JPH11511558A

JPH11511558A - 蛍光および発光ラベル組成物ならびにそれらの使用方法

Info

Publication number: JPH11511558A
Application number: JP9510616A
Authority: JP
Inventors: エフ．ザグ，ロバート; ヒュンチュー，サエ
Original assignee: ファーストメディカル，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1996-08-26
Publication date: 1999-10-05
Also published as: DE69620902T2; US5650334A; EP0856155A4; EP0856155B1; WO1997008552A1; DE69620902D1; EP0856155A1; CA2230488A1; ES2173313T3; AU6909196A; AU703881B2

Abstract

(57)【要約】蛍光および化学発光ラベル組成物は、その上に間隔を開けて結合した多数の標的結合分子（例えば、抗体または核酸）を有する直鎖状多糖類骨格分子を含む。そして、各標的結合分子は、それに結合した多数の蛍光または化学発光染料分子を含む。このようにして、固相表面上の単一の標的部位に導入された信号は、結合活性を失うことなく増強され得る。

Description

【発明の詳細な説明】蛍光および発光ラベル組成物ならびにそれらの使用方法発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的に、生物学的サンプル中の標的物質を検出するための組成物および方法に関する。より特定すると、本発明は、多数の結合分子に結合した多数の蛍光または発光染料分子（これは、次いで、直鎖状多糖類骨格に結合される）を含有するラベル組成物に関する。溶液中および固相担体上の特定の生物学的物質を検出する多くの方法が知られている。生物学的サンプル中の標的物質への検出可能な標識の結合が、特異的結合物質により仲介される免疫化学的方法は、本発明にとって特に興味深い。例えば、蛍光標識または化学発光標識された抗体のような標識された特異的結合物質（これは、抗原またはハプテンのような標的物質を認識する）は、標的物質を含むであろう生物学的標本に曝され、そして標的物質の存在は、標識の結合により確認される。同様の技術は、核酸ハイブリダイゼーション方法を用いて実施され得、目的の核酸配列は、生物学的標本の核酸中の相補的配列を認識する標識されたポリヌクレオチドを用いて検出され得る。いずれの場合においても、標的物質は、存在するならば、蛍光または発光標識に結合し、標識の蛍光または発光に基づく検出が可能となる。蛍光標識は、他の一般的なアッセイ標識（例えば、酵素標識）と比較して、多くの利点を提供する。蛍光標識の検出は、簡単であり、かつ多くの酵素標識に共通する基質の添加を必要としない。蛍光標識により発生した信号は、局在化し、単一の反応領域またはチャンバ内の異なる反応ゾーン中の多数の分析物の検出が可能となる。従って、蛍光標識は、異なる分析物に対して最終検出工程のみが別個に実施されなければならない多数の分析物の検出のためのプロトコルを簡単にする。特に望ましい特性を有する、「アリールスルホネートシアニン蛍光染料」と呼ばれるシアニン蛍光物質のクラスが開発されたことは、本発明にとって特に興味深い。アリールスルホネートシアニン蛍光染料は、高い吸光係数（代表的には、 130,000L/mol〜250,000L/mol）、良好な量子収率、大部分の生物学的物質およびプラスチックの自己蛍光波長の範囲外（500nm〜750nm）の蛍光発光スペクトル、良好な溶解性、および低い非特異的結合特性を有する。これらの優れた特性にも関わらず、アリールスルホネートシアニン蛍光染料は、ある制限を被る。特に、これらの染料は、比較的狭いストークスシフトを有し、染料の励起スペクトルと発光スペクトルとの間の顕著な重複を生じる。励起スペクトルと発光スペクトルとの間の重複は、次いで、励起された際に染料分子が互いに密接して位置する場台、蛍光の自己消光を生じさせ得る。このような自己消光は、イムノアッセイに使用するための単一の抗体分子に結合し得るアリールスルホネート染料分子の数を制限する。例示的なアリールスルホネートシアニン蛍光染料であるCy5の場合、ストークスシフトは、17nm（これは、650nmの励起波長と667nmの発光波長との間の差である）である。最適な蛍光収率は、２〜４個のCy5分子が単一の抗体分子に結合する場合に得られる。蛍光信号出力は、４個より多い分子が単一の抗体分子に結合する場合、急速に降下する。