JP2012519850A - 高感度蛍光分析のための検出システム及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光分析において蛍光信号を測定する検出システムを提供すること。
【解決手段】このシステムは，蛍光標識と結合された小感知面を有するプローブと，基材の感知面に近い側にどちらも取り付けられた光源及び検出器とを備える。本発明はまた，小表面（≦５ｍｍ）を有するプローブチップを用いて，液体標本内の分析物を検出する方法と，複数の結合分子及び複数の蛍光標識を有する高分子量重合体（≧１ＭＤ）と，にも関する。結合反応は，反応溶液を横方向に流動させ，プローブチップを反応容器内で上下させることによって加速される。本発明は更に，複数の結合分子及び複数の蛍光標識を有する架橋フィコールを含む蛍光標識混合物に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は，蛍光分析（ａｓｓａｙ）における蛍光信号（ｓｉｇｎａｌ）を測定する検出システムに関する。このシステムは，蛍光標識（ｌａｂｅｌ）と結合された感知面を有するプローブと，基材の感知面に近い側にどちらも取り付けられた光源及び検出器とを備える。本発明はまた，小表面を有するプローブを用いて，液体標本内の分析物を検出する方法と，複数の結合分子及び複数の蛍光標識を有する重合体と，にも関する。本発明は更に，複数の結合分子及び複数の蛍光標識を有する架橋多糖類バックボーン分子を含む蛍光標識混合物に関する。

免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）システムの開発においては，多くの性能要求条件を満たす必要がある。分析は，サブピコグラムからナノグラムの非常に低いレベルで分析物を検出するために十分高感度でなければならない。看護状況の点で患者管理のために時を得た結果を提供し，バッチ分析器のスループット要求条件を満たすために，総分析時間は１５分以下でなければならない。いくつかの場合において，結果を得る応答時間及び試験費用を最小化するために，同一の標本について複数の分析を同時に行う分析物パネルが有利である。

多くの免疫分析は蛍光標識を用いる。なぜならば，そのような標識には多くの実践的利点があるからである。酵素に比べ，蛍光標識はずっと安定であり，追加の基質試薬を必要としない。多分析物パネルに関して，蛍光標識は，共通反応室（ｃｈａｍｂｅｒ）内で分離した結合ゾーンを利用できるようにする。なぜならば，隣接する結合ゾーンからの干渉を受けずに，各結合ゾーンを順に蛍光励起して発光を測定することができるからである。しかし，蛍光標識を用いる分析は，主に，酵素が基質を触媒的に変化させ，時間と共に多くの生成分子を累積させることができるという理由で，酵素を用いる分析よりも低感度である。

アリールスルホン酸塩シアニン蛍光染料は，Mujumdar et al., Bioconjugate Chemistry, Vol.4, pp. 105‐111, 1993と，Southwick et al., Cytometry, Vol. 11, pp. 418‐430, 1990と，米国特許第５，２６８，４８６号とに記載されている。上記文献それぞれに記載されているＣｙ５は，FLUOROLINK（登録商標） Ｃｙ５（登録商標）の商品名で，Biochemical Detection Systems, Inc., Pittsburgh, Pa.から商業的に入手することができる。アリールスルホン酸塩シアニン蛍光染料は，高消失係数（通常，１３０，０００ ｌ／ｍｏｌから２５０，０００ ｌ／ｍｏｌ）と，良好な量子収量と，ほとんどの生物学的物質及びプラスチックの自己蛍光波長外の範囲（５００ｎｍから７５０ｎｍ）における蛍光発光スペクトルと，良好な溶解性と，低い非特定結合特性とを有する。

これらの優れた特性にもかかわらず，アリールスルホン酸塩シアニン蛍光染料はある制約を持つ。特にこれらの染料は比較的狭いストークスシフトを有し，染料の励起スペクトラムと発光スペクトラムとの間に大きな重複を生じる。励起スペクトラムと発光スペクトラムとの間の重複は，次に，染料分子が励起された場合，当該染料分子が互いに接近していると，蛍光の自己消光を起こすことがある。このような自己消光は，免疫分析に用いる単一抗体分子に対して抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）することができるアリールスルホン酸塩染料分子の数を制限する。アリールスルホン酸塩シアニン蛍光染料の例であるＣｙ５の場合，ストークスシフトは１７ｎｍである（これは励起波長６５０ｎｍと，発光波長６６７ｎｍとの差である）。最適な蛍光収量は，単一抗体分子に２個から４個のＣｙ５分子が抱合するときに得られる。蛍光信号出力は，４個を超える染料分子が単一抗体分子に抱合すると，急速に低下する。個々の抗体分子に４個を超える染料分子が抱合できないため，Ｃｙ５で標識付けされた抗体及びほかの結合物質を用いた免疫分析の感度は著しく制限される。

したがって，蛍光免疫分析によって高感度で分析物を検出する改良された光学検出システム及び改良された方法が必要である。このシステム及び方法は，利用者が容易に扱うことができ，高い特定の信号及び最小の背景ノイズを提供できることが望ましい。

本発明は，プローブチップ上の蛍光信号を測定するための蛍光検出システムに関する。このシステムは，（ａ）長さ対幅のアスペクト比が少なくとも５対１であるプローブであって，遠端及び近端を有し，該近端は蛍光標識と結合した感知面を有する，プローブと，（ｂ）上記プローブの感知面に直接励起光を放出する光源と，（ｃ）上記感知面に向けられた集光レンズと，（ｄ）上記の放出蛍光光を検出する光学検出器と，を備え，上記集光レンズは上記放出蛍光光を集光して，上記光学検出器へ向ける。

本発明はまた，蛍光免疫分析によって分析物を検出する方法にも関する。一実施形態（３ステップ結合）によれば，方法は，（ａ）プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，上記チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，（ｂ）上記プローブチップを，分析物を有する標本溶液を入れた標本容器に浸し，上記プローブチップを上記標本容器内で上下させ，上記標本容器内の標本溶液を横方向に流動させるステップと（ｃ）結合対の第１要素と抱合させた第２抗体分子を含む試薬溶液を入れた試薬容器に上記プローブチップを浸し，上記プローブチップを上記試薬容器内で上下させ，該試薬容器内の上記試薬溶液を横方向に流動させるステップと，（ｄ）洗浄溶液を入れた洗浄容器に前記プローブチップを浸すステップと，（ｅ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む増幅溶液を入れた増幅容器に上記プローブチップを浸し，上記プローブチップを上記増幅容器内で上下させ，上記増幅容器内の増幅溶液を横方向に流動させて，上記プローブチップ上に，上記分析物と，上記第１抗体と，上記第２抗体と，上記結合対の第１要素及び第２要素との免疫複合体を形成するステップと，（ｆ）第２洗浄溶液を入れた第２洗浄容器に上記プローブチップを浸すステップと，（ｇ）上記プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，上記の形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，上記第１抗体及び上記第２抗体は，上記分析物に対する抗体である。

本発明の方法は，（ｉ）分析物分子を結合する小感知面を有するプローブを用いるステップと，（ｉｉ）反応容器内で上記プローブチップを上下させて，上記反応容器内の反応溶液を横方向へ流動させるステップと，（ｉｉｉ）複数の結合分子及び複数の蛍光標識と抱合する高分子量重合体を用いるステップと，の独特な組合せによって，高感度を達成する。

本発明は更に，（ａ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有する架橋フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）と，（ｂ）少なくとも５個の結合分子と，（ｃ）少なくとも２５個の蛍光染料分子と，を有する蛍光標識混合物であって，上記結合分子と上記蛍光染料分子とが上記架橋フィコールに付着している混合物に関する。

