KR101158271B1 - 프로브 복합체 - Google Patents

Abstract

과제: 본 발명의 목적은 고감도의 면역측정법에 사용될 수 있는 고기능이고 또 가용성의 감도가 높은 프로브 복합체를 제공하는 것이다.

해결수단: 담체에 친수성 매개 물질을 결합시켜 그 매개 물질에 항체 및 비오틴, 하프텐, 방사성 동위체 또는 저분자량의 펩티드 등의 검출마커를 결합시키는 것에 의해 고감도의 프로브 복합체를 제조할 수 있다. 또한 담체에 친수성의 매개물질을 결합시키는 것에 의해 많은 하프텐 분자를 결합시키고, 또 프로브 복합체 전체로서 친수성으로 되기 때문에 비특이적인 반응을 유발하지 않고 고기능인 프로브 복합체를 얻을 수 있다.

면역측정법, 프로브 복합체, 가용성, 고감도, 담체, 친수성 매개물질, 하프텐, 검출마커

Description

프로브 복합체{Probe complex}

본 발명은 담체에 매개물질을 통하여 프로브 및 하프텐 또는 저분자 펩티드 등의 검출마커가 결합된 프로브 복합체 제조 기술에 관한 것이고, 제조된 프로브 복합체는 효소면역측정법이나 면역조직화학 등의 면역반응을 이용하는 면역측정에 널리 사용될 수 있다.

면역조직화학법이나 면역측정법은 항원과 항체의 면역반응을 이용하여 생체내의 자기 항원 또는 외래 항원을 검출하는 방법으로 이용되고 있다. 이들 방법은 특이성과 감도가 높기 때문에 생체내에 존재하는 미량의 물질을 분리함없이 검출할 수 있다.

면역조직화학법은 항원과 항체의 특이적인 반응을 이용하여 목적으로 하는 항원의 세포 내의 국재(localization) 또는 조직내에서의 국재를 검출하는 수법이다. 일반적으로 널리 사용되고 있는 ABC법에 의한 면역조직화학법은 다음과 같은 공정으로 실시한다. 동결조직이나 파라핀 고정된 조직으로부터 조직 절편을 제조한다. 이어 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 소 혈청 알부민 등으로 블록킹을 실시한다. 여기에 목적하는 항원에 결합되는 항체와 비오틴을 결합시킨 비오틴화 항체를 반응시켜 항원과 비오틴화 항체의 면역결합체가 형성된다. 이 면역복합체에 서양꽃양배추 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소가 결합된 애비딘을 첨가하여 비오틴-애비딘 효소 복합체를 형성시켜 효소의 발색기질이나 발광 기질에 의해 목적으로 하는 항원을 검출한다. 애비딘에 플루오레세인 등의 형광물질이나 아크리디늄 에스테르 등의 발광물질을 도입하여 목적하는 항원을 검출할 수 있다.

또한 혈청 등의 생체 시료 중의 항원을 검출하는 면역측정법은 다음과 같은 공정으로 실시한다. 먼저 마이크로플레이트 등의 담체에, 측정할 항원과 결합할 포착 항체를 고상화한다. 그후 항체나 담체에 비특이적인 흡착을 방지하기 위하여 소 혈청 알부민 등으로 블로킹을 실시한다. 여기에 측정할 항원이 포함되는 시료를 가하고 포착 항체와 목적으로 하는 항원을 결합시킨다. 또한 항원을 인식하는 항체 등의 프로브와 비오틴 등의 하프텐이 결합된 프로브 복합체를 첨가하고, 포착된 항원과 프로브 복합체를 결합시킨다. 이것에 의해 포착 항체-항원-프로브 복합체의 면역 복합체가 마이크로플레이트 등의 담체 상에 형성된다. 이 면역복합체의 비오틴과 HRP 표식 애비딘을 결합시켜 HRP의 발색 기질이나 발광 기질을 가하여 목적으로 하는 항원을 측정한다.

