JPH09166595A - サンドイッチイムノアッセイおよびその試薬 - Google Patents
サンドイッチイムノアッセイおよびその試薬Info
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- JPH09166595A JPH09166595A JP32551795A JP32551795A JPH09166595A JP H09166595 A JPH09166595 A JP H09166595A JP 32551795 A JP32551795 A JP 32551795A JP 32551795 A JP32551795 A JP 32551795A JP H09166595 A JPH09166595 A JP H09166595A
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- sandwich immunoassay
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 貴重な抗体を無駄にすることなく安価で高感
度なサンドイッチイムノアッセイおよびその試薬を提供
する。 【解決手段】 固相抗体（一次抗体）として鶏卵抗体で
あるＩｇＹを用い、二次抗体としてＩｇＧを用い、Ｉｇ
ＧのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識部位
とを同時に有する物質を用いて、試料中に存在する抗原
の量を測定することを特徴とするサンドイッチイムノア
ッセイ。
度なサンドイッチイムノアッセイおよびその試薬を提供
する。 【解決手段】 固相抗体（一次抗体）として鶏卵抗体で
あるＩｇＹを用い、二次抗体としてＩｇＧを用い、Ｉｇ
ＧのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識部位
とを同時に有する物質を用いて、試料中に存在する抗原
の量を測定することを特徴とするサンドイッチイムノア
ッセイ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なサンドイッ
チイムノアッセイおよびこれに使用する試薬に関する。
チイムノアッセイおよびこれに使用する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体成分中の微量の抗原性物質を測定す
る方法としては、抗原抗体反応を利用した様々なイムノ
アッセイが行われている。その一つとして、抗原に少な
くとも２種の異なる抗体を反応させることを特徴とする
サンドイッチ法があり、現在広く利用されている。この
方法では、固相抗体（一次抗体）と二次抗体を使用する
ことが不可欠である。また、最終的には固相の抗体とサ
ンドイッチを形成した二次抗体の量を何らかの方法で測
定する必要がある。一般的には、二次抗体に何らかの標
識を行い、その標識物質の量を測定することによって目
的抗原の量を測定している。
る方法としては、抗原抗体反応を利用した様々なイムノ
アッセイが行われている。その一つとして、抗原に少な
くとも２種の異なる抗体を反応させることを特徴とする
サンドイッチ法があり、現在広く利用されている。この
方法では、固相抗体（一次抗体）と二次抗体を使用する
ことが不可欠である。また、最終的には固相の抗体とサ
ンドイッチを形成した二次抗体の量を何らかの方法で測
定する必要がある。一般的には、二次抗体に何らかの標
識を行い、その標識物質の量を測定することによって目
的抗原の量を測定している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】抗体を標識するものと
しては、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、発光物質等
があるが、いずれの物質も抗体に結合させるためには、
何らかの化学反応を介して結合させる必要があり、その
標識操作によって抗体、標識物質のどちらもが何らかの
変化を受ける。例えば、標識操作は抗体の安定性を損ね
たり、貴重な抗体そのものを損失する可能性が大きい。
さらに、標識操作は化学反応であるため、１００％標識
されることはない。
しては、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、発光物質等
があるが、いずれの物質も抗体に結合させるためには、
何らかの化学反応を介して結合させる必要があり、その
標識操作によって抗体、標識物質のどちらもが何らかの
変化を受ける。例えば、標識操作は抗体の安定性を損ね
