WO2018030295A1 - 繊維状物質を用いる検出方法 - Google Patents

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WO2018030295A1
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antibody
solution
substance
flagella
gold colloid
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PCT/JP2017/028402
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松葉隆雄
小林龍司
武藤悠
康俊 河合
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東ソー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a detection system that utilizes fibers for detecting intermolecular interactions.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the principle is that there is an overlap between the fluorescence spectrum of one fluorescent molecule (hereinafter abbreviated as “donor”) and the excitation spectrum of another fluorescent molecule (hereinafter abbreviated as “acceptor”). This is a phenomenon in which fluorescence energy excites the acceptor, and fluorescence derived from the acceptor is generated.
  • a sandwich assay in which an antigen is sandwiched between two antibodies will be described as an example. When one antibody is labeled with a donor and the other antibody is labeled with an acceptor, energy transfer occurs when two labeled antibodies come close to each other via an antigen, and a fluorescent signal of the acceptor is generated.
  • the fluorescence signal increases according to the amount of antigen, the amount of antigen can be quantified homogeneously.
  • the donor and the acceptor are close to each other with a certain probability, and a signal associated therewith is generated. This is the background signal.
  • the homogeneous system has the advantage that the reaction rate is high, but has the disadvantage that the S / N ratio is not high. Therefore, in the case of a measurement system that requires a high S / N ratio, a heterogeneous measurement system that performs a B / F separation operation is often employed. This is because the B / F separation operation can remove substances not involved in the reaction out of the system, so that the background signal can be greatly reduced and the S / N ratio is improved. For this purpose, it is necessary to immobilize a substance capable of binding to the measurement target (hereinafter, exemplified by an antibody) on a water-insoluble carrier or the like. However, in that case, since the reaction between the measurement object and the antibody becomes a solid-liquid reaction, it takes time to reach an equilibrium as compared with the homogeneous reaction.
  • the measurement target hereinafter, exemplified by an antibody
  • reaction time As a method for shortening the reaction time, there is a method in which a water-insoluble carrier is made into fine particles. Then, since the dispersion degree of the antibody in a solution becomes high, reaction rate will improve. For example, a method of using magnetic fine particles as a water-insoluble carrier and magnetically separating the fine particles can be exemplified. Furthermore, the reaction speed increases because the closer to the homogeneous measurement system as the micronization progresses, but simple B / F separation by magnetic separation becomes difficult, and complicated separation by centrifugation operation is necessary. It becomes. In other words, the construction of the measurement system itself becomes complicated and it is difficult to use it in the industry.
  • the water-insoluble carrier is several ⁇ m to submicron, which can be separated in a short time by magnetism etc. It was realistic to use fine particles up to.
  • the present invention is as follows. (1) a) a first recognition substance bonded to a fibrous substance, b) a labeled second recognition substance, and c) a substance to be detected (provided that both the first recognition substance and the second recognition substance can bind to the substance to be detected) in a dispersed state. Contacting with each other to form a complex in which a, b, and c are bound to each other, separating the complex from b that has not been bound, and detecting a label of the obtained complex. And a detection method of a substance to be detected. (2) The method according to (1), wherein the fibrous substance is a linear fiber.
  • the fibrous material is a fiber constructed by self-organization or a polymer produced by an electrospinning method.
  • the separation method is any one of filtration separation, centrifugation and electrophoresis.
  • the recognition substance is an antibody against the detection target substance.
  • the form of the fibrous substance used in the present invention is not limited as long as it can exist in a dispersed state in the solution even when bound to the first recognition substance.
  • Any fiber may be used as long as it has a characteristic that it can exist in a dispersed state in a buffer solution to be used or a buffer solution containing protein.
  • the fibrous material shows a state where the difference in concentration between the upper part and the lower part of the solution is within 20%, preferably within 10%.
  • Examples of the fibrous substance include not only those composed of a single linear fiber, but also those that are branched in the middle, those that are bent, those that are mesh-like, and the thickness of the fiber Even if it is not uniform, it may be present in a dispersed state in the solution and has physical properties such as filtration separation.
  • fibrous materials obtained by defibrating natural products often contain irregular branch-like structures in the middle of fiber unraveling. Therefore, it is preferable to reduce the structure to such an extent that it does not cause a practical problem. The clear reason that the structure leads to an increase in the background signal is unknown, but it is expected that a label such as a gold colloid is captured by irregular branching.
  • linear fibers can be preferably used for this purpose.
  • fibers constructed by self-organization of peptides and proteins and polymers produced by electrospinning can be preferably used for this purpose.
  • the shape of the cross section of the fiber is not particularly limited, and it may be not only a symmetrical shape such as a circle, a rectangle, a rhombus, a star, but also a shape that does not have a fixed shape.
  • the fibers may be present separately one by one, or a plurality of fibers may be gathered or a plurality of fibers may be gathered into a twisted shape or a sheet shape.
  • the size of the fibrous substance cannot be defined unconditionally depending on the shape of the fibrous substance, the protein concentration of the solution used, and the type of buffer solution.
  • the diameter Is 1 to several micrometers, preferably 1 to 500 nanometers, and a length of 100 nanometers to 50 micrometers (hereinafter sometimes abbreviated as nanofibers).
  • the length ratio is 2 or more, preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and the upper limit is not particularly limited, but 10,000 or less can be exemplified.
  • the types of fibrous substances used in the present invention include, for example, protein fibers such as flagella, microtubules, amyloid fibers, actin filaments, collagen, laminin, and gelatin.
  • protein fibers such as flagella, microtubules, amyloid fibers, actin filaments, collagen, laminin, and gelatin.
  • proteins include carbon nanofibers, cellulose nanofibers, carboxymethylcellulose nanofibers, chitin nanofibers, chitosan nanofibers and derivatives thereof, and metal fibers such as gold, silver, copper, cobalt, nickel, etc.
  • metal oxide fibers such as titanium oxide, zinc oxide, aluminum oxide, and tungsten oxide can also be used.
  • nanofibers produced by an electrospinning method can also be used.
  • examples of polymers that can be produced by electrospinning include PVDF, polystyrene, polylactic acid, nylon, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyaniline, polyurethane, polyhydroxybutyrate, polycaprolactone, chitosan.
  • examples include a method of spinning collagen, cellulose and the like alone, a method of spinning a plurality of polymers after blending, a method of spinning a copolymer, and a method of spinning by mixing materials other than the polymer to improve the function. .
  • Nanofibers produced by other methods can also be used.
  • the method for producing the nanofiber is not particularly specified.
  • a method for culturing and extracting microorganisms a method for culturing by adding various materials during culturing, a method for pulverizing natural materials, a method for chemically growing raw materials, etc. it can.
  • the recognition substance can be appropriately selected depending on the reaction system to be constructed.
  • proteins, peptides, organic substances, inorganic substances, nucleic acids, and the like can be used, and antibodies and the like are preferably used as examples of protein-based recognition substances.
  • As a method for immobilizing the recognition substance it may be bonded to the fibrous substance via a chemical bond or some tag.
  • a reaction between amino groups, a reaction between an amino group and an SH group, a reaction between an amino group and a carboxy group, and the like can be exemplified, but other methods may be used.
  • immobilization via a functional group can be performed by presenting a functional group on the fiber surface by a genetic engineering technique.
  • Examples of the latter method include a combination of a tag peptide and a tag recognition antibody, a method using the binding property of biotin and avidin, and the like.
  • a recognition substance such as a protein can be bound.
  • the antibody can be immobilized on the polymer surface by hydrophobic bonding, and can also be immobilized via a functional group on the surface.
  • the fiber on which the recognition substance is immobilized can be stored by methods such as refrigeration, freezing, and freeze-drying. At this time, various stabilizers and the like can be added as necessary.
  • the first recognizing substance and the second recognizing substance are used, but they may be the same or different as long as they can simultaneously be bound to the detection target substance.
  • labeling substances include colloidal gold, dyes, fluorescent dyes, fine particles, fluorescent fine particles, enzymes, and the like, and they may be detected by a detection method corresponding to these labeling substances.
  • a detection method corresponding to these labeling substances.
  • the detection target substance is not particularly limited, and the target substance measured by a normal immunoassay can be measured.
  • antigens, protein substances, low molecular organic compounds, viruses, bacteria, cells, and the like can be exemplified, but are not limited thereto.
  • a) a first recognition substance bound to a fibrous substance; b) A labeled second recognition substance and c) a substance to be detected are brought into contact in a dispersed state in a solution to form a complex in which a, b, and c are bound.
  • the contact order at this time is not particularly limited, and may be contacted sequentially or simultaneously.
  • c that has not been bonded is removed by filtration separation or the like, and then b is brought into contact with each other. This is a preferable method because it has excellent sensitivity. .
  • an additive can be added to the detection system in order to increase the dispersibility of the fibrous substance.
  • an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant can be exemplified.
  • the dispersibility of the fibrous substance can be enhanced by adding protein or polyethylene glycol.
  • the reaction time between the recognition substance and the detection target substance is usually 10 minutes or less, preferably 3 minutes or less, more preferably 1 minute or less, although it varies depending on the binding force of the recognition substance and the size and dispersity of the fibrous substance.
  • the separation method is not particularly limited, and the separation can be performed by a method such as filtration separation, centrifugation, or electrophoresis.
  • a filtration membrane can be used as a filtration separation method.
  • a filtration membrane may be selected so that the above-mentioned complex does not pass and b that has not been bound passes.
  • materials such as ordinary filter paper, glass fiber, PVDF, and pore size filters of 0.22, 0.45, and 0.6 micrometers can be exemplified, but the material and film thickness are not particularly limited.
  • the centrifugal method can be separated by centrifuging at a gravitational acceleration at which the fibrous substance to which the labeled body is bound precipitates but the labeled body does not precipitate.
  • separation can be performed based on the difference in mobility between the fibrous substance to which the label is bound and the label under a certain electric field.
