JP2011257410A - アッセイコンジュゲート及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記コンジュゲートは、異分子間性担体、少なくとも10個の標識基、分析物特異的結合対成員(例えば、それぞれ対象とする抗原又は抗体と複合体を形成する抗体又は抗原)ならびにアクリジニウム含有化合物を分析物特異的結合対成員に間接的に結合する異分子間リンカーを含む。
【選択図】図1
Description
例えば、米国特許第4,228,237号は、アビジンで標識した酵素も同時に使用する方法における、リガンドのためのビオチン標識特異的結合物質の使用を述べている。さらに、ビオチン−抗ビオチン系の使用が国際公開広報第WO92/08979号に述べられている。また、米国特許第4,927,769号は、界面活性剤の添加によってアクリジニウムエステル標識コンジュゲートから生成される化学発光シグナルを増強する方法を記述している。加えて、米国特許第4,959,182号は、界面活性剤及びそれに結合した蛍光化合物の添加によってアルカリホスファターゼ触媒1,2−ジオキセタンから生成される化学発光シグナルを増幅する方法を述べている。(免疫測定法においてシグナルを高めるための増幅戦略は、L.J.KrickaとD.Wildにより「Signal Generation and Detection Systems」、The Immunoassay Handbook,第2版、D.Wild編集、p.159−176(Nature Publishing Group,N.Y.2001)において総説されている)。
被験試料は、例えば、赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿などの全血成分、腹水、尿、脳脊髄液などの何らかの生体液、ならびに対象分析物を含有しうる身体の他の成分(すなわち組織)でありうる。
(アクリジニウム)x−ウシ血清アルブミンの作製
結晶性BSAを、0.1%CHAPS[3−(3−コラミドプロピルジメチルアミノ)−1−プロパンスルホン酸塩]を含むリン酸緩衝液中に6.7mg/mlの濃度で溶解することによってウシ血清アルブミン(BSA)の溶液を作製した。DMF[N,N−ジメチルホルムアミド]中のアクリジニウム活性エステル290mlを、4mlアンバーバイアル中の前記BSA溶液1mlに加えた。前記活性エステルは、10−(3−スルホプロピル)−N−(2−カルボキシエチル)−9−アクリジニウムカルボキサミド(米国特許第5,468,646号)及びN−ヒドロキシスクシニミドから作製し、4mg/mlでDMFに溶解した。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌して混合し、その後50−60分間環境温度下に置いた。次にG25ゲルろ過のために溶液をPD10カラム(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)に移し、0.1%CHAPSを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端空隙で黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集した。タンパク質濃度及びBSA分子当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために280及び370nmでアクリジニル化BSAの吸光度を測定した。濃度は1.45mg/ml、12.8アクリジニウム/BSAと算定された。
(アクリジニウム)x−BSAへのマレイミド基の結合
(a)30原子リンカーによる活性化
(アクリジニウム)x−BSA 1ml(アンバーバイアル中の実施例1より)を、5mMでDMFに溶解した30原子リンカー、スクシニミジル(4−トリカプロアミドシクロヘキシルメチル)N−マレイミド(米国特許第4,994,385号)108μlに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、その後60分間環境温度下に置いた。次にゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1%CHAPS及び5mM EDTA[エチレンジアミン四酢酸塩]を含むリン酸緩衝液で溶出した。前端で(アクリジニウム)x−BSA−30原子マレイミドを含む黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで氷浴中で保存した。
(アクリジニウム)x−BSA 1ml(アンバーバイアル中の実施例1より)を、DMF中で5mMに新鮮溶解したスクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−6−アミドカポレート(LC−SMCC、Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)108μlに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、60分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1%CHAPS及びEDTAを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端で(アクリジニウム)x−BSA−LCマレイミドを含む黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで2−8℃の冷蔵庫で保存した。
還元Mab c11−10 IgGと(アクリジニウム)x−BSA−30原子マレイミドとのコンジュゲート形成
モノクローナル抗HCVコア抗原である、1.5mlバイアル中の0.1%CHAPSを含むpH7.0のリン酸緩衝液1ml中のクローンc11−10(Tonen Corp.,Ohi−Machi,Japan)3.5mgに、蒸留水中に25mMの濃度まで新鮮溶解した0.5Mジチオトレイトール50μlを加えた。溶液を静かに逆転させることによって混合し、30分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1%CHAPS及び5mM EDTAを含むpH7.0のリン酸緩衝液で溶出した。A280ピークにおける還元IgGを空隙容量から清浄な4mlアンバーバイアル中に収集し、コンジュゲート形成時まで氷浴で保存した。
還元Mab c11−10 IgGと(アクリジニウム)x−BSA−LCマレイミドとのコンジュゲート形成
還元c11−10 IgGを、実施例IIIで述べたのと同じ手順によってc11−10 IgG 1.78mg/mlから作製した。また、還元抗体の収集後10分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例II(b)からの(アクリジニウム)x−BSA−LCマレイミド0.8mlをアンバーバイアル中の還元c11−10 IgG0.25mlに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを18から20時間、2から8℃の冷蔵庫内に置いた。0.1%までのProclin 300を前記コンジュゲート混合物に加え、0.22ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを実施例IIIで述べたようにSEC−HPLCで分画した。各々の注入量は200μlであり、遊離IgGのピークに先立つピーク付近で2つの分画を収集した。各々の分画を280及び370nmで測定し、IgG濃度及びIgGモル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。
Mab c11−10 Fab’と(アクリジニウム)x−BSA−LCマレイミドとのコンジュゲート形成