たり、貴重な抗体そのものを損失する可能性が大きい。
さらに、標識操作は化学反応であるため、１００％標識
されることはない。
【０００４】一方、貴重な二次抗体自体を標識すること
なく、二次抗体に親和性を有する物質に標識する場合も
ある。この場合にも、親和性を有する物質として抗体を
用いれば通常のサンドイッチ法と同じことになり、必要
とする抗体の種類を増やすだけである。近年、プロテイ
ンＡやプロテインＧ等のような抗体のＦｃ部分を特異的
に認識する物質が見いだされ、これを二次抗体に親和性
を有する物質として使用する試みがある。しかしなが
ら、それらの物質は一般的に使用する動物種の抗体に結
合するので、固相に用いる抗体との相互作用が無視でき
なかった。この相互作用を解消しようとして固相抗体の
Ｆｃ部分を除去した抗体を使用することが考えられてい
るが、このような操作は標識操作と同様の障害を抗体に
もたらすと同時に、固相との結合に適したＦｃ部分を除
くことになるので、固相に使用する抗体としては都合が
悪くなる。
なく、二次抗体に親和性を有する物質に標識する場合も
ある。この場合にも、親和性を有する物質として抗体を
用いれば通常のサンドイッチ法と同じことになり、必要
とする抗体の種類を増やすだけである。近年、プロテイ
ンＡやプロテインＧ等のような抗体のＦｃ部分を特異的
に認識する物質が見いだされ、これを二次抗体に親和性
を有する物質として使用する試みがある。しかしなが
ら、それらの物質は一般的に使用する動物種の抗体に結
合するので、固相に用いる抗体との相互作用が無視でき
なかった。この相互作用を解消しようとして固相抗体の
Ｆｃ部分を除去した抗体を使用することが考えられてい
るが、このような操作は標識操作と同様の障害を抗体に
もたらすと同時に、固相との結合に適したＦｃ部分を除
くことになるので、固相に使用する抗体としては都合が
悪くなる。
【０００５】本発明は、上記の事情に鑑みなされたもの
で、貴重な抗体を無駄にすることなく安価で高感度なサ
ンドイッチイムノアッセイおよびその試薬を提供するこ
とを目的とする。
で、貴重な抗体を無駄にすることなく安価で高感度なサ
ンドイッチイムノアッセイおよびその試薬を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の抗
体を標識する操作を行うことなく、抗体に何ら改変もス
トレスも加えないでサンドイッチイムノアッセイを行う
方法を鋭意研究し、本発明を完成した。
体を標識する操作を行うことなく、抗体に何ら改変もス
トレスも加えないでサンドイッチイムノアッセイを行う
方法を鋭意研究し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、固相抗体（一次抗
体）として鶏卵抗体であるＩｇＹを用い、二次抗体とし
てＩｇＧを用い、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能力を
有する部位と標識部位とを同時に有する物質を用いて、
試料中に存在する抗原の量を測定することを特徴とする
サンドイッチイムノアッセイを提供する。
体）として鶏卵抗体であるＩｇＹを用い、二次抗体とし
てＩｇＧを用い、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能力を
有する部位と標識部位とを同時に有する物質を用いて、
試料中に存在する抗原の量を測定することを特徴とする
サンドイッチイムノアッセイを提供する。
【０００８】本発明では固相抗体（一次抗体）として鶏
卵抗体を用いる。鶏卵抗体はＩｇＹと呼ばれ、抗原性物
質で免疫したニワトリが生んだ卵黄から容易に精製して
得られる。ＩｇＹは多くの点でＩｇＧと似通っており、
固相抗体として使用可能である。また、この抗体はアフ
ィニティクロマトグラフィーにも利用できる（特公平７
−５３７６０号）。しかも、ＩｇＹはプロテインＡやプ
ロテインＧには親和性を有しないという性質をもつ。
卵抗体を用いる。鶏卵抗体はＩｇＹと呼ばれ、抗原性物
質で免疫したニワトリが生んだ卵黄から容易に精製して
得られる。ＩｇＹは多くの点でＩｇＧと似通っており、
固相抗体として使用可能である。また、この抗体はアフ
ィニティクロマトグラフィーにも利用できる（特公平７
−５３７６０号）。しかも、ＩｇＹはプロテインＡやプ
ロテインＧには親和性を有しないという性質をもつ。
【０００９】ＩｇＹは抗原性物質を用いて常法によりニ
ワトリを免疫し、その鶏卵卵黄中から十分な抗体価をも
つ抗体を調製することができる。このようなＩｇＹの調
製法は例えば、Nippon Nogeikagaku Kaishi, 68:1457-1
