo primario-anticuerpo secundario conjugado con biotina-estreptavidina conjugada con enzima. Debido a que la pluralidad de moléculas del conjugado de anticuerpo secundario con biotina se han unido a cada molécula de anticuerpo primario y una pluralidad de moléculas del conjugado de estreptavidina con enzima se han unido a cada molécula del conjugado de anticuerpo secundario con biotina según el método, en consecuencia la cantidad de

55 enzima unida indirectamente al anticuerpo primario puede incrementarse marcadamente. Como resultado, el antígeno en la sección de tejido puede detectarse con una sensibilidad elevada.

Tal como se ha indicado anteriormente, el método SAB es un método excelente capaz de producir una señal más intensa debido a que un número muy elevado de moléculas de un enzima se unen finalmente al anticuerpo primario

60 unido al antígeno. Sin embargo, desde otro punto de vista de los procedimientos, resulta necesario llevar a cabo tres etapas de procedimiento: la reacción del anticuerpo primario, la reacción del anticuerpo secundario y la reacción del reactivo enzimático. Tal como se ha indicado anteriormente, el método SAB incluye muchas etapas y no puede evaluarse si resulta satisfactorio en los aspectos de la práctica clínica y similares, que exigen rapidez y simplicidad conjuntamente con exactitud. De esta manera, se espera que se haya mejorado el método SAB.

Como otro medio de inmunoensayo general, es conocido el inmunoensayo enzimático (EIA). El principio y procedimiento típicos del EIA son los siguientes. En primer lugar, un anticuerpo que reconoce una sustancia que se desea someter a ensayo se inmoviliza en un portador, tal como una perla de poliestireno o una microplaca. Tras bloquear seguidamente el portador con proteína, tal como albúmina, a continuación se añade una solución (muestra) que contiene una sustancia (antígeno) como el objeto de ensayo pretendido. A continuación, se añade un anticuerpo que reconoce un antígeno, conjugado con un enzima (anticuerpo marcado con enzima). En otras palabras, el antígeno queda interpuesto entre dos anticuerpos. Seguidamente, se lava el exceso de anticuerpo marcado con enzima; se añade un sustrato cromogénico del enzima para el desarrollo de color. Debido a que la cantidad del antígeno depende de la actividad del enzima, puede determinarse la concentración del antígeno en la muestra mediante comparación con el desarrollo de color de una muestra que contiene antígeno a una concentración preliminarmente conocida. Varios factores son responsables de la sensibilidad del inmunoensayo enzimático, y la calidad del anticuerpo marcado con enzima es uno de los factores significativos. Más específicamente, se cree que puede obtenerse una señal más intensa en el caso de que el anticuerpo marcado con enzima presente muchas moléculas del enzima, de manera que el antígeno puede someterse a ensayo a una sensibilidad elevada.

Tal como se ha indicado anteriormente, la calidad del anticuerpo marcado con enzima resulta muy importante para el inmunoensayo e influye marcadamente sobre la sensibilidad del sistema de ensayo o sobre el número de etapas incluidas en el procedimiento. Tal como se ilustra posteriormente, se han realizado muchos intentos para obtener un anticuerpo marcado con enzima que consiga una elevada sensibilidad. Muchos de ellos comprenden conjugar muchas moléculas de un enzima y un anticuerpo con un portador.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº JP-A 63-503138 (1988), se conjuga un anticuerpo con un portador conjugado con un derivado de un marcaje detectable, tal como un fármaco, toxina, quelante o compuesto de boro. A modo de portador se utiliza aminodextrano; en primer lugar se conjuga un fármaco, tal como metotrexato, con el aminodextrano. A continuación, el grupo aldehído generado a partir de la oxidación de la cadena sacárida del anticuerpo con peryodato sódico se deja reaccionar con el grupo amino del aminodextrano, seguido de la reducción con cianoborohdiruro sódico para conseguir un enlace covalente, con el fin de preparar un complejo de fármaco, anticuerpo y aminodextrano.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº JP-A 3-158758 (1991), se oxida dextrano con peryodato sódico; el grupo aldehído resultante se deja reaccionar con el grupo amino de la fosfatasa alcalina y anticuerpo, seguido de la reducción con borohidruro sódico, con el fin de preparar un complejo de enzima, anticuerpo y dextrano.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº 6-509167 (1994), se hace reaccionar divinilsulfona con un polímero, tal como dextrano para introducir el grupo vinilo en el mismo, seguido de la reacción con un enzima y un anticuerpo, preparando de esta manera un complejo de enzima, anticuerpo y dextrano.

Todos los complejos preparados mediante dichos métodos eran complejos formados mediante la conjugación directa de dos sustancias a un polímero. Todos los complejos preparados mediante dichos métodos se afirma que presentan un mejor rendimiento en comparación con la conjugación directa de las dos sustancias sin utilizar ningún portador. Sin embargo, dichos métodos presentan la desventaja siguiente. Más específicamente, debido a que la cantidad de sustancias capaces de conjugarse con un portador en el caso de que dos sustancias deban conjugarse con el portador, es finita, cuanto mayor sea la cantidad de una sustancia que se conjuga, menor será la cantidad de la otra sustancia que se conjuga. En el caso de que se supere la desventaja, resulta posible obtener un complejo de mejor rendimiento.

El documento EP nº A-0 992 794, un documento según el art. 54(3) EPC, da a conocer un complejo de enzimaanticuerpo en el que el enzima se conjuga con el anticuerpo mediante un portador.