  • the detection target substance can be detected by detecting the label of the separated complex.
  • the detection at this time may be quantitative or qualitative.
  • a water-insoluble carrier When the shape of a water-insoluble carrier is changed to a fibrous material as in the present invention, it becomes possible to exist in a dispersed state in the solution as the diameter of the fibrous material becomes thinner. Unless otherwise, stay in solution and disperse. Furthermore, since it has sufficient length in the major axis direction, it becomes possible to easily separate the fibrous substance by filtration or the like. In other words, by using a fibrous substance, it is possible to construct a measurement system having characteristics that are contradictory to the conventional philosophy of reacting in a homogeneous system and capable of being easily separated. By using the method of the present invention, a measurement system with a short reaction time and a high S / N ratio can be constructed as compared with a normal heterogeneous measurement system.
  • E. coli expressing the H48 antigen It is an electron micrograph of purified H48 antigen. It is a figure which shows SDS-PAGE of the purified H48 antigen. It is a figure which shows reaction (1) of a peptide bond flagella and a peptide recognition antibody fixed gold colloid. It is a figure which shows reaction (2) of a peptide bond flagella and a peptide recognition antibody fixed gold colloid. It is a transmission electron micrograph after reaction (2). It is a figure which shows reaction (3) of a peptide bond flagella and a peptide recognition antibody fixed gold colloid. It is a figure which shows reaction (4) of a peptide bond flagella and a peptide recognition antibody fixed gold colloid.
  • FIG. 6 is an SDS-PAGE photograph of purified cysteine-substituted flagella (Example 5).
  • FIG. 6 is a transmission electron micrograph of purified cysteine-substituted flagella (Example 5).
  • FIG. 6 is an SDS-PAGE photograph of a product obtained by immobilizing an antibody on cysteine-substituted flagella (Example 5). It is the photograph of the membrane filter which performed the detection of BNP from which density
  • Example 6 It is a photograph of the filter after filtering a sample (Example 6). It is the figure which quantified the density of the band with the immunochromatography reader (Example 6). It is the result of measuring the absorbance with a spectrophotometer. (Example 7). It is the result of having analyzed the photograph of the gel after agarose electrophoresis, and (Example 8). It is a photograph of the filter after filtering a sample (Example 9). It is the figure which quantified the density of the band with the immunochromatography reader (Example 9). It is an electron micrograph of a short chain nanofiber (Example 10).
  • Example 10 which is the photograph of the filter after filtering a sample, and quantifying the density of the band with the immunochromatography reader. It is the figure after filtering the sample, and the figure which quantified the density of the band with the immunochromatography reader (comparative example 1). It is the figure which quantified the density of the band with the immunochromatography reader (comparative example 1). It is the figure which compared the difference in color intensity with a flagella and particle
  • Flagella were prepared by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-279176. Briefly, a plasmid obtained by cloning a gene encoding the H48 antigen of Escherichia coli into pET-19b (manufactured by Novagen) and a plasmid (pPG1-2) having a T7-RNA polymerase gene were transformed into a friC mutant strain of E. coli K12 strain ( YK4130) and cultured overnight at 30 ° C. in LB medium containing kanamycin (50 ⁇ g / ml) and ampicillin (100 ⁇ g / ml). Then, after confirming that flagella were formed in E.
  • flagella were collected as a pellet by the method described in the publication. From the transmission electron micrograph of flagella and the results of SDS-PAGE, it was shown that high-purity flagellar fibers were obtained (FIGS. 2 and 3).
  • peptide bond flagella (monomer) was obtained by heat-processing the said peptide bond flagella at 65 degreeC for 15 minutes.
  • Reference Example 3 Preparation of Gold Colloid Immobilized with Peptide Recognizing Antibody BM33-28 (antibody described in JP 2012-140331 A), which recognizes the cyclic portion of BNP, was prepared by F (ab ′) 2 according to a conventional method. And adjusted to 100 ⁇ g / ml with distilled water. 1 ml of the antibody solution was added to a solution of 9 ml of 40 nm colloidal gold solution (BBI) mixed with 1 ml of 50 mM phosphate buffer pH 7.0. Thereafter, the antibody was immobilized on the gold colloid by reacting at room temperature for 10 minutes.
  • BBI colloidal gold solution
  • the color of gold colloid remains on the filter, but in the case of peptide-bonded flagella (monomer) and when only the peptide-recognizing antibody-immobilized gold colloid is filtered, the color of gold colloid does not remain (white) This indicates that the antibody on the gold colloid surface binds to the peptide on the flagellar surface and remains on the filter.
  • Reference Example 6 TEM image of Reference Example 5
  • the peptide-bonded flagella prepared in Reference Example 2 was mixed with the peptide-recognizing antibody-immobilized gold colloid prepared in Reference Example 3 or a commercially available streptavidin-immobilized gold colloid (manufactured by BBI). Thereafter, it was negatively stained with phosphotungstic acid on a collodion membrane-attached mesh (manufactured by Nisshin EM), and a transmission electron micrograph was taken with JEM-1400plus (FIG. 6).
  • the photo on the left shows a mixture of peptide-bonded flagella and peptide-recognizing antibody-immobilized gold colloid
  • the photo on the right shows a mixture of peptide-bonded flagella and streptavidin-immobilized gold colloid. From this photograph, it was confirmed that the peptide antibody-immobilized gold colloid was specifically bound to the peptide-bonded flagella surface.
  • Reference Example 7 Reaction of peptide-bonded flagella and peptide antibody-immobilized gold colloid (3) After reacting the antibody-immobilized gold colloid (5 ⁇ l) prepared in Reference Example 3 with various amounts of peptide-bonded flagella prepared in Reference Example 2 (see numerical values in the figure) at room temperature for 5 minutes, 0.6 ⁇ m And filtered with a Durapore membrane filter. As a result, as the amount of peptide bond flagella decreased, the color of the gold colloid on the filter changed from red to black (FIG. 7).
  • Reference Example 8 Reaction of peptide-bonded flagella and peptide antibody-immobilized gold colloid (4)
  • 5 ⁇ l of the peptide-recognizing antibody-immobilized gold colloid prepared in Reference Example 3 and 10 ⁇ g of peptide-bonded flagella prepared in Reference Example 2 were mixed and filtered for various changes (see numerical values in the figure).
  • the color of the filter was observed (FIG. 8).
  • the color of the filter hardly changed after 60 seconds after mixing the both, it was confirmed that this was a measurement system in which the reaction proceeded in a very short time.
  • Example 1 Detection of BNP with antibody-bound flagella and ALP-labeled antibody
  • Binding of antibody to flagella 1 mg of flagella (diameter: about 20 nm, average length: 1.2 ⁇ m, linear) 75 ⁇ l of a solution in which 2 mg of SMCC (manufactured by Thermo) was dissolved in 250 ⁇ l of DMSO was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, unreacted reagents were removed with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 100 K used in Reference Example 2 to prepare flagella with a maleimide group introduced.
  • 3 mg of BC23-11 the antibody described in Japanese Patent No.
  • Example 2 Detection of BNP using antibody-bound flagella and antibody-immobilized gold colloid (1) Binding of antibody to flagella BM33-28 was digested with pepsin and reduced to produce a Fab 'antibody of BM33-28. did. Next, 6 ⁇ l of a DMSO solution of 250 mM SM (PEG) 12 (manufactured by Thermo) is added to 500 ⁇ l of the 1 mg / ml flagella solution prepared in Reference Example 1 (PBS, 10 mM EDTA solution), and reacted at room temperature for 1 hour. I let you.
  • BM33-28 Fab ′ antibody was added, PBS was added so that the reaction volume became 1 ml, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Reacted. Thereafter, unreacted Fab ′ antibody was removed with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 100 K used in Reference Example 2 to produce flagella bound with the Fab ′ antibody of BM33-28.
  • a colloidal gold a colloidal gold (WRGH1-60NM) having a diameter of 60 nm manufactured by Wine Red Chemical Co., Ltd. was used.
  • Example 3 Detection of BNP using antibody-bound cellulose and antibody-immobilized gold colloid (1) Binding of antibody to cellulose 2% cellulose (diameter: about 0.65 ⁇ m, length: about 4.8 ⁇ m) solution (manufactured by Sugino Machine) ) The supernatant obtained by centrifuging 2 ml at 100 ⁇ g for 5 minutes was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect the precipitate. A 5% solution of trimethoxy (3,3,3-trifluoropropyl) -silane (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was prepared with a 70% aqueous ethanol solution (pH 3.7), and this was added to the precipitate obtained by the centrifugation.
  • trimethoxy (3,3,3-trifluoropropyl) -silane manufactured by Tokyo Chemical Industry
  • the state of the gold colloid remaining on the membrane is shown in FIG. Moreover, the result of having measured the color intensity by the gold colloid on a membrane with the immunochromatography reader is shown in FIG. It was confirmed that the color intensity derived from colloidal gold was increased according to the BNP concentration. Thus, it was shown that a system capable of visually detecting a sandwich assay of BNP using cellulose fibers can be constructed.
  • Example 4 Detection of BNP using antibody-bound chitosan (diameter: about 0.4 ⁇ m, length: about 3.5 ⁇ m) and antibody-immobilized gold colloid (1) Conversion of chitosan amino group to thiol group It was suspended in 1 ml PBS solution so that it might become 0.05% (weight / volume). Next, this solution was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and chitosan was recovered as a pellet.
  • this solution was centrifuged at 8000 g and 10 ° C. for 15 minutes, and the colloidal gold was recovered as a pellet. Then, 1 ml of gold colloid preservation solution was added to the pellet and suspended, and centrifuged again at 8000 g and 10 ° C. for 15 minutes. To this pellet, 500 ⁇ l of gold colloid storage solution was added to obtain a BM33-28 sensitized gold colloid.