상기와 같은 면역조직화학법이나 면역측정법으로는 항체 등의 프로브와 비오틴이 결합된 프로브 복합체가 사용되고 있다. (예컨대 비특허문헌 1 참조) 이 비오틴 대신 디니트로페닐 (DNP), 디곡시게닌(DIG), FITC 등의 하프텐을 항체와 결합시켜 프로브 복합체로 하고 이들 하프텐을 인식하는 항체에 효소를 결합시켜 검출하는 방법도 개발되어 있다.

효소를 사용하지 않고 비오틴 대신 플루오레세인 등의 형광 기질이나 아크리 디늄 에스테르 등의 발광 기질과 항체를 결합시켜 프로브 복합체로 하고 형광이나 발광에 의해 검출하는 면역측정법도 개발되어 있다.

이들 면역조직화학법이나 면역측정법은 감도와 특이성이 높은 검출법이지만 생체내에는 통상의 방법으로는 검출하는 것이 곤란한 미량물질도 다수 존재한다. 예컨대 인간 가스트린 방출 펩티드 전구체(proGRP)의 정상인의 혈청 농도는 14 pg/ml 정도이고, 암태아성 항원(CEA)이나 α-페토프로테인의 정상인 혈청중 농도인 5~20 ng/ml와 비교하면 1000배 정도의 감도가 필요하다. 또한 외래항원인 C형 간염 바이러스(HCV)는 혈중에 존재하는 바이러스 양이 매우 적기 때문에 100-1000 카피의 바이러스 RNA를 검출하는 감도가 필요하며 단백질의 농도로는 약 0.03 내지 0.3 pg/ml의 항원을 검출하는 감도가 필요하다.

생체내의 미량 물질을 검출하기 위하여 면역조직화학법이나 면역측정법의 감도를 상승시키기 위한 개량이 행하여져 오고 있다. 면역조직화학법이나 면역측정법의 감도 상승을 위해서는 다양한 요소가 관여되어 있으나 상기 항원과 결합하는 항체 등의 프로브와 비오틴 등이 결합된 프로브 복합체의 기능을 개량하는 것도 1개의 요소이다. 예컨대 1분자의 항체에 결합시키는 비오틴의 분자수를 증가시키는 것에 의해 그 비오틴에 결합되는 애비딘, 애비딘에 결합된 효소 등의 분자수가 증가되어 발색이나 발광 시그널이 상승하여 감도가 상승한다.

그러나 종래의 항체 등의 프로브와 비오틴이나 하프텐 등이 결합된 프로브 복합체는 항체에 직접 하프텐을 결합시키는 것이다. 예컨대 항체에 비오틴을 결합시키는 1개의 방법은 항체의 아미노기와 비오틴에 도입된 NHS 에스테르를 반응시켜 공유결합에 의해 제작하는 것이다. 이 경우 반응 조건의 검토에 의해 1분자의 항체에 결합되는 비오틴의 분자수를 증가시킬 수 있다. 그러나 항체의 아미노기의 수는 제한되어 있고 결합되는 비오틴의 분자수도 한계가 있다. 또한 항체의 항원결정기근방의 아미노기에 비오틴이 결합된 경우는 역으로 입체장애 등에 의해 항체와 항원의 결합을 저해하는 것도 고려할 수 있다.

또한 결합시키는 하프텐이 소수성 물질인 경우는 항체에 다수의 소수성 하프텐이 결합되면 프로브 복합체 전체로서의 소수성이 강해진다. 면역조직화학법이나 면역측정법에서 프로브 복합체의 소수성이 강하면 조직이나 플레이트으로의 소수 결합에 의한 비특이적 결합이 생겨 백라이트의 상승에 관련되어 충분한 감도를 얻을 수 없게 된다.

비특허문헌1: Harlow, E. 및 Lane, D. 저 "Antibodies: A LABORATORY MANUAL" (미국), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988년, p.340-341.