光学検出システムの第１実施形態を示す図である。 光学検出システムの第２実施形態を示す図である。 光学検出システムの第３実施形態を示す図である。 光学検出システムの第４実施形態を示す図である。 光学検出システムの第５実施形態を示す図である。 光学検出システムの第６実施形態を示す図である。 分析物を検出する２ステップ結合法を示す図である。 光源及び検出器がどちらもプローブの感知面の反対側に取り付けられている光学検出システムを示す図である。 プローブが分析物溶液に浸されている光学検出システムの別の視点の図である。 架橋フィコール４００を調製するフローチャートである。 Ｃｙ５‐抗体‐架橋フィコール４００を調製するフローチャートである。 セファロース４Ｂ ＣＬクロマトグラフィによってＳＰＤＰで標識付けされた架橋フィコール４００の溶離パターンを示す図である。 タンパク質Ａを検出する免疫分析フォーマットを示す図であって，Ａｂ：抗体，Ａｇ：抗原（タンパク質Ａ），Ｓａ：ストレプトアビジン，Ｂ：ビオチン，Ｆ：蛍光標識である。

＜定義＞
本願の特許請求の範囲及び明細書において用いる用語は，次に掲げるものを除き，当業者が理解する通常の意味に従って解釈するものとする。

本願において，「約」は記載されている値の±１５％以内を指す。

本願において，「分析物結合」分子は，分析物分子との特定の結合反応に関係することができる任意の分子を指す。例として，限定するものではないが次のものがある。（ｉ）抗原分子であって，当該抗原に対する特定の抗体の存在を検出するために用いる抗原分子。（ｉｉ）抗原の存在を検出するために用いる抗体分子。（ｉｉｉ）タンパク質分子であって，当該タンパク質の結合パートナの存在を検出するために用いるタンパク質分子。（ｉｖ）結合パートナの存在を検出するために用いるリガンド。（ｖ）核酸結合分子の存在を検出するための単鎖核酸分子。

形状の「アスペクト比」は，当該形状の長辺寸法対短辺寸法の比を指す。

「結合分子」は，ほかの注目分子と結合できる分子を指す。

本願において，「結合対」は互いに引き付け合い，特に結合する２個の分子を指す。結合対の例として，限定するものではないが次のものがある。抗原及び当該抗原に対する抗体，リガンド及びその受容体，核酸の相補鎖，ビオチン及びアビジン，ビオチン及びストレプトアビジン，並びにレクチン及び炭水化物。好適な結合対は，ビオチン及びストレプトアビジン，ビオチン及びアビジン，フルオレセイン及び抗フルオレセイン，ジゴキシゲニン及び抗ジゴキシゲニン。ビオチン及びアビジンは，ビオチン誘導体及びストレプトアビジンのようなアビジン誘導体を含み，複合結合シーケンスを用いる分析手順（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）における中間結合物質として用いてもよい。例えば抗体は，ビオチンによって標識が付けられ（「ビオチン化」され），先行して固相面に固定された対象物質に結合するために用いてもよい。そして，アビジン又はストレプトアビジンを用いる本発明による蛍光混合物を蛍光標識を導入するために用いてもよい。

本願において，「固定された」は試薬が固体面に固定されていることを指す。試薬が固体面に固定されているとき，試薬は当該面に非共有結合しているか，共有結合しているかのいずれかである。

本願において，「モノリシック基材」は，一つの屈折率を有するガラス，石英又はプラスチックのような固体物質の一片を指す。

本願において，「開口数」はシステムが光を受容し，光を放射することができる角度範囲を特徴付ける無次元の数を指す。

本願において，「光ファイバ」は長さ方向に光を搬送するガラス又はプラスチックのファイバである。光ファイバは通常，誘電物質（コア物質）と，該誘電物質を取り囲むより低い屈折率を有する別の誘電物質（クラッド）とからなる円形断面誘電導波路である。

本願において，「プローブ」は感知側が分析物結合分子の薄膜層で覆われた基材を指す。プローブは遠端及び近端を有する。近端（本願においてはプローブチップとも呼ばれる）は，分析物結合分子の薄膜で覆われた感知面を有する。

＜蛍光検出システム＞
本発明は，プローブチップ上の蛍光信号を測定する蛍光検出システムに関する。本発明は，光源及び検出器双方を，プローブの感知面に近い側に取り付けることによって，検出光学系に入射する不要な反射が減少し，検出効率が向上することを開示している。

このシステムは，（ａ）長さ対幅のアスペクト比が少なくとも５：１であるプローブであって，第１端及び第２端を有し，第２端が蛍光標識と結合した感知面を有するプローブと，（ｂ）プローブの感知面に直接励起光を放射する光源と，（ｃ）感知面に向けられた集光レンズと，（ｄ）発光蛍光光線を検出する光検出器と，を備え，集光レンズは発光蛍光光線を集光して，光検出器に向ける。

プローブは，モノリシック基材であってもよいし，光ファイバであってもよい。プローブは，長さ対幅のアスペクト比が少なくとも５：１，好ましくは１０：１である，棒状，円筒形，円形，正方形，三角形など任意の形状であってよい。免疫分析の際，プローブは標本溶液及び１又は複数の分析溶液に浸されるため，プローブチップが溶液に浸ることができるように，少なくとも５：１のアスペクト比を有する長いプローブを備えることが望ましい。長いプローブを種々の反応室に移動させることによって，異種の分析を行うことができる。分析の際に試薬及び標本を調合し，吸引することが避けられる。プローブの感知面は，分析物結合分子で覆われ，蛍光標識と結合している。

本発明には，蛍光標識に対して適切な励起光を発光することができる任意の光源が適当である。好適な光源は，蛍光標識に適した波長の光を発光できるレーザである。例えば，Ｃｙ５蛍光染料に対してはレーザの中心波長が６４９ｎｍであることが望ましい。発光光を検出するために適した光検出器は，光電子増倍管（ＰＭＴ），電荷結合素子（ＣＣＤ）又はフォトダイオードである。

光源及び集光レンズを含む光検出器は，プローブチップ面（感知面）と同じ側に取り付けられる。感知面が下を向いているときは，それらは双方ともチップ面より下に取り付けられる。感知面が上を向いているときは，それらは双方ともチップ面より上に取り付けられる。それらはプローブの反対端よりも感知面に近い。感知面は常に集光レンズの開口数以内にある。プローブは集光レンズと中心をそろえてもよいが，必須ではない。