462, 1994 や、上記特公平７−５３７６０号に開示され
ている。ニワトリの免疫は、例えば、抗原溶液を適当な
アジュバントと混合して、産卵鶏に筋肉注射することに
よって行い、さらに隔週間隔で初回免疫を含めて４回繰
り返し、鶏卵を採取する。
ワトリを免疫し、その鶏卵卵黄中から十分な抗体価をも
つ抗体を調製することができる。このようなＩｇＹの調
製法は例えば、Nippon Nogeikagaku Kaishi, 68:1457-1
462, 1994 や、上記特公平７−５３７６０号に開示され
ている。ニワトリの免疫は、例えば、抗原溶液を適当な
アジュバントと混合して、産卵鶏に筋肉注射することに
よって行い、さらに隔週間隔で初回免疫を含めて４回繰
り返し、鶏卵を採取する。
【００１０】鶏卵中の特異的抗体価は、酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、マイクロタイ
ター法等を用いて測定することができ、免疫後に２週間
程度の間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移
を追跡することができる。
（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、マイクロタイ
ター法等を用いて測定することができ、免疫後に２週間
程度の間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移
を追跡することができる。
【００１１】本発明におけるＩｇＹは、前記のようにし
て得られた卵黄中に含まれる免疫グロブリンを抽出、分
離することによって得ることができる。分離方法として
は、例えば、デキストラン硫酸やポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）、寒天、カラギナン、ファーセレラン、ペ
クチン、キサンタンガム、アルギン酸、アルギン酸塩、
アルギン酸誘導体等を用いてリポタンパク質を沈殿さ
せ、その上清から分離、精製する方法（特開昭６３−２
１５６９９号、特開昭６４−３８０９８号参照）や、プ
ロパノール、クロロホルム等を用いた抽出法等、従来免
疫グロブリンの抽出、分離に用いられた方法を用いるこ
とができるが、カラギナン、キサンタンガム、ペクチン
等を用いるのが好ましい。
て得られた卵黄中に含まれる免疫グロブリンを抽出、分
離することによって得ることができる。分離方法として
は、例えば、デキストラン硫酸やポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）、寒天、カラギナン、ファーセレラン、ペ
クチン、キサンタンガム、アルギン酸、アルギン酸塩、
アルギン酸誘導体等を用いてリポタンパク質を沈殿さ
せ、その上清から分離、精製する方法（特開昭６３−２
１５６９９号、特開昭６４−３８０９８号参照）や、プ
ロパノール、クロロホルム等を用いた抽出法等、従来免
疫グロブリンの抽出、分離に用いられた方法を用いるこ
とができるが、カラギナン、キサンタンガム、ペクチン
等を用いるのが好ましい。
【００１２】本発明におけるＩｇＹは、前記のようにし
てカラギナン等を用いて卵黄リポタンパク質を除去した
卵黄水溶性タンパク質をイオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲル濾過、硫酸ナトリウム塩析、塩酸ア
ンモニウム塩析等の公知のタンパク質精製法によって精
製した精製ＩｇＹを使用する。特に、カラギナン法とイ
オン交換クロマトグラフィーを組み合わせて得られるＩ
ｇＹが好ましい。
てカラギナン等を用いて卵黄リポタンパク質を除去した
卵黄水溶性タンパク質をイオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲル濾過、硫酸ナトリウム塩析、塩酸ア
ンモニウム塩析等の公知のタンパク質精製法によって精
製した精製ＩｇＹを使用する。特に、カラギナン法とイ
オン交換クロマトグラフィーを組み合わせて得られるＩ
ｇＹが好ましい。
【００１３】本発明においては、ＩｇＹを一次抗体とし
て用いる場合には、化学修飾等の改変を何ら加えること
なくそのままの状態で使用できる。
て用いる場合には、化学修飾等の改変を何ら加えること
なくそのままの状態で使用できる。
【００１４】本発明のサンドイッチイムノアッセイで
は、まず上記ＩｇＹを固相に結合させる。固相への結合
は、従来ウサギＩｇＧやヤギＩｇＧに対して用いた場合
と同様にして常法により実施することができる（例え
ば、特公平７−５３７６０号参照）。