발명의 개시

발명이 해결하고자하는 과제

따라서, 본 발명의 목적은 고감도의 면역측정법에 사용될 수 있는 고기능 프로브 복합체를 제공하는 것이고, 또 가용성의 감도가 높은 프로브 복합체를 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본원 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 담체에 친수성 매개 물질(carrier)을 결합시키고, 그 매개 물질에 항체 및 비오틴, 하프텐, 방사성 동위체 또는 저분자량의 펩티드 등의 검출마커를 결합시키는 것에 의해 고감도의 프로브 복합체를 제조할 수 있는 것을 발견하고 본원발명을 완성하기에 이르렀다. 담체에 친수성의 매개 물질을 결합시키는 것에 의해 많은 전술한 검출마커를 결합시키고 또 프로브 복합체 전체로서 친수성이 증가되기 때문에 비특이적 반응을 유발하기 어렵고, 고기능의 프로브 복합체를 완성시켰다.

발명의 효과

본 발명의 프로브 복합체는 생체내에 존재하는 항원, 단백질을 검출하기 위하여 프로브 복합체를 개량한 것이다. 이 프로브 복합체를 사용하는 것에 의해 종래 측정 불가능하였던 항원이나 단백질이 면역조직화학법이나 면역측정법에 의해 측정가능하게 된다.

또한 매개 물질이 친수성이기 때문에 하프텐, 비오틴, 방사성동위체, 저분자량 펩티드 등의 검출마커가 소수성이어도 프로브 복합체의 친수성이 증가되어 전체로서 소수성이 약해진다. 이 때문에 면역반응에서 소수결합에 의한 비특이반응을 경감시키는 효과도 기대할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 담체에 매개 물질로서 친수성 물질을 결합시키고 또 친수성의 물질에 프로브와 비오틴, 하프텐, 방사성동위체, 저분자량 펩티드, 렉틴 등의 검출마커를 직접 결합시키는 것이다. 이 검출마커는 본원발명의 프로브 복합체를 면역반응에 이용하기 위한 표식물이다.

본 발명에서 말하는 담체라는 것은 분자량 20,000 내지 4,000,000의 것이면 특별한 제한은 없다. 그러나 감도를 보다 향상시키기 위해서는 다수의 담체 등의 프로브나 하프텐 등이 결합될 수 있도록 어느 정도 이상의 분자량을 가진 것이 바람직하다. 담체의 예로서는 다당류나 고분자량 단백질이나 펩티드 폴리머를 들 수 있고, 이들의 분자량이 20,000 내지 20,000,000, 바람직하게는 20,000 내지 4,000,000, 더욱 바람직하게는 70,000 내지 2,000,000의 것이 적합하다. 또한 다당류나 펩티드 폴리머를 사용하는 경우, 동일 분자량이어도 측쇄가 풍부한 편이 보다 많은 매개물질을 결합시킬 수 있다.

본 발명에서 다당류 담체로서는 덱스트란, 아미노덱스트란, 피콜(ficoll), 덱스트린, 아가로오스, 각종 셀룰로오스, 키틴, 수용성 키토산, 수용성 전분 등을 예시할 수 있다. 또한 본 발명에서 고분자량 단백질 담체로서는 β-갈락토시다제, 티로글로불린, 헤모시아닌 등을 예시할 수 있다. 또한 본 발명에서 펩티드 폴리머의 담체로서는 폴리리진 이외에 각종 펩티드 폴리머가 사용될 수 있다.

본 발명에서 말하는 매개물질로서는 수용성의 분자량 2000 이상인 물질이면 여러가지 것을 사용할 수 있다. 예컨대 소 혈청 알부민, 인간 혈청알부민, 트랜스페린, 리보누클레아제, 카제인, 헤모글로빈, 오보알부민, 애비딘 등의 단백질이나 수용성 키토산 등을 들 수 있다. 또한 폴리리진과 같은 펩티드 폴리머도 이용가능하다.

프로브로서는 항체(모노클로날 항체, 폴리클로날 항체) 및 그의 단편(F(ab')2, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' 등), 각종 리셉터 등으로 측정하려고하는 물질에 결합하는 단백질이면 좋다. 또한 각종 애비딘(애비딘 D, 스트렙토애비딘 등), 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 각종 렉틴(콘카나발린 A, 랜틸 렉틴, 강남콩(Phaseolus Vulgaris) 렉틴 등), 각 피분석 핵산결합 프로브 등도 사용될 수 있다.

