JP2012144519A - 抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 抗原結合能の低下又は喪失を招くことなく、標識物質等を結合することが可能な抗体を提供すること。
【解決手段】（１）分子中の一部のジスルフィド結合が切断され、チオール基に還元されている、（２）ジスルフィド結合の切断によって低分子化していない、及び、（３）抗原結合能を保持している、との特徴を有する、ＩｇＧ型抗体により課題を解決する。
【選択図】 図３

Description

本発明は、抗体に関するものである。

抗体（抗体分子）は、種々の分野で使用されている。例えば液体クロマトグラフィーの分野では、血中の有用なタンパク質を特異的に認識する抗体を結合した担体がアフィニティークロマトグラフィーに使用されている。また免疫測定の分野では、抗体を検出可能な標識物質に結合した標識抗体や、抗体を水不溶性の担体に結合した固相化抗体が使用されている。

免疫測定は、一般的に抗原抗体反応を利用して測定対象となる抗原（抗体により特異的に認識される物質）を検出又は定量する方法であり、臨床診断の分野で広く使用されている。免疫測定の一種である、いわゆるサンドイッチ法では、抗体に酵素や化学物質等の検出可能な標識物質を結合した標識抗体と、抗体を水不溶性の担体に固定化した固相（固相化抗体）を使用して、「固相化抗体−測定対象抗原−標識抗体」という免疫複合体を形成させ、いわゆるＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離操作によって固相を液相と分離し、その後に固相又は液相中の標識物質の量を検出し、検出値に基づいて測定対象抗原の存在及び／又は存在量を測定する。また免疫測定においては、アビジンやビオチン等の特異的結合ペアの一方を抗体に結合し、他方を担体に結合して固相化抗体を製造することもある。

免疫測定において使用する標識抗体は、通常、抗体（例えばＩｇＧ型の抗体）をＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸（ＳＭＣＣ）で処理することで、抗体を形成するペプチド鎖中のアミノ基にチオール基（ＳＨ基）を導入し、これを予め活性ジスルフィド基を導入した標識物質と反応させることで製造する。しかしこの方法では、ＳＨ基導入の過程で、ＳＭＣＣが抗体を形成するペプチド鎖中のアミノ基に対してランダムに反応するため、抗体の抗原結合能が低下し、又、希ではあるが抗体の抗原結合能が失われることがある。

従来、上記のような課題が発生する場合には、抗体をペプシンやパパイン等の消化酵素で処理して低分子化し、生じたＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメント中に残存するジスルフィド結合（ＳＳ結合）を還元処理することでＳＨ基を生じさせ、これを予めマレイミドと結合した標識物質と反応させることが行われている（マレイミド・ヒンジ法）。しかしこの方法でも、ＩｇＧ型抗体の場合、Ｈ鎖やＬ鎖を連結しているＳＳ結合の切断により抗体のコンフォーメーションの変化が引き起こされ、抗体の抗原結合能が低下し、又、希ではあるが抗体の抗原結合能が失われることもある。

上記のような課題は抗体に標識物質を結合する場合に限られず、抗体を担体に結合する場合や、抗体をアビジンやビオチンといった結合ペアの一方を結合する場合にも同様である。

本発明の目的は、抗原結合能の低下又は喪失を招くことなく、標識物質等を結合することが可能な抗体を提供することにある。

前記目的に鑑みて成された本発明は、以下（１）から（３）の特徴を有するＩｇＧ型抗体である。
（１）分子中の一部のジスルフィド結合（ＳＳ結合）が切断され、チオール基（ＳＨ基）に還元されている、
（２）ＳＳ結合の切断によって低分子化していない、及び、
（３）抗原結合能を保持している。

また本発明は、以下（１）から（３）の特徴を有するＩｇＧ型抗体である。
（１）分子中の一部のＳＳ結合が切断され、この切断されて生じたＳＨ基を利用して他の物質が結合されている、
（２）ＳＳ結合の切断によって抗体自体は低分子化していない、及び、
（３）抗原結合能を保持している。