４個より多い染料分子を個々の抗体分子に結合できないことは、Cy5標識化抗体および他の結合物質を用いるイムノアッセイの感度を顕著に制限する。キャリア分子（例えば、デキストラン）への蛍光染料分子の直接的結合は、蛍光出力を増強する技術として提案された。このようなキャリア分子は、代表的には、１個または数個の抗体分子を含み、標的物質への各抗体の結合は、多数の蛍光染料分子を保持する。しかし、上記のように、個々の染料分子の自己消光密度のため、このようなキャリア分子へのアリールスルホネートシアニン染料の結合が、蛍光発光のレベルを顕著に増加させることは予測されない。さらに、多くの先行技術の蛍光染料／キャリア分子複合体の結合能力は、複合体中に存在する限られた数の抗体分子およびキャリア分子による抗体の立体障害の両方により、制限された。化学発光標識もまた、多くの観点において有利である。それらは、特定の条件（例えば、強酸化剤の存在）への曝露を必要とするが、光信号は、局在化し、簡単なデバイスおよびプロトコルにより容易に検出される。特定の所望の特性を有する、アクリジニウムエステルと呼ばれる化学発光染料のクラスが開発されたことは、本発明にとって特に興味深い。アクリジニウムエステルは、タンパク質と容易に反応し、安定な誘導体を生じる。それらは、抗体と反応する際、比較的高い取込み比を有する。これらの理由のため、生物学的サンプル中の標的物質の検出に使用するための、改良された蛍光および発光ラベル組成物を提供することが望ましい。このような組成物は、蛍光および／または発光ラベル複合体が一般的に用途（固相イムノアッセイ、免疫組織化学染色、フローサイトメトリーなどを含む）を見出す全ての情況において有用であるべきである。改良された特性（例えば、アリールスルホネート染料組成物の場合、低減された自己消光および比較的高い標的結合能力）を有する多数の染料分子を有する結合体を含有する、改良されたアリールスルホネートシアニン染料組成物および改良されたアクリジニウムエステル染料組成物を提供することが特に望ましい。このような組成物は、低い非特異的結合、高い溶解性、および前述のアリールスルホネートシアニンおよびアクリジニウムエステル染料処方物に関連する他の所望の特性を示し続けるべきである。２．背景技術の説明アリールスルホネートシアニン蛍光染料は、Mujumdarら(1993)BIOCONJUGATE C HEMISTRY 4:105-111；Southwickら(1990)CYTOMETRY 11:418-430；および米国特許第5,268,486号に記載されている。Cy5は、上記の各文献に記載され、Biologic al Detection Systems，Inc.，Pittsburgh，Pennsylvaniaから商標名Fluorolink "Cy5"で市販されている。デキストランのような蛍光標識化多糖類は、Globeら(1 983)ANAL．BIOCHEM．130:287およびdeBelderら(1973)CARBOHYDRATE RES．30:376 に記載されている。アクリジニウムエステル染料は、Weeksら(1983)CLIN．CHEM ．29:1474-1479に記載されている。発明の要旨本発明は、標的物質および生物学的サンプルの高感度の蛍光および化学発光検出のための組成物および方法を提供する。組成物は、結合した多数の標的結合分子を有するキャリアまたは骨格分子を含むラベル組成物である。そして、各標的結合分子は、それに結合した多数の蛍光または化学発光染料分子を有する。骨格分子は、直鎖状多糖類（例えば、高分子量デキストラン）であり、そして標的結合分子は、直鎖状多糖類に沿って間隔を開けた位置で結合する抗体、核酸などである。このような組成物は、アリールスルホネートシアニン蛍光染料（例えば、 Cy5）を取り込むのに特に適切であり、それらは、低減された自己消光を有する実質的に増強された蛍光発光レベル（信号増幅）を提供する。このような組成物はまた、化学発光の発光標識を増強するために、アクリジニウムエステルを取り込むのに特に適切である。本発明の組成物は、蛍光または化学発光標識が特異的結合を介して標的物質に導入される、実質的に任意のアッセイまたは標識化手順（固相および他の不均一イムノアッセイ、生物学的標本の免疫組織化学染色、フローサイトメトリーなどを含む）に有利に使用され得る。組成物は、ラベル組成物が、直接的または間接的に結合した標的物質を有する固相表面に曝される、固相アッセイの実施に特に有用である。特に好ましい使用は、固相表面が、液体サンプル中に存在するであろう標的物質に特異的な結合物質で誘導体化される、２部位（two-site）または「サンドイッチ」固相アッセイにおける使用である。