항체는 목적으로 하는 항원 또는 피분석물과 결합하는 것이면 좋다. 항체는 펩신이나 파파인 등의 프로테아제를 사용하여 F(ab')2 나 Fab의 단편을 얻을 수 있다. 일반적으로 항체의 중쇄(H쇄)는 S-S 결합에 의해 중쇄끼리 결합되어 있고, 그 결합은 환원제에 의해 절단된다. 환원제로서는 시스테아민이나 메르캅토에탄올 등을 들 수 있고, F(ab')2도 그와 같은 환원제로 Fab'로 절단되어 티올(SH)기가 새로 생긴다. 본 발명에는 항체의 이들 단편(F(ab')2, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' 등)도 사용될 수 있다.

본 발명의 매개물질로는 검출마커로서 하프텐이나 저분자량의 펩티드, 렉틴 등의 면역반응의 시그널의 검출에 이용될 수 있는 물질을 결합시킬 수 있다. 검출마커는 프로브 복합체를 면역측정에 이용하기 위한 표식물이다. 이와 같은 검출마커로서는 렉틴 또는 하프텐을 들 수 있다. 하프텐에는 디니트로페닐(DNP), 디곡시게닌(DIG), FITC 등이 포함된다. 예컨대 비오틴을 프로브 복합체에 결합시킨 경우, 비오틴에 친화성이 있는 애비딘에 HRP와 같은 효소, 플루오레세인과 같은 형광물질 또는 아크리디늄 에스테르와 같은 발광물질을 표식하고 프로브 복합체와 반응시켜 발색, 형광, 발광 등에 의해 시그널을 검출할 수 있다.

또한 하프텐으로서 플루오레세인?이소티오시아네이트(FITC)나 아크리니디늄 에스테르 등의 형광물질이나 발광물질을 직접 매개물질에 결합시킬 수 있다. 이 경우도 형광이나 발광으로 시그널을 검출할 수 있다.

또한 방사성 동위체를 직접 매개물질에 결합시키거나 방사성 동위체로 라벨링된 하프텐을 매개물질에 결합시킬 수 있으며, 이 경우 그 방사활성으로 시그널을 검출할 수 있다.

또한 하프텐으로서 DIG나 DNP를 결합시킬 수 있다. 이들 경우는 DIG나 DNP에 결합되는 항체를 효소, 형광물질, 발광물질 등으로 표식시킨 것을 반응시켜 시그널로서 검출한다. 이 경우는 하프텐에 대한 항체를 얻을 수 있으면 어떤 물질이어도 면역측정계의 검출마커로서 사용가능하다.

검출마커로서는 하프텐 이외에 저분자량의 펩티드 등도 사용가능하다. 프로브 복합체의 매개물질에 저분자량의 펩티드를 결합시키고, 이 펩티드에 대한 항체에 효소, 형광물질, 발광물질을 표식하여 시그널을 검출할 수 있다. 이들 펩티드는 당쇄나 지질을 포함하고 있는 것이어도 상관없다.

검출마커에 대한 항체를 사용하여 면역반응의 시그널을 검출하는 경우는 검출마커는 항체를 얻을 수 있는 항원성이 있는 물질이고, 매개물질과 결합될 수 있는 것이라면 하프텐이나 저분자량 펩티드 이외의 물질도 이용가능하다.

또한 발광, 발색 효소의 기질도 매개물질에 결합시켜 검출마커로서 이용할 수 있다. 기질에 대한 효소를 반응시키는 것에 의해 시그널을 검출할 수 있기 때문이다.

본원발명의 프로브 복합체에 결합시키는 검출마커는 분자량 1만 이하의 것이 바람직하다. 고분자량의 것은 매개 물질에 결합될 수 있는 분자수가 제한되어 면역측정법의 감도 상승에 기여할 수 없는 것으로 생각되기 때문이다.