図１は第１実施形態を示す図である。光学的に透明な棒（プローブ）は，ガラス又は石英でできている。棒の下端は感知面として用いられる。蛍光標識は感知面に結合されている。蛍光を検出するため，棒の感知端は蛍光発光に最適化された緩衝液を入れた透明底を有する容器に浸される。透明底の材料は，プラスチック，ガラス又は石英から選択してもよい。光検出器及び励起レーザは，容器と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の遠端面に，入射角αで投射されるように配置される。入射角は，棒の開口角θより大きいように設定されている。棒の屈折率は空気よりずっと大きく，緩衝液の屈折率に近いので，入射レーザ光の大部分は棒を通過する。少量のレーザ光は感知面で反射される。いくらかのレーザ光は棒内に結合して，棒の他の端で反射する。α＞θのとき，反射光は棒の感知面から射出されて，環状明帯を形成する。この環の中心は，ずっと低い光強度を有する。集光レンズが環の中央に置かれるので，検出光学系に入射する不要な反射が減少する。この反射を更に減少させるため，棒の上端にテーパを付け，一定の粗さになるまで研磨してもよい。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図２は，容器内に入れられた緩衝液の中ではなく，空中で棒を測定する第２実施形態を示す図である。レーザ及び検出器の構成は第１実施形態に類似しており，光検出システム及び励起レーザは棒と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の感知面に，入射角αで投射されるように配置される。入射角は，棒の開口角θより大きいように設定されている。いくらかの入射レーザ光は棒を通過する。大部分のレーザ光は感知面で反射される。残りのレーザ光は棒内に結合して，棒の上端で反射する。α＞θのとき，反射光は棒の感知面から射出されて，環状明帯を形成する。この環の中心は，ずっと低い光強度を有する。集光レンズが環の中央に置かれるので，検出光学系に入射する不要の反射は減少する。この反射を更に減少させるため，棒の上端にテーパを付け，一定の粗さになるまで研磨してもよい。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図３は，図１の実施形態の透明棒を不透明棒で置き換えた第３実施形態を示す図である。不透明棒の材料は，プラスチック，セラミックス又は金属であってよい。棒の下端は感知面として用いられる。蛍光を検出するため，棒の感知面は蛍光発光に最適化された緩衝液を入れた透明底を有する容器に浸される。透明底の材料は，プラスチック，ガラス又は石英から選択してもよい。光検出器及び励起レーザは，容器と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の感知面に，入射角αで投射されるように配置される。棒は不透明であるため，レーザビームは感知面で反射され吸収される。棒の材料は，励起レーザに対して最小の蛍光を発光することが好ましい。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図４は，容器内に入れられた緩衝液の中ではなく，空中で不透明棒を測定する第４実施形態を示す図である。不透明棒の材料は，プラスチック，セラミックス又は金属であってよい。棒の下端は感知面として用いられる。光検出器及び励起レーザは，容器と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の感知面に，入射角αで投射されるように配置される。棒は不透明であるため，レーザビームは感知面で反射され吸収される。棒の材料は，励起レーザに対して最小の蛍光を発光することが好ましい。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図５は，棒の感知面を覆う鏡様薄膜を有する第５実施形態を示す図である。棒は透明でもよいし，不透明でもよい。この鏡様薄膜コーティングは，励起又は発光いずれかの光を反射するために用いられる。鏡面コーティングにはアルミニウム，金又は銀を使うことができる。任意選択で，第１薄膜の上にＳｉＯ₂でできた第２薄膜をコーティングしてもよい。不透明棒の材料は，プラスチック，セラミックス又は金属であってよい。透明棒の材料は，ガラス，石英又はプラスチックから選択される。蛍光標識は感知面に結合されている。蛍光を検出するため，棒の感知端は蛍光発光に最適化された緩衝液を入れた透明底を有する容器に浸される。透明底の材料は，プラスチック，ガラス又は石英から選択してもよい。光検出器及び励起レーザは，容器と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の感知面に，入射角αで投射されるように配置される。棒の感知面は第１鏡様薄膜で覆われているので，レーザビームは反射角αで反射される。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図６は，棒の感知面を覆う鏡様薄膜を有するが，測定は空中で行われる第６実施形態を示す図である。棒は透明でもよいし，不透明でもよい。この鏡様薄膜コーティングは，励起又は発光いずれかの光を反射するために用いられる。鏡面コーティングにはアルミニウム，金又は銀を使うことができる。任意選択で，ＳｉＯ₂でできた第２薄膜が第１薄膜の上にコーティングされる。不透明棒の材料は，プラスチック，セラミックス又は金属であってよい。透明棒の材料は，ガラス，石英又はプラスチックから選択される。蛍光標識は感知面に結合されている。蛍光を検出するために，棒の感知面と，光検出システムと，励起レーザは，棒の感知面と同じ側に取り付けられ，集光レンズは感知面より下にある。レーザは，レーザビームが棒の感知面に，入射角αで投射されるように配置される。棒の感知面は鏡様薄膜で覆われているので，レーザビームは反射される。感知面において発光を検出するために，光電子増倍管又はＣＣＤを用いることができる。棒の感知面と集光レンズとの間の距離は，最良の検出効率を得るように調整可能である。

図２，４及び６は，レーザ及び光検出器がプローブチップより下に取り付けられているように示されているが，蛍光信号を検出するために，プローブを逆さまにひっくり返し，レーザ及び光検出器を感知面より上に取り付けてもよいことを理解されたい。

＜蛍光免疫分析による分析物の検出＞
本発明はまた，蛍光免疫分析によって，液体標本内の分析物を検出する方法にも関する。本発明は，（ｉ）分析物分子を結合する小感知面を有するプローブを用いるステップと，（ｉｉ）プローブチップを反応容器内で上下させて，反応溶液を反応容器の横方向に流動させるステップと，（ｉｉｉ）少なくとも５個の結合分子と，少なくとも２５個の蛍光標識とに抱合する高分子量重合体を用いるステップと，の組合せが，検出レベルの感度をｐｇ／ｍｌに改善することを開示している。

図７は，本方法の一実施形態を示す図である。この実施形態（２ステップ結合）において，方法は，（ａ）プローブのチップ（感知面）上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，チップ面の直径は５ｍｍ以下であるステップと，（ｂ）プローブチップを，分析物を有する液体標本を入れた標本容器に浸すステップと，（ｃ）プローブチップを標本容器内で上下させ，標本容器内の試薬溶液を横方向に流動させて，第１抗体と分析物を結合させるステップと，（ｄ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む試薬溶液を入れた試薬容器にプローブチップを浸すステップと，（ｅ）プローブチップを試薬容器内で上下させ，試薬容器内の試薬溶液を横方向に流動させて，プローブチップ上に，分析物と，第１抗体と，第２抗体との免疫複合体を形成するステップと，（ｆ）洗浄溶液を入れた洗浄容器にプローブチップを浸すステップと，プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，第１抗体及び第２抗体は，分析物に対する抗体である。上記の方法において，結合ステップ（ｃ）の後に，任意選択の洗浄ステップを加えてもよい。結合面が小さいために，持ち越し（ｃａｒｒｉｅｄ ｏｖｅｒ）溶液の量は最小であり，この追加洗浄ステップは必要でないこともある。

別の実施形態（２ステップ結合）においては，方法は，（ａ）プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，（ｂ）標本容器にプローブチップを浸すステップであって，標本容器には（ｉ）分析物を有する液体標本と，（ｉｉ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む試薬溶液とが入っているステップと，（ｃ）プローブチップを標本容器内で上下させ，標本容器内の試薬溶液を横方向に流動させて，プローブチップ上に，分析物と，第１抗体と，第２抗体との免疫複合体を形成するステップと，（ｄ）洗浄溶液を入れた洗浄容器にプローブチップを浸すステップと，（ｅ）プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，第１抗体及び第２抗体は，分析物に対する抗体である。

また別の実施形態（３ステップ結合）においては，方法は，（ａ）プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，（ｂ）プローブチップを，分析物を有する液体標本を入れた標本容器に浸し，プローブチップを標本容器内で上下させ，標本容器内の標本溶液を横方向に流動させるステップと，（ｃ）結合対の第１要素と抱合させた第２抗体分子を含む試薬溶液を入れた試薬容器にプローブチップを浸し，プローブチップを試薬容器内で上下させ，該試薬容器内の試薬溶液を横方向に流動させるステップと，（ｄ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む増幅溶液を入れた増幅容器にプローブチップを浸し，プローブチップを増幅容器内で上下させ，増幅容器内の増幅溶液を横方向に流動させて，プローブチップ上に，分析物と，第１抗体と，第２抗体と，結合対の第１要素及び第２要素との免疫複合体を形成するステップと，（ｅ）第２洗浄溶液を入れた第２洗浄容器にプローブチップを浸すステップと，（ｆ）プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，第１抗体及び第２抗体は，分析物に対する抗体である。上記の方法において，結合ステップ（ｂ）及び（ｃ）の後に任意選択の洗浄ステップを追加してもよい。結合面が小さいために，持ち越し溶液の量は最小であり，この追加洗浄ステップは必要でないこともある。