以下、本発明の抗体を詳細に説明する。

本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体に対してゆるやかな還元処理をして製造し得るものである。ＩｇＧ型抗体は、ラクダＩｇＧ抗体等、特殊なものを除き、二本のＨ鎖（重鎖）と二本のＬ鎖（軽鎖）からなり、Ｈ鎖−Ｌ鎖間がそれぞれ１個以上のＳＳ結合で連結される一方、Ｈ鎖同士もまた複数のＳＳ結合によって連結されている（以下、天然形態のＩｇＧ型抗体を、「インタクト抗体」という）。本発明の抗体を製造するのに用いるインタクト抗体としては、ヒト、サル、ウサギ、イヌ、ヒツジ、マウス、ラット、ラクダ等、由来する動物種の区別無く、またそのサブクラスの制限無く使用することができる。また抗体の種類としてはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良く、また更には遺伝子組換え（リコンビナント）の手法により製造されたＩｇＧ型抗体（本明細書においては、便宜上、当該抗体もインタクト抗体と記載する）であっても良い。ただし、後述する還元処理の前に、適切な精製操作を行なって夾雑物を除去しておくことが好ましい。

本発明の抗体を製造するための方法としては、還元剤を用いた還元処理が例示できる。還元剤としては、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）等、一般に入手可能な還元剤を使用することができる。還元剤による還元処理は、抗体の抗原結合能を低下せず、かつ、還元処理を阻害しない緩衝剤によって適切なｐＨに調製した緩衝液中で実施すれば良い。そのような緩衝液として例えば、リン酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシン緩衝液であって、ｐＨがｐＨ６．０からｐＨ７．５、好ましくはｐＨ６．５から７．０の緩衝液があげられる。特に、本発明の抗体を製造した後、引き続き後述するような標識物質の結合を行なう場合であって、その際にマレイミドを使用する場合には、マレイミドの加水分解を防止するためにｐＨを中性付近、具体的にはｐＨ６．０からｐＨ７．０とすると好ましい。上記緩衝液には、ＳＨ基の酸化を抑制するため、ＥＤＴＡやＥＧＴＡ等の酸化防止剤を更に添加すると好ましい。

還元処理は、インタクト抗体の一部のＳＳ結合を切断し、その切断によってインタクト抗体を低分子化することがなく、かつ処理後の抗体が抗原結合能を維持する、即ち、インタクト抗体の二本のＨ鎖間の全ＳＳ結合を切断することのなく、Ｈ鎖とＬ鎖間の全ＳＳ結合を切断することのなく、かつ処理後の抗体が抗原結合能を維持するものであれば良い。例えばＨ鎖間の全ＳＳ結合が切断されればＨ鎖間の連結が解かれ、インタクト抗体は２分子化し、各分子はなお抗原結合能を保持するとしても、その分子量は１／２になり、低分子化してしまう。またいずれかのＨ鎖とＬ鎖間の全ＳＳ結合が切断されれば鎖間の連結は解かれ、いずれか一方の分子はなお抗原結合能を保持するとしても、分子量は低分子化してしまう。

本発明の抗体を前記したような還元剤を用いた還元処理によって製造する場合、温度条件として４℃から４０℃、好ましくは３５℃から３７℃の範囲を選択する。還元反応時間としては温度条件によって異なるが、４℃から８℃の場合、８時間から３６時間、好ましくは１２時間から２４時間の範囲を選択し、３５℃から３７℃の場合、６０分から２４０分、好ましくは９０分から１８０分の範囲を選択し、かつ、単に溶液を室温放置して処理する方法等が例示できる。また還元剤を用いる場合、還元処理温度や処理時間のみならず、処理されるべきインタクト抗体と還元剤のモル比の制御も重要である。上記例示した還元剤のうち、例えば、２−メルカプトエチルアミンを用いる場合であって、上記例示したｐＨ、温度及び反応時間で処理を行なう場合、インタクト抗体のモル濃度１に対し、還元剤のモル濃度は３０，０００から１，５００，０００とすると好ましい。

本発明の抗体の具体的な形態は、インタクト抗体としてマウス由来の抗体を例に説明すれば、少なくともＨ鎖とＬ鎖間のＳＳ結合の一部が切断されたものと、少なくともＨ鎖同士のＳＳ結合の一部が切断されたものの二種類である。いずれのものも、低分子化（インタクト抗体からの、当該抗体を構成するペプチド鎖の脱離）が生じていないため、例えば上記還元処理を行なった後にゲルろ過クロマトグラフィーに供する等して、インタクト抗体と同様の溶出時間で溶出するピークを取得する等すれば良い。また抗原との反応性を保持しているか否かは、例えば抗原と混合した後にゲルろ過クロマトグラフィーに供する等して抗原と免疫複合体を形成したことを試験すれば確認できる。