En el documento EP nº A-0 123 300, se une una fosfatasa alcalina a un sustrato sólido, por ejemplo dextrano, preferentemente mediante un ligando, por ejemplo p-ABPA. Posteriormente, se biotinila la fosfatasa alcalina y se eluye o se separa del sustrato.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

De esta manera, es un propósito de la invención proporcionar un nuevo complejo de alta calidad de enzima, proteína y portador con el que puede superarse la desventaja anteriormente mencionada, y un método para la producción del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La fig. 1 muestra gráficos que ilustran los resultados del Ejemplo 9.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores han realizado investigaciones sobre un método para producir un complejo de enzima, proteína y portador para obtener un complejo de alta calidad de enzima, proteína y portador. Los inventores han encontrado que el propósito puede conseguirse mediante la conjugación de un enzima con un portador, y conjugando demás una proteína con el enzima. Tras investigaciones adicionales, finalmente se ha llevado a cabo la invención.

En otras palabras, la invención se refiere a un complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 1, preparado mediante la conjugación covalente de dos o más moléculas de un enzima con un portador, y la conjugación de una proteína que presenta una potencia de unión específica para la otra sustancia o sustancias, sola

o con por lo menos una molécula del enzima. Además, la invención se refiere a un complejo de enzima, proteína y portador preparado según la reivindicación 2 mediante la conjugación directa, y además a dicha proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias en el portador del complejo anteriormente preparado de enzima, proteína y portador, anteriormente mencionada. Por lo tanto, en el complejo de enzima, proteína y portador de la presente invención, cada uno de entre un enzima y dicho enzima conjugado con una proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias, se conjuga covalentemente numerosamente a un portador; o un enzima, estando el mismo enzima conjugado covalentemente con una proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias, y también dicha proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia, se conjugan numerosamente con un portador. A continuación se describe en detalle la invención.

La invención se ha llevado a cabo durante el examen de los complejos de enzima-proteína utilizables en el campo de la inmunohistoquímica y del inmunoensayo enzimático. Sin embargo, la aplicación de la invención a otros campos no se encuentra limitada en modo alguno.

El portador al que se hace referencia según la invención se refiere a proteínas y polisacáridos, aunque sin limitación específica. Sin embargo, resulta preferible que se conjugue un gran número de moléculas de un enzima con el portador, de manera que se incremente la sensibilidad del inmunoensayo. Por lo tanto, resulta esencial: (1) que el peso molecular sea grande en cierta medida, y (2) la presencia de un grupo funcional reactivo para la conjugación con un enzima, o la posibilidad o potencia de la introducción de dicho grupo funcional reactivo. Entre los ejemplos del portador para conseguir dicho propósito se incluyen los polímeros peptídicos y/o los polisacáridos, apropiadamente con pesos moleculares medios de entre 5.000 y 500.000 Da, más preferentemente de entre 10.000 y 300.000 Da, determinados mediante cromatografía de filtración en gel. En la presente memoria dichos intervalos de peso molecular meramente son simples objetivos; pueden utilizarse pesos moleculares mayores que el intervalo anteriormente indicado sin que se produzca precipitación ni sedimentación en un líquido, y también pueden utilizarse presos moleculares menores que el intervalo anteriormente indicado, con la condición de que pueda conseguirse el propósito de la invención.

Según la invención, por ejemplo, se utiliza apropiadamente como el portador un péptido que contiene dos o más grupos amino que presentan potencia de unión. Uno de los ejemplos incluye un péptido con grupo amino, tal como un péptido que comprende por lo menos un tipo de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de lisina, arginina, ornitina, glutamina y otros aminoácidos básicos, presentando estos aminoácidos por lo menos un tipo de grupo amino seleccionado de entre el grupo que consiste de grupo a-amino, grupo £-amino y otros grupos amino. Además, entre los ejemplos específicos de los mismos se incluye polilisina, que es un polímero de lisina con un grupo £-amino e incluye diversos péptidos que comprenden lisina y uno o más aminoácidos adicionales. Entre los ejemplos de este último polímero peptídico se incluyen copolímero aleatorio de lisina y glicina, copolímero aleatorio de lisina y serina y copolímero aleatorio de lisina y ácido glutámico, que se encuentran comercialmente disponibles como copolímeros aleatorios con diversos pesos moleculares.

Alternativamente, también pueden utilizarse polisacáridos con grupos amino introducidos en los mismos como el portador de la invención. Son ejemplos de los polisacáridos, dextrano, agarosa, dextrina y almidón soluble. Pueden introducirse grupos amino en los polisacáridos mediante métodos conocidos. Por ejemplo, puede prepararse dextrano con grupos amino mediante el tratamiento de dextrano con peryodato sódico para generar grupos aldehído, que se deja reaccionar con diamina y después se reduce con borohidruro sódico.

Cualquiera de entre los enzimas que presentan dos o más grupos amino puede utilizarse como el enzima que debe utilizarse según la invención, y apropiadamente se utilizan enzimas para el uso general en el inmunoensayo. Aunque sin limitación, son ejemplos de los mismos, la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la �-galactosidasa y la glucosa oxidasa.

La proteína con una potencia de unión específica a una o más sustancias adicionales según la invención incluye: (1) una proteína, (2) uno o más fragmentos de una proteína, y (3) una mezcla de una proteína y el fragmento o fragmentos de la proteína, y más prácticamente incluye un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno específico y un receptor capaz de unirse a un ligando específico, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal; avidina y estreptavidina, que se unen específicamente a la biotina; proteína A y proteína G, que se unen específicamente a anticuerpos; lectina, que se une específicamente a una cadena sacárida; y proteína de unión a ácido hialurónico, que se une específicamente a ácido hialurónico. Además, la proteína en la invención incluye fragmentos de proteína capaces de unirse específicamente a una o más sustancias específicas. Por ejemplo, los fragmentos de proteína son los fragmentos de anticuerpo F(ab')2, Fab' y Fabc'.

La proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia o sustancias en la presente invención incluye unas con una potencia de unión específica a otra sustancia individual, y unas con una potencia de unión específica a otra pluralidad de sustancias.

Según la invención, en primer lugar se prepara un complejo de un portador y un enzima. Por ejemplo, un método para lo anterior comprende modificar grupos amino de un portador para formar grupos tiol y mezclar el portador resultante con un enzima con uno o más grupos maleimida modificados a partir de uno o más grupos amino. Debido a que el grupo tiol y el grupo maleimida reaccionan rápidamente entre sí y forman un enlace covalente, puede prepararse el portador conjugado con el enzima.

Para introducir un grupo tiol en el grupo amino del portador, son conocidos métodos que utilizan anhídrido Sacetilmercaptosuccínico, N-succinimidilo, 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y N-hidroxisuccinimida de ácido Sacetiltioglicólico (SATA). Estos reactivos reaccionan con un grupo amino, de manera que se introduce un grupo tiol bloqueado. A continuación, el grupo protector que bloquea el grupo tiol se elimina mediante tratamiento con hidroxilamina en el caso de que se utilice anhídrido S-aceitlmercaptosuccínico o SATA, o con ditiotreitol (DTT) en el caso de que se utilice SPDP, para generar un grupo tiol.

Para introducir un grupo maleimida en el grupo amino del enzima, se utiliza un compuesto con un grupo maleimida y un grupo éster de succinimida dentro de una sola molécula. Por ejemplo, se utiliza satisfactoriamente un reactivo entrecruzante divalente con un grupo maleimida en un extremo y un grupo N-hidroxisuccinimida en el otro extremo. Son ejemplos de los mismos, N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS) y N-(4-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS).

Aparte de EMCS y GMBS, indicados anteriormente, entre los compuestos que presentan un grupo maleimida y un grupo succinimida dentro de una sola molécula se incluyen aquellos indicados a continuación, aunque sin limitación: N-succinimidil-N-maleimidoacetato, N-succinimidil-4-(N-maleimido)butirato, N-succinimidil-6-(Nmaleimido)hexanoato, N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, N-succinimidil-m-(Nmaleimido)benzoato, N-succinimidil-p-(N-maleimidofenil)-4-butirato, N-sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, N-succinimidil-m-(N-maleimido)benzoato, N-sulfosuccinimidil-p-(Nmaleimidofenil)-4-butirato y similares.

Debido a que el portador no resulta necesario para conjugarse adicionalmente con otra sustancia o sustancias en la invención, resulta preferible preparar un complejo de enzima y portador en el que el máximo número posible de moléculas del enzima se conjugue con el mismo. A continuación se describe un ejemplo del medio para conseguir este propósito. Se añade un gran exceso de un reactivo de maleimidación y se deja que reaccione con el complejo de enzima y portador con el fin de introducir grupos maleimida en prácticamente la totalidad de los grupos amino restantes en el complejo. El mismo enzima que el utilizado para la producción del complejo se tiola bajo condiciones que permitan que quede uno o más grupos amino en el enzima. Esto permite conjugar posteriormente una proteína con una potencia de unión específica con una o más sustancias adicionales mediante la utilización del grupo o grupos amino que quedan en el enzima. El enzima que se ha tiolado de esta manera y el complejo de enzima y portador en el que se han introducido grupos maleimida reaccionan entre sí.

A continuación, los grupos maleimida restantes se bloquean con una sustancia que presenta grupos tiol. Son ejemplos de la sustancia con grupos tiol para la utilización en el bloqueo: mercaptoetanol, hidrocloruro de cisteamina y cisteína. Al utilizar mercaptoetanol para el bloqueo, uno o más grupos amino se encuentran presentes únicamente en el enzima tiolado del complejo de enzima y portador. En el caso de que se utilice para el bloqueo hidrocloruro de cisteamina o cisteína, se encuentran presentes grupos amino en el enzima tiolado del complejo de enzima y portador y en el reactivo utilizado para bloquear el grupo o grupos maleimida restantes.

Para conjugar la proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia, tal como se ha explicado anteriormente, con el complejo de enzima y portador, se utiliza satisfactoriamente la reacción de grupo tiol y grupo maleimida de la misma manera que durante la preparación del complejo de enzima y portador. Por ejemplo, el reactivo anteriormente indicado para introducir grupos maleimida se deja que reaccione con los grupos amino presentes en el complejo de enzima y portador. Por otra parte, el reactivo anteriormente indicado para introducir grupos tiol se deja reaccionar con la proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias. Al mezclar ambas entre sí, puede prepararse un complejo de enzima, proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias, y portador. En el caso de que se encuentre presente en la proteína un enlace S-S no implicado en ningún caso en la unión con la otra sustancia o sustancias, el enlace S-S se reduce con hidrocloruro de cisteamina o DTT, en lugar de la tiolación, de manera que pueden generarse grupos tiol.

El complejo completamente preparado es un complejo en el que la proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia o sustancias se encuentra conjugada con el enzima solo, tras bloquear finalmente con mercaptoetanol el grupo o grupos maleimido restantes en el portador durante la preparación del complejo de enzima y portador. El otro ejemplo de complejo completamente preparado es un complejo en el que la proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias se conjuga tanto con el enzima como con el portador tras bloquear finalmente con hidrocloruro de cisteamina o con cisteína el grupo o grupos maleimida restantes en el portador, durante la preparación del complejo de enzima y portador.

