JPH01312462A - 免疫反応の促進法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は免疫反応の促進法に関するものであり、特に免
疫反応を利用して物質を分析定量するための酵素免疫測
定法、酵素抗体法による組織染色法に応用でき、これら
の手法が繁用される臨床医学、基礎医学、生化学などの
分野で有用である。

〔従来技術〕

免疫反応（抗原抗体反応）は、通常の酵素反応あるいは
一般の化学反応と比較して長時間を要するということは
当該分野では一般的な考え方である。例えば「酵素免疫
測定法」　（石川栄治　他編、医学書院）１４９ページ
記載のα−フェトプロティンの測定においては一次免疫
反応に２時間、二次免疫反応に２時間を要している。−
船釣にはこの場合よりも更に長時間を要するものが多く
、同書の１８５ページ記載のアンピシリンの測定におい
ては一次反応に８時間、続いて二次反応に１２時間、即
ち合計２０時間の反応を行っている。但し、例外として
、同じく同書の１９９ページ記載のサイロキシン測定法
のように１０〜２０分間の反応を行うものもあるが、こ
れは測定対象物の濃度が高いなど特殊な場合であり、免
疫反応を利用した場合の特徴である高感度、特異性を発
揮させるにはやはり時間単位の反応時間が要求される。

このように長時間を要する免疫反応を如何に短縮してゆ
くかに関しては従来より研究がなされ、例えば、デキス
トランあるいはアルキレングリコール及び／又はポリア
ルキレングリコールを反応促進剤に用いる方法（特開昭
６ｌ−７９１６４）がある。しかし、この方法は上記反
応促進剤を高濃度で使用すると粘性が出るという点で、
場合によっては使いづらいこともある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ｌ／−ザー・イムノアッセイ（免疫反応を利用した測定
法の一種）においての［ｇＧ、　Ｉｇ＾、　ＩｇＭの測
定でＥＤＴＡを添加した場合、影響が見られないと報告
されている（臨床病理、３０巻、８号、９２３〜９２５
ページ、　１９８２年）が、本発明者らは酵素で標識し
た免疫反応即ち抗原と抗体の反応の促進法について鋭意
検討した結果、酵素で標識された抗体又は抗原とそれに
対応する抗原又は抗体及び／又は不溶化された抗体又は
抗原との反応において、キレート剤が反応促進効果を有
“することを見い出した。

即ち、本発明は酵素で標識された抗体又は抗原と該抗体
又は抗原に対応する抗原又は抗体及び／又は不溶化され
た抗体又は抗原との反応において、反応液中にキレ−１
・剤を添加することを特徴とする免疫反応の促進法であ
る。

〔問題点を解決するだめの手段及びその作用］本発明が
対象とする免疫反応（抗原抗体反応）とは、免疫反応を
利用して物質を分析定量するために実施されるもので、
しかも、抗原と抗体の反応速度又は反応量を酵素で検出
するものを言う。

即ち、反応に関与する成分は、酵素で標識された抗体（
以下、酵素標識抗体と言う）、酵素で標識された抗原（
以下、酵素標識抗原と言う）、抗原又は抗原修飾物、抗
体又は抗体修飾物、不溶化された抗体又は抗原のうち、
少なくとも酵素標識抗体又は酵素標識抗原を含む２成分
以上から選ばれるものである。このような反応は通常極
微量の物質を分析定量するために実施されるので、各成
分の反応液中の濃度を上げて反応を促進することはでき
ず、又各成分を大量かつ安価に入手することが難しいこ
ともある。更に、酵素、抗体及び抗原はいずれも生物由
来のものが多く、不安定であるため反応は通常０〜４０
°Ｃ１常圧、中性付近のｐｉで実施される。従って通常
の化学反応のように高温、高圧、酸性あるいはアルカリ
性のｐＨで実施することにより反応を促進することは不
可能である。本発明法によれば反応成分を非常に安定な
状態に保ちつつ免疫反応を促進することができる。

本発明に用いられるキレート剤とは、金属イオンと結合
してキレート化合物を形成するものであり、大別して水
溶性化合物を形成するものと難溶性または有機溶媒に抽
出されるキレート化合物を形成するものに分けられる。