液体サンプルへの曝露後、固相は、洗浄され、本発明のラベル組成物に曝され、固定化された標的物質に直接的または間接的（例えば、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンの中間結合を介して）に結合する。次いで、本発明の蛍光ラベルは、表面上の局在化反応ゾーン内で励起エネルギーに曝すことにより固相表面上で検出され得る。あるいは、化学発光ラベルは、光を生成するために標識を刺激するように選択される条件に曝すことにより（例えば、アクリジニウムエステル標識の場合、強酸化剤への曝露により）固相表面上で検出され得る。図面の簡単な説明図１は、本発明の蛍光ラベル組成物中の多糖類骨格、標的結合物質、および蛍光標識の構造的関係を示す概略図である。図2Aおよび2Bは、固相表面上の２つの異なる反応ゾーンにおける標的物質の検出のための、図１の蛍光ラベル組成物を用いる本発明の方法を例示する。図３は、本発明の方法に従って、標的物質を固相上に捕捉するための特異的結合物質の使用を例示する。好適な実施態様の説明本発明のラベル組成物は、骨格またはキャリア分子12と、複数の標的結合分子 14と、該標的結合分子の各々に結合した多数の蛍光または化学発光染色分子16とを含む結合体（conjugate）10（図１）を含む。骨格またはキャリア分子12は、直鎖状多糖類（通常、単一の直鎖状多糖類分子からなる）を含み得る。結合体10 は、少なくとも２つの標的結合物質14を含み得、通常少なくとも４つの標的結合物質、好ましくは５〜20の標的結合物質、さらに好ましくは６〜15の標的結合物質を含む。標的結合物質14の各々は、好ましくは少なくとも１つの蛍光または化学発光染色分子、さらに好ましくは少なくとも２つの染色分子、そして多くの場合、３つ以上の染色分予を含み得る。多くの蛍光染料について、染色分子の数の上限は５、10またはそれ以上であり得る。しかし、例えば、アリールスルホネートシアニン蛍光染料の場合には、蛍光染色分子の最適な数は、抗体結合物質14当たり２〜４の染色分子であり得る。多くの化学発光染料について、染色分子の数の上限は５、10またはそれ以上であり得る。例えば、アクリジニウムエステルの場合には、染色分子の最適な数は、抗体結合物質14当たり１〜５の染色分子であり得る。本発明の組成物および方法は、種々の生物学的試料における広範な標的物質を標識し検出するために用いられ得る。本明細書において、用語「標的物質」は、以下に説明するように、生物学的試料中または固相表面上に存在すると思われる分子、化合物または他の組成物として定義されるものとして用いられる。標的物質は、標的結合物質（後述）を介した結合により検出可能であり得、通常、生物学的分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、または核酸）であり得、従って、特定の生物学的、薬理学的、遺伝的、または生化学的特性、あるいはそれらの特性の組み合わせに関連し得る。例示的な分析物の非包括的な一覧が、米国特許第4,366,241号、第19欄第７行〜第26欄第42行に記載されており、その開示は本明細書に参考として援用されている。標的物質は、疾病および治療的処置をモニターする際の診断にしばしば用いられるタイプの種々の生物学的試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、大脳液、脊髄液、接眼レンズ液（涙）、唾液、痰、精液、頚管ムチン、切屑(scraping)、スワブ試料など）中に存在し得、あるいはこのような試料から分離され得る。このような医学的試料に加えて、本発明の組成物および方法は、工業的、環境的または食品試料（例えば、水、プロセス流、乳汁、食肉、家禽、魚、条件媒体(condi tion media)など）中の標的物質を検出するのに用いられ得る。ある種の環境においては、アッセイの残りの工程（後述）に対する試料の適合性を改善するために、例えば、液化、分離、可溶化、濃縮、濾過、化学的処理、またはこれらの処理工程の組み合わせにより、試料を前処理することが望ましい。特に、本発明の蛍光組成物および方法による検出の前に、固相表面の標的物質を捕捉するための固相表面との反応を可能にするために、試料を前処理することが望ましい。免疫学的試験の前に、生物学的、工業的および環境的試料を選択および前処理することは当該分野で周知であるので、さらに説明する必要はない。本明細書で用いられるように、用語「標的結合物質」は、他の化合物に特異的に結合する空間的および極性的特徴あるいは生物学的物質複合体における特徴を有する任意の高分子化合物を意味する。本発明において有用なこのような標的結合物質は、特定の標的組成物（例えば、上記で定義された標的物質）に特異的に結合するよう選択または調製され得る。