또한 각종 렉틴(콘카나발린 A, 렌틸 렉틴, 강남콩 렉틴 등) 등도 검출마커로서 이용가능하다.

이하에 비제한적으로 프로브 복합체의 제조방법을 개설한다.

본원발명은 먼저 담체와 매개물질이 결합된 복합체를 제조한다. 예컨대 담체로서 당쇄를 갖는 덱스트란이나 피콜 등과 매개물질로서 BSA나 카제인 등의 단백질을 결합시키는 경우, 먼저 덱스트란이나 피콜에 과요오드산나트륨을 반응시키는 것에 의해 알데히드기가 생성된다. 이 알데히드기와 BSA 등의 단백질의 아미노기가 반응하여 담체와 매개물질의 복합체가 형성된다.

이 복합체는 담체 단독의 것에 비하여 친수성이 증대되어 있고 또 프로브 및 하프텐 등의 결합될 수 있는 영역도 증가하고 있다.

다음에 매개물질에 프로브와 검출마커로서 하프텐을 결합시킨다. 프로브와 하프텐의 결합량을 콘트롤하기 위하여 각각의 결합에 사용되는 관능기는 상이한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대 매개물질 BSA에 하프텐으로서 비오틴을 프로브로서 Fab'를 결합시키는 경우는 다음과 같은 방법이 고려된다.

BSA의 아미노기에는 비오틴에 NHS (N-hydroxysuccinimide) 에스테르를 도입한 Sulfo-NHS-LC-Biotin의 NHS 에스테르를 결합시킨다. 한편, Fab'와 BSA를 결합시키기 위하여 BSA에 링커를 도입한다. BSA 내부의 S-S 결합을 시스테아민 염산 및 DTT 등으로 환원하고, 티올기를 생성시킨다. 이 티올기에 링커로서 1,2-비스말레이미드 등을 반응시켜 말레이미드기를 도입한다. 이 말레이미드 기와 항체의 Fab의 티올기를 반응시켜 담체, 매개물질, 검출마커, 프로브의 프로브 복합체를 제조할 수 있다.

검출마커로서는 각종 하프텐, 방사성 동위체나 펩티드 등이 있다. 펩티드를 매개물질에 결합시키는 경우, 예컨대 펩티드의 말단에 시스테인을 도입하고 이 티올기와 매개물질의 BSA 등의 아미노기를 이용하여 결합시킬 수 있다. 또한 링커를 사용하여 매개물질에 숙신이미딜 기 등을 도입하고 펩티드의 아미노기와 반응시킬 수 있다.

상기 담체와 매개 물질의 결합, 매개물질과 검출마커의 결합 및 매개물질과 프로브의 결합에는 공유결합이 이용될 수 있다. 공유결합에는 다양한 관능기를 이용할 수 있다. 예컨대 알데히드기와 아미노기, 히드라진 기와 알데히드기, 말레이미드기와 티올기, 숙신이미딜 기와 아미노 기, 비닐기와 히드록시기, 비닐기와 티올기의 공유결합 등이 있지만, 이들의 관능기의 결합에 한정되는 것은 아니다. 또한 담체, 매개물질, 검출마커, 프로브에 결합시키기 위한 적합한 관능기가 존재하지 않는 경우는 관능기를 갖는 링커 분자를 도입하는 것에 의해 결합시킬 수 있다.

링커는 2종 이상의 관능기를 갖고 있는 것이면 좋으나, 2종 이상의 관능기는 상이한 관능기이어도 좋고 동일 관능기이어도 상관없다.

제조한 담체, 매개물질, 프로브 및 검출마커로서 하프텐 또는 저분자량의 펩티드의 프로브 복합체는 면역조직화학이나 면역측정법 등의 면역반응에 이용될 수 있다. 예컨대 비오틴을 사용한 경우는 목적하는 항원과 프로브 복합체를 결합시킨 후 애비딘-HRP를 반응시키고 발색 기질 또는 발광 기질 등을 가하여 검출 글루코오스 옥시다제, 루시페라제 등의 효소가 결합된 애비딘을 이용하여 검출할 수 있다.