c11−10(Fab’)2をペプシン消化によって作製し、Superdex 200Gカラムから精製した(Aoyagiら、J.Clin.Mirobiol.37,p.1802−1808(1999))。アクリジニウム−BSAとc11−10 Fab’とのコンジュゲート形成を実施例IIIで述べたのと同じ手順によって実施した。但しIgGの代りにc11−10(Fab’)2 0.5mgから出発した。c11−10(Fab’)2のDTT還元からc11−10 Fab’2を収集した後10分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例II(b)からの(アクリジニウム)x−BSA−LCマレイミド0.8mlをアンバーバイアル中の還元c11−10 Fab’0.8mlに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを18から20時間、2から8℃の冷蔵庫内に置いた。そのコンジュゲート混合物をProclin 300に加えて0.1%にし、0.22ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを、Varian ProStar System(Varian Inc.,Walnut Creek,Calif.)において600×21mm TSK−Gel G3,000カラム(Tosoh Biosep LLC,Montgomeryville,PA)によるサイズ排除HPLCで分画し、0.1%CHAPSを含むリン酸緩衝食塩水で溶出した。流速は3ml/分であり、溶出物を280と370nmの波長の二元チャンネルで監視した。注入量は1mlであり、32から38分の保持時間から、毎分1つの分画で6つの分画を収集した。タンパク質濃度及びFab’当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために、各々の分画の吸光度をVarian Cary 50 Scan分光光度計(Varian Inc.,Walnut Creek,CA)において280及び270nmで測定した。Fab’濃度及びFab’モル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。
HCVコア抗原に関するサンドイッチアッセイ
D.ShahとJ.Stewartによる出版物「Automated Panel Analyzers−PRISM」(Immunoassay Handbook、第2版、D.Wild編集、Nature Publishing,NY,NY)の中に述べられているように単一チャンネルPRISM(登録商標)装置を使用してアッセイを実施した。
(アクリジニウム)x−BSA−30原子結合c11−10 IgGのコンジュゲートの試験
各々実施例IIIにおいてSEC−HPLCから単離したコンジュゲート分画2及び3を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1%Proclin 300を加えた3−N−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝食塩水のコンジュゲート希釈液中で100ng/mlに希釈した。10−(3−スルホプロピル)−N−(2−カルボキシエチル)−9−アクリジニウムカルボキサミドの直接標識から作製したc11−10コンジュゲートを対照として使用した。それらのコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで試験した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは6NCの平均計数であり、陽性応答は2回の試験でのAgPCの平均計数であった。
(アクリジニウム)x−BSA−LC結合c11−10 IgGのコンジュゲートの試験
実施例IVにおいてSEC−HPLCから単離したコンジュゲート分画2を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1%Proclin 300を加えたMOPS食塩水のコンジュゲート希釈液中で100ng/mlに希釈した。実施例VIIの直接標識アクリジニウムと同じc11−10コンジュゲートを対照として使用した。両方のコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは12NCの平均計数であり、陽性応答は4回の試験でのAgPCの平均計数であった。
(アクリジニウム)x−BSA−LC結合c11−10 Fab’のコンジュゲートの試験
実施例VにおいてSEC−HPLCから単離したコンジュゲート分画を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1%Proclin 300を加えたMOPS食塩水のコンジュゲート希釈液中で各々50ng/mlに希釈した。実施例VIIの直接標識アクリジニウムと同じc11−10コンジュゲートを対照として使用した。すべてのコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは6NCの平均計数であり、陽性応答は2回のAgPCの平均計数であった。
Claims (19)
- a)親水性担体、b)少なくとも10個のシグナル生成基、c)分析物特異的結合対成員及びd)リンカーを含むコンジュゲート。
- 前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。
- a.1)少なくとも10個のシグナル生成基、2)分析物特異的結合対成員、3)親水性担体及び4)リンカーを含むコンジュゲートを、コンジュゲート/分析物複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で被験試料と接触させること;及び
b.前記コンジュゲートの前記少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定すること
の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。 - 前記分析物が、1)ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、2)前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、3)前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び4)前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌に対する前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。
- a.被験試料を、分析物/第一分析物特異的結合対成員複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で第一分析物特異的結合対成員と接触させること;
b.(a)で生じた前記複合体を、分析物/第一分析物特異的結合対成員/コンジュゲート複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で、1)親水性担体、2)少なくとも10個のシグナル生成基、3)第二分析物特異的結合対成員及び4)リンカーを含むコンジュゲートと接触させること;及び
c.前記コンジュゲートの前記少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定すること
の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。 - 前記分析物が、1)ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、2)前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、3)前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び4)前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌のフラグメントから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 1)親水性担体、2)少なくとも10個のシグナル生成基、3)分析物特異的結合対成員及び4)リンカーを含むコンジュゲートを含む、被験試料における分析物の検出のためのキット。
- a)少なくとも10個のシグナル生成基を親水性担体に組み込むこと;
b)リンカーを工程(a)で生じた前記生成物に結合させること;及び
c)コンジュゲートを形成するために工程(b)の前記結合リンカーと分析物特異的結合対成員とでコンジュゲート形成させること
の工程を含む、コンジュゲートを形成する方法。 - 前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項16に記載の方法。
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