天然の特異的結合ペアは、この標的結合物質を提供し得、これらは、抗体と抗原、レクチンと炭水化物、ホルモンとホルモンレセプター、酵素と酵素基質、ビオチンとアビジン／ストレプトアビジン、ビタミンとビタミン結合タンパク質、相補的ポリヌクレオチド配列、薬剤とレセプター、酵素と反応生成物、酵素と酵素インヒビター、アポタンパク質と共同因子、免疫グロブリンとレセプター、生体とレセプター、成長因子とレセプター、キレート剤と金属、などを含む。ビオチンとアビジン（ビオチン誘導体とアビジン誘導体（例えば、ストレプトアビジン）とを含む）もまた、複雑な結合配列を用いるアッセイプロトコルにおける中間体結合物質として用いられ得る。例えば、抗体はビオチンで標識（ビオチニレート化）され得、固相表面であらかじめ固定化された標的物質に結合するよう用いられ得る。アビジン標的結合物質を用いる本発明のラベル組成物は、次いで、蛍光または化学発光ラベルを導入するために用いられ得る。天然の特異的結合物質が存在しない場合（多くの場合そうであるが）、特異的標的結合物質が調製され得る。抗原性およびハプテン性の標的物質については、抗体は周知の技術により調製され得る。ポリヌクレオチドについては、相補的ポリヌクレオチド（DNA分子およびRNA分子を含む）は周知の合成技術により調製され得る。本発明のラベル結合体に導入するに適切な骨格またはキャリア分子は、500kD 、好ましくは750kD、さらに好ましくは1000kDを超える分子量を有する直鎖状多糖特に好ましくは、100kD、好ましくは1500kDを超える分子量を有するデキストラン分子が用いられ、多くの場合、2000kD以上の分子量を有するデキストラン分子が用いられる。好ましい直鎖状ポリマーは、2000kDの分子量を有するデキストランである。本発明の組成物は、実質的には、結合物質に共有結合または非共有結合（好ましくは、共有結合）し得る任意の蛍光ラベルを含み得る。タンパク質および核酸標的結合物質の場合は共に、適切な蛍光ラベルは、蛍光染料、フルオレセイン、 Texas Redなどを含む。いずれの場合にも、好ましい蛍光ラベルは、米国特許第5 ,268,486号に記載されるようなアリールスルホネートシアニン蛍光染料であり得る。この特許の開示全体は、本明細書に参考として援用される。上記特許においてCy5と称されるアリールスルホネートシアニン蛍光染料が特に好ましい。Cy5は、以下の構造を有する：あるいは、本発明の組成物は、実質的には、結合物質に共有結合または非共有結合（好ましくは、共有結合）し得る任意の化学発光ラベルを導入し得る。タンパク質および核酸標的結合物質の場合は共に、適切な化学発光ラベルは、代表的には低分子量ハプテン（例えば、リミノール、ロフィン、ルシゲン、1,2-ジオキセタンなど）であり得る。好ましい化学発光ラベルは、WeeksらのCLIN．CHEM．2 9：1474-1479(1983)に記載のアクリジニウムエステルのクラスを含む。この文献は、安定して結合された結合体を提供するために、アクリジニウムエステルがタンパク質（例えば、本発明の標的抗体）とどのように反応するかについての教示を与える。蛍光または化学発光ラベルの標的結合物質への結合は、共有結合または非共有結合であり得、好ましくは共有結合である。共有結合の様式は、ラベルおよび標的結合物質両方の細かな性質に依存し得る。標的物質がポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体）である場合には、蛍光ラベルは、上記科学文献および特許文献に記載の慣用的な結合体の化学（conjugation chemistry）を用いて、種々の部分（ジスルフィド、ヒドロキシフェニル、アミノ、カルボキシル、インドールまたは他の官能基を含む）を介して標的物質に共有結合し得る。あるいは、抗体が公知の技術によりビオチニレート化され得（WilchekおよびBayer，ANAL． BIOCHEM．171：1-32(1988)を参照せよ）、そして、アビジン分子を介して蛍光ラベルに結合し得る（ここで、蛍光または化学発光ラベル−アビジン結合体は、本発明の蛍光または化学発光ラベル組成物を含み得る）。蛍光または化学発光ラベルのポリヌクレオチド標的結合物質への共有結合は、慣用的な結合体の化学を用いて、種々の部分（アルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、イミデート、イノシン、アシルおよびアルキルを含む）を介してなされ得るが、一方で、ビオチンによる誘導体化が多くの参考文献に教示されている（Learyら，PROC．NATL．ACAD．SCI．USA 80: 4045-4049（1983）；WO86/02929 ；EP063 879；Langerら，PROC．NATL．ACAD．SCI．