또한 아크리디늄 에스테르나 그의 유도체를 프로브 복합체로 결합시킬 수 있다. 아크리디늄 에스테르는 NHS 에스테르를 갖고 있기 때문에 BSA 등의 아미노 기와 반응하여 결합된다. 아크리디늄 에스테르는 화학발광 면역측정법에 이용가능하고, 고감도의 측정계로서 이용될 수 있다.

또한 검출마커로서 DNP, DIG, FITC 등을 사용한 경우나 저분자량의 펩티드는 공유결합으로 매개물질에 결합시킬 수 있다. 그리고 이들 물질에 특이적으로 결합하는 항체에 HRP 등의 효소를 결합시켜 발색이나 발광으로 검출하는 것도 가능하다.

본 발명을 또한 상세하고 비한정적으로 설명하기 위하여 이하에 효소 프로브 복합체의 제조방법 및 이들의 성능에 관하여 실시예를 든다.

도 1은 본 발명의 프로브 복합체의 모식도이다.

실시예 1

담체로서 Ficoll400을 사용한 비오틴-항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 제조

Ficoll400 (Amersham Bioscienses) 44 mg을 측량하고 0.1M 인산 완충액(pH 7.0) 0.8 ml에 용해시키고 과요오드산나트륨 용액을 0.4 ml 첨가 혼합하였다. 실온에서 2시간 반응시킨 후 여과 (Sephadex G25, Amersham Biosceinses)에 의해 과잉의 과요오드산 나트륨을 제거하고 Bovine Serum Albumin (BSA) 용액을 첨가하여 실온에서 3시간 반응시키고 Ficoll에 BSA를 도입하였다. 반응 산물의 안정화를 위하여 Dimethylamine Borate (DMAB: 생화학공업주식회사)를 첨가 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 Ficoll 상의 미반응 알데히드 기를 블록하기 위하여 Tris 용액을 첨가하였다. 실온에서 하루밤 반응시킨 후 여과(SephacrylS300, 1.6^* 30)에 의해 반응산물을 정제하고, 280 nm의 흡광도를 측정하여 담체 BSA 결합물의 농도를 산출하였다. 이 담체 BSA 결합물 1 mg을 시스테아민 염산염으로 환원시키고, 여과(SephadexG25, Aemrsham Bioscienses)에 의해 과잉의 시스테아민 염산염을 제거하고 Dimethyofolmamide에 용해시킨 1,2-bismaleimide 및 Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce #21335) 수용액을 첨가 혼합하고 실온에서 1.5 시간 반응시켜 담체 BSA 결합물에 말레이미드 기 및 비오틴을 도입하였다. 과잉의 1,2-bismaleimide와 Sulfo-NHS-LC-Biotin은 겔여과 (SephaedexG25, Amersham Bioscienses)에 의해 제거하였다. 0.1M 인산 완충액(pH 6.0) 중의 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체의 F(ab)'2 용액 (C11-14F(ab)'2와 C11-9F(ab)'2를 등량 혼합)에 0.15M 시스테아민 염산염을 1/10 용액 첨가하고 37℃에서 1.5시간 배양을 실시하고 겔여과(SephadexG25, Amersham Bioscienses)에 의해 과잉의 시스테아민 염산염을 제거하고 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드 및 비오틴을 도입한 담체 BSA 결합물을 혼합하고 4℃에서 하루밤 반응시킨 후 겔여과(Sephacryl S300, 1.6x30)를 행하고 유리 Fab'를 제거하였다. 이 때 본 발명의 담체 BSA-Fab' 복합체는 수십만 이상의 분자량인 것으로 추측된다. 이와 같이 하여 제조된 담체 BSA-Fab' 복합체의 280 nm의 흡광도를 측정하고 항체의 흡광도로 간주하여 농도를 산출하였다.