固相（プローブチップの感知面）に試薬を固定させる方法は，免疫化学において普通であり，固相と試薬との間に共有結合性，疎水性又は静電性の結合を形成させることを含む。分析物結合分子は，感知面上に直接固定してもよい。あるいは，分析物結合分子を，結合対を介して感知面上に間接的に固定してもよい。例えば，まず抗フルオレセインを，固体面に吸収させるか，又は固体面上を覆うアミノプロピルシランに共有結合させることのいずれかによって，固定することができる。そして，フルオレセインで標識付けされた分析物結合分子を，フルオレセインと抗フルオレセインとの結合（結合対）によって，固体面に結合することができる。

本発明の方法は，（ｉ）分析物分子を結合する小感知面を有するプローブを用いるステップと，（ｉｉ）反応容器内でプローブチップを上下させて，反応容器内の反応溶液を横方向へ流動させるステップと，（ｉｉｉ）複数の結合分子及び複数の蛍光標識と抱合する高分子量重合体を用いるステップと，の独特な組合せによって，高感度を達成する。

本発明の第１要因は，分析物を結合する小さなチップを有するプローブを用いることである。このチップは，直径５ｍｍ以下，好ましくは２ｍｍ又は１ｍｍ以下の小表面を有する。プローブチップの小表面はいくつかの利点を与える。固相免疫分析において小表面を持つことは，非特定結合が少なく，したがって背景信号が低くなるため，有利である。さらに，プローブチップ上の試薬又は標本の持ち越しは，チップが小表面であるために非常に少ない。この特徴によって，プローブチップは洗浄が容易であり，洗浄溶液はより容量が多いため，洗浄液内の汚染は無視できるようになる。プローブチップの小表面の別の側面は，結合容量が小さいことである。したがって，プローブチップが試薬溶液に浸されたとき，試薬の結合によって大容量の試薬が消費されることはない。試薬濃度は実効的に変わらない。洗浄溶液の汚染は無視でき，試薬の消費は少ないので，試薬溶液と，増幅溶液と，洗浄溶液とを何回も，例えば２〜８回，再使用することができる。

しかし，プローブチップにおける表面との結合反応は遅い。プローブチップが溶液に浸されたとき，溶液容量に対する結合表面の比は小さく，したがって対象分子がプローブの感知面に拡散するために，非常に長い放置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）時間が必要である。感度を増強するための本発明の第２要因は，プローブチップを横切る溶液の横方向の流動（環状流動）を起こすことであり，このことは，固相に固定された結合パートナによる対象分子の捕捉を加速する。例えば反応容器をオービタルシェーカ上に載せて，オービタルシェーカを少なくとも５０ｒｐｍ，好ましくは少なくとも２００ｒｐｍ，より好ましくは少なくとも５００ｒｐｍ，例えば５００〜１０００ｒｐｍの速度で回転させてもよい。さらに，プローブチップの上下の溶液を更に攪拌するために，０．０１〜１０ｍｍ／ｓの速度でプローブチップを環状流動面に垂直に上下させる。低背景にするために表面を小さくすることと，より急速な対象分子補足のために流動させることとを組み合せることによって，特定の分析信号が高くなり，背景ノイズが低くなる。このことが分析感度の決定要因である。

感度を増強する本発明の第３要因は，複数の結合分子及び複数の蛍光染料で標識付けされた高分子量重合体を用いることである。蛍光染料は，免疫分析における標識として多くの実践的な利点を有する。まず，蛍光染料は非常に安定であり，結合タンパク質に容易に結合する。蛍光染料は，高感度分析に用いるために十分な蛍光信号を発生することができないという，大きな制約がある。したがって，蛍光信号を増加させるために，一つの重合体に複数の蛍光染料を標識付けすることが重要である。デキストラン重合体，フィコール重合体，核酸重合体のような多くの重合体が，染料担体として適当である。蛍光標識は，重合体に直接付着させてもよいし，抗体，すなわちストレプトアビジンのような結合分子を介して重合体に間接的に付着させてもよい。

結合分子が抗体のようなポリペプチド又はタンパク質であるとき，科学文献及び特許文献に記載されている通常の抱合化学を用いて，ジスルフィド，ヒドロキシフェニル，アミノ，カルボキシル，インドール，又はほかの官能基を含む多様な部分（ｍｏｉｅｔｙ）を介して，蛍光標識は結合分子と共有結合できる。あるいは，既知の技法によって抗体をビオチン化し（Wilchek and Byer, Analytical Biochemistry, vol. 171, pp. 1‐32, 1988参照），アビジン／ストレプトアビジン分子を介して蛍光標識に結合させてもよい。

蛍光標識のポリヌクレオチドへの共有結合は，普通の抱合化学を用いて，アルデヒド，ケトン，イソチオシアナート，イミダート，イノシン，アシル及びアルキルを含む多様な部分を介して行われる。ここでビオチンの誘導体化は，多くの参考文献において教示されている（Leary et al, Proc. National Academy of Science of the USA, vol. 80, pp. 4045‐4049, 1983, WO 86/02929, EP 063 879, Langer et al, Proc. National Academy of Science of the USA, vol. 78, pp. 6633‐6637, 1981, EP 2009 996参照）。

アリールスルホン酸塩シアニン蛍光染料標識を抗体及びほかのタンパク質に結合させる技法の例は，米国特許第５，２６８，４８６号及び第５，６５０，３３４号に記載されており，ここに参照する。好適なＣｙ５蛍光標識を抗体及び核酸双方に結合させる技法は，Biological Detection Systems, Inc., Pittsburgh, Paによって発行された技術報，カタログ番号A25000に記載されている。

本発明の方法は，本願明細書で説明した蛍光検出システムによって検出を行うステップを有し，光源及び検出器はプローブの感知面と同じ側（近い側）に取り付けられる。

あるいは，本発明の方法は，光学系によって検出を行うステップを有し，光源及び検出器双方はプローブの感知面と反対側であって，プローブの反対端に近い位置に取り付けられる（図８〜９参照）。

図８において，プローブは検出システムから取り外すことができる。レーザ光は，プローブの一端に直接結合する。プローブは，光検出システムに対してＸ−Ｙ−Ｚ方向に動かすことができる。この動きによって，プローブと光検出システムとの間の精密な位置合わせができる。プローブチップは，標準のマイクロタイタプレートの穴（ｗｅｌｌ）に浸すことができる。プレートはオービタルシェーカの上に載せられる。プローブチップと，穴の中の標本溶液との間の相対運動によって，分析速度が速くなる。

図９の拡大図に示すように，プローブチップは結合分析のための分析物標本に直接浸される。結合端は，光検出システムから離れている。光検出器として，光電子増倍管（ＰＭＴ）が用いられる。

プローブは，モノリシック基材又は光ファイバのいずれかでできたものでよい。プローブが光ファイバであるときは，ファイバプローブの結合端は，結合効率を改善するために反射防止コーティング層で覆ってもよい。

一実施形態においては，レーザの前に偏光フィルタを置き，ＰＭＴの前に垂直偏光の第２偏光フィルタを置く。二枚の偏光フィルタによって，不要なレーザ反射が最小限になる。

別の実施形態においては，偏光フィルタを，蛍光の波長だけを通過させる帯域通過フィルタで置き換えてもよい。

プローブのコアは直径０．１ｍｍを超えるが，５ｍｍ，好ましくは２ｍｍ又は１ｍｍを超えない。好適な開口数は０．１５と０．５０との間である。

＜複数の結合分子及び蛍光標識を含む高分子量分枝多糖類＞
本発明はまた，（ａ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有する架橋フィコールと，（ｂ）少なくとも５個の結合分子と，（ｃ）少なくとも２５個の蛍光染料分子と，を含む蛍光標識混合物にも関し，結合分子及び蛍光染料分子は架橋フィコールに付着している。この混合物は，５〜５０個又は５〜１００個の結合分子と，２５〜１００個又は２５〜５００個の蛍光染料分子とを有することが望ましい。