  • Example 5 Detection of BNP using antibody-immobilized cysteine-substituted flagella and antibody-immobilized gold colloid (1) Preparation of cysteine-substituted flagella Genes of mutants in which one amino acid of H48 antigen of Escherichia coli was replaced with cysteine Prepared by engineering method. First, by using the plasmid having the gene encoding the H48 antigen used in Reference Example 1 as a template and performing an inverse PCR with a pair of the forward primer sequence GTGCAGGTTCCGCAACTGCCAACC and the reverse primer sequence AATTTACAATCTGAACAGGTGTTA, the 291st threonine of the H48 antigen is obtained.
  • a plasmid encoding mutant H48-T291C substituted with cysteine was constructed.
  • cysteine-substituted flagellar fibers were collected by the method shown in Reference Example 1.
  • the collected flagella were analyzed by SDS-PAGE under non-reducing conditions, and it was confirmed that flagellar fibers were isolated with high purity (FIG. 17).
  • the collected flagella were observed with a transmission electron microscope and confirmed to show the structure of flagella (FIG. 18).
  • Example 6 Detection of BNP using antibody-bound collagen and antibody-immobilized gold colloid
  • a PD-10 column manufactured by GE
  • this solution was centrifuged at 8000 g and 10 ° C. for 15 minutes, and the colloidal gold was recovered as a pellet. Then, 1 ml of a gold colloid preservation solution was added to the pellet, suspended, and centrifuged under the same conditions. To this pellet, 500 ⁇ l of gold colloid storage solution was added to obtain a sensitized gold colloid of BNM33-28.
  • Example 7 Detection of BNP Using Centrifugation BM33-28 binding flagella prepared in Example 2 and ALP-labeled BC23-11 prepared using LK-12 were used. Two solutions were prepared by adding 300 ⁇ l of BC23-11-ALP diluted 1000 times with PBS to 10 ⁇ g of BM33-28 binding flagella. Next, 300 ⁇ l of the same BNP standard solution as in Example 1 was added and allowed to stand for 15 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 40,000 rpm for 30 minutes to precipitate a complex of BM33-28 binding flagella and BC23-11-ALP via BNP.
  • the precipitate was suspended in 1 ml of PBS, centrifuged again under the same conditions, and the precipitate was recovered, thereby removing unreacted BC23-11-ALP. This operation was repeated twice. Next, 1 ml of a 1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate (pNPP) solution (1M diethanolamine, 0.5 mM MgCl 2 ) was added, and after 30 minutes, the absorbance at 405 nm was measured. The results are shown in FIG. From the results, it was confirmed that the absorbance derived from the substrate was increased by the presence of BNP.
  • pNPP p-nitrophenyl phosphate
  • the complex of BM33-28 binding flagella and BC23-11-ALP via BNP and BC23-11-ALP that did not form the complex can be centrifuged. It has been shown that centrifugation can be used as a method.
  • Example 8 Detection of BNP Using Electrophoretic Separation
  • Two solutions prepared by mixing 3 ⁇ g of BM33-28-bonded flagella prepared in Example 2 and 20 ⁇ l of BC23-11-immobilized gold colloid and adjusting to 30 ⁇ l with PBS Prepared.
  • 20 ⁇ l each of the same BNP standard solution as in Example 1 was added and allowed to stand for 5 minutes.
  • electrophoresis was performed at 135 V for 30 minutes (TAE buffer solution) with an electrophoresis apparatus (Mupid-exu, manufactured by ADVANCE).
  • TAE buffer solution an electrophoresis apparatus
  • the photographed gel is shown in FIG. 25A. Since colloidal gold is negatively charged, it migrates to the positive side when a voltage is applied.
  • FIG. 25A shows the result of processing the image A with image analysis software (ImageJ).
  • Example 9 Comparison of Background Values Using Linear Fibers and Branched Fibers Flagella, collagen (manufactured by Kaigetsu Laboratories), chitosan (BiNFi-s8, manufactured by Sugino Machine), cellulose, to which antibodies are not fixed, respectively
  • the fiber solution was adjusted with PBS so that the concentration shown in FIG. 26 (BiNFi-s5, manufactured by Suginomashi) was obtained.
  • PVDF Electrospun Fiber
  • PVDF fibers were dispersed in methanol and centrifuged (15,000 rpm, 5 minutes) to obtain PVDF fibers in the precipitate.
  • the precipitate was dispersed in 0.2 M sodium carbonate buffer (pH 9.4), centrifuged, and the supernatant was discarded to remove methanol.
  • the pepsin digested fragment (F (ab ′) 2) of BM33-28 prepared in Reference Example 3 was adjusted to a concentration of 1 ⁇ g / ml (0.2 M sodium carbonate buffer (pH 9.4)). Added and left at 4 ° C. overnight.
  • FIG. 28 shows an image obtained by observing the antibody-bound PVDF fiber using a microscope (Minscope TM-1000 manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • Example 2 100 ⁇ l each of the same BNP standard solution as in Example 1 was added and allowed to stand for 5 minutes. After standing, suction filtration was performed with a 0.65 ⁇ m Durapore membrane filter using a biodot SF device. The state of the gold colloid remaining on the film and the results of measurement using an immunochromatographic reader are also shown in FIG. From the results, it was confirmed that the color intensity derived from colloidal gold was increased by the presence of BNP. Thus, it was shown that the measurement system of the present invention can be constructed even when PVDF fibers are used.
  • FIG. 32 shows the result of calculating the change in color intensity (change in color intensity from cal1, ⁇ mABS) of the assay system using flagella and microparticles from Table 1.