실시예 2

기존의 방법을 사용한 비오틴화 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체의 제조

Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce #21335)의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라 실시하였다. PBS 중의 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체(C11-14 IgG과 C11-9 IgG를 등량 혼합)에 Sulfo-NHS-LC-Biotin을 혼합하고, 실온에서 1시간 반응시킨 후 과잉의 Sulfo-NHS-LC-Biotin을 겔여과(SephadexG25, Amersham Bioscienses)에 의해 제거하였다. 제조한 비오틴화 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체의 280 nm의 흡광도를 측정하고 항체 농도를 산출하였다.

실시예 3

실시예 1에서 제조한 비오틴-항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체와 실시예 2에서 기존의 방법으로 제조한 비오틴화 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체의 비교

항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체를 0.1M 아세트산 0.1M 인산 완충액(pH 4.8)으로 4㎍/ml로 조정하고 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 250㎕ 씩 가하여 4℃에서 하루밤 배양하였다. PBS로 세정한 후 0.5% 카제인을 각 웰에 350 ㎕ 씩 가 하고 실온에서 3시간 배양을 실시하였다. 재조합체 HCV 코어 항원(Cl1)을 0fmol/L, 148fmol/L, 444fmol/L, 1333fmol/L, 4000fmol/L, 12000fmol/L, 36000fmol/L의 농도로 제조한 것을 샘플로 하여 첨가하고 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양을 실시하였다. 0.05% Tween20을 포함하는 10 mM 인산 완충액 pH 7.3(세정액)으로 6회 세정한 후 2차 항체로서 실시예 1에서 제조한 비오틴-항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체 및 실시예 2에서 기존의 방법으로 제조한 비오틴화 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 희석하여 200 ㎕ 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세정액으로 6회 세정하고 HRP 결합 애비딘을 5000배 희석액 200μ를 가하여 실온에서 30분간 배양을 실시하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고 기질 용액(오르토페닐렌디아민 과산화수소 혼합액)을 200㎕ 가하고 실온에서 30분간 배양을 실시하며 5N 황산을 200 ㎕ 씩 부가하여 실온에서 배양을 실시하고, 5N 황산을 50㎕ 씩 가하여 반응을 정지시켰다. 492 nm의 흡광도(레퍼런스 파장 600 nm)를 마이크로플레이트 리더(MPRA4i, TOSOH)로 측정하였다. 각 농도의 조합체 HCV 코어 항원(c11)을 가하여 웰의 흡광도로부터 0 fmol/L의 흡광도의 값을 뺀 값을 표 1에 나타내었다.

표 1

표 1로부터 기존방법에 의해 비오틴화된 항체를 사용한 경우, 444 fmol/L의 코어 항원량에서는 0fmol/L과의 차를 확인할 수 없지만, 실시예 1에서 제조한 본 발명에 의한 비오틴-항체 복합체를 사용하는 것에 의해 444 fmol/L 및 3배 희석된 148 fmol/L의 코어 항원량을 충분히 검출할 수 있는 것은 명확하였다. 또한 흡광도를 비교하면 1333 fmol/L에서 약 5배, 444 fmol/L에서 약 6배 정도 본 발명의 비오틴-항체 복합체가 기존의 방법보다도 높은 값을 나타내었다.

Claims (7)

1. 분자량 20,000 내지 4,000,000의 수용성 담체에 친수성의 분자량 2,000 이상의 매개물질이 결합되고, 매개물질에 프로브 및 2개 이상의 검출마커가 결합된 프로브 복합체.
2. 분자량 20,000 내지 4,000,000의 수용성 담체에 친수성의 분자량 2,000 이상의 매개물질이 결합되고, 매개물질에 프로브 및 2개 이상의 분자량 10,000 이하의 검출마커가 결합된 프로브 복합체.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 검출마커가 비오틴인 프로브 복합체.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 검출마커가 하프텐인 프로브 복합체.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 검출마커가 형광물질 또는 발광물질인 프로브 복합체.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 검출마커가 방사성 동위체를 갖는 것인 프로브 복합체.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 검출마커가 항체와의 결합능을 갖는 물질인 프로브 복합체.

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