USA 78: 6633-6637（1981）；およびEP2009 996を参照せよ）。蛍光ラベルを核酸分子に結合させる方法を教示する多くの他の参考文献が利用可能である。アリールスルホネートシアニン蛍光染料ラベルを抗体および他のタンパク質に結合させる代表的な技術は米国特許第5,268,486号に記載され、その全体の開示は上記のように本明細書に参考として援用されている。好ましいCy5蛍光ラベルを抗体および核酸の両方に結合させる技術は、Biologlcal Detection Systems， Inc.，Pittsburgh，Pennsylvaniaにより刊行された技報（Cat．No．A25000）に記載されている。標的結合物質は、タンパク質および／または核酸を炭水化物に結合させる公知の手順を用いて、直鎖状多糖類に結合し得る。例えば、Manubeら，BIOCHEM．BIO PHYS．RES．COMM．115: 1009(1983)は、抗ガン剤（ミトマイシン）のデキストランと結合体化したモノクローナル抗体への結合体化（conjugation）を記載する。デキストランは、抗体を架橋させることにより、薬剤の細胞毒性効果を増強した。Schefflerら，J．BIOL．CHEM．247: 18(1972)は、ポリ核酸をフィコールおよびデキストランに結合しDNAポリメラーゼの活性を調べる方法を開発した。McM asterら，CELL．IMMUNOLOGY 20: 42-53(1975)は、ハプテン特異的Ｂ細胞免疫応答をモニターするジニトロフェノール−フィコールを調製した。標的結合物質を直鎖状多糖類に結合する種々の化学的アプローチが存在する。カルボキシル、スルフヒドリルおよびアミノ基に関連する架橋剤が用いられ得る。Wongは、「タンパク質の結合体化と架橋の化学」，CRC Pressにおいて包括的な説明を提供する。多糖類分子当たりの結合する抗体の数は、結合体化反応における抗体と多糖類（デキストラン）とのモル比に依存し得る。本発明のラベル組成物は、上記の結合体の化学を用いて、上記の分子成分から調製され得る。調製後、組成物は、慣用的な分離技術（例えば、ゲル濾過、HPLC など）を用いて分離および精製され得る。代表的には、本発明の組成物は、重量基準で少なくとも90％の純度であり、好ましくは重量基準で少なくとも95％の純度であり、そして通常は重量基準で99％以上の純度である。本発明の蛍光および化学発光ラベル組成物は、多くの場合、固相表面に存在する標的物質を検出するために用いられ得る。本明細書において用いられるように、用語「固相表面」は、標的物質を支持または捕捉し得る任意の生物学的または非生物学的表面を含み得る。不均一イムノアッセイに用いられる場合には、固相表面は、代表的には、標的結合物質があらかじめ固定化されたプラスチック（例えば、アクリル）、ガラス、膜、または他の非生物学的表面であり得る。他の結合物質の捕捉抗体を固定化する具体的な方法は、同時係属中の米国出願第08/374 ,265号（代理人整理番号16415-000800）および同第08/522,435号（代理人整理番号16415-001700）に記載され、その開示全体が本明細書に参考として援用されている。固相は、次いで、生物学的試料と反応し、試料内部に存在し得る標的物質を捕捉するために用いられ得る。このような固相表面は、多くの場合、それぞれが試料中の標的物質の量に対して過剰に存在する２つの抗体を用いる２部位免疫測定アッセイに用いられる。比較的高濃度の標的結合物質および比較的高濃度の標識された標的結合物質が、すべての標的物質が捕捉されそして検出されることを確実にする。このような２部位免疫測定アッセイを行うための特定のプロトコルは、図2Aおよび2Bに関連して後述する。本発明の蛍光または化学発光ラベル組成物はまた、生物学的固相表面（組織片、無傷細胞、生体膜、オルガネラ、染色体など）についても有用であり得る。組成物はまた、例えばブロッティングにより所望の標的物質を生物学的１次材料から転移させることにより調製される非生体膜についても有用であり得る。ここで図2Aおよび図2Bを参照して、本発明の蛍光ラベル組成物を用いて行われる代表的な２部位免疫測定アッセイについて説明する。固相表面30は、第１の標的物質32と、免疫学的に異なる第２の標的物質34とを含む。標的物質32および34 は、任意のタイプの上記の物質であり得、タンパク質、炭水化物、核酸などを含む。少なくとも２つのタイプの蛍光ラベル結合体10'および10"が、代表的には水溶液として固相表面30に供される。水溶液の形態により、結合体が結合体に特異的な標的物質を認識するまで移動することが可能となる。結合体10'は、標的物質32に特異的な標的結合物質14を含み、結合体10"は、標的物質34に特異的な標的結合物質14"を含む。