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Abstract

抗原抗体間の反応速度が高く、簡便なＢ／Ｆ分離工程を行うことができる測定系を提供する。 ａ）繊維状物質に結合させた第一の認識物質、 ｂ）標識された第二の認識物質、及び ｃ）検出対象物質 （但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるもので ある）を分散状態で接触させ、 上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、 当該複合体と、結合しなかったｂとを、分離し、 得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。

Description

繊維状物質を用いる検出方法
　本発明は、繊維を分子間相互作用の検出に利用する検出系に関する。
　抗原と抗体の相互作用は、抗原と抗体が溶液中で均一に存在する場合に反応速度が速いことは知られている。その利点を生かした測定系がホモジニアス測定系で、抗原と抗体を混合すると極めて短時間に平衡状態に達するため、通常試薬混合後数分で測定が開始できる場合が多い。これらの測定系はこれまでにいくつか報告されており、代表的なものが蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ
　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，略して「ＦＲＥＴ」）である。その原理は、ある蛍光分子（以下ドナーと略）の蛍光スペクトルと、もうひとつの蛍光分子（以下アクセプターと略）の励起スペクトルに重なりがあって、それらが数ナノメートル程度まで近接すると、ドナーの蛍光エネルギーがアクセプターを励起し、アクセプターに由来する蛍光が生じる現象である。抗原を二つの抗体で挟み込むサンドイッチアッセイを例として説明する。一つの抗体にドナーを、もう一つの抗体にアクセプターを標識した場合、抗原を介して二つの標識抗体が近接すると、エネルギー移動が起こり、アクセプターの蛍光シグナルが生じる。つまり、抗原の量に応じて蛍光シグナルも増加するため、ホモジニアスで抗原の量を定量できる。しかし抗原が存在しない場合でも、ある一定の確率でドナーとアクセプターは近接するため、それに伴うシグナルが発生する。これがバックグラウンドシグナルとなる。
　バックグラウンドノイズ低減方法の一つとして、極めて親和性の高い抗体を使用することが考えられる。その方法によると、測定系中の抗体濃度を低減できるため、ドナーとアクセプターの非特異的な近接が減少するため、バックグラウンドシグナルは低減する。しかし、測定系に利用できる超高親和性の抗体を準備することは現実的に難しく、たとえ準備できたとしても、未結合の物質を分離する工程（以下Ｂ／Ｆ分離と略）を行うヘテロジニアス測定系のようにバックグラウンドのシグナルを低減させることは不可能である。
　また、抗原を介した抗体の近接が起きた場合に、２種類の蛍光物質間でのエネルギー転移が効率よく起きるような標識方法が確立されているわけではない。
　ホモジニアス系には反応速度が高いという利点があるが、Ｓ／Ｎ比が高くないというデメリットがある。そこで高Ｓ／Ｎ比が要求される測定系の場合は、Ｂ／Ｆ分離操作を行うヘテロジニアス測定系が採用される場合が多い。これは、Ｂ／Ｆ分離操作により、反応に関与しなかった物質を系外に除去できるため、バックグラウンドのシグナルを大幅に低減することができ、Ｓ／Ｎ比が向上するためである。このためには、水不溶性担体などに測定対象物に結合能を有する物質（以下、抗体で例示する）を固定化する必要がある。しかし、そうすると、測定対象物と抗体間の反応は固液反応となるため、ホモジニアス反応と比較して平衡に達するまで時間がかかる。
　反応時間を短縮する方法として、水不溶性担体を微粒子化してゆく方法がある。そうすると、溶液中での抗体の分散度が高くなるため反応速度は向上してゆく。たとえば、水不溶性担体として磁気微粒子を使用し、磁気で微粒子を分離する方法が例示できる。さらに、微粒子化を進めるに従いホモジニアス測定系に近づいてゆくため、反応速度は速くなるが、磁気分離などによる簡便なＢ／Ｆ分離が難しくなってゆき、遠心分離操作などによる煩雑な分離が必要となってくる。つまり、測定系を構築する事自体が煩雑となり産業上の利用は難しくなる。
　結果的に、抗原抗体間の反応速度と簡便なＢ／Ｆ分離工程の両方を考慮して、水不溶性担体としては、磁気等で短時間にＢ／Ｆ分離が可能な数μｍからサブミクロン程度までの微粒子を用いることが現実的であった。
　このように、高い反応速度と簡便な分離を達成するためには、数μｍからサブミクロン程度までの微粒子化が必要であるが、このサイズの粒子は不透明である。そのため標識物を直接目視、吸収、蛍光などで検出する場合は、検出器からみて粒子の裏に隠れた標識物は検出できないことになり、特に低濃度域の検出が難しいという課題があった。
　高感度測定を短時間に達成するには、高Ｓ／Ｎ比の維持と反応速度の向上が必要である。前者については、シグナルの値を向上させることと、ノイズの低減が課題となる。後者についてはできるだけホモジニアス反応に近づける必要がある。そこで、Ｓ／Ｎ比を向上させるために、Ｂ／Ｆ分離が可能な材料と、ホモジニアス反応と同等の反応速度を有する材料について種々検討したところ、繊維状物質を抗原認識物質の固定場として利用する事を見出し、本発明に到達した。
　即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）ａ）繊維状物質に結合させた第一の認識物質、
　　　ｂ）標識された第二の認識物質、及び
　　　ｃ）検出対象物質
（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）を分散状態で接触させ、上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、当該複合体と、結合しなかったｂとを、分離し、得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
（２）繊維状物質が直鎖状態の繊維である、（１）に記載の方法。
（３）繊維状物質が自己組織化することで構築される繊維又はエレクトロスピニング法で作製するポリマーである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）分離の方法がろ過分離、遠心分離又は電気泳動のいずれかである、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）認識物質が検出対象物質に対する抗体である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明で使用する繊維状物質の形態は、第一の認識物質と結合させても溶液中で分散状態で存在できるものであればよく、たとえばＰＢＳやＴＢＳなどといった、通常生化学関係の実験で利用する緩衝液中や、タンパク質を含む緩衝液中で分散状態で存在できるという特性を有した繊維であればよい。たとえば、繊維状物質が溶液の上部と下部で濃度差が２０％以内、好ましくは１０％以内の状態を示せば問題ない。
　線維状物質は、一本の直鎖状の繊維からなっているものだけでなく、途中で枝分かれしているもの、折れ曲がっているもの、網目状になっているものが例示でき、繊維の太さも均一ではなくても、溶液中で分散状態で存在でき、ろ過分離等できる物性を有していれば良い。ただし、天然物を解繊して得る繊維状物質の中には、繊維がほぐれる途中の不規則な枝分かれ様の構造を含む場合が多いが、この構造が多いと構築した測定系のバックグラウンドシグナルの上昇の原因となるため、該構造は実用上問題にならない程度に低減させる事が好ましい。該構造がバックグラウンドシグナルの上昇につながる明確な理由は不明であるが、不規則な枝分かれに、金コロイドなどの標識物が捕捉されてしまうためと予想される。
　以上のことから、本目的には直鎖状態の繊維を好ましく利用することができる。たとえば、ペプチドやタンパク質が自己組織化することで構築される繊維や、エレクトロスピニング法で作製するポリマーも本目的に好ましく利用することができる。
　また、繊維の断面の形も特に限定されず、円形、四角形、ひし形、星形、などの対称性を有した形だけではなく、定まった形を有していないものでもよい。さらに、繊維が一本ずつ別個に存在していてもよく、又は繊維が複数本集まったあるいは複数本集まってねじれた形やシート状になっていても良い。
　繊維状物質の大きさは、繊維状物質の形状や使用する溶液のタンパク質の濃度や緩衝液の種類によって一概に規定できないが、たとえば、１本の直鎖状の繊維状物質の場合は、直径が１～数マイクロメートル好ましくは、１～５００ナノメートルで、長さが１００ナノメートル～５０マイクロメートルの物（以下、ナノファイバーと略することもある）が例示され、また、繊維の直径に対する長さの比は２以上、好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上であり、その上限は特に限定されるものではないが、１０，０００以下のものを例示することができる。
　本発明で使用する繊維状物質の種類は、たとえばタンパク質系のファイバーとしては、鞭毛、微小管、アミロイド繊維、アクチンフィラメント、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン等の繊維を例示することができる。タンパク質系以外の例としては、カーボンナノファイバー、セルロースナノファイバー、カルボキシメチルセルロースナノファイバー、キチンナノファイバー、キトサンナノファイバーやそれらの誘導体などを例示でき、金、銀、銅、コバルト、ニッケルなどの金属繊維や、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化タングステンなどの金属酸化物繊維なども利用することができる。また、エレクトロスピニング法などで作製するナノファイバーも利用することができる。たとえば、エレクトロスピニング法で作製することのできるポリマーの一例をあげると、ＰＶＤＦ，ポリスチレン、ポリ乳酸、ナイロン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリール、ポリアニリン、ポリウレタン、ポリヒドロキシブチラート、ポリカプロラクトン、キトサン、コラーゲン、セルロース等を単独で紡糸する方法や、機能向上のため、複数の高分子をブレンド後に紡糸する方法、コポリマーを紡糸する方法、高分子以外の材料を混合して紡糸する方法が例示できる。また、複数のノズルから異種のポリマーを同時に紡糸し、ポリマーが混和していない状態で単一の繊維として紡糸された材料も例示することができるが、これらに限定されたものではない。また、その他の方法で作製されたナノファイバーも利用することができる。
　また、ナノファイバーの作製方法も特に規定されない。たとえば、微生物を培養・抽出して作製する方法、培養時に各種材料を添加して培養する方法、天然の材料を粉砕する方法、原料を化学的に成長させて作製する方法等を例示することができる。
　認識物質については、構築する反応系によって適宜選択することができる。たとえば、タンパク質、ペプチド、有機物質、無機物質、核酸などを用いることができ、タンパク質系の認識物質の例としては抗体などを用いることが好ましい。認識物質の固定化方法は、化学結合や何らかのタグを介して繊維状物質に結合すればよい。たとえば前者の場合は、アミノ基同士の反応、アミノ基とＳＨ基間の反応、アミノ基とカルボキシ基間の反応などを例示することができるが、その他の方法でも構わない。また、遺伝子工学的な手法で繊維表面に官能基を提示させてその官能基を介した固定化も実施可能である。また、後者の方法としてはタグペプチドとタグ認識抗体の組み合わせや、ビオチンとアビジンの結合性を利用した方法などが例示できる。その他繊維状物質をシランカップリング剤などでコーティングし、表面を改質した後に、タンパク質などの認識物質を結合させることもできる。また、ＰＶＤＦやＰＳといったポリマー繊維などの場合は、疎水結合によりポリマー表面に抗体を固定化することができるし、表面の官能基を介した固定化も可能である。なお繊維状物質に抗体を結合させる場合は、インタクト抗体のみならず、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗原結合部位が残った形のフラグメントをも例示することができるが、これらの形には限定されない。