は、まず上記ＩｇＹを固相に結合させる。固相への結合
は、従来ウサギＩｇＧやヤギＩｇＧに対して用いた場合
と同様にして常法により実施することができる（例え
ば、特公平７−５３７６０号参照）。
【００１５】使用できる固相は、とくに制限されず公知
のものが使用できる。例えば、マイクロプレート、プラ
スチック試験管、ラテックス、ガラスビーズ、ゼラチ
ン、デキストランゲル、赤血球等が挙げられる。
のものが使用できる。例えば、マイクロプレート、プラ
スチック試験管、ラテックス、ガラスビーズ、ゼラチ
ン、デキストランゲル、赤血球等が挙げられる。
【００１６】サンドイッチを形成する二次抗体には、従
来使用されている動物種の抗体が利用可能である。マウ
ス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等のＩｇＧを何ら標識操作を
することなく、あるいは酵素処理や限定分解を行うこと
なく、サンドイッチイムノアッセイの二次抗体として使
用することができる。二次抗体はポリクローナルであっ
てもモノクローナルであってもよい。このようなＩｇＧ
は当業者に公知の方法によって調製できる。
来使用されている動物種の抗体が利用可能である。マウ
ス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等のＩｇＧを何ら標識操作を
することなく、あるいは酵素処理や限定分解を行うこと
なく、サンドイッチイムノアッセイの二次抗体として使
用することができる。二次抗体はポリクローナルであっ
てもモノクローナルであってもよい。このようなＩｇＧ
は当業者に公知の方法によって調製できる。
【００１７】本発明において、サンドイッチを形成した
二次抗体の量を測定するために使用するのは、免疫グロ
ブリンのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識
部位とを合わせ持つ物質であり、好ましくはポリペプチ
ドである。以後、このポリペプチドを標識ポリペプチド
という。
二次抗体の量を測定するために使用するのは、免疫グロ
ブリンのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識
部位とを合わせ持つ物質であり、好ましくはポリペプチ
ドである。以後、このポリペプチドを標識ポリペプチド
という。
【００１８】免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合能
力はプロテインＡやプロテインＧから得ることができ
る。プロテインＡおよびプロテインＧは、それぞれ黄色
ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびＧ群レン
サ球菌（Streptococcus）の細胞壁タンパク質で、ヒ
ト、マウス、ウサギなどの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
のＦｃフラグメントと特異的に結合する。
力はプロテインＡやプロテインＧから得ることができ
る。プロテインＡおよびプロテインＧは、それぞれ黄色
ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびＧ群レン
サ球菌（Streptococcus）の細胞壁タンパク質で、ヒ
ト、マウス、ウサギなどの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
のＦｃフラグメントと特異的に結合する。
【００１９】また、標識としては放射性同位元素、酵
素、蛍光色素、発光物質等が挙げられる。特に酵素が好
ましい。酵素活性は、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等
から得ることができる。
素、蛍光色素、発光物質等が挙げられる。特に酵素が好
ましい。酵素活性は、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等
から得ることができる。
【００２０】これらの免疫グロブリンのＦｃ領域に対す
る結合能力を有する部位と標識部位とを化学的方法また
は遺伝子組換え操作によって結合させて作製することが
できる。例えば、プロテインＡとアルカリホスファター
ゼをカルボジイミドを用いて結合して標識ポリペプチド
を得ることができる。また、例えば、特開平２−３０８
７９１号は、プロテインＡの免疫グロブリンのＦｃ部分
を結合する領域の一つであるＢ領域をＤＮＡ合成法によ
り合成し、そのＣ末端に発光細菌の１種であるＶｉｂｒ