一実施形態においては，蛍光染料分子は直接架橋フィコールに付着している。別の実施形態においては，蛍光染料分子は，抗体分子すなわちストレプトアビジンのような結合分子を介して間接的に架橋フィコールに付着している。蛍光消光を最小化するため，蛍光染料分子は架橋フィコールに沿って隙間を空けた位置に付着させられる。

この蛍光標識構成は，本発明の上述の方法に好適な構成である。

フィコールは，分子量７０ｋダルトン及び４００ｋダルトンのものが商業的に入手できる。フィコールは，高分子担体として役立つという利点がある。分析感度を上げる際の架橋蛍光タンパク質に関する一つの課題は，非特定の背景信号が増加することがあるという点である。同じ比率で特定分析信号と背景信号とが増加することは同一の信号対背景比に帰着し，感度の改善にはならない。一般に，多糖類の免疫分析に用いられる多くの固相物質に対する非特定結合は無視できる程度である。したがって，フィコール高分子担体は，固相に対する非特定結合を最小にしつつ，特定結合における信号を増加させる。したがって，感度を向上させる信号対背景比の改善になる。

フィコールは，代替物である多糖類デキストランに対して有利である。デキストランは直鎖分枝点がわずかであるため，分子量分布の点で極めて多分散である。タンパク質を多糖類担体に結合させる際に，出発物質が規定された狭い分子量範囲のものであるとき，再現性のある結果が得られる。フィコールの分枝構造が，フィコールに化学的切断又は機械的せん断に対するいくらかの許容度を与え，したがって分子量に関する影響を最小化する。フィコールの分枝構造の別の側面は，重合体と免疫分析に用いられる固相物質との相互作用を最小化し，結果的にほかの多糖類に比べて非特定結合が低いことである。

フィコール４００（分子量）は多分散であり，この物質の大部分は，免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）よりもずっと小さな分子に分かれる。理想的な多糖類担体は，百万ダルトンを超える分子量を有し，セファロース４Ｂ ＣＬカラムの空隙容量又はその近傍で溶離することが望ましい。そのような高分子量重合体が実践的に利用価値のあることを示すフィコール４００調製物は，極めてわずかである。

本発明の一態様は，高分子重合体を生成するために，フィコールの架橋誘導体を調製することである。フィコールの架橋化は，重合体内の分枝の程度を更に増加させる。本発明のこの態様の利点は，架橋化学を制御することによってフィコール重合体を広範な分子量で準備できる点にある。百万ダルトンを超える分子量を有する架橋フィコールを得ることができ，この重合体は可溶性のままである。このような重合体は，蛍光染料及びタンパク質の抱合のために更に誘導体化できる。抱合重合体は，固相結合分析において単一増幅を示し，最も驚くことには，固相に対する非特定結合が低いことを示す。このような性能特徴は，フィコール４００又はほかの多糖体類の商業的調製物には期待されない。

架橋フィコール混合物は，次の特徴を有することが望ましい。（ａ）２．５，５又は１０ｍｇ／ｍｌを超える可溶性がある。（ｂ）平均流体力学直径が１００，１５０又は２００ｎｍを超える。（ｃ）分子量が１，２，５又は１０ＭＤを超える。（ｄ）結合分子及び／又は蛍光染料分子を付着させるために，フィコール当たり少なくとも２５個の官能基を有する。

フィコールのアミン誘導体は商業的に入手可能であり，架橋を可能にする。図１０は架橋フィコールを調製するフローチャートである。

多くの蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は，ストレプトアビジンすなわち抗体のようなタンパク質のアミン基への結合を可能にするＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）として商業的に入手可能である。Ｃｙ５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７はよい例である。蛍光標識化タンパク質は，慣用のマレイミド／チオールタンパク質抱合手順又はほかの架橋法を用いてアミノフィコールに結合される。図１１は，架橋フィコールへの抗体抱合のフローチャートである。

架橋フィコールはＣｙ５‐抗フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の高分子担体として役立ち，このような抱合体は単量体Ｃｙ５‐抗ＦＩＴＣに比べて免疫分析感度を向上させるために用いることができる。

本発明を以降の実施例によって更に説明するが，これは，本発明の範囲を記載された特定の手順に限定するものと解釈してはならない。

＜架橋フィコール４００の調製＞
図１０は，架橋フィコール４００を調製するフローチャートである。

リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の，フィコール４００ｋＤ（Skold Technology）当たり８８アミンを含む，アミノ化された２０ｍｇ／ｍｌのフィコール４００（Sigma/Aldrich)２ｍｌに，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の５０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ（succinimydyl 6‐[3‐[2‐pyridyldithio]‐proprionamido]hexanoate, Invitrogen）１０μｌを加えた。フィコールに対するＳＰＤＰの分子結合比（ＭＣＲ）は１５であった。混合物は室温で１時間反応させ，その後透析された。チオールの取り込みは，標準の方法によって，フィコール４００ｋＤ当たり５．５と推定された。

ＳＰＤＰで標識付けされたフィコール４００上のチオールを脱保護するために，ジチオスレイトール（ＤＴＴ，Thermo Scientific）の３０μｌを，１ｍｌのＰＢＳ中の２０ｍｇに加え，室温で２時間反応させた。ＳＨ‐フィコールは，ＰＤ１０カラムで精製した。

次の二つの調製によって，アミン化したフィコール４００（８８アミン／フィコール）にＳＭＣＣ（succinimidyl 4‐[N‐malemidomethyl]cyclohexan‐1‐carboxylate）が結合された。１．）１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのアミン化フィコール４００を，ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ（Pierce Chemical）２５μｌと混合し，ＳＭＣＣ／フィコールＭＣＲ３０とした。混合物は室温で２時間反応させ，続いてＰＤ１０カラム（GE Healthcare）で精製した。２．）１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのアミン化フィコール４００をＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ１２．５μｌと混合し，ＳＭＣＣ／フィコールＭＣＲを１５とした。混合物は室温で２時間反応させ，続いてＰＤ１０カラムで精製した。

ＳＨ‐フィコール４００とＳＭＣＣ‐フィコール４００とを架橋させるために，次の二つの調製を行った。１．）１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのＳＨ‐フィコール４００を，１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのＳＭＣＣ‐フィコール４００と混合した（３０ＭＣＲ）。２．）１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのＳＨ‐フィコール４００を，１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのＳＭＣＣ‐フィコールと混合した（１５ＭＣＲ）。各混合物は３０°Ｃで一晩反応させた。

架橋フィコール４００への抗体抱合の結合場所を提供するために，残差アミンを過剰ＳＰＤＰと反応させた。架橋フィコール４００の２０ｍｇをＤＭＦ中の５０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ７５μｌと混合した。混合物は室温で１時間反応させ，続いてＰＢＳに対して透析した。