　また認識物質を固定化した繊維は、冷蔵、冷凍、凍結乾燥などの方法で、保存することができる。この際必要に応じて、各種の安定化剤などを添加することもできる。
　本発明では、第一の認識物質と第二の認識物質とを用いるが、それらが検出対象物質に対して同時に結合状態をとりうる限り、それらは同一であっても異なっていてもよい。
　標識物質としては、金コロイド、色素、蛍光色素、微粒子、蛍光微粒子、酵素などをあげることができ、それら標識物質に応じた検出方法で検出すればよい。もちろん感度を高めるために通常知られている方法を併用することも可能である。
　検出対象物質に関しては、特に限定はなく、通常のイムノアッセイで測定している対象物質を測定することができる。たとえば、抗原、タンパク質系の物質や低分子有機化合物、ウイルス、細菌、細胞等を例示することができるが、これらに限定されたものではない。
　本発明では、まず、
ａ）繊維状物質に結合させた第一の認識物質、
ｂ）標識された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
を溶液中で分散状態で接触させ、ａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させる。このときの接触順序には特に限定はなく、順次接触させてもよく、また同時に接触させてもよい。好ましくは、ａとｃを接触させて結合させた後、結合しなかったｃをろ過分離等して除去し、その後にｂを接触させるという順序であり、優れた感度を有するため好ましい方法である。
　また繊維状物質の分散性を高めるために、検出系に添加剤を添加することができる。たとえば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が例示できる。また、タンパク質あるいはポリエチレングリコールなどの添加により繊維状物質の分散性を高めることもできる。
　認識物質と検出対象物質との反応時間は、認識物質の結合力、繊維状物質の大きさや分散度によって異なるが、通常１０分以下、好ましくは３分以下、さらに好ましくは１分以下である。
　次いで、上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体と、結合しなかったｂとを、分離する。分離方法は特に限定されず、ろ過分離、遠心分離、電気泳動などの方法で分離することができる。ろ過分離の方法としては、ろ過膜を使うことができる。この時、前述の複合体は通過せず、結合しなかったｂは通過するようなろ過膜を選択すればよい。たとえば通常のろ紙、ガラスファイバー、ＰＶＤＦなどの材料や、０．２２、０．４５、０．６マイクロメーターのポアサイズのフィルター等を例示することができるが、材質および膜厚は特に限定されない。遠心分離の方法は、標識体が結合した繊維状物質が沈殿するが、標識体は沈殿しない重力加速度で遠心分離することで分離することができる。また電気泳動を用いる方法は、一定の電場下での、標識体が結合した繊維状物質と標識体の移動度の違いで分離することができる。
　この後、分離された複合体の標識を検出することにより、検出対象物質を検出することができる。このときの検出は定量的であっても定性的であってもよい。
　本発明のように、水不溶性の担体も繊維状物質に形を変えると、繊維状物質の直径が細くなるに従い、溶液中で分散された状態で存在できるようになり、遠心分離などの操作をしない限り溶液中にとどまり分散する。さらに長軸方向に十分な長さを有しているので、ろ過等することで繊維状物質を容易に分離することが可能となる。つまり、繊維状物質を用いることで、ホモジニアス系で反応し、かつ、容易に分離が可能という、これまでの考え方からすると相反する特徴を有した測定系を構築することができる。本発明の方法を用いることで、通常のヘテロジニアス測定系と比較して、反応時間は短く、かつＳ／Ｎ比の高い測定系を構築することができる。
Ｈ４８抗原を発現した大腸菌である。 精製したＨ４８抗原の電子顕微鏡写真である。 精製したＨ４８抗原のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。 ペプチド結合鞭毛とペプチド認識抗体固定化金コロイドの反応（１）を示す図である。 ペプチド結合鞭毛とペプチド認識抗体固定化金コロイドの反応（２）を示す図である。 反応（２）後の透過型電子顕微鏡写真である。 ペプチド結合鞭毛とペプチド認識抗体固定化金コロイドの反応（３）を示す図である。 ペプチド結合鞭毛とペプチド認識抗体固定化金コロイドの反応（４）を示す図である。 フルオレッセイン結合鞭毛とＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体の反応（１）を示す図である。 繊維状物質を用いたＢＮＰのサンドイッチアッセイを示す図である。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真である（実施例２）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例２）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真である（実施例３）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例３）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真である（実施例４）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例４）。 精製したシステイン置換鞭毛のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である（実施例５）。 精製したシステイン置換鞭毛の透過型電子顕微鏡写真である（実施例５）。 システイン置換鞭毛に抗体を固定化して得られた生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である（実施例５）。 濃度が異なるＢＮＰの検出を、抗体固定化鞭毛と抗体固定化金コロイドを用いて行ったメンブレンフィルターの写真である（実施例５）。 ＢＮＰの濃度とメンブレンフィルター上の金コロイドの吸光度の関係を示す図である（実施例５）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真である（実施例６）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例６）。 分光光度計で吸光度を測定した結果である。（実施例７）。 アガロース電気泳動後のゲルの写真と、それを解析した結果である（実施例８）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真である（実施例９）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例９）。 短鎖ナノ繊維の電子顕微鏡写真である（実施例１０）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真とイムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（実施例１０）。 サンプルをろ過した後のフィルターの写真とイムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（比較例１）。 イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した図である（比較例１） 鞭毛と粒子で呈色強度の差を比較した図である（比較例１）。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
　参考例１　鞭毛繊維の作製
　特開２０００－２７９１７６号公報に記載された方法で鞭毛を作製した。簡単に説明すると、大腸菌のＨ４８抗原をコードする遺伝子をｐＥＴ－１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にクローニングしたプラスミドと、Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド（ｐＰＧ１－２）を、大腸菌Ｋ１２株のｆｌｉＣ変異株（ＹＫ４１３０）に導入し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で、３０℃で一晩培養した。その後、ＪＥＭ－１４００ｐｌｕｓ（透過型電子顕微鏡：日本電子製）で、大腸菌に鞭毛が形成されていることを確認した後（図１）、同公報に記載の方法で、鞭毛をペレットとして回収した。鞭毛の透過型電子顕微鏡写真とＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、高純度な鞭毛繊維を得たことが示された（図２，３）。
　参考例２　鞭毛繊維のペプチド修飾
　ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌに調製した参考例１で作製したＨ４８鞭毛２００ｕｌに、１ｍｇのｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を添加して、室温で１時間反応させた。その後、分画分子量１００Ｋの限外ろ過膜Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を使い、未反応の試薬を除去した。その後、特開２０１２－１４０３３１号公報に記載の配列番号１０で示されるペプチド１ｍｇを添加し、４℃で一昼夜反応させた。その後、前述と同じ限外ろ過膜を使い未反応のペプチドを除去し、ペプチド結合鞭毛を得た。また、上記ペプチド結合鞭毛を６５℃で１５分加熱処理することで、ペプチド結合鞭毛（モノマー）を得た。
　参考例３　ペプチド認識抗体を固定化した金コロイドの作製
　ＢＮＰの環状部分を認識する抗体であるＢＭ３３－２８（特開２０１２－１４０３３１号公報に記載の抗体）を、定法によりＦ（ａｂ’）２化し、蒸留水で１００μｇ／ｍｌに調製した。９ｍｌの４０ｎｍの金コロイド溶液（ＢＢＩ製）に１ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を混合した溶液に、上記抗体溶液１ｍｌを添加した。その後、室温で１０分間反応させることで金コロイドに抗体を固定化した。その後、０．５５ｍｌの１％ポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬製）と、１．１ｍｌの１０％ＢＳＡ水溶液を添加し、８，０００×ｇで１分間遠心分離することで、抗体が固定された金コロイドを回収した。金コロイドを金コロイド保存緩衝液（０．０５％　ＰＥＧ２００００、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８）で数回洗浄し、５２０ｎｍの吸光度が６．０になるように同緩衝液で希釈し、ペプチド認識抗体固定化金コロイドを得た。
　参考例４　ペプチド結合鞭毛とペプチド抗体固定化金コロイドの反応（１）
　参考例２で作製したそれぞれ１００μｇのペプチド結合鞭毛とペプチド結合鞭毛（モノマー）を、参考例３で作製したペプチド認識抗体固定化金コロイド（１０μｌ）と室温で５分間反応させ、０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ　Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）でろ過した結果を図４に示す。なおペプチド認識抗体固定化金コロイド（１０μｌ）だけをろ過した結果も図４に示す。
　ペプチド結合鞭毛の場合は金コロイドの色がフィルター上に残るが、ペプチド結合鞭毛（モノマー）の場合と、ペプチド認識抗体固定化金コロイドだけをろ過した場合は金コロイドの色が残らない（白色）ことから、金コロイド表面の抗体が鞭毛表面のペプチドに結合し、フィルター上に残っていることが示された。
　参考例５　ペプチド結合鞭毛とペプチド抗体固定化金コロイドの反応（２）
　参考例２で作製したペプチド結合鞭毛５０μｇまたは参考例１で作製した鞭毛５０μｇと、参考例４で作製した抗体固定化金コロイド５μｌを室温で５分間反応させ、０．６μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルター（メルクミリポア製）でろ過した結果を図５に示す。これらの結果から、ペプチド結合鞭毛の場合だけがフィルター上に金コロイドの色が残っていることから、鞭毛により金コロイドが巻き込まれているのではなく、鞭毛表面のペプチドを介して金コロイドが鞭毛に結合していることが示された。