A modo de realización de la invención se describe a continuación el método para producir el complejo de enzima, proteína y portador utilizando poli-L-lisina como el portador, peroxidasa como el enzima y un fragmento de anticuerpo F(ab')2 como la proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia.

Para conjugar la proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia, tal como se ha explicado anteriormente, con el complejo de enzima y portador, se utiliza satisfactoriamente la reacción de grupo tiol y grupo maleimida de la misma manera que durante la preparación del complejo de enzima y portador. Por ejemplo, el reactivo anteriormente indicado para introducir grupos maleimida se deja que reaccione con los grupos amino presentes en el complejo de enzima y portador. Por otra parte, el reactivo anteriormente indicado para introducir grupos tiol se deja reaccionar con la proteína que presenta una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias. Al mezclar ambas entre sí, puede prepararse un complejo de enzima, proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias, y portador. En el caso de que se encuentre presente en la proteína un enlace S-S no implicado en ningún caso en la unión con la otra sustancia o sustancias, el enlace S-S se reduce con hidrocloruro de cisteamina o DTT, en lugar de la tiolación, de manera que pueden generarse grupos tiol. En el caso de que la proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias presente una cadena sacárida, ésta puede utilizarse satisfactoriamente. Por ejemplo, resulta posible que el grupo o grupos aldehído generados mediante oxidación de la cadena sacárida de la proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias con peryodato sódico se dejó reaccionar con el grupo o grupos amino en el complejo de enzima y portador, seguido de la reducción para conjugar ambos entre sí.

1.: Preparación de portador conjugado con grupo tiol

Se añade anhídrido S-acetilmercaptosuccínico y se deja reaccionar con una solución que contiene poli-L-lisina; después, se deja reaccionar hidroxilamina con la mezcla de reacción resultante, para introducir grupos tiol en el portador (preparación de portador-SH). En la presente memoria, el portador no se tiola por completo en ningún caso, sino que se dejan libres algunos de los grupos amino del portador.

2.: Preparación de peroxidasa conjugada con grupo maleimida

Se deja que EMCS reaccione con peroxidasa de rábano picante (POD) con el fin de preparar peroxidasa conjugada con grupo maleimida (M-POD).

3.: Preparación de complejo 1 de POD-poli-L-lisina

Mediante la mezcla de portador conjugado con grupo tiol y M-POD y dejando que reaccionen entre sí, se prepara un complejo (portador-S-M-POD). Tras la reacción, los grupos maleimida restantes se bloquean con mercaptoetanol. Mediante la reacción puede obtenerse un portador (complejo) con una pluralidad de grupos S-M-POD y SH introducidos en el mismo y que presenta grupos amino libres.

4.: Preparación del complejo con un grupo maleimida conjugado con el mismo

Se añade un gran exceso de una solución de EMCS y se deja reaccionar con el complejo obtenido en 3, para introducir grupos maleimida en la totalidad de los grupos amino del complejo. Mediante la reacción puede obtenerse un portador (complejo), en el que se ha introducido una pluralidad de S-M-POD, grupos maleimida y grupos COOH generados mediante hidrólisis del éster de N-hidroxisuccinimida de EMCS tras la unión de EMCS a los grupos SH.

5.: Preparación de peroxidasa conjugada con grupo tiol

Se introduce uno o más grupos tiol en POD dejando que reaccione N-hidroxisuccinimida éster de ácido Sacetiltioglicólico con POD y dejando después que reaccione hidroxilamina con la mezcla de reacción resultante. En este caso, las reacciones se llevan a cabo bajo condiciones que permitan la existencia de uno o más grupos amino libres en POD (SH-POD-NH2).

6.: Preparación de complejo 2 de POD-poli-L-lisina

Mediante la reacción de SH-POD-NH2 con el complejo obtenido en 4, se introduce peroxidasa tiolada en grupos maleimida conjugados con el portador. A continuación, los grupos maleimida restantes se tratan con mercaptoetanol, para convertir los grupos maleimida restantes en grupos OH. Mediante la reacción, puede obtenerse un portador (complejo enzimático) en el que se ha introducido una pluralidad de S-M-POD, una pluralidad de M-S-POD-NH2, grupos COOH y grupos OH.

7.: Preparación de complejo 2 de POD-poli-L-lisina con POD conjugado con grupos maleimida

Mediante la reacción de una solución de EMCS con el complejo enzimático obtenido en 6, se maleimidan el grupo o grupos amino de POD en el complejo. Se prepara un complejo con una pluralidad de S-M-POD, una pluralidad de M-S-POD-M, grupos COOH y grupos OH.

8.: Preparación de fragmento de anticuerpo reducido

Se trata IgG de cabra antiratón con pepsina para obtener su fragmento F(ab')2 y se deja reaccionar hidrocloruro de cisteamina con el fragmento F(ab')2 para obtener un fragmento de anticuerpo reducido (SH-Fab').

9.: Preparación de un complejo de enzima, anticuerpo y portador

Mediante la mezcla del fragmento de anticuerpo reducido y el complejo obtenido en 7, se conjuga el fragmento de anticuerpo con el grupo o grupos maleimida de POD. Mediante la reacción, puede obtenerse un portador (complejo de enzima-anticuerpo) conjugado con una pluralidad de S-M-POD, una pluralidad de M-S-POD-M-S-Fab', una pluralidad de M-S-POD-M, grupos COOH y grupos OH. En caso necesario, el portador resultante puede, además, tratarse con mercaptoetanol para convertir el grupo o grupos maleimida no modificados de M-S-POD-M en uno o más grupos OH, bloqueando de esta manera el grupo o grupos maleimida.