ＳＰＤＰで標識化した架橋フィコール４００調製物は，セファロース４Ｂ ＣＬ（GE Healthcare）カラムで分画した。結果によると，架橋フィコールは，元のフィコール４００よりもずっと大きな重合体であり，架橋の程度はＳＭＣＣのＭＣＲに依存する。高分子重合体は４Ｂ ＣＬの空隙容量又はその近傍で溶離され，フラクション４０〜５０，フラクションのピークは約４５であり，ＳＭＣＣ ＭＣＲ３０が得られた（図１２参照）。これらは，引き続いて結合タンパク質及び蛍光染料担体と抱合させるために好適な重合体である。比較のために，空隙フラクションはフラクション３２であり，非架橋ＳＰＤＰ‐フィコールは高分散であり，ピークフラクション約９８，フラクション５０〜１２０で溶離された。

＜Ｃｙ５‐抗体‐架橋フィコール抱合体の調製＞
図１１はＣｙ５‐抗体‐架橋フィコール４００を調製するフローチャートである。１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の３．２ｍｇ／ｍｌの抗ＦＩＴＣ（Biospacific）を，ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐ＮＨＳ（GE Healthcare）１０μｌと混合し，３０°Ｃで３０分反応させた。次に混合物をＰＤ１０カラムで精製した。１ｍｌのＰＢＳ中の１．５ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐抗ＦＩＴＣを，ＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ１．９μｌと混合して，室温で１時間反応させ，続いてＰＤ１０カラムで精製した。

架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰ上のチオールは，１ｍｌのＰＢＳ中の０．７ｍｇの架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰに対して３８ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ３０μｌを加えて脱保護し，室温で１時間反応させ，その後，架橋フィコールをＰＤ１０カラムで精製した。

Ｃｙ５‐抗ＦＩＴＣ‐ＳＭＣＣを架橋フィコール４００‐ＳＨと混合して，室温で一晩反応させた。そして，１２．５ｍｇ／ｍｌのＮ‐エチルマレイミド（ＮＥＭ，Aldrich）１０μｌを加え，室温で３０分反応させた。そして抱合体はセファロース４Ｂ ＣＬカラムで精製した。

＜Ｃｙ５‐抗体デキストラン抱合体の調製＞
Ｃｙ５‐抗体デキストラン（直鎖）抱合体（米国特許第５，６５０，３３４号に記載されている）を比較検討のために調製した。

１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の３．２ｍｇ／ｍｌの抗ＦＩＴＣ（Biospacific）を，ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐ＮＨＳ（GE Healthcare）１０．６μｌと混合し，３０°Ｃで３０分反応させた。そして混合物はＰＤ１０カラムで精製された。

１ｍｌのＰＢＳに１．５ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐抗ＦＩＴＣを，ＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ１．９μｌと混合し，室温で１時間反応させ，ＰＤ１０カラムで精製した。

デキストランをチオールと反応させるために，ＤＭＦ中の３４ｍｇ／ｍｌのＬＣ−ＳＰＤＰ（succinimydyl 6‐[3‐[2‐pyridyldithio]‐proprionamido]hexanoate）（Pierce #21651）の溶液１５０μｌを，ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍｌのアミノデキストラン（Molecular Probes, #D‐7145, １３０アミン／デキストラン, 分子量２０００ｋダルトン）を含む５ｍｌの溶液に加えた。反応は室温（ＲＴ）で３０分行い，次に混合物をＰＢＳに対してＲＴで一晩透析した。反応中に，アミノデキストラン中の９５％以上のアミンがＬＣ−ＳＰＤＰで標識付けされた。そしてＬＣ−ＳＰＤＰ‐デキストランをセファロース４Ｂ ＣＬカラムで精製した。低分子量のデキストランフラクションを取り除くために，空隙ピークのフラクションだけを収集した。

ｐＨ７.４のＰＢＳ中の２．６ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐抗ＦＩＴＣの溶液６．１５ｍｌを，ＤＭＦ中の２．７ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ（Pierce #22320）１５６μｌと混合し，ＲＴで３０分反応させた。反応しなかったＳＭＣＣは，ＰＤ１０カラムで生成して除去した。

ＬＣ−ＳＰＤＰデキストランは，３．１ｍｇ／ｍｌのＬＣ−ＳＰＤＰデキストラン５．２ｍｌに０．５Ｍのジチオストレイトール１５６μｌを加え，ＲＴにて１５分放置することによって減少させた。そして，デキストランはＰＤ１０（Pharmacia #17‐0851‐01）カラムで精製した。

減少したＬＣ−ＳＰＤＰをＳＭＣＣ−抗ＦＩＴＣと混合し，ＲＴにて一晩放置することによって抱合を行った。反応を停止させるために，最終濃度１．０ｍＭでＮＥＭ（Sigma #12828‐7）を加えた。そして，抱合物をセファロース４Ｂ ＣＬに加え，空隙容量に溶離しているフラクションを収集した。

＜トロポニンＩ分析材料＞
底面に固定されたベンゾフェノン‐ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）‐ビオチンを有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）でできた反応ディスクを次のように調製した。ディスク当たり１００μｌのベンゾフェノンＢＳＡ‐ビオチンを６０分間紫外線硬化させて，１０μｌ／ｍｌで固定した。

ストレプトアビジン単一クローン抗体抗ＴｎＩ抱合体（ＳＡ‐ａｎｔｉ ＴｎＩ）を，ヘテロ二機能性結合試薬と，Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（SATA, Pierce #26102）と，ＳＭＣＣ（Pierce #22320）とを用いて調製した。ＳＡＴＡ（ＤＭＦ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解）の１５モル過量を，ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．７４ｍｇ／ｍｌの抗ＴｎＩ（BioDesign）１ｍｇと室温で３時間反応させた。また，ＳＡＴＡ（ＤＭＦ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解）の１５モル過量を，ＰＢＳ中の１．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン１．１ｍｇと室温で３時間反応させた。反応しなかったリンカは，抗ＴｎＩ／ＳＡＴＡ反応混合物及びストレプトアビジン／ＳＭＣＣ反応混合物双方から，ＰＤ１０カラムを用いて除去した。精製した抗ＴｎＩ‐ＳＡＴＡ及びストレプトアビジン‐ＳＭＣＣをタンパク質モル比１：３で混合した。１Ｍのヒドロキシルアミンを最終濃度１００ｍＭまで加えることによって，抱合反応を開始し，４°Ｃで１８時間放置した反応混合物中の最終濃度１ｍＭで１００ｍＭのＮＥＭ（Aldrich Chemical）を加えて反応を停止させ，室温で１５分間放置した。ＮＥＭを加えた放置の後，セファクリルＳ３００カラム（GE Healthcare）を用いて混合物を精製した。

各ディスクに２５μｇ／ｍｌのＳＡ−抗ＴｎＩ４０μｌを加えて，室温にて１時間放置した。分析緩衝液はｐＨ７．４のＰＢＳに，１％のＢＳＡと，０．１％のツイーン２０とを加えたものであった。そして，ディスクを３回洗浄した。

親和性精製したヤギ抗ＴｎＩペプチド３（Biospacific）に，次のようにフルオレセインで標識付けした。１．８ｍｌのＰＢＳ中の抗体１ｍｇを，ＤＭＦ中の２ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン‐ＮＨＳ（Invitrogen）６４μｌと混合させて，室温にて２時間反応させ，その後，ＰＤ１０カラムで精製した。

＜トロポニンI免疫分析におけるＣｙ５‐抗ＦＩＴＣとＣｙ５‐抗ＦＩＴＣ‐架橋フィコールとの比較＞
ディスクに４０μｌの標本容量中０ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌのトロポニンIを加え，室温で１時間放置した。そのディスクを分析緩衝液中で３回洗浄した。各ディスクに１０μｇ／ｍｌのフルオルセインで標識付けした抗ＴｎＩペプチド３ ４０μｌを加え，室温で２５分間放置し，その後３回洗浄した。それぞれ抗体が１０μｇ／ｍｌであるＣｙ５−抗ＦＩＴＣ又はＣｙ５抗ＦＩＴＣ‐架橋（ｃｘ）フィコールいずれか４０μｌをディスクに加え，室温で２５分間放置し，その後３回洗浄した。そして，各ディスク面のＣｙ５フルオルセインを測定した（表１参照）。