ｉｏ ｈａｒｖｅｙｉのルシフェラーゼ遺伝子の構造遺
伝子をつなぎ融合したポリペプチドの遺伝子を得、この
遺伝子を大腸菌で発現させて得られるポリペプチドを開
示する。このようなポリペプチドも本発明のサンドイッ
チイムノアッセイで使用することができる。遺伝子組換
え操作によるポリペプチドの作製は、化学的方法に比べ
て損失が少なく好ましい。
る結合能力を有する部位と標識部位とを化学的方法また
は遺伝子組換え操作によって結合させて作製することが
できる。例えば、プロテインＡとアルカリホスファター
ゼをカルボジイミドを用いて結合して標識ポリペプチド
を得ることができる。また、例えば、特開平２−３０８
７９１号は、プロテインＡの免疫グロブリンのＦｃ部分
を結合する領域の一つであるＢ領域をＤＮＡ合成法によ
り合成し、そのＣ末端に発光細菌の１種であるＶｉｂｒ
ｉｏ ｈａｒｖｅｙｉのルシフェラーゼ遺伝子の構造遺
伝子をつなぎ融合したポリペプチドの遺伝子を得、この
遺伝子を大腸菌で発現させて得られるポリペプチドを開
示する。このようなポリペプチドも本発明のサンドイッ
チイムノアッセイで使用することができる。遺伝子組換
え操作によるポリペプチドの作製は、化学的方法に比べ
て損失が少なく好ましい。
【００２１】本発明を実施するには、固相に結合したＩ
ｇＹ、抗原、その抗原に対するＩｇＧ、および標識ポリ
ペプチドを水性媒体中で反応させる。水性媒体のｐＨ
は、従来のサンドイッチイムノアッセイが行われている
範囲のｐＨが使用でき、ｐＨ６〜８が好適である。反応
温度についても同様に従来使用されている範囲で実施す
ることができる。酵素の種類に併せて最適な酵素活性が
得られるｐＨおよび反応温度で実施すればよい。
ｇＹ、抗原、その抗原に対するＩｇＧ、および標識ポリ
ペプチドを水性媒体中で反応させる。水性媒体のｐＨ
は、従来のサンドイッチイムノアッセイが行われている
範囲のｐＨが使用でき、ｐＨ６〜８が好適である。反応
温度についても同様に従来使用されている範囲で実施す
ることができる。酵素の種類に併せて最適な酵素活性が
得られるｐＨおよび反応温度で実施すればよい。
【００２２】また、測定対象とする抗原は特に制限され
ず、各種タンパク質またはウイルス等が挙げられる。原
則として対応する抗体が存在するものであれば測定可能
である。
ず、各種タンパク質またはウイルス等が挙げられる。原
則として対応する抗体が存在するものであれば測定可能
である。
【００２３】標識ポリペプチドは、最初から水性媒体中
に存在させてもよいが、サンドイッチを形成させた後に
加えてもよい。
に存在させてもよいが、サンドイッチを形成させた後に
加えてもよい。
【００２４】反応後、公知手段によって分離（Ｂ／Ｆ分
離）を行う。例えば、界面活性剤などを含む蒸留水や適
当な緩衝液により洗浄して未結合成分を除去した後に、
反応した二次抗体の量を測定する。
離）を行う。例えば、界面活性剤などを含む蒸留水や適
当な緩衝液により洗浄して未結合成分を除去した後に、
反応した二次抗体の量を測定する。
【００２５】測定は標識物質に応じて適当な検出手段を
用いて行うことができる。例えば、標識用酵素として、
アルカリ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼを用いる場合
には、それぞれの酵素基質であるそれぞれ、ＰＮＰまた
は４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）、
２−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド、過酸化水
素と３，３’５，５’−テトラメチルベンチジンの組み
合わせなどを用いて検出できる。これらの酵素基質は、
酵素の作用を受けて変化することにより変色または発色
し、検出されうる。また、酵素としてルシフェラーゼを
用いた場合には、ルシフェラーゼがＡＴＰの存在下でル
シフェリンと反応して光を発する性質を利用して生物発
光法で測定できる。この場合には反応容器として有色の
マイクロプレートを使用し、発光をルミノメーターで測
定することができる。さらに、標識酵素としてアルカリ
ホスファターゼを用い、化学発光基質としてＡＭＰＰＤ
［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジ
オキセタン二ナトリウム塩］を用いる化学発光酵素免疫
測定法も高感度な測定法として好ましい。
用いて行うことができる。例えば、標識用酵素として、
アルカリ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼを用いる場合