本発明に使用には前者に属するものが好適に用いられ、
代表的なものとしてエチレンジアミン四酢酸（以下、Ｅ
ＤＴＡと言う）等のポリアミノカルボン酸類、クエン酸
等のオキシカルボン酸類、縮合リン酸塩等が挙げられる
。特にＥＤＴＡやエチレングリコールビス（β、−アミ
ノエチルエーテル）四酢酸（以下、ＥＧＴＡと言う）が
より好ましい。これらを免疫反応の反応液中に添加する
濃度としてはキレート剤の種類によって異なるが、通常
０．０１ｍＭ〜１０抛門で、より好ましくは０．１ｍＭ
〜ＬＯｍＭの範囲である。又、免疫反応の促進効果は必
ずしも濃度に依存して強くなるのではなく、キレート剤
により特定の濃度で最も効果が強（なることもある。

本発明は酵素で標識された酵素標識抗体又は酵素標識抗
原と該抗体又は抗原に対応する抗原又は抗体及び／又は
不溶化された抗体又は抗原との反応に利用されるが、そ
の抗原には、ペプチド、蛋白質その他の低分子物質が含
まれ、更に具体的には生理活性ペプチド、ホルモン類、
各種腫瘍関連抗原、ビタミン類、抗生物質等の薬剤など
が含まれる。又、抗体としては、上記抗原を動物に免疫
して得られるものであり、通常抗血清あるいは精製した
イムノグロブリンの形で使用される。又、イムノグロブ
リンから抗原結合部位のみを分離したもの、例えばＦ（
ａｂ’）ｚフラグメント、　Ｆａｂ’フラグメントとし
て使用されることもある。更に用途によっては抗体を化
学的に修飾して用いることもある。

酵素標識抗体又は酵素標識抗原は上記抗体又は抗原と酵
素とを化学的に結合させたものであり、酵素としてはペ
ルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが用いられる
。不溶化された抗体又は抗原とは、ポリスチレン球、ガ
ラス球、多糖ゲル等の各種不溶性担体に上記抗体又は抗
原を物理的あるいは化学的に結合させたものである。更
に、本発明において利用できるのは、免疫組織染色にお
いて調製される画定化された生体組織切片、あるいは免
疫電気泳動において得られる泳動ゲルなども含まれる。

上記のような成分を反応させる際に、反応液中にキレー
ト剤を添加することにより免疫反応を１．２倍あるいは
それ以上に促進することができる。

従って、本発明により、従来の測定条件（温度、ｐＨ）
において、一定時間当りの反応生成物の量を多くしたり
、一定量の反応生成物を短時間で得ることができる。本
発明の具体的な応用範囲としては、例えば固相法酵素免
疫測定法、酵素抗体法による免疫Ｍｉ織染色、免疫電気
泳動、ホモジニアス酵素免疫測定法などがあるが、酵素
を用いた免疫反応を利用する分野では全て応用が可能で
ある。

以下、試験例及び実施例によって本発明法を説明する。

ｍ　　　酵素標識サイロキシンの抗体不溶化ポリスチレ
ンビーズへの結合 ペルオキシダーゼにＳ−アセチルカプト無水コハク酸に
てＳＨ基を導入し、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉ
ｎ、　Ｃｈｅｍ、）、　２７巻、　１７２１ページ、　
１９８１年に従いサイロキシンと結合させた（以下、酵
素標識サイロキシンと言う）。一方、抗サイロキシン血
清より精製したサイロキシン抗体の溶液にポリスチレン
ビーズ（径６．５ｍｍ）を入れ、４°Ｃで一装置くこと
により該ビーズにサイロキシン抗体を不溶化させた（以
下、抗体不溶化ポリスチレンビーズと言う）。

上記酵素標識サイロキシンを０．５％牛血清アルブミン
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で希釈し、この
試液０．４ｄ、及び同じ液に１ｍＭ又は５ｍＭのＥＤＴ
Ａを加えた試液０．４ｄに、上記抗体不溶化ポリスチレ
ンビーズ１個を入れ、３７℃で３０分間反応させた。ビ
ーズを水洗後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５）に０
．４■／　ｍｌのオルトフェニレンジアミンと０．００
５χＨ２０，を加えた基質溶液０．５ｄを加え、室温で
３０分間酵素反応を行い、２Ｎ１１□ＳＯ。

２　ｍｌを加えて反応を停止した。反応停止液の４９７
ｎｎ＋の吸光度を測定したところ第１表の結果が得られ
た。第１表より明らかなように、ＥＤＴＡの添加により
酵素標識サイロキシンの結合量が増加した。