　参考例６　参考例５のＴＥＭ撮影
　参考例２で作製したペプチド結合鞭毛と、参考例３で作製したペプチド認識抗体固定化金コロイドまたは市販されているストレプトアビジン固定化金コロイド（ＢＢＩ製）を混合後、コロジオン膜貼付メッシュ（日進ＥＭ製）上で、リンタングステン酸でネガティブ染色し、ＪＥＭ－１４００ｐｌｕｓで透過型電子顕微鏡写真を撮影した（図６）。左側の写真がペプチド結合鞭毛とペプチド認識抗体固定化金コロイドを混合したもの、右側の写真がペプチド結合鞭毛とストレプトアビジン固定化金コロイドを混合したものである。この写真から、ペプチド結合鞭毛表面へペプチド抗体固定化金コロイドが特異的に結合していることが確認された。
　参考例７　ペプチド結合鞭毛とペプチド抗体固定化金コロイドの反応（３）
　参考例３で作製した抗体固定化金コロイド（５μｌ）と、参考例２で作製した種々の量（図中の数値を参照）のペプチド結合鞭毛を室温で５分間反応させた後、０．６μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターでろ過した。その結果、ペプチド結合鞭毛の量が減少するに従い、フィルター上の金コロイドの色合いが、赤色から黒色に変化してゆく結果が得られた（図７）。金コロイドは近接することで、赤色から黒色に変化してゆくことが知られていることから、反応系に存在するペプチド結合鞭毛の量が減少してゆくと、鞭毛上で結合する金コロイドが近接するため、黒色に変化していると考えられる。このことからも、鞭毛上に金コロイドが結合していることが確認された。
　参考例８　ペプチド結合鞭毛とペプチド抗体固定化金コロイドの反応（４）
　参考例３で作製したペプチド認識抗体固定化金コロイド５μｌと参考例２で作製したペプチド結合鞭毛１０μｇを混合してからろ過するまでの時間を種々変化（図中の数値を参照）させた時のフィルターの色を観察した（図８）。その結果、両者を混合後６０秒以降はフィルターの色がほとんど変化しなかったことから、極めて短時間に反応が進む測定系であることが確認された。
　参考例９　フルオレッセイン結合鞭毛とＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体の反応
　フルオレッセインを結合させたアルブミンを免疫抗原として、定法により抗フルオレッセイン抗体を単離した。その後、ＡＬＰ標識試薬であるＬＫ－１２（同仁化学製）の説明書に従い、ＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体を作製した。
参考例１で作製した１ｍｇのＨ４８鞭毛をＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌに調整した中に、ＮＨＳ－フルオレッセイン（Ｔｈｅｒｍｏ製）１ｍｇを２０μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を全量添加し、室温で１時間反応させた。その後、分画分子量１００Ｋの限外ろ過膜Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａで未反応の試薬を除去し、フルオレッセイン結合鞭毛を得た。
　その後、１マイクログラムのフルオレッセイン結合鞭毛または参考例２で作製したペプチド結合鞭毛と、１０００倍希釈したＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体（１００μｌ）を室温で５分反応させた後に、参考例４で使用したフィルターでろ過した。その後２００μｌのＰＢＳで３回ろ過洗浄を行い、ＡＬＰ用発色試薬であるＮＢＴ／ＢＣＩＮ試薬（Ｒｏｃｈｅ製）をフィルター上に添加し室温で１時間反応させた。その結果、フルオレッセイン結合鞭毛とＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体の組み合わせの時だけ、フィルターが発色した（図９）。これらのことより、ＡＬＰ標識抗フルオレッセイン抗体が結合した鞭毛がフィルター上に捕捉されていることが確認された。
　実施例１　抗体結合鞭毛とＡＬＰ標識抗体でのＢＮＰの検出
（１）鞭毛への抗体の結合
　３ｍｇの鞭毛（直径：約２０ｎｍ、平均の長さ：１．２μｍ、直鎖状）に、１．２ｍｇのＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を２５０μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を７５μｌ添加して、室温で１時間反応させた。その後、参考例２で使用した分画分子量１００Ｋの限外ろ過膜で未反応の試薬を除去することで、マレイミド基を導入した鞭毛を作製した。次にＢＮＰのＣ末端を認識する抗体であるＢＣ２３－１１（特許第５８１０５１４号公報に記載の抗体）３ｍｇに１．２ｍｇのＴｒａｕｔ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を２５０μｌの水に溶解した溶液全量を添加して、室温で１時間放置した。その後脱塩カラムＰＤ－１０（ＧＥ製）で未反応の試薬を除去し、ＳＨ基が導入されたＢＣ２３－１１を得た。その後、マレイミド基を導入した鞭毛とＳＨ基が導入されたＢＣ２３－１１を混合し室温で３時間反応した後、４０，０００ｒｐｍで３０分超遠心分離し得られたペレットをＰＢＳに溶解することで、ＢＣ２３－１１が結合した鞭毛を得た。
（２）ＡＬＰ標識した抗体の作製
　参考例３で作製した、Ｆ（ａｂ’）２化されたＢＭ３３－２８を、ＬＫ－１２でＡＬＰ標識した。
（３）ＢＮＰの検出
　ＢＣ２３－１１が結合した鞭毛（１０μｇ／１００μｌ　ＰＢＳ）を２本用意し、それぞれに２種類のＢＮＰ標準液１００μｌを添加した。ＢＮＰ標準液は、ＡＩＡ試薬用のＢＮＰ標準液（東ソー製）のうち、Ｃａｌ１（ＢＮＰ　０ｐｇ／ｍｌ）とＣａｌ６（ＢＮＰ　２４２０ｐｇ／ｍｌ）を使用した。これらを室温で１時間反応させた後、参考例４と同じフィルターでろ過した。２００μｌのＰＢＳを添加してろ過洗浄する操作を３回行った後、１０００倍希釈したＡＬＰ標識したＢＭ３３－２８を１００μｌ添加し、室温で１時間フィルター上で反応させ、ＢＮＰを介して、ＢＣ２３－１１が結合した鞭毛とＡＬＰ標識したＢＭ３３－２８のサンドイッチを形成させた。その後、２００μｌのＰＢＳを添加してろ過洗浄する操作を３回行なった。その後、参考例９で使用したＡＬＰ発色試薬を１００μｌ添加し、室温で１時間反応させた結果を図１０に示した。Ｃａｌ１ではほとんど発色が見られないが、Ｃａｌ６では濃赤色の発色が確認できた。このように、２種類の抗体でＢＮＰを挟み込む測定系が鞭毛上で構築できることを示した。
　実施例２　抗体結合鞭毛と抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
（１）鞭毛への抗体の結合
　定法に従いＢＭ３３－２８をペプシン消化及び還元を行い、ＢＭ３３－２８のＦａｂ’化抗体を作製した。次に、参考例１で作製した１ｍｇ／ｍｌの鞭毛溶液５００μｌ（ＰＢＳ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液）に対し、２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）１２（Ｔｈｅｒｍｏ製）のＤＭＳＯ溶液を６μｌ添加し、室温で１時間反応させた。その後、ＰＤ－１０（ＧＥ製）で未反応の試薬を除去した後、ＢＭ３３－２８のＦａｂ’化抗体を４ｍｇ添加し、反応液量が１ｍｌになるようにＰＢＳを添加し、室温で２時間反応させた。その後、参考例２で使用した分画分子量１００Ｋの限外ろ過膜で未反応のＦａｂ’化抗体を除去することで、ＢＭ３３－２８のＦａｂ’化抗体を結合した鞭毛を作製した。
（２）抗体の金コロイドへの固定化
　金コロイドは、ワインレッドケミカル社製の直径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１－６０ＮＭ）を用いた。２５０μｌの金コロイド溶液にｐＨ９．２の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を２５０μｌ添加した。その中に、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＣ２３－１１溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を５００μｌ添加し、１５分間静置した。さらに、２５０ｍＭのＭｅｔｈｙｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｏｍｏ製）のＤＭＳＯ溶液１０μｌを添加し、３０分静置した。引き続き、ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬製）の混合液を１０００μｌ添加し、１５分静置した。その後、８，０００ｇで９分間の遠心操作を行い、透明になった上清を廃棄した。ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００の混合液を１０００μｌ添加し、遠心分離する操作を繰り返した。最終的に金コロイド保存用の緩衝液３００μｌにペレットを懸濁し、ＯＤ５２０＝６．０となるよう、金コロイド保存用の緩衝液を用いて金コロイド溶液を希釈し，ＢＣ２３－１１固定化金コロイドを得た。
（３）ＢＮＰの検出
　上記の方法で作製したＢＭ３３－２８を結合した鞭毛及び、ＢＣ２３－１１固定化金コロイドを用いてＢＮＰ測定を以下のように行った。まず、１μｇのＢＭ３３－２８結合鞭毛にＢＣ２３－１１固定化金コロイド溶液２０μｌ添加し、ＰＢＳで２５μｌに調整した混合液を６つ用意した。次に、ＡＩＡ試薬用のＢＮＰ標準液（東ソー製）のＣａｌ１～６（ＢＮＰ　０，１５，４２，１５７，５９９，２４２０ｐｇ／ｍｌ）をそれぞれ２２５μｌ添加し、５分間静置した。その後バイオドットＳＦ装置（ＢＩＯＲＡＤ製）を用い、０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過を行った。メンブレン上に残った金コロイドの様子を図１１に示す。また、メンブレン上の金コロイドによる呈色強度をイムノクロマトリーダー：Ｃ１００６６（浜松フォトニクス製）を用いて測定した結果を図１２に示す。ＢＮＰ濃度に応じて金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認された。このように、ＢＮＰのサンドイッチアッセイを目視で検出可能な系が構築可能であることが示された。
　実施例３　抗体結合セルロースと抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
（１）セルロースへの抗体の結合
　２％セルロース（直径約０．６５μｍ、長さ約４．８μｍ）溶液（スギノマシン社製）２ｍｌを１００×ｇで５分遠心して得られた上清を１５，０００ｒｐｍで５分遠心し、沈殿物を回収した。７０％エタノール水溶液（ｐＨ　３．７）で、トリメトキシ（３，３，３－トリフルオロプロピル）－シラン（東京化成製）の５％溶液を作製し、前記遠心分離で得られた沈殿物に本溶液１ｍｌ加え、室温で２時間反応させた。その後、１５，０００ｒｐｍで５分遠心分離後沈殿を回収した。エタノールでの洗浄操作を２回行い、沈殿を乾燥させた（７０℃、３時間）。乾燥物に０．２ｍｇ／ｍｌのＢＭ３３－２８溶液（５０ｍＭ　炭酸ナトリウムＢｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．５）を５００μＬ加え懸濁させ、４℃で終夜反応させた。ＰＢＳ１ｍｌを添加し、１５，０００ｒｐｍで５分遠心分離後沈殿を回収した。ＰＢＳでの洗浄操作を２回行い、沈殿をＰＢＳ５００μｌに懸濁することで、ＢＭ３３－２８を固定化したセルロースを得た。
（２）金コロイドへの抗体の固定化
　ＢＣ２３－１１を固定化した金コロイドは実施例２で作製したものを使用した。
（３）ＢＮＰの検出
　ＰＢＳで５倍に希釈したＢＭ３３－２８結合セルロース２０μｌにＢＣ２３－１１固定化金コロイド溶液２０μｌ添加した混合液を６つ用意した。次に、実施例２と同じＢＮＰ標準液をそれぞれ２１０μｌ添加し、５分間静置した。その後バイオドットＳＦ装置を用い、０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過を行った。メンブレン上に残った金コロイドの様子を図１３に示す。また、メンブレン上の金コロイドによる呈色強度をイムノクロマトリーダーで測定した結果を図１４に示す。ＢＮＰ濃度に応じて金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認された。このようにセルロース繊維を用いてＢＮＰのサンドイッチアッセイを目視で検出可能な系が構築可能であることが示された。