には、それぞれの酵素基質であるそれぞれ、ＰＮＰまた
は４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）、
２−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド、過酸化水
素と３，３’５，５’−テトラメチルベンチジンの組み
合わせなどを用いて検出できる。これらの酵素基質は、
酵素の作用を受けて変化することにより変色または発色
し、検出されうる。また、酵素としてルシフェラーゼを
用いた場合には、ルシフェラーゼがＡＴＰの存在下でル
シフェリンと反応して光を発する性質を利用して生物発
光法で測定できる。この場合には反応容器として有色の
マイクロプレートを使用し、発光をルミノメーターで測
定することができる。さらに、標識酵素としてアルカリ
ホスファターゼを用い、化学発光基質としてＡＭＰＰＤ
［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジ
オキセタン二ナトリウム塩］を用いる化学発光酵素免疫
測定法も高感度な測定法として好ましい。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明のサンドイッチイムノアッ
セイにおいては、固相に結合したＩｇＹ（一次抗体）と
抗原とＩｇＧ（二次抗体）とがサンドイッチを形成し、
さらに、二次抗体のＩｇＧのＦｃ領域に、標識ポリペプ
チドのＩｇＧのＦｃ領域と親和性を有する部分が形成す
る。本発明においては、一次抗体としてＩｇＹを使用す
るため、たとえ余剰の標識ポリペプチドが存在していて
も一次抗体に結合することなく高感度のイムノアッセイ
を行うことができる。
セイにおいては、固相に結合したＩｇＹ（一次抗体）と
抗原とＩｇＧ（二次抗体）とがサンドイッチを形成し、
さらに、二次抗体のＩｇＧのＦｃ領域に、標識ポリペプ
チドのＩｇＧのＦｃ領域と親和性を有する部分が形成す
る。本発明においては、一次抗体としてＩｇＹを使用す
るため、たとえ余剰の標識ポリペプチドが存在していて
も一次抗体に結合することなく高感度のイムノアッセイ
を行うことができる。
【００２７】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、これによって本発明を限定するものと解
してはならない。
く説明するが、これによって本発明を限定するものと解
してはならない。
【００２８】
実施例１：ＴＳＨの化学発光イムノアッセイ 測定すべき抗原として甲状腺刺激ホルモンであるＴＳＨ
を用い、アルカリホスファターゼによる化学発光によっ
て測定する本発明のイムノアッセイを行った。
を用い、アルカリホスファターゼによる化学発光によっ
て測定する本発明のイムノアッセイを行った。
【００２９】（１）抗ＴＳＨＩｇＹの作製 ６０日間で４回の免疫を行い、その後１５日間に得た鶏
卵よりＩｇＹを分離した。精製したＩｇＹはＴＳＨを固
定したカラムによってイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーを行い、ＴＳＨ特異的ＩｇＹとした。
卵よりＩｇＹを分離した。精製したＩｇＹはＴＳＨを固
定したカラムによってイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーを行い、ＴＳＨ特異的ＩｇＹとした。
【００３０】（２）抗ＴＳＨＩｇＧ（ヤギ）抗体の調製 抗ＴＳＨヤギ抗体は市販品（Ｓｃｒｒｉｐｓ社製）を用
いた。これはβ鎖特異的抗ＴＳＨヤギモノクローナル抗
体（Ｎｏ．ＧＴ０３９）であり、アフィニティクロマト
グラフィーで精製を行った特異的抗体である。ＩｇＧ濃
度としては１０．１ｍｇ／ｍｌで入荷した。
いた。これはβ鎖特異的抗ＴＳＨヤギモノクローナル抗
体（Ｎｏ．ＧＴ０３９）であり、アフィニティクロマト
グラフィーで精製を行った特異的抗体である。ＩｇＧ濃
度としては１０．１ｍｇ／ｍｌで入荷した。
【００３１】（３）標識ポリペプチドの調製 ファルマシア社製のプロテインＡとベーリンガーマンハ
イム社製のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）をカルボ
ジイミドを用いて結合して標識ポリペプチドを調製し
た。プロテインＡ１ｍｇとＡＬＰ１ｍｇを５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに溶解し、これに水溶性
カルボジイミド（ＥＤＣ）０．０１ｍｇを添加し、４℃
で一晩撹拌し反応させた。反応物をセファクリルＳ−３
００カラム（ファルマシア）に流し、５０ｍＭＴＢＳ