＜トロポニンI免疫分析におけるＣｙ５‐抗ＦＩＴＣ‐架橋フィコールとＣｙ５‐抗ＦＩＴＣデキストランとの比較＞
ディスクに４０μｌの標本容量中０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンIを加え，室温で１時間放置した。そのディスクを分析緩衝液中で３回洗浄した。１０μｇ／ｍｌのフルオレセインで標識付けした抗ＴｎＩペプチド３ ４０μｌを各ディスクに加えて室温にて１２０分間放置し，その後３回洗浄した。それぞれ抗体が１０μｇ／ｍｌであるＣｙ５−抗ＦＩＴＣ‐デキストラン（実施例３参照）又はＣｙ５‐抗ＦＩＴＣ‐架橋フィコール（実施例２参照）いずれか４０μｌをディスクに加え，室温で２５分間放置し，その後３回洗浄した。そして，各ディスク面のＣｙ５フルオルセインを測定した（表２参照）。

＜Ｃｙ５‐ストレプトアビジン‐架橋フィコールの調製＞
ストレプトアビジンのＣｙ５による標識付け
ＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐ＮＨＳ（GE Healthcare）３２μｌをｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の２．４ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Scripps Labs）１ｍｌと３０°Ｃで４０分間反応させた。その混合物をＰＤ１０カラム（Pharmacia）に加えて，未抱合のＣｙ５を除去した。スペクトル分析によれば，ストレプトアビジン分子当たり２．８個のＣｙ５が結合した。

架橋フィコールへのＣｙ５‐ストレプトアビジンの抱合
ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ（Pierce Chemical）５．８μｌを，ｐＨ７．４のＰＢＳ１ｍｌ中のストレプトアビジン２ｍｇと室温で１時間反応させた。その混合物をＰＤ１０カラムに加えて，未結合のＳＭＣＣを除去した。

架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰ上のチオールを，１ｍｌのＰＢＳ中の１ｍｇの架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰに３８ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ３０μｌを加えて脱保護し，室温で１時間反応させ，その後，ＰＤ１０カラムによって架橋フィコールを精製した。

Ｃｙ５‐ストレプトアビジン‐ＳＭＣＣを架橋フィコール４００‐ＳＨと混合して，室温で一晩反応させた。そして１２．５ｍｇ／ｍｌのＮＥＭ（Aldrich）１０μｌを加えて室温で３０分間反応させた。そして抱合体をセファロース４Ｂ ＣＬカラムで精製した。

＜Ｃｙ５で標識付けした架橋フィコールの調製及びストレプトアビジンへの抱合＞
上記の方法（実施例２，３及び７）は，結合タンパク質に二つの化学的修正を行う必要がある。一つ目はＣｙ５による標識付けであり，二つ目はＳＭＣＣを架橋フィコールに抱合できるようにすることである。いくつかの場合，特に抗体については，二つの化学的修正は，結合能力が失われることになるので，望ましくないことがある。次の方法は，架橋フィコールをＣｙ５で直接標識付けし，次いで結合タンパク質に抱合させる。したがって，この方法は結合タンパク質に一つの化学的修正しか必要としない。

Ｃｙ５で標識付けされた架橋フィコールの調製
ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍｌのフィコール４００ｋＤ（Skold Technology）当たり８８個のアミンを含むようにアミノ化されたフィコール４００（Sigma/Aldrich）２ｍｌに，ＤＭＦ中の５０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ（Invitrogen）１０μｌを加えた。ＳＰＤＰ対フィコールの分子結合比（ＭＣＲ）は１５であった。混合物は室温で１時間反応させ，次いで透析した。チオールの取り込みは，標準の方法でフィコール４００ｋＤ当たり５．５と推定された。

ＳＰＤＰで標識付けされたフィコール４００上のチオールを脱保護するために，１ｍｌのＰＢＳ中２０ｍｇに，ＰＢＳ中の３８ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ（Thermo Scientific）３０μｌを加え，室温で２時間反応させた。ＳＨ‐フィコールはＰＤ１０カラムで精製した。

ＳＭＣＣは，次のようにアミン化したフィコール４００（８８アミン／フィコール）に結合させた。１ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇのアミン化したフィコール４００（８８アミン／フィコール）を，ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ（Pierce Chemical）２５μｌと混合して，ＳＭＣＣ／フィコールＭＣＲ３０を得た。混合物を室温で２時間反応させ，その後ＰＤ１０カラムで精製した。

ＳＨ‐フィコール４００とＳＭＣＣ‐フィコール４００とを架橋させるために，１ｍｌのＰＢＳ中のＳＨ‐フィコール４００ １０ｍｇを，１ｍｌのＰＢＳ中のＳＭＣＣ‐フィコール４００ １０ｍｇと混合させた（ＭＣＲ３０）。混合物は３０°Ｃで一晩反応させた。

架橋フィコール４００へのタンパク質抱合の結合場所を提供するために，残留アミンをＭＣＲ３０のＳＰＤＰと反応させた。架橋フィコール４００ ２０ｍｇをＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ６４μｌと混合した。混合物を室温で１時間反応させ，次いでＰＢＳに対して透析した。ＳＰＤＰをＭＣＲ３０に修正することによって，後に続くＣｙ５‐ＮＨＳによる標識付けに十分な数のアミノ基が残る。ＳＰＤＰで標識付けされた架橋フィコール４００の調製物は，次にセファロース４Ｂ ＣＬ（GE Healthcare）カラムで分画した。

Ｃｙ５標本付けのために，ＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍｌのＣｙ５‐ＮＨＳ１５μｌを，ｐＨ９．０の０．１Ｍ炭酸ナトリウム１ｍｌ中のＳＰＤＰ‐架橋フィコール１ｍｇと室温で１時間反応させた。その混合物をＰＤ１０カラムで精製した。架橋フィコールは平均分子量４百万ダルトンであると仮定すると，スペクトル分析によれば，架橋フィコール当たり４５個のＣｙ５が取り込まれた。抗体及びストレプトアビジンは通常約２個のＣｙ５で標本付けされる。

Ｃｙ５‐架橋フィコールへのストレプトアビジンの抱合
ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ（Pierce Chemical）５．８μｌを，ｐＨ７．４のＰＢＳ１ｍｌ中のストレプトアビジン２ｍｇと室温で１時間反応させた。混合物をＰＤ１０カラムに加えて未結合のＳＭＣＣを除去した。

Ｃｙ５‐架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰ上のチオールを，１ｍｌのＰＢＳ中の架橋フィコール４００‐ＳＰＤＰ０．７ｍｇに，３８ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ３０μｌを加えて脱保護し，室温で１時間反応させ，次いでＰＤ１０カラムで架橋フィコールを精製した。

ストレプトアビジン‐ＳＭＣＣをＣｙ５‐架橋フィコール４００‐ＳＨと混合し，室温で一晩反応させた。そして１２．５ｍｇ／ｍｌのＮＥＭ（Aldrich）１０μｌを加えて，室温で３０分反応させた。そして抱合物をセファロース４Ｂ ＣＬカラムで精製した。

＜タンパク質Ａの免疫分析：プローブフォーマット＞
プローブの調製
直径１ｍｍ，長さ２ｃｍの石英プローブを，製造業者の手順による化学蒸着処理（Yield Engieering Systems, 1224P）を用いてアミノプロピルシランで覆った。そしてプローブチップをｐＨ７．４のＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのマウス単一クローン抗フルオレセイン（Biospacific）の溶液に浸した。抗体がプローブに吸収されるのを５分間待ち，プローブチップをＰＢＳで洗浄した。そしてプローブチップをＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの親和性精製したフルオレセインで標識付けしたニワトリ抗タンパク質Ａ（Cygnus Technologies）を含む溶液に浸した。抗体は標準の方法でフルオレセイン化した。１０分後にプローブをＰＢＳで洗浄した。