第　　１　　表 実施例１　酵素免疫測定法によるサイロキシンの測定 Ｑ、　１．２５．２．５．５．０．１２．５．２５．Ｏ
Ｉ１ｇ／ａのサイロキシンを含むヒト血清をクリニカル
・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｌｌｌ、）＋　２
７巻、　１７２１ページ、　１９８１年に従って調製し
、この０．０５ｄにｍで用いた酵素標識サイロキシンの
希釈液０．４ｍｌ！及び同じく拭朋で用いた抗体不溶化
ポリスチレンビーズ１個を加え、３７°Ｃで３０分間反
応させた。なお酵素標識サイロキシンの希釈には、２■
／ｄの８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸及び０
．５％の牛血清アルブミン、０．５％のゼラチンを含む
０．１Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７）を用い、この際１ｍ
ＨのＥＤＴＡを添加しないものと添加したものについて
検量線を比較した。酵素反応は弐Ｗ桝に準じた。検量線
を第１図に示す。ＥＤＴＡ無添加ではＥＤＴＡ添加の条
件と比較してビーズに結合する酵素標識サイロキシン量
が少なく全体の吸光度差も小さい。

それに対してＥＤＴＡ添加では充分な吸光度が得られ、
実際の測定に応用が可能である。

１１桝又　酵素免疫測定法によるフェリチンの測定（Ｅ
ＤＴＡ添加と無添加の比較） ジャーナル・オプ・アプライド・バイオケミストリー（
Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｏ＋、）、　　４巻、　４
１ページ。

１９８２年に従いフェリチンの測定を行った。酵素標識
フェリチン抗体は上記の同文献に記載のマレイミド法に
よって調製した。反応液に５ｍＭ　　ＥＤＴＡを添加し
た場合と添加しない場合について検量線を比較した。酵
素反応は実施例１に準じて行った。フェリチンＯｐｇ／
１ｕｂｅ及び５００ｐｇ　／　ｔｕｂｅの反応結果、酵
素反応が３０分の場合で４９２ｎｍの吸光度差は、ＥＤ
ＴＡ添加で１．０５．ＥＤＴＡ無添加で０．７２１であ
った。又最少測定感度は、ＥＤＴＡ添加で５　ｐｇ／　
ｔｕｂｅ、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ無添加で９　ｐｇ／　ｔｕ
ｂｅとＥＤＴＡ添加の方が吸光度差、測定感度ともに良
好であった。

尖旌適３　　酵素免疫測定法によるα−フエ）プロティ
ンの測定（ＥＧＴＡ添加と無添加 の比較） ＥｐＴＡの代わりにＥＧＴＡを用いて、実施例量と同様
に操作した結果、Ｏｐｇ／１ｕｔ）６及−び５００ｐｇ
／１ｕｂｅの反応結果、酵素反応が３０分の場合で４９
２ｎｍの吸光度差は、ＥＧＴＡ添加で１．１２．　　Ｅ
ＧＴＡ無添加で０．７４６であった。又最少測定感度は
、ＥＧＴＡ添加で４　ｐｇ／　ｔｕｂｅ、　Ｅ　Ｇ　Ｔ
　Ａ無添加で１３ｐｇ／１ｕｂｅとＥＤＴＡ添加の方が
吸光度差、測定感度ともに良好であった。

実施例４　酵素抗体法による組織染色法の比較（ＥＤＴ
Ａ添加と無添加の比較） （改訂版酵素抗体法（渡辺慶−１中根−穂編。

学際企画）〕に従って肝癌組織切片のα−フェトプロテ
ィン（ＡＦＰ）を染色した。肝凍結切片をスライドグラ
ス上で風乾後、第一抗体（抗ＡＦＰモノクローナル抗体
）と４時間反応させた。次いでパーオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＧ抗体を４時間反応させて、３，３゛−ジア
ミノベンジジンと１１□０□を基質として発色し、ＡＦ
Ｐの分布を光学顕微鏡にて観察した。次にパーオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の溶液に５ｍＭＥＤＴＡを
添加して同じ操作を行った。その結果、パーオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体との反応を２時間に短縮して
も上記と同様の染色像が得られた。

〔発明の効果］ 以上の様に本発明によれば、免疫反応が促進され、一定
時間の反応では免疫反応の生成物量が増加し、又、一定
量の反応生成物を得るための反応時間を短縮することが
できる。従って、免疫反応を利用した種々の分析測定に
おいて反応時間即ち測定操作に要する時間を短縮できる
とともに、検出感度の向上が図られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、尖旌桝土におけるサイロキシンの検量線を示
したもので、−・−はＥＤＴＡ添加、−〇−はＥＤＴＡ
無添加の場合である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素で標識した抗原または抗体を用いる免疫反応
   において、反応溶液中にキレート剤を添加することを特
   徴とする免疫反応の促進法。