El complejo de enzima, proteína y portador de la invención es un primer éxito de la realización de la estructura anteriormente mencionada, y debido a la cantidad extremadamente grande de enzima en el portador, puede llevarse a cabo una reacción fuerte de color al someter el enzima a una reacción de color. Además, debido a que la proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias puede conjugarse con un enzima, aunque muchas moléculas del enzima ocupan la superficie del portador, en consecuencia, muchas moléculas de proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias pueden conjugarse con el complejo y, de esta manera, se escala extremadamente la capacidad de unión de la misma a la otra sustancia.

Debido a que muchas moléculas de la proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia o sustancias se encuentran presentes en el complejo de enzima, proteína y portador de la invención, puede capturarse incluso una cantidad traza de sustancia de ensayo y unirse al complejo de enzima, proteína y portador. Al conjugar la sustancia de ensayo a cualquier molécula o uno o más fragmentos moleculares de la proteína, puede llevarse a cabo una reacción de color muy fuerte debido a que muchas moléculas del enzima se encuentran conjugadas con el complejo de enzima, proteína y portador. Según la invención, en otras palabras, puede detectarse incluso una cantidad traza de una sustancia y someterse a ensayo a una sensibilidad muy elevada. De esta manera, la invención proporciona un ensayo exacto. Por consiguiente, puede formarse un excelente kit de ensayo mediante la utilización del complejo.

Además, para la creación del complejo de enzima, proteína y portador según la invención, la polilisina no se trata en primer lugar con EMCS (la incidencia de precipitación provoca que la polilisina quede inutilizable), sino que se trata en primer lugar con anhídrido S-acetilmercaptosuccínico para modificar una parte de los grupos amino del portador, formando grupos tiol a los que se conjuga un enzima maleimidado, seguido del tratamiento con un gran exceso de EMCS para la maleimidación y carboxilación, y la reacción posterior con un enzima conjugado con grupos tiol, de manera que se consigue que muchas moléculas del enzima puedan conjugarse con el portador, finalmente incluso en el caso de que el número de moléculas de enzima conjugadas inicialmente sea pequeño, sin que se produzca precipitación ni sedimentación. Puede producirse un efecto marcado, de manera que pueden conjugarse muchas moléculas del enzima con el portador en estado de solución.

Por consiguiente, la invención proporciona un efecto excelente de manera que una sustancia puede someterse a ensayo con exactitud en una cantidad traza de una muestra, o en una muestra extremadamente diluida.

Ejemplos

Con el fin de describir la invención en mayor detalle, se proporcionan ejemplos. Sin embargo, la invención no se encuentra limitada a dichos ejemplos.

Ejemplo 1

Preparación de un complejo de enzima y portador

Se preparó peroxidasa conjugada con un grupo maleimida de la manera siguiente: se añadieron 20 mg de EMCS diluidos en 0,6 ml de dimetilformamida (DMF), a 100 mg de peroxidasa de rábano picante disueltos en 2,4 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25 (fabricada por Pharmacia Co.) y el filtrado obtenido se sometió a ensayo de la absorbancia a 403 nm, se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia, y se concentró mediante ultrafiltración.

A continuación, se preparó la polilisina conjugada con el grupo tiol de la manera siguiente. Se añadieron 6 mg de anhídrido S-acetilmercaptosuccínico disueltos en 20 μl de DMF a 5 mg de hidrobromuro de poli-L-lisina (fabricado por Sigma Co.; peso molecular medio: 37.600 Da) disueltos en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6,5 y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 100 μl de tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7, 10 μl de EDTA 0,1 M, pH 7 y 100 μl de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción resultante, y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 5 minutos. Seguidamente, la solución de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 230 nm, y se concentró mediante ultrafiltración. En este caso no se modificó la totalidad de los grupos amino para formar grupos tiol.

La peroxidasa conjugada con grupo maleimida y la poli-L-lisina conjugada con grupo tiol se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Se añadió un volumen de 1/10 veces de mercaptoetanol 0,1 M a la mezcla de reacción resultante y se hizo reaccionar a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44 (fabricada por Biosepla, Co.) y se midió la absorbancia de cada fracción a 403 nm. Se encontraba un complejo de peroxidasa de rábano picante y poli-L-lisina en una fracción del filtrado de elevado peso molecular. Se concentró la fracción mediante ultrafiltración hasta 3 ml tras cambiar el tampón por tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5. La cantidad de peroxidasa de rábano picante en el complejo era de 20 mg. Lo resultante se denominó complejo 1 de enzima y portador.

Se añadieron 50 mg de EMCS disueltos en 0,75 ml de DMF al complejo y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El producto resultante se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm, y se concentró mediante ultrafiltración. Lo resultante se denominó complejo 1 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador. En este caso, todos los grupos amino se habían modificado en grupos maleimida, mientras que los grupos tiol se habían convertido en grupos carboxilo.

A continuación, se preparó peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol de la manera siguiente.