（トリス緩衝液：ｐＨ７．０）で溶出した。溶出した分
画のタンパク質濃度と酵素活性を測定し、高分子側に溶
出されたＡＬＰ活性を有する部分を標識体画分として回
収した。回収した標識体はゼラチンを１ｍｇ／ｍｌ含む
トリス緩衝液で適当に希釈して試験に用いた。
イム社製のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）をカルボ
ジイミドを用いて結合して標識ポリペプチドを調製し
た。プロテインＡ１ｍｇとＡＬＰ１ｍｇを５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに溶解し、これに水溶性
カルボジイミド（ＥＤＣ）０．０１ｍｇを添加し、４℃
で一晩撹拌し反応させた。反応物をセファクリルＳ−３
００カラム（ファルマシア）に流し、５０ｍＭＴＢＳ
（トリス緩衝液：ｐＨ７．０）で溶出した。溶出した分
画のタンパク質濃度と酵素活性を測定し、高分子側に溶
出されたＡＬＰ活性を有する部分を標識体画分として回
収した。回収した標識体はゼラチンを１ｍｇ／ｍｌ含む
トリス緩衝液で適当に希釈して試験に用いた。
【００３２】（４）抗原ＴＳＨ量の測定 黒色マイクロプレート（ラボシステム社製）に抗ＴＳＨ
ＩｇＹを１０μｇ／ｍｌで５０μｌずつ分注し、４℃で
一晩放置した。ゼラチンを１０ｍｇ／ｍｌ含むＴＢＳ
（トリス緩衝溶液）３００μｌを各ウェルに分注しブロ
ッキングを行った。ＴＳＨを０〜１００μＵ／ｍｌ含む
溶液を各ウェルに５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間
反応させた。ウェルを洗浄後、抗ＴＳＨモノクローナル
抗体を１００ｎｇ／ｍｌに希釈して５０μｌ分注し、３
７℃で１時間反応させた。
ＩｇＹを１０μｇ／ｍｌで５０μｌずつ分注し、４℃で
一晩放置した。ゼラチンを１０ｍｇ／ｍｌ含むＴＢＳ
（トリス緩衝溶液）３００μｌを各ウェルに分注しブロ
ッキングを行った。ＴＳＨを０〜１００μＵ／ｍｌ含む
溶液を各ウェルに５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間
反応させた。ウェルを洗浄後、抗ＴＳＨモノクローナル
抗体を１００ｎｇ／ｍｌに希釈して５０μｌ分注し、３
７℃で１時間反応させた。
【００３３】ウェルを洗浄後、プロテインＡ−ＡＬＰ結
合ポリペプチドを各ウェルに５０μｌずつ分注し、３７
℃で１時間反応させた。ウェルを洗浄後、ＡＭＰＰＤ
（ルミジェンＰＰＤ：大日本製薬）を各ウェルに５０μ
ｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた後直ちに発光
量を測定した。発光量の測定にはルミノメーターを用
い、発光量は５秒間の発光量を積算して求めた。
合ポリペプチドを各ウェルに５０μｌずつ分注し、３７
℃で１時間反応させた。ウェルを洗浄後、ＡＭＰＰＤ
（ルミジェンＰＰＤ：大日本製薬）を各ウェルに５０μ
ｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた後直ちに発光
量を測定した。発光量の測定にはルミノメーターを用
い、発光量は５秒間の発光量を積算して求めた。
【００３４】得られたＴＳＨ濃度と発光量の関係を図１
に示す。ＴＳＨの１μＵ／ｍｌが測定可能であり、１０
０μＵ／ｍｌまで良好な検量線が作成できた。
に示す。ＴＳＨの１μＵ／ｍｌが測定可能であり、１０
０μＵ／ｍｌまで良好な検量線が作成できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＳＨ濃度と発光量の関係を示す片対数グラフ
である。
である。
Claims (12)
- 【請求項１】 固相抗体（一次抗体）として鶏卵抗体で
あるＩｇＹを用い、二次抗体としてＩｇＧを用い、Ｉｇ
ＧのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識部位
とを同時に有する物質を用いて、試料中に存在する抗原
の量を測定することを特徴とするサンドイッチイムノア
ッセイ。 - 【請求項２】 前記標識部位が、放射性同位元素、酵
素、蛍光色素、発光物質からなる群から選択される請求
項１記載のサンドイッチイムノアッセイ。 - 【請求項３】 前記標識部位が酵素である請求項１また
は２記載のサンドイッチイムノアッセイ。 - 【請求項４】 前記酵素がルシフェラーゼである請求項
１〜３のいずれかに記載のサンドイッチイムノアッセ
イ。 - 【請求項５】 前記酵素がアルカリフォスファターゼで
ある請求項１〜３のいずれかに記載のサンドイッチイム