　実施例４　抗体結合キトサン（直径約０．４μｍ、長さ約３．５μｍ）と抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
　（１）キトサンが有するアミノ基のチオール基への変換
　まずキトサンを０．０５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）となるよう１ｍｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。次にこの溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、キトサンをペレットとして回収した。その後このペレットに酸性Ｔｒａｕｔ’ｓ溶液（１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、２ｍｇ／ｍｌ　２－イミノチオラン塩酸塩、ｐＨ５．０）を１ｍｌ加えてからソニケーションし、室温で１時間反応させた。反応後この溶液に２００μｌの中和溶液（１Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）―アミノメタン、１００ｍＭ　Ｇｌｙ　Ｃｌ、ｐＨ８）を加え、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。
　ペレットとなったキトサンに１ｍｌのＰＢＳ溶液を加えてからソニケーションし、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＰＢＳによるこの洗浄操作を合計３回行った後、ペレットとなったキトサンに１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５）を１ｍｌ加えた。以上により、アミノ基をチオール基へ変換したキトサンを調製した。
　（２）抗体へのマレイミド基の導入
　１ｍｇのＢＣ２３－１１をＰＢＳ溶液中で１ｍｇ／ｍｌとなるよう濃度を調整した。次にＳＭ（ＰＥＧ１２）を２５０ｍＭとなるようジメチルスルホキシドに溶かし、抗体溶液へ１μｌ加えた。この溶液を室温で１時間反応させた後、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を加え反応を停止した。その後この抗体溶液６００μｌをＰＤ－１０カラム（ＧＥ社製）に通し、１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５）へバッファ交換した。そしてこのカラムの溶出液を分画分子量３０，０００の限外ろ過膜で５００μｌまで濃縮し、マレイミド基を導入した抗体とした。
　（３）キトサンへの抗体結合
　アミノ基をチオール基へ変換したキトサン溶液５００μｌと、マレイミド基を導入した抗体溶液５００μｌとを混ぜ、４℃で一昼夜反応させた。その後この反応液へ１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を２００μｌ加えて中和した。次にこの溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、抗体を結合したキトサンをペレットとして回収した。このペレットに１ｍｌのＰＢＳ溶液を加えてソニケーションした後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心して抗体を結合したキトサンを洗浄した。この洗浄を合計３回行った後、抗体を結合したキトサンを５００μｌのＰＢＳ溶液に懸濁してソニケーションした。この溶液をＢＣ２３－１１結合キトサンとした。
　（４）金コロイドへの抗体感作
　直径４０ｎｍの金コロイド（ＢＢＩ製）溶液を４．５ｍｌに、５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）溶液を５００μｌ加えた。その後この溶液に３０μｇ／ｍｌのＢＭ３３－２８を５００μｌ加え、室温で１０分間感作させた。そしてこの溶液へ１％　ＰＥＧ２００００溶液２７５μｌと１０％ＢＳＡ溶液５５０μｌを加え、８０００ｇ、１０℃で１５分間遠心した。遠心後は上清を捨て、１ｍｌの金コロイド保存溶液にペレットを懸濁した。その後この溶液を８０００ｇ、１０℃で１５分遠心し、金コロイドをペレットとして回収した。そしてこのペレットに１ｍｌの金コロイド保存液を加え懸濁し、再度８０００ｇ、１０℃で１５分遠心した。このペレットに５００μｌの金コロイド保存溶液を加え、ＢＭ３３－２８感作金コロイドとした。
　（５）ＢＮＰの検出
　実施例２で使用したのと同様なＢＮＰキャリブレーター溶液２００μｌにＢＭ３３－２８感作金コロイドを１０μｌ加えた。次にこの溶液へＢＣ２３－１１結合キトサンを１μｌ加え、よく撹拌した。この溶液を室温で５分間静置した後、ポアサイズが０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターでろ過した。ろ過後メンブレンを回収し、キャリブレーター溶液の通過した場所を写真で撮影した（図１５）。また、この場所をはさみで切りぬき、イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した。実験の結果、ＢＮＰの存在によってメンブレン上にバンドが出現することを確認できた（図１６）。
　実施例５　抗体を固定化したシステイン置換鞭毛と抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
　（１）システイン置換鞭毛の作製
　大腸菌のＨ４８抗原のうち１ヶ所のアミノ酸をシステインに置換した変異体を遺伝子工学的手法によって作製した。まず、参考例１で使用したＨ４８抗原をコードする遺伝子を持つプラスミドを鋳型として使用し、フォワードプライマー配列ＧＴＧＣＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣとリバースプライマー配列ＡＡＴＴＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＴＡのペアによるインバースＰＣＲを行うことにより、Ｈ４８抗原の２９１番目のスレオニンがシステインに置換された変異体Ｈ４８－Ｔ２９１Ｃをコードするプラスミドを構築した。
　次に、参考例１に示す方法で、システイン置換鞭毛繊維を回収した。回収した鞭毛を非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、高純度に鞭毛繊維が単離されたことを確認した（図１７）。また、回収した鞭毛を透過型電子顕微鏡で観察し、鞭毛の構造を示していることを確認した（図１８）。
　（２）システイン置換鞭毛に対する抗体の固定化
　１８０μｇのＢＣ２３－１１をＰＢＳで５．０ｍｇ／ｍＬに濃度調整し、ＳＭ（ＰＥＧ）６（Ｔｈｅｒｍｏ製）を６ｎｍｏｌを添加し、室温で１時間反応させた。その後、Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を用いて未反応の試薬を除去し、マレイミド基が導入された抗体を得た。次に、４５μｇのマレイミド基導入抗体を、４５μｇのシステイン置換鞭毛と混合し、室温で３０分間反応させた。その後、分画分子量１０００Ｋの透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製）を用いて、試料溶液の１０００倍量のＰＢＳで１２時間の透析を５回行うことで、未反応のマレイミド基導入抗体を除去した。得られた生成物を非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、目的とした抗体固定化鞭毛２９１－ＰＥＧ６－ＢＣが得られたことを確認した（図１９）。
　（３）抗体を固定化した金コロイドの作製
　ＢＭ３３－２８固定化金コロイドＡｕ７０－ＢＭ（Ｆａｂ’）は、実施例２に記載された方法によって作製した。抗体は、ペプシン消化した後に２－メルカプトエタンで部分還元することによって得られたＦａｂ’断片化抗体を使用した。金コロイドは、粒子径７０ｎｍのＷＲＧＨ１－７０ＮＭ（ワインレッドケミカル製）を使用した。
　（４）ＢＮＰの検出
　（２）で作製した抗体固定化鞭毛２９１－ＰＥＧ６－ＢＣと、（３）で作製した抗体固定化金コロイドＡｕ７０－ＢＭ（Ｆａｂ’）を用いて、ＢＮＰのサンドイッチアッセイを以下の方法で行った。測定試料は、実施例２で使用したＢＮＰ標準液を用いた。まず、０．４ｍｇ／ｍＬに濃度調整した抗体固定化鞭毛を８μＬ、ＯＤ５２０＝６．０になるように濃度調整した抗体固定化金コロイドを８μＬ、および測定試料１００μＬを混合し、３７℃で３０分間静置して反応させた。その後、バイオドットＳＦ装置を用いて孔径０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過し、メンブレンフィルターの上に残った金コロイドの着色を観察した（図２０）。また、金コロイドによる吸光度をイムノクロマトリーダーを用いて測定した（図２１）。その結果、測定試料中のＢＮＰ濃度が高いほど、メンブレンフィルター上の金コロイドによる吸光度が大きくなることが、目視および吸光度測定で確認できた。
　実施例６　抗体結合コラーゲンと抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
　（１）クラゲ由来コラーゲンへのマレイミド基の導入
　ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに調製したクラゲ由来コラーゲン（海月研究所製）６００μｌに、２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）１２のＤＭＳＯ溶液を２４μｌ加えた。その後室温で１時間反応させた後に、１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を７６μｌ加え反応を止めた。反応後にＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ社製）へ通し、未反応の試薬を除くことで、マレイミド基が導入されたコラーゲンを得た。
　（２）抗体が有するアミノ基のチオール基への変換
　ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに調製した２ｍｌのＢＣ２３－１１に、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に調製したＴｒａｕｔ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｔを４４μｌ加えた。その後室温で１時間反応させた後に１００ｍＭグリシン，１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を４５６μｌ加え、反応を止めた。反応後にＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ－１０カラムへ通し、未反応の試薬を除去した。以上により、抗体が有するアミノ基をチオール基へ変換した。
　（３）クラゲ由来コラーゲンへの抗体標識
　マレイミド基を導入したコラーゲンと、アミノ基をチオール基へ変換した抗体とを混ぜ、４℃で一昼夜反応させた。その後この溶液を１０００ｋ　ｃｕｔの透析膜（ｓｐｅｃｔｒｕｍ製）の中へ入れてＰＢＳ溶液で透析し、コラーゲンに標識されなかった抗体を除いた。以上により、抗体標識されたコラーゲンを調製した。
　（４）金コロイドへの抗体感作
　直径４０ｎｍの金コロイド（ＢＢＩ社製）溶液を４．５ｍｌ取り、この溶液へ５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）溶液を５００μｌ加えた。その後３０μｇ／ｍｌのＢＮＭ３３－２８水溶液を５００μｌ加え、室温で１０分間感作させた。そしてこの溶液へ１％　ＰＥＧ２０００溶液２７５μｌと１０％ＢＳＡ溶液５５０μｌを加え、８０００ｇ、１０℃で１５分間遠心した。遠心後のペレットは、１ｍｌの金コロイド保存溶液に懸濁した。その後この溶液を８０００ｇ、１０℃で１５分遠心し、金コロイドをペレットとして回収した。そしてこのペレットに１ｍｌの金コロイド保存液を加え懸濁し、同条件で遠心した。このペレットに５００μｌの金コロイド保存溶液を加え、ＢＮＭ３３－２８感作金コロイドとした。
　（５）ＢＮＰの検出