Se añadieron 2,5 mg de N-hidroxisuccinimida éster de ácido S-acetilmercaptotioglicólico (SATA) en 0,5 ml de DMF a 100 mg de peroxidasa de rábano picante disueltos en 2,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 100 μl de EDTA 0,1 M, pH 7, y 0,5 ml de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, se recogieron las fracciones con absorbancia a 403 nm y se concentraron. Se sometió a ensayo el número de grupos tiol de la peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol mediante el método conocido, descrito en Journal of Immunoassay 4(3):209-327. Después, se calculó que el número de grupos tiol presente en una molécula de peroxidasa de rábano picante era de 1,3. Se encuentran presentes tres o más grupos amino en una molécula de peroxidasa de rábano picante. De esta manera se confirmó que quedaba por lo menos un grupo amino en la peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol preparada de esta manera bajo las condiciones anteriormente indicadas.

El complejo 1 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador y la peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Al producto resultante se añadió un volumen de 1/10 veces de mercaptoetanol 0,1 M, llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción resultante se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44, seguido de la medición de la absorbancia a 403 nm. El complejo eluyó en una fracción de elevado peso molecular del filtrado. Se denominó complejo 2 de enzima y portador.

Separadamente se mezclaron el complejo 1 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador, y la peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol, y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas; a continuación, se añadió un volumen de 1/10 veces de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M a la mezcla de reacción resultante, seguido de purificación de la manera indicada anteriormente. El complejo resultante se denominó complejo 3 de enzima y portador. Las cantidades de peroxidasa de rábano picante conjugada en el complejo 2 de enzima y portador, y en el complejo 3 de enzima y portador eran de 40 mg en ambos casos.

Ejemplo 2

Preparación 1 de un complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador

Se preparó el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra antiratón mediante un método conocido. Se disolvieron 55 μl de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, que contenía EDTA 5 mM de F(ab')2 de IgG de cabra antiratón disuelto en 0,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, y se llevó a cabo la reacción a 37ºC durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25; se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 280 nm y se concentró mediante ultrafiltración.

Se preparó complejo 2 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador de la manera siguiente. Se añadieron 10 mg de EMCS disueltos en 375 μl de DMF a 5 mg del complejo 2 de enzima y portador disueltos en 1,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, y se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm y se concentró mediante ultrafiltración.

Se mezcló el complejo 2 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador y el Fab' de IgG de cabra antiratón y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción, y se llevó a cabo la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, se sometió la mezcla de reacción resultante a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm. Una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos era el complejo de enzima, Fab' y portador.

Ejemplo 3

Preparación 2 de un complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador

Se preparó el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador de la manera siguiente. Se añadieron 10 mg de EMCS disueltos en 375 μl de DMF a 5 mg del complejo 3 de enzima y portador disueltos en 1,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, y se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm y se concentró mediante ultrafiltración.

El Fab' de IgG de cabra antiratón preparado mediante el método indicado anteriormente se mezcló con el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador, y se hizo reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción, y se hizo reaccionar a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, Fab' y portador.

Ejemplo 4

Preparación 1 de un complejo de enzima, anticuerpo primario y portador

Mediante un método conocido, se digirió anticuerpo de conejo anti-producto génico de p53 con pepsina con el fin de preparar fragmento F(ab')2 de conejo anti-producto génico de p53. Se preparó el fragmento Fab' de conejo antiproducto génico de p53 mediante el método siguiente. Se añadieron 55 μl de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M disueltos en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, que contenían EDTA 5 mM, a 5 mg de F(ab')2 de conejo antiproducto génico de p53 disueltos en 0,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1,5 horas. La reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, recogiendo una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 280 nm, y después se concentró la fracción mediante ultrafiltración. El fragmento Fab' de conejo anti-producto génico de p53 preparado de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, Fab' y portador.

Ejemplo 5

Preparación 2 de un complejo de enzima, anticuerpo primario y portador

El anticuerpo monoclonal anti-CD34 conjugado con grupo tiol (fabricado por Nichirei Corp.) se preparó de la manera siguiente. Se añadieron 0,1 mg de SATA disueltos en 50 μl de DMF a 5 mg de anticuerpo monoclonal anti-CD34 disueltos en 1 ml de PBS, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 10 μl de EDTA 0,1 M, pH 7, y 100 μl de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción resultante, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. El producto resultante se purificó mediante filtración en gel en una columna Sephadex G25. Se mezcló el anticuerpo monoclonal anti-CD34 conjugado con grupo tiol preparado de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3, y se llevó a cabo la reacción a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; posteriormente, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción del filtrado de elevado peso molecular que contenía ambos picos como un complejo de enzima, anticuerpo monoclonal y portador.

Ejemplo 6

Preparación de un complejo de enzima y estreptavidina

Se preparó estreptavidina conjugada con grupo tiol de la manera siguiente. Se añadieron 0,25 mg de SATA disueltos en 250 μl de DMF a 25 mg de estreptavidina disueltos en 2,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, llevando a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 50 μl de EDTA 0,1 M, pH 7, y 200 μl de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción resultante, llevando a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. El producto resultante se purificó mediante filtración en gel en una columna Sephadex G25. La estreptavidina conjugada con grupo tiol preparada de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, estreptavidina y portador.

Ejemplo 7

Comparación inmunohistoquímica entre el complejo de enzima, anticuerpo y portador del Ejemplo 3 y el anticuerpo marcado con enzima preparado mediante el método convencional, y comparación con el método SAB.