ノアッセイ。 - 【請求項６】 前記ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能力
を有する部位がプロテインＡまたはプロテインＧのもの
である請求項１〜５のいずれかに記載のサンドイッチイ
ムノアッセイ。 - 【請求項７】 ＩｇＹからなる固相抗体（一次抗体）、
測定試料中の抗原に対するＩｇＧからなる二次抗体、お
よびＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と
標識部位とを同時に有する物質を含むことを特徴とする
サンドイッチイムノアッセイ用試薬。 - 【請求項８】 前記標識部位が、放射性同位元素、酵
素、蛍光色素、発光物質からなる群から選択される請求
項７記載のサンドイッチイムノアッセイ用試薬。 - 【請求項９】 前記標識部位が酵素である請求項７また
は８記載のサンドイッチイムノアッセイ用試薬。 - 【請求項１０】 前記酵素がルシフェラーゼである請求
項７〜９のいずれかに記載のサンドイッチイムノアッセ
イ用試薬。 - 【請求項１１】 前記酵素がアルカリフォスファターゼ
である請求項７〜９のいずれかに記載のサンドイッチイ
ムノアッセイ用試薬。 - 【請求項１２】 前記ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能
力を有する部位がプロテインＡまたはプロテインＧのも
のである請求項７〜１１のいずれかに記載のサンドイッ
チイムノアッセイ用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32551795A JPH09166595A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | サンドイッチイムノアッセイおよびその試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32551795A JPH09166595A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | サンドイッチイムノアッセイおよびその試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09166595A true JPH09166595A (ja) | 1997-06-24 |
Family
ID=18177767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32551795A Pending JPH09166595A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | サンドイッチイムノアッセイおよびその試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09166595A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014100095A (ja) * | 2012-11-20 | 2014-06-05 | Kyushu Univ | タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法 |
| CN110672844A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-10 | 华中科技大学 | 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 |
-
1995
- 1995-12-14 JP JP32551795A patent/JPH09166595A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014100095A (ja) * | 2012-11-20 | 2014-06-05 | Kyushu Univ | タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法 |
| CN110672844A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-10 | 华中科技大学 | 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 |
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