本発明の抗体の好ましい態様として、ＳＳ結合切断率が４０％以上１００％未満の抗体があげられる。なお本明細書において、ＳＳ結合の切断率とは、１分子のインタクト抗体のうち還元処理によって切断されたＳＳ結合数を、１分子のインタクト抗体に存在するＳＳ結合の総数で除した値である。またＳＳ結合の切断率については、５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）等ＳＨ基に反応する試薬を用いて定量することができる。

以上に説明した本発明の抗体は、その分子中の一部のＳＳ結合が切断されているが、本発明者らの知見によれば、インタクト抗体と比較して抗原との結合能が向上する場合がある。これは、インタクト抗体のＦｃ部分に存在するＳＳ結合の一部が切断された結果、インタクト抗体が有する２つの抗原結合部位の立体構造上の自由度が増し、より自由に抗原と反応可能になったからと推測される。なお、還元処理を行なった抗体に関しては、後述する他の物質を結合する操作に供する場合を除き、還元処理により切断されたＳＨ基のＳＳ再結合を防止するための処理（キャッピング）を行なうと好ましい。キャッピングは、例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）等を使用することにより容易に行なうことができる。
本発明の抗体は、以上に説明した還元処理によって分子中の一部のＳＳ結合が切断され、残基としてＳＨ基を露出している。そこで本発明では、このＳＨ基を利用して、例えば標識物質等を結合させることが可能である。結合させる物質としては、後述するＳＨ基との結合性を有する結合剤に結合可能なものであれば制限はない。例えば、免疫測定で標識物質として使用されている酵素、化学発光物質、蛍光物質又は呈色物質等、免疫測定で使用される担体、アビジンやビオチン等の特異的な結合ペアの一方、そして液体クロマトグラフィー用担体等が例示できる。中でも、抗原との高い反応性が要求される免疫測定を実施するため、本発明の抗体に上記標識物質を結合させて標識抗体とすると特に好ましい。

還元処理した抗体と上記物質とを結合するためには、ＳＨ基と特異的に結合する結合試薬として、マレイミド基を有する試薬やブロモアセトアミド基を有する試薬等を使用すれば良い。マレイミド系試薬としては、例えば入手の容易性等の観点から、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）が特に好ましい結合試薬としてあげられる。このようにして標識物質等を結合させた後には、還元処理により切断されたＳＨ基であって、かつ結合剤が結合しなかったＳＨ基のジスルフィド再結合を防止するため、キャッピングを行なうことが好ましい。

標識物質等を結合した抗体を得るには、例えばゲルろ過クロマトグラフィーに供する等して、結合の操作に供する前の抗体と比較してより高分子化したピークを取得する等すれば良い。またそのようにして得た抗体が抗原との反応性を保持しているか否かは、例えば標識物質を結合した場合には免疫測定における標識抗体として使用し、既知量の抗原をサンプルとして免疫測定を実施すれば、抗原と免疫複合体を形成することを通じて確認できる。

本発明によれば、
（１）分子中の一部のジスルフィド結合（ＳＳ結合）が切断され、チオール基（ＳＨ基）に還元されている、
（２）ＳＳ結合の切断によって低分子化していない、そして
（３）抗原結合能を保持している、
という特徴を有する抗体が提供される。この抗体は、ＳＳ結合の一部が切断されているとはいえ、インタクト抗体と同様の分子構造を維持しているため、抗原結合能を失うことはなく、かつ、標識物質等を結合することが可能なＳＨ基を有している。従って本発明の抗体は、免疫測定で使用する標識抗体を製造する材料として特に有利なものである。なお、ＳＳ結合切断率は４０％以上１００％未満とすると好ましい。加えて本発明の抗体は、広く一般に入手可能な還元剤を使用して安価かつ短時間で製造することが可能であり、しかも、還元処理の操作自体も還元剤を使用する等により簡便に実施可能である。

実施例１の方法で還元処理した抗体とインタクト抗体のクロマトグラムである。本図から、実施例１で採用した条件での還元処理では、インタクト抗体の低分子化がほとんど生じていないことが分かる。 ジスルフィド結合（ＳＳ結合）を完全に還元した抗体とＳＳ結合の一部を還元した抗体のクロマトグラムである。本図から、ＳＳ結合を完全に還元した抗体は、インタクト抗体の低分子化により溶出時間が変化していることが分かる。 ＳＳ結合の一部を還元した抗体およびＳＳ結合を完全に還元した抗体の測定感度を比較した結果を示す図である。本図から、ＳＳ結合の一部を還元した抗体から作製した標識抗体（コンジュゲート）を用いた免疫反応試薬における感度が、インタクト抗体から作製した免疫反応試薬の感度よりも高値を示すことが分かる。