Mediante la utilización de anticuerpo monoclonal anti-LCA (fabricado por Nichirei Corp.) como anticuerpo primario, se tiñó una sección de tejido intestinal. En primer lugar, se realizó una sección delgada de tejido incluido en parafina, que se depositó en un portaobjetos de vidrio. A continuación, se llevó a cabo el tratamiento para eliminar la parafina y el tratamiento para eliminar la peroxidasa, y se dejó que el espécimen preparado de esta manera reaccionase con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante una hora, seguido de un enjuague exhaustivo en PBS, preparando de esta manera el espécimen con unión del anticuerpo primario. Se añadió gota a gota un anticuerpo secundario a dicho espécimen. Como anticuerpo secundario se utilizó el complejo de enzima, Fab' y portador preparado en el Ejemplo 3, a una concentración de 6 μg/ml (concentración de Fab'). Separadamente, como anticuerpo secundario, se utilizó el fragmento Fab' directamente marcado con peroxidasa mediante un método convencional, a la misma concentración. El método de marcaje mediante el método convencional se realizó según la referencia Journal of Immunoassay 4(3):209-327, en la que los materiales y reactivos eran todos idénticos a los del Ejemplo 3. Se dejó que el anticuerpo primario del espécimen unido a anticuerpo primario reaccionase con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 30 minutos en cada uno de los dos casos indicados anteriormente.

En el método SAB, se utilizó un anticuerpo policlonal antiratón marcado con biotina (fabricado por Nichirei Corp.) como el anticuerpo secundario. En este caso, se hizo reaccionar el anticuerpo primario del espécimen unido a anticuerpo primario con el anticuerpo secundario durante 10 minutos, seguido de enjuague, y después se añadió gota a gota estreptavidina marcada con peroxidasa (fabricada por Nichirei Corp.), llevando a cabo la reacción

5 durante 5 minutos.

A continuación, se llevó a cabo un enjuague exhaustivo en cada uno de los tres casos anteriormente indicados; los especimenes resultantes recibieron la adición gota a gota de una solución de sustrato (diaminobencidina, peróxido de hidrógeno) para la reacción, y después se enjuagaron en agua destilada, se sellaron y se observaron al

10 microscopio.

Se muestran los resultados en la Tabla 1, a continuación. El complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador preparado en el Ejemplo 3 era especialmente excelente, en comparación con el anticuerpo marcado con enzima preparado mediante el método convencional. Además, el complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador

15 preparado en el Ejemplo 3 era excelente en comparación con el procedimiento de amplificación que comprendía el método SAB. Tabla 1 Especímenes Intensidad de tinción A ± B +++ C +

A: anticuerpo marcado con enzima mediante el método convencional

B: complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador del Ejemplo 3

C: método SAB

Ejemplo 8

20 Comparación inmunohistoquímica entre el complejo de enzima, anticuerpo primario y portador, preparado en el Ejemplo 4, y el método SAB.

Como anticuerpo primario para el método SAB se utilizó anticuerpo policlonal anti-p53 de conejo (fabricado por

25 Nichirei Corp.) al igual que el material utilizado en el Ejemplo 4. En primer lugar, se realizó una sección delgada de tejido de cáncer gástrico incluido en parafina y se depositó sobre un portaobjetos de vidrio. A continuación, se llevó a cabo el tratamiento para eliminar la parafina y el tratamiento para eliminar la peroxidasa, y el espécimen preparado de esta manera se dejó reaccionar con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante una hora. Tras el enjuague exhaustivo en PBS, el espécimen unido al anticuerpo primario se dejó reaccionar con anticuerpo policlonal

30 anticonejo marcado con biotina (fabricado por Nichirei Corp.) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras el enjuague, se añadió gota a gota a dicho espécimen estreptavidina marcada con peroxidasa, llevan a cabo la reacción durante 5 minutos.

Separadamente, el complejo de enzima, anticuerpo primario y portador (complejo de enzima, Fab' y portador)

35 preparado en el Ejemplo 4 se sometió a reacción con el espécimen preparado de esta manera, tal como se ha indicado anteriormente, a temperatura ambiente durante una hora. La concentración del complejo de enzimaanticuerpo era de 2 μg/ml (concentración de Fab').

Tras llevar a cabo un enjuague exhaustivo en cada uno de los dos casos anteriormente indicados, los especímenes

40 resultantes recibieron la adición gota a gota de una solución de sustrato (diaminobencidina, peróxido de hidrógeno) para la reacción de color, y después se enjuagaron en agua destilada, se sellaron y se observaron con un microscopio.

Como resultado, la intensidad de tinción obtenida al utilizar el complejo de enzima, anticuerpo primario y portador 45 era igual a la intensidad obtenida mediante el método SAB que comprendía el procedimiento de amplificación.

Ejemplo 9

Comparación según inmunoensayo enzimático entre el complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador 50 preparado en el Ejemplo 3 y el anticuerpo marcado con enzima preparado mediante el método convencional

Se añadieron 100 μl de IgG de cabra antiratón a una concentración de 10 μg/ml a una placa de microtitulación de 96 pocillos, para la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Se enjuagó la placa de microtitulación en solución salina fisiológica, seguido de la adición de 200 μl de albúmina de suero bovino al 1%, para la incubación 55 durante 2 horas. Se añadieron 100 μl de IgG de ratón a concentraciones determinadas (entre 0 y 1.000 pg/ml) para la incubación durante 2 horas y se enjuagaron en solución salina fisiológica. A continuación, a la placa de microtitulación preparada de esta manera se añadieron 100 μl del complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador preparado en el Ejemplo 3 a una concentración de 0,5 μg/ml basada en la cantidad de anticuerpo (es decir, como concentración de anticuerpo), ó 100 μl del anticuerpo marcado con enzima preparado mediante el método convencional a una concentración de 2 μg/ml basada en la cantidad de anticuerpo, para la incubación durante 30 minutos. La placa de microtitulación resultante se enjuagó adicionalmente en solución salina fisiológica, seguido de 5 la adición de 100 μl de una solución de sustrato (tetrametilbencidina, peróxido de hidrógeno) para la reacción durante 15 minutos. Se terminó la reacción mediante la adición de 50 μl de ácido sulfúrico 1 N. Se midió el grado de reacción de color con un lector de microplacas. Tal como se muestra en la fig. 1, los resultados indican que la reacción de color obtenida a partir de un volumen menor del complejo de enzima, anticuerpo secundario y portador preparado en el Ejemplo 3, era más intensa que la reacción de color del anticuerpo marcado con enzima preparado

10 mediante el método convencional.