十分なインキュベーション時間（代表的には、60秒〜600 秒）の後、結合体10'および10"は、図2Bに示すように、それぞれに特異的な標的物質32および34に結合し得る。結合していないラベル結合体を洗浄により除去することにより、固相表面30上の別個の反応ゾーンは、用いられる特定の蛍光ラベル16を励起するよう選択された波長を有する励起エネルギーで別個に識別され得る（interrogated）。通常、同じ蛍光ラベル16が両方の結合体10'および10"に用いられ得るが、結合体が結合する反応ゾーンを物理的に隔離することにより、妨害を受けることなく独立した検出が可能となる。従って、両方の標的物質32および34の量は、単一の固相表面上で独立して測定され得る。標的物質32および34は、代表的には、あらかじめ固相表面に固定化されている特異的結合物質（例えば、それぞれについて捕捉抗体36および38）を用いて固相表面30に導入されることが認識されるであろう。２部位免疫測定アッセイのこのような局面は、図３に示すように当該分野で周知である。以下の実施例は例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。実験材料および方法１．Cy5−抗体−デキストラン結合体の調製デキストランをチオレート化するために、ジメチルホルムアミド(DMF)中のスクシンイミジル 6-[3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド]ヘキサノエート(L C-SPDP)(Pierce #21651)34mg/ml溶液150μlを、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(P BS)中で、アミノデキストラン(Molecular Probes，#D-7145，130アミン／デキストラン、2000 kDM.W.)20mg/mlを含有する溶液５mlに加えた。室温(RT)で30分間反応を行い、次いで、混合物をPBSに対してRTで終夜透析した。反応の間に、アミノデキストラン中の95％を超えるアミンが、LC-SPDPで標識された。次いで、子量デキストランフラグメントを除去するために、第１ピーク画分のみを回収した。 PBS(pH7.4)中の抗CKMM抗体(BiosPacific G31520)の2.6mg/ml溶液6.15mlを、DM F中のスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)(Pierce #22320)の2.7mg/ml溶液156μlと混合し、RTで30分間反応させた。未反応のSMCCを、Sephadex^e G25カラムで精製することにより除去した。 3.1mg/ml LC-SPDP−デキストラン5.2mlに0.5Mジチオトレイトール156μlを加え、そして2RTで15分間インキュベートすることにより、LC-SPDP−デキストランを還元した。次いで、デキストランを、PBS(pH7.4)中、PD-10（Pharmacia #17-0 851-01）カラムで精製した。還元したLC-SPDP−デキストランをSMCC-抗CKMMと混合し、そしてRTで終夜インキュベートすることにより、結合体化を行った。n-エチルマレイミド(NEM)（Sig ma #12828-7）を最終濃度1.0mMで加え、反応を停止させた。次いで、この結合体を、Centricon Concentrator(Amicon #4211)内で６mlまで濃縮し、緩衝液を0.1M 炭酸ナトリウム(pH9.3)に交換した。 Cy5(Biological Detection Systems 1464C-1)0.1mgを濃縮した結合体1.3mlに加えることにより、抗CKMM/デキストランを、1:4（抗体：染料）のモルカップリング比でCy5により標識した。RTで30分後、結合体をPD-10カラムで精製して遊離抗体を除去した。結合体の分光分析により、抗体当たり2.9個のCy5分子が結合していることがわかった。約10個の抗体が、2000kDの平均分子量を有するデキストランに結合した。２．CKMBアッセイ材料底部に固定化されたベンゾフェノンウシ血清アルブミン(BSA)−ビオチンを有する反応ウェルを以下のようにして調製した。3M companyから入手した両面テープ415を用いて、Germanow-Simon companyから入手したアクリル系ディスクの表面にテフロンリングを取り付けることにより、各々の反応ウェルを組み立てた。テフロンリングの寸法は、内径９mm、高さ1.5mmであった。アクリル系ディスクの寸法は、30×30mm sidesで、厚み0.6mmであり、この上に４つのテフロンリングを取り付けた。