以下実施例により本発明の一実施形態を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ 還元処理酵素標識抗体を用いた心筋トロポニンＩ測定用免疫反応試薬の評価
（１）標識抗体の製造
ウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）１５ｍｇを１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含むｐＨ７．６の５０ｍＭほう酸緩衝液にて一晩透析した。Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで２．８５ｍＭになるよう溶解し、前記透析したＡＬＰ溶液に添加した後、３０℃で９０分間反応させた。反応後、ゲルろ過用カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷ、東ソー株式会社製）にてＳＭＣＣが導入されたＡＬＰ（ＳＭＣＣ導入ＡＬＰ）を分取した。

抗心筋トロポニンＩ マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型インタクト抗体）５ｍｇを、５ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液にて一晩透析した。２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）をｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液で２００ｍＭになるように溶解し、透析後の抗体に５ｖｏｌ％になるように添加して、３７℃で２４０分間、還元処理を行なった。処理後の抗体（還元処理抗体）を前記ゲルろ過用カラムに供し、インタクト抗体と同一の溶出時間に出現したピーク画分を分取した。この時のクロマトグラムを図１に示す。図１に示されるように、還元処理抗体がインタクト抗体と同一の溶出時間（９．６分）で溶出することから、還元処理による低分子量化が生じていないことが分かる。

以上のようにして取得した処理抗体１ｍｇに対し、ＳＭＣＣ導入ＡＬＰ２．５ｍｇを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後、ゲルろ過用カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、東ソー株式会社製）にてＳＭＣＣ導入ＡＬＰが結合した処理抗体を取得した。

比較のため、還元処理していないインタクトの抗心筋トロポニンＩ抗体を用いて、同様の手法でアルカリ性ホスファターゼ標識抗心筋トロポニンＩ抗体（比較抗体）を得た。

（２）心筋トロポニンＩ測定試薬の作製
上記（１）で使用したインタクト抗体とは異なる部位で心筋トロポニンＩと結合する抗体を担体に結合し、上記（１）で製造したＳＭＣＣ導入ＡＬＰが結合した処理抗体を加えて凍結乾燥した。同様にして、比較抗体を加えて凍結乾燥し、比較試薬を製造した。

（３）心筋トロポニンＩ測定試薬の評価
上記（２）で製造した試薬と比較試薬を、免疫測定装置（ＡＩＡ−１８００、東ソー株式会社製）に供して免疫測定を行なった。測定サンプルとして、既知量の心筋トロポニンＩを含む標準品セット（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ｃＴｎＩ３）、東ソー株式会社製）を用い、３７℃で１０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、ＡＬＰの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）を加え、ＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の増加速度（ｎｍｏｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。この増加速度は試薬中の抗体とサンプル中の心筋トロポニンＩの反応性及びサンプル中の心筋トロポニンＩの量に比例している。また、サンプルは既知濃度の心筋トロポニンＩを含んでいるため、任意の２点の濃度における蛍光強度の増加速度の差を心筋トロポニンＩの濃度の差で割ることで、単位心筋トロポニンＩあたり蛍光強度の増加速度を算出することができる。算出された数値は感度と同義であるため、２種類の試薬の数値を比較することで、感度の比較を行なった。

結果を表１及び表２に示す。表１は各心筋トロポニンＩ濃度における蛍光強度の増加速度を、表２は表１から算出した単位心筋トロポニンＩあたり蛍光強度の増加速度、すなわち感度をそれぞれ示す。表２から分かるように、本発明の抗体（還元処理抗体）を標識抗体とした試薬は、インタクト抗体を標識抗体とした試薬と比較して約２倍の感度を有していた。

実施例２ 心筋トロポニンＩ測定用免疫反応試薬を用いたＳＳ結合切断率の評価
（１）還元処理抗体の作製
まず、インタクト抗体中のＳＳ結合を完全に還元（切断）した抗体を作製した。抗心筋トロポニンＩ マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型インタクト抗体）５ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液にて一晩透析した。２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）をｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液で２Ｍになるように溶解し、透析後の抗体に５ｖｏｌ％になるように添加して、３７℃で２４時間、還元処理を行なった。ＳＳ結合を完全に還元した処理抗体を前記ゲルろ過用カラムに供し、ピーク画分を分取した。この時のクロマトグラムを図２に示す。図２に示されるように、処理抗体がインタクト抗体よりも遅い溶出時間（１０．４分）で溶出することから、還元処理により抗体が低分子量化していることが分かる。