La fig. 1 muestra los resultados anteriormente indicados. En la figura, el eje de abscisas expresa la concentración de IgG de ratón, y el eje de ordenadas expresa la absorbancia a 450 nm. Los círculos negros representan el complejo de enzima, anticuerpo y portador preparado en el Ejemplo 3, mientras que los círculos blancos representan el

15 anticuerpo marcado con enzima preparado mediante el método convencional.

Ventajas de la invención

El complejo inventivo de enzima, proteína y portador resulta útil particularmente como anticuerpo marcado con

20 enzima (a modo de anticuerpo primario o secundario), para la inmunohistoquímica e inmunoensayo enzimático, y permite llevar a cabo inmunoensayos de elevada sensibilidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir un complejo de enzima, proteína y portador, que comprende:

(1)

un portador,

(2)

un enzima, encontrándose conjugadas covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1), y

(3)

una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, encontrándose conjugada la proteína sola con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2), comprendiendo el método las etapas de preparar un complejo de un portador y un enzima que comprende modificar grupos amino de un portador en grupos tiol y mezclar el portador resultante con un enzima con uno o más grupos maleimido modificados a partir de uno o más grupos amino, añadir un amplio exceso de un reactivo de maleimidación y permitir que reaccione con el complejo de enzima y portador, con el fin de introducir grupos maleimida en prácticamente la totalidad de los grupos amino remanentes en el complejo, tiolar el mismo enzima tal como se utiliza para la producción del complejo bajo condiciones en las que queda uno o más grupos amino en el enzima, hacer reaccionar entre sí el enzima que se ha tiolado de esta manera y el complejo de enzima y portador con grupos maleimida introducidos en el mismo, posteriormente bloquear los grupos maleimida remanentes con mercaptoetanol, de manera que el grupo o grupos amino se encuentren presentes únicamente en el enzima tiolado del complejo de enzima y portador, y conjugar la proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia con el complejo de enzima y portador mediante reacción del grupo tiol de la proteína con el grupo maleimida del complejo.
2. Método para producir un complejo de enzima, proteína y portador, que comprende:

(1)

un portador,

(2)

un enzima, en el que se conjuga covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1),

(3)

una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, en la que la proteína se encuentra conjugada con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2), y

(4)

la misma proteína que en (3), conjugada directamente con el portador en (1), comprendiendo el método las etapas de preparar un complejo de un portador y un enzima que comprende modificar grupos amino de un portador en grupos tiol y mezclar el portador resultante con un enzima con uno o más grupos maleimido modificados a partir de uno o más grupos amino, añadir un amplio exceso de un reactivo de maleimidación y permitir que reaccione con el complejo de enzima y portador, con el fin de introducir grupos maleimida en prácticamente la totalidad de los grupos amino remanentes en el complejo, tiolar el mismo enzima tal como se utiliza para la producción del complejo bajo condiciones en las que queda uno o más grupos amino en el enzima, hacer reaccionar entre sí el enzima que se ha tiolado de esta manera y el complejo de enzima y portador con grupos maleimida introducidos en el mismo, posteriormente bloquear los grupos maleimida remanentes con mercaptoetanol, de manera que el grupo o grupos amino se encuentren presentes únicamente en el enzima tiolado del complejo de enzima y portador, y en el reactivo utilizado para bloquear el grupo o grupos maleimida remanentes, y conjugar la proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia con el complejo de enzima y portador mediante reacción del grupo tiol de la proteína con el grupo maleimida del complejo.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el portador presenta un peso molecular medio de entre
5.000 y 500.000 Da, determinado mediante cromatografía de filtración en gel.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el portador presenta un peso molecular medio de entre 10.000 y
300.000 Da, determinado mediante cromatografía de filtración en gel.
5.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el portador se selecciona de entre el grupo que consiste de: (a) un polímero peptídico que presenta dos o más grupos amino básicos, y (b) un polisacárido en el que se han introducido grupos amino.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el portador es polilisina.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el enzima se selecciona de entre el grupo que consiste de peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, �-galactosidasa y glucosa oxidasa.
8.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína con una potencia de unión específica a otra sustancia o sustancias es por lo menos una seleccionada de entre el grupo que consiste de un anticuerpo y uno o más fragmentos del mismo.
9.

Método según la reivindicación 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
10. Método según la reivindicación 8, en el que el fragmento o fragmentos se refiere a por lo menos uno 5 seleccionado de entre el grupo que consiste de F(ab')2, Fab' y Fabc'.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína con una potencia de unión específica con otra sustancia o sustancias es avidina o estreptavidina.

10 12. Complejo producido de acuerdo con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Kit de inmunoensayo que comprende el complejo producido de acuerdo con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15 14. Kit de inmunoensayo según la reivindicación 13, en el que el inmunoensayo es una inmunohistotinción o un inmunoensayo enzimático.