タンパク質Ａ免疫分析
分析フォーマットは図１３に示されている。

抗タンパク質Ａで覆われたプローブチップを，分析緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと，０．１％のツイーン２０とを含むＰＢＳ）に希釈した２００μｌのタンパク質Ａを入れたマイクロウェルに浸した。マイクロウェルはオービタルミキサ（Big Bear Automation）の上に置き，プローブを静止状態に保ち，オービタルミキサを直径２ｍｍの環状ストローク，２５０ｒｐｍで動かした。３０分後にプローブチップをＰＢＳで３回洗浄した。そしてプローブチップを分析緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのビオチンで標識付けし，親和性精製したニワトリ抗タンパク質Ａ（Cygnus Technologies）２００μｌを入れたマイクロウェルに浸した。抗タンパク質Ａは，標準の方法でビオチン化した。２５０ｒｐｍの環状流動で５分間放置した後，プローブをＰＢＳで３回洗浄した。そして，プローブチップを，分析緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのＣｙ５‐ストレプトアビジン‐架橋フィコールを入れたマイクロウェルに浸した。２５０ｒｐｍの環状流動で５分間放置した後，プローブチップをＰＢＳで３回洗浄した。プローブチップに結合したＣｙ５フルオレセインを，図１に示した光学系で測定した。表３に結果を示す。

本発明及び本発明を作成し使用する方法及び過程を，当業者が同じものを作成し使用できるために十分，明確，簡潔，かつ正確な用語で説明した。上記は本発明の公的な実施形態を説明したものであって，特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱すること泣く，修正を行ってもよいことを理解されたい。発明の主体を得に指摘し，はっきりと請求するために，次の各請求項が本明細書を完結する。

Claims (18)

1. 蛍光分析において蛍光信号を測定する検出システムであって，
   長さ対幅のアスペクト比が少なくとも５：１であるプローブであって，遠端及び近端を有し，該近端は蛍光標識と結合した感知面を有する，プローブと，
   前記プローブの感知面に直接励起光を放射する光源と，
   前記感知面に向けられた集光レンズと，
   前記の放射蛍光光を検出する光検出器と，を備え，
   前記集光レンズは前記放射蛍光光を集光して，前記光検出器へ向ける，検出システム。
2. 前記プローブのチップ面は直径５ｍｍ以下である請求項１に記載のシステム。
3. 前記プローブは透明である請求項１に記載のシステム。
4. 前記プローブの前記遠端は，不要な反射を減少させるためにテーパが付けられているか，及び／又は粗面仕上げされている請求項３に記載のシステム。
5. 前記光源は，前記チップ面に投射される光ビームが，前記プローブの開口数角より大きい入射角を有するように配置される請求項３に記載のシステム。
6. 前記プローブは，不透明なモノリシック棒である請求項１に記載のシステム。
7. 前記感知面は，アルミニウム，金又は銀から選択された薄膜であり，該薄膜は約５０ｎｍから約５００μｍの厚みを有する請求項１に記載のシステム。
8. 溶液を入れた容器を更に備え，前記プローブの近端は該溶液に浸され，前記光源及び前記集光レンズは前記容器の底面に取り付けられている請求項１に記載のシステム。
9. 液体標本内の分析物を検出する方法であって，
   プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，前記チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，
   前記プローブチップを，分析物を有する液体標本を入れた標本容器に浸すステップと，
   前記プローブチップを前記標本容器内で上下させ，前記標本容器内の試薬溶液を横方向に流動させて，前記分析物と前記第１抗体とを結合させるステップと，
   少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む試薬溶液を入れた試薬容器に前記プローブチップを浸すステップと，
   前記プローブチップを前記試薬容器内で上下させ，該試薬容器内の前記試薬溶液を横方向に流動させて，前記プローブチップ上に，前記分析物と，前記第１抗体と，前記第２抗体との免疫複合体を形成するステップと，
   洗浄溶液を入れた洗浄容器に前記プローブチップを浸すステップと，
   前記プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，前記の形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，
   前記第１抗体及び前記第２抗体は，前記分析物に対する抗体である，方法。
10. 液体標本内の分析物を検出する方法であって，
    プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，前記チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，
    （ｉ）分析物を有する液体標本と，（ｉｉ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む試薬溶液とを入れた標本容器に前記プローブチップを浸すステップと，
    前記プローブチップを前記標本容器内で上下させ，前記標本容器内の試薬溶液を横方向に流動させて，前記プローブチップ上に，前記分析物と，前記第１抗体と，前記第２抗体との免疫複合体を形成するステップと，
    洗浄溶液を入れた洗浄容器に前記プローブチップを浸すステップと，
    前記プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，前記の形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，
    前記第１抗体及び前記第２抗体は，前記分析物に対する抗体である，方法。
11. 液体標本内の分析物を検出する方法であって，
    （ａ）プローブのチップ上に固定された第１抗体を有するプローブを取得するステップであって，前記チップの面の直径は５ｍｍ以下である，ステップと，
    （ｂ）前記プローブチップを，分析物を有する液体標本を入れた標本容器に浸し，前記プローブチップを前記標本容器内で上下させ，前記標本容器内の標本溶液を横方向に流動させるステップと，
    （ｃ）結合対の第１要素と抱合させた第２抗体分子を含む試薬溶液を入れた試薬容器に前記プローブチップを浸し，前記プローブチップを前記試薬容器内で上下させ，該試薬容器内の前記試薬溶液を横方向に流動させるステップと，
    （ｄ）少なくとも百万ダルトンの分子量を有し，少なくとも５個の第２抗体分子及び少なくとも２５個の蛍光標識と抱合させた重合体を含む増幅溶液を入れた増幅容器に前記プローブチップを浸し，前記プローブチップを前記増幅容器内で上下させ，前記増幅容器内の増幅溶液を横方向に流動させて，前記プローブチップ上に，前記分析物と，前記第１抗体と，前記第２抗体と，前記結合対の第１要素及び第２要素との免疫複合体を形成するステップと，
    （ｅ）第２洗浄溶液を入れた第２洗浄容器に前記プローブチップを浸すステップと，
    （ｆ）前記プローブチップ上の蛍光信号を検出することによって，前記の形成された免疫複合体を検出するステップと，を有し，
    前記第１抗体及び前記第２抗体は，前記分析物に対する抗体である，方法。
12. 前記チップ面は約２ｍｍ以下である請求項９，１０又は１１に記載の方法。
13. 前記結合対の第１要素はビオチンであり，前記結合対の第２要素はストレプトアビジンである請求項１１に記載の方法。
14. 少なくとも百万ダルトンの分子量を有する架橋フィコールと，
    少なくとも５個の結合分子と，
    少なくとも２５個の蛍光染料分子と，を有する混合物であって，
    前記結合分子及び前記蛍光染料分子は，前記架橋フィコールに付着している混合物。
15. 前記蛍光染料分子は，前記結合分子を介して前記架橋フィコールに間接的に付着している請求項１４に記載の混合物。
16. 前記結合分子は抗体分子すなわちストレプトアビジンである請求項１４に記載の混合物。
17. 前記蛍光染料分子はアリールスルホン酸塩シアニンである請求項１４に記載の混合物。
18. 前記アリールスルホン酸塩シアニンはＣｙ５である請求項１７に記載の混合物。

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