　実施例１で使用したのと同様のキャリブレーター２００μｌにＢＮＭ３３－２８感作金コロイドを１０μｌ加え、次にＢＣ２３－１１で標識されたコラーゲンを２０μｌ加え、よく撹拌した。この溶液を室温で５分間静置した後、ポアサイズが０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターでろ過した（図２２）。また、イムノクロマトリーダーでバンドの濃さを定量した。実験の結果、ＢＮＰの存在によってメンブレン上にバンドが出現することを確認できた（図２３）。
　実施例７　遠心分離を用いたＢＮＰの検出
　実施例２で作製したＢＭ３３－２８結合鞭毛と、ＬＫ－１２を用いて作製したＡＬＰ標識されたＢＣ２３－１１を使用した。
　１０μｇのＢＭ３３－２８結合鞭毛に、ＰＢＳで１０００倍希釈したＢＣ２３－１１－ＡＬＰを３００μｌ添加した溶液を２つ用意した。次に、実施例１と同じＢＮＰ標準液をそれぞれ３００μｌ添加し、１５分間静置した。その後、４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、ＢＮＰを介したＢＭ３３－２８結合鞭毛とＢＣ２３－１１－ＡＬＰの複合体を沈殿させた。上清を除いた後、沈殿をＰＢＳ１ｍｌで懸濁し、再度同条件で遠心分離後沈殿を回収することで、未反応のＢＣ２３－１１－ＡＬＰを除去した。この操作を２回繰り返した。次に、１ｍｇ／ｍｌのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液（１Ｍ　ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３０分後４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２４に示す。結果からＢＮＰの存在により、基質由来の吸光度が上昇することを確認した。以上の結果から、ＢＮＰを介したＢＭ３３－２８結合鞭毛とＢＣ２３－１１－ＡＬＰの複合体と、複合体を形成しなかったＢＣ２３－１１－ＡＬＰは遠心分離が可能なことから、複合体の検出方法として遠心分離が利用できることが示された。
　実施例８　電気泳動分離を用いたＢＮＰの検出
　実施例２で作製した３μｇのＢＭ３３－２８結合鞭毛とＢＣ２３－１１固定化金コロイド２０μｌを混合し、ＰＢＳで３０μｌとなるよう調整した溶液を２つ用意した。次に、実施例１と同じＢＮＰ標準液をそれぞれ２０μｌ添加し５分間静置した。その後、０．７％のアガロースゲルを用いて、電気泳動装置（Ｍｕｐｉｄ－ｅｘｕ、ＡＤＶＡＮＣＥ社製）で１３５Ｖ、３０分間泳動させた（ＴＡＥ緩衝液）。撮影したゲルを図２５Ａに示す。金コロイドは負に帯電しているため、電圧をかけるとプラス側に泳動する。ＢＣ２３－１１金コロイド、ＢＮＰ及び、ＢＭ３３－２８結合鞭毛の複合体は分子が大きくなるため、アガロースゲル中を泳動し難くなり、複合体を形成していないＢＣ２３－１１金コロイドに比べ泳動距離が短くなる。図２５Ａ中、ａ１，ｂ１はアガロースゲルのウェルの部分、ａ２，ｂ２は複合体に由来する金コロイド呈色部分、ａ３，ｂ３は複合体を形成していないＢＣ２３－１１金コロイドに由来する呈色部分である。図２５Ｂには、Ａの画像を画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）で処理した結果を示す。ａ２、ｂ２を比較するとＢＮＰ存在下で電気泳動を行ったｂ２の方が金コロイドに由来する呈色強度が強いことが分かる。ｉｍａｊｅＪを用いてａ２、ｂ２の面積を求めると，ａ２：２９５５、ｂ２：７８６０となり、この結果からも複合体の形成により、金コロイドの電気泳動距離が短くなったことが分かる。
　以上の結果から、アガロースゲル電気泳動を用いて、ＢＮＰを介したＢＭ３３－２８結合鞭毛とＢＣ２３－１１固定化金コロイドの複合体と、複合体を形成しなかったＢＣ２３－１１固定化金コロイドを、分離可能であることが示された。
　実施例９　直鎖繊維、分岐繊維を用いた場合のバックグランド値の比較
　それぞれ、抗体を固定していない鞭毛、コラーゲン（海月研究所製）、キトサン（ＢｉＮＦｉ―ｓ８、スギノマシン製）、セルロース（ＢｉＮＦｉ―ｓ５、スギノマシ社製）を、図２６に記載の濃度になるよう繊維溶液をＰＢＳで調整した。繊維溶液１００μｌ、実施例１と同じＢＮＰ標準液のうちｃａｌ１（０ｐｇ／ｍｌ）を１００μｌ、実施例２に記載のＢＣ２３－１１固定化金コロイド２０μｌを混合した後、バイオドットＳＦ装置を用い、０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過を行った。膜上に残った金コロイドの様子を図２６に示す。また、メンブレン上の金コロイドによる呈色強度をイムノクロマトリーダーを用いて測定した結果を図２７に示す。結果から、直鎖繊維はアッセイあたりに使用する繊維量を増加させてもバックグランドがほとんど上昇しないが、分岐繊維を用いた場合は、繊維量の増加にともないバックグランドが上昇することが確認された。
　実施例１０　エレクトロスピニング繊維（ＰＶＤＦ）を用いた測定系
（１）ＰＶＤＦナノ短繊維の作製
　ＰＶＤＦ（ＳＯＬＥＦ社製）をＤＭＦ／アセトン（６０／４０）で１２．５ｗｔ％になるように溶解し、ＮＡＮＯＮ－１（ＭＥＣＣ製）を用い、３，０００ｒｐｍで回転するΦ２００ドラムコレクターを用いて、配向性ナノファイバーをエレクトロスピニング法により作製した（２０ＫＶ、１．０ｍｌ／ｈｒ）。繊維径は約４００ｎｍであった。得られたナノファイバーを１００μｍ間隔で切断し、長さが１００μｍのＰＶＤＦ繊維を得た。
（２）ＰＶＤＦナノ繊維への抗体の固定化
　ＰＶＤＦ繊維をメタノール中に分散し遠心（１５，０００ｒｐｍ、５分）することで、沈殿にＰＶＤＦ繊維を得た。沈殿を０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に分散させ遠心し、上清を捨てることで、メタノールを除去した。次に参考例３で作製したＢＭ３３－２８のペプシン消化断片（Ｆ（ａｂ‘）２）を１μｇ／ｍｌに濃度調整し（０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４））、上記沈殿に１ｍＬ添加して、４℃で終夜静置した。遠心操作（１５，０００ｒｐｍ、５分）で繊維に固定化されていない抗体を除去した後、沈殿に１％ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ）を１ｍＬ加え室温で１時間静置することで、ブロッキング操作を行った。その後ＰＢＳで洗浄する操作を３回繰り返した後、ＰＢＳ１００μｌを加えることで、抗体結合ＰＶＤＦ繊維溶液を得た。抗体結合ＰＶＤＦ繊維を顕微鏡（Ｍｉｎｓｃｏｐｅ　ＴＭ－１０００　日立社製）を用いて観察した画像を図２８に示す。
（３）ＢＮＰの検出
　抗体結合ＰＶＤＦ繊維２０μｌと実施例２に記載のＢＣ２３－１１結合金コロイド２０μｌを混合した溶液を２つ準備した。次に、実施例１と同じＢＮＰ標準液をそれぞれ１００μｌ添加し、５分間静置した。静置後、バイオドットＳＦ装置を用い、０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過を行った。膜上に残った金コロイドの様子と、イムノクロマトリーダーを用いて測定した結果も図２９に示す。結果からＢＮＰの存在により金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認された。このように、ＰＶＤＦ繊維を用いた場合においても本発明の測定系が構築可能であることが示された。
　比較例１　抗体結合マイクロ粒子と抗体固定化金コロイドを用いたＢＮＰの検出
（１）ＢＭ３３－２８のマイクロ粒子への固定化
　白色マイクロ粒子（粒子径：３μｍ、表面修飾：‐ＮＨ２、ラテックス粒子、Ｍｉｃｒｏｍｅｒ製）懸濁溶液（５．６４×１０－１ｐＭ）１００μＬに、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）を２００μＬ加えた。２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）６（Ｔｈｅｒｍｏ製）のＤＭＳＯ溶液を５μＬ添加し、３０分室温で反応させマレイミド基をマイクロ粒子表面に導入後、５，０００ｇで１０分間の遠心操作を２回繰り返すことで、未反応の試薬を除去した。
　その後、０．１ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ　８．０）に調製した実施例２に記載したＦａｂ’化したＢＭ３３－２８抗体を５００μＬ添加し室温で３０分反応させた。次に８０ｍＭのＨＳ－ＰＥＧ６－ＯＭｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１０μＬ添加し未反応のマレイミド基をブロックし、その後１０％のＢＳＡ溶液１００μＬを加えブロッキングを行った。その後、ＰＢＳで洗浄する操作を２回行うことで、未反応の抗体を除去した。沈殿物をＰＢＳ緩衝液５００μＬに懸濁させ、ＢＭ３３－２８固定化マイクロ粒子を得た。
（２）ＢＮＰの検出
　ＢＭ３３－２８固定化マイクロ粒子溶液２０μＬと、実施例２で作製したＢＣ２３－１１標識金コロイド溶液２０μＬ及び、実施例２と同じＢＮＰ標準液各２１０μＬをそれぞれ混合し、５分静置した。次にバイオドットＳＦ装置を用い、０．６５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルターで吸引ろ過を行った。メンブレン上に残った金コロイドの様子を図３０に示す。また、メンブレン上の金コロイドによる呈色強度をイムノクロマトリーダーを用いて測定した結果を図３１に示す。図３０、図３１からＢＮＰの濃度に応じて金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認できた。
（３）データの比較
　実施例２に記載の鞭毛を用いたアッセイ系と、本比較例のアッセイによるイムノクロマトリーダーで測定した呈色強度測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から鞭毛、マイクロ粒子を用いたアッセイ系の呈色強度の変化量（ｃａｌ１からの呈色強度変化量、ΔｍＡＢＳ）を計算した結果を図３２に示す。その結果、繊維（鞭毛）を用いたアッセイ系はマイクロ粒子を用いたアッセイ系に比べ低濃度域（ｃａｌ２－１、ｃａｌ３－１）でΔｍＡＢＳが大きいことが確認された。ΔｍＡＢＳが小さい場合、目視による判定が困難になる。そのため、本発明の実施には、マイクロ粒子でなく繊維を用いることがより好ましいことが示された。
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、２０１６年８月９日に出願された日本特許出願２０１６－１５６７７５号、２０１６年１１月７日に出願された日本特許出願２０１６－２１７５８４号の明細書、２０１７年２月２日に出願された日本特許出願２０１７－０１７７０６号、２０１７年４月７日に出願された日本特許出願２０１７－０７７０８６号及び２０１７年５月２４日に出願された日本特許出願２０１７－１０２７１５号の明細書特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (5)

  1. 　ａ）繊維状物質に結合させた第一の認識物質、
    　ｂ）標識された第二の認識物質、及び
    　ｃ）検出対象物質
    （但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるもので
    ある）
    を分散状態で接触させ、
    上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、
    当該複合体と、結合しなかったｂとを、分離し、
    得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
  2. 　繊維状物質が直鎖状態の繊維である、請求項１に記載の方法。
  3. 　繊維状物質が自己組織化することで構築される繊維又はエレクトロスピニング法で作製するポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　分離の方法がろ過分離、遠心分離又は電気泳動のいずれかである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　認識物質が検出対象物質に対する抗体である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
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