テフロンリングをCO₂でエッチングし、リングのディスクへの結合を改善した。次いで、ベンゾフェノン BSA−ビオチンを、10分間UV硬化させることにより、40μg/mlで固定化した。ストレプトアビジン−モノクローナル抗CKMB抗体結合体(SA-抗CKMB)を、ヘテロ二官能結合剤（S-アセチルチオグリコール酸 N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SATA，Pierce #26102)、およびスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC，Pierce #22320)）を用いて調製した。15モルの過剰のSATA（Pierceより入手、５mg/mlでジメチルホルムアミド( DMF)に溶解したもの）を、１mgの抗CKMBと、PBS(pH7.4)中0.74mg/mLで、室温で３時間反応させた。また、15モルの過剰のSMCC（５mg/mlでDMFに溶解したもの）を、1.1mgのストレプトアビジンと、PBS中1.1mg/mLで、室温で３時間反応させた。を、抗CKMB/SATAおよびストレプトアビジン/SMCCの両方の反応混合物から取り除いた。精製した抗CKMB-SATAおよびストレプトアビジン-SMCCを、タンパク質のモル比1:3で混合した。1Mヒドロキシルアミンを最終濃度100mMまで加えることにより結合体化反応を開始し、４℃で18時間にわたってインキュベートした。100mM N-エチルマレイミド(NEM)（Aldrich Chemical）を反応混合物に最終濃度１mMで加え、そして室温で15分間インキュベートすることにより、反応を停止した。NE Mでのインキュベートの後、Centricon-100濃縮器（Amicon社製）を用いて、結合ム（１×100cm）（Bio-Rad社製）を用いて、濃縮した混合物を精製し、ストレプトアビジン一抗CKMB結合体を単離した。 Cy5/抗CKMM-Dx結合体を、上記のようにして調製した。あった。アッセイ緩衝液は、PBS(pH7.4)中の４％ HSA、150μg/ml マウスIgG、 20であった。３．CKMBアッセイプロトコル SA-抗CKMB溶液(7.5μg/ml)を、SA-抗CKMB希釈緩衝液に加えた。この溶液50μL を反応ウェルに加え、37℃で１時間インキュベートした。ディスク全体を洗浄緩衝液に浸漬することにより、ウェルを洗浄した。洗浄緩衝液を含む５つの異なる容器内で、洗浄工程を５回繰り返した。マイクロピペットを用いて、過剰の洗浄緩衝液をウェルから取り除いた。CKMBを含む試料（50μl）を反応ウェルに加え、そして室温で10分間インキュベートした。ディスク全体を洗浄緩衝液に浸漬することにより、ウェルを洗浄した。洗浄緩衝液を含む５つの異なる容器内で、洗浄工程を５回繰り返した。マイクロピペットを用いて、過剰の洗浄緩衝液をウェルから取り除いた。Cy5/抗CKMM-Dx結合体（50μl）を適切な量で加え、室温で５分間インキュベートした。ディスク全体を洗浄緩衝液に浸漬することにより、ウェルを洗浄した。洗浄緩衝液を含む５つの異なる容器内で、洗浄工程を５回繰り返した。マイクロピペットを用いて、過剰の洗浄緩衝液をウェルから取り除いた。洗浄緩衝液（50μl）を各ウェルに加え、リーダーを用いてCy5シグナルを読みとった。結果結果を下記の表１および２に示す。表１の結果は、０（コントロール）および 100ng/mlの試料とCy5標識化された抗CKMMとを含む場合についてのCKMBアッセイの結果である。Cy5-抗CKMM-デキストランを用いたアッセイが、CKMBポジティブ試料について、６倍までの高い蛍光シグナルを有し得る。ネガティブ試料（Cy5-抗体の非特異的結合から得られる）についての蛍光シグナルは、デキストラン結合体および天然抗体と比較して増加しなかった。従って、デキストラン結合体について、シグナル−バックグラウンド比が改善される。表２は、異なる分子量のデキストランを有するCy5-抗体-デキストラン結合体を用いたCKMBアッセイのデータを示す。デキストラン（200kD）により、有効シグナルが最大となる。上述の記載は、発明の理解を明確にするために詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲の範囲内で、特定の改変がなされ得ることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 11/10 Ｃ１２Ｎ 11/10 Ｃ１２Ｑ 1/08 Ｃ１２Ｑ 1/08 1/68 1/68 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも500kDの分子量を有する直鎖状多糖類；該直鎖状多糖類に沿って間隔を開けた位置に結合した多数の標的結合分子；および該標的結合分子の少なくともいくつかに結合した、多数の蛍光または化学発光染料分子を含有するラベル組成物。