一方で還元処理時間（還元処理条件）を変えた抗体の作製を行なった。２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）をｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液で２００ｍＭになるように溶解し、透析後の抗体に５ｖｏｌ％になるように添加して、３７℃で３０分から２４０分間、還元処理を行なった。同様に、処理後の抗体を前記ゲルろ過用カラムに供した結果、処理抗体がインタクト抗体と同じ溶出時間（９．６分）で溶出しており、還元処理による低分子量化が生じていないことを確認した。

（２）ＳＳ結合切断率の算出
サンプル用、ブランク用に試験管を用意し、これに５ｍＭのＥＤＴＡを添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）８００μＬを注入した。サンプル用試験管に上記（１）の抗体溶液を２００μＬ、ブランク用試験管に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２００μＬ加え、ボルテックスミキサーで撹拌した。一方、５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１ｍＭのＤＴＮＢ溶液を調製した。１ｍＭのＤＴＮＢ溶液をそれぞれの試験管に２０μＬ加え、撹拌の後、ブランク用試料を分光光度計にセットし、測定波長４１２ｎｍで測定を行なった。吸光度から計算によりＳＳ結合切断数（個／分子）を算出した。

還元処理による低分子量化が生じていた場合、還元処理が完全に進行しているといえ、その時のＳＳ結合切断数は６．１３（個／分子）であった。上記（１）で還元処理時間を変えて作製した還元抗体のＳＳ結合切断数も同様に算出し、還元が完全に進行した際のＳＳ結合切断数（６．１３）で除することで、ＳＳ結合切断率（％）を算出した。

（３）標識抗体の作製
上記（１）で取得した、それぞれの条件の処理抗体１ｍｇに対し、実施例１（１）で作製したＳＭＣＣ導入ＡＬＰ２．５ｍｇを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後、ゲルろ過用カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、東ソー株式会社製）にてＳＭＣＣ導入ＡＬＰが結合した処理抗体を取得した。

比較のため、還元処理していないインタクトの抗心筋トロポニンＩ抗体を用いて、同様の手法でアルカリ性ホスファターゼ標識抗心筋トロポニンＩ抗体（比較抗体）を得た。

（４）心筋トロポニンＩ測定試薬の作製
上記（１）で使用したインタクト抗体とは異なる部位で心筋トロポニンＩと結合する抗体を担体に結合し、上記（３）で製造したＳＭＣＣ導入ＡＬＰが結合した処理抗体を加えて凍結乾燥した。同様にして、比較抗体を加えて凍結乾燥し、比較試薬を製造した。

（５）心筋トロポニンＩ測定試薬の評価
上記（４）で製造した試薬と比較試薬を、実施例１（３）と同様な方法で免疫測定を行ない、感度の比較を行なった。

上記（２）で算出したＳＳ結合切断率と感度を比較した結果を表３及び図３に示す。表３及び図３から分かるように、ＳＳ結合切断率の上昇にしたがって感度が上昇し、ＳＳ結合切断率が４０％以上の時に、インタクト抗体を標識抗体とした場合よりも高い感度が認められた。また、ＳＳ結合切断率が５０％程度から感度が最大になり、以降、切断率が上昇しても一定の感度を保っていたが、ＳＳ結合切断率が１００％になる（抗体自体が低分子化される）と感度の低下が認められた。このことから、ＳＳ結合切断率は４０％以上１００％未満が好ましく、５０％以上９０％以下が特に好ましいことがわかる。

Claims (3)

1. 以下（１）から（３）の特徴を有する、ＩｇＧ型抗体。
   （１）分子中の一部のジスルフィド結合が切断され、チオール基に還元されている、
   （２）ジスルフィド結合の切断によって低分子化していない、及び、
   （３）抗原結合能を保持している。
2. 以下（１）から（３）の特徴を有する、ＩｇＧ型抗体。
   （１）分子中の一部のジスルフィド結合が切断され、この切断されて生じたチオール基を
   利用して他の物質が結合されている、
   （２）ジスルフィド結合の切断によって抗体自体は低分子化していない、及び、
   （３）抗原結合能を保持している。
3. ジスルフィド結合切断率が４０％以上１００％未満である、請求項１又は２に記載の抗体。

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