２．前記直鎖状多糖類が、デキストランおよびフィコールからなる群より選択される、請求項１に記載のラベル組成物。３．前記直鎖状多糖類が少なくとも500kDの分子量を有するデキストランである、請求項２に記載のラベル組成物。４．前記標的結合分子が、抗体、抗体フラグメント、抗体アナログ、抗原、核酸、ホルモン、ホルモンレセプター、酵素、酵素基質、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１に記載のラベル組成物。５．前記直鎖状多糖類が少なくとも500kDの分子量を有するデキストランであり、前記標的結合分子が抗体である、請求項１に記載のラベル組成物。６．前記染料分子が蛍光シアニン染料である、請求項１に記載のラベル組成物。７．前記シアニン染料がアリールスルホネートシアニンである、請求項６に記載のラベル組成物。８．前記アリールスルホネートシアニンがCy5である、請求項７に記載のラベル組成物。９．前記染料分子が化学発光染料である、請求項１に記載のラベル組成物。１０．前記化学発光染料がアクリジニウムエステルである、請求項９に記載のラベル組成物。１１．前記直鎖状多糖類が該多糖類に共有結合した２〜１０個の標的結合分子を有する、請求項１に記載のラベル組成物。１２．前記標的結合分子のそれぞれが該標的結合分子に共有結合した２〜４個の蛍光染料分子を有する、請求項１１に記載のラベル組成物。１３．前記標的結合分子のそれぞれが該標的結合分子に共有結合した１〜５個の化学発光染料分子を有する、請求項１１に記載のラベル組成物。１４．前記直鎖状多糖類が少なくとも500kDの分子量を有するデキストランであり、前記標的結合分子が抗体であり、前記蛍光染料がアリールスルホネートシアニンである、請求項１に記載のラベル組成物。１５．生物学的サンプル中の標的物質を標識化する方法であって、（ａ）少なくとも500kDの分子量を有する直鎖状多糖類；（ｂ）該直鎖状多糖類に沿って間隔を開けた位置に結合した、該標的物質に特異的に結合する多数の分子；および（ｃ）該標的結合分子の少なくともいくつかに結合した多数の蛍光または化学発光染料あるいは化学発光分子を含有するラベル組成物を提供する工程；および該ラベル組成物を該生物学的サンプルに曝す工程を包含する、方法。１６．前記生物学的物質が固相中または固相上にある、請求項１５に記載の方法。１７．前記固相が、ポリマー性表面、無機表面、組織断面、および膜フィルターからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。１８．前記ラベル組成物が固相表面に曝され、該固相表面が、該固相表面に固定化された標的結合分子を有する固相表面を提供し；そして該固相を、前記標的物質を含んでいるであろう前記生物学的サンプルに曝し、それにより該標的物質が該固相に結合されることにより前もって調製され、該ラベル組成物を曝す工程が、該ラベル組成物を該固相に曝すことを含む、請求項１７に記載の方法。１９．前記直鎖状多糖類が、デキストランおよびフィコールからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。２０．前記直鎖状多糖類が少なくとも1000kDの分子量を有するデキストランである、請求項１８に記載の方法。２１．前記標的結合分子が、抗体、抗体フラグメント、抗体アナログ、抗原、核酸、ホルモン、ホルモンレセプター、酵素、酵素基質、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。２２．前記直鎖状多糖類が少なくとも1000kDの分子量を有するデキストランであり、前記標的結合分子が抗体である、請求項１５に記載の方法。２３．前記染料分子が蛍光シアニン染料である、請求項１５に記載の方法。２４．前記シアニン染料がアリールスルホネートシアニンである、請求項２３に記載の方法。２５．前記アリールスルホネートシアニンがCy5である、請求項２４に記載の方法。２６．前記直鎖状多糖類が、デキストランおよびフィコールからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。２７．前記化学発光染料がアクリジニウムエステルである、請求項２６に記載の方法。２８．前記標的結合分子のそれぞれが該標的結合分子に共有結合した１〜10個の蛍光染料分子を有する、請求項１５に記載の方法。２９．前記直鎖状多糖類が少なくとも1000kDの分子量を有するデキストランであり、前記標的結合分子が抗体であり、前記蛍光染料がアリールスルホネートシアニンである、請求項１５に記載の方法。