CN109564216B - 使用纤维状物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种抗原抗体间的反应速度高、可进行简便的B/F分离工序的测定系统。一种检测对象物质的检测方法，其包括下述工序：使a)与纤维状物质结合的第一识别物质、b)被标记的第二识别物质、及c)检测对象物质以分散状态接触；形成上述a、b、及c结合而成的复合物；将该复合物与未结合的b分离；对得到的该复合物的标记进行检测，其中，第一识别物质和第二识别物质都可以与检测对象物质结合。

Description

使用纤维状物质的检测方法
技术领域
本发明涉及将纤维用于分子间相互作用的检测的检测系统。
背景技术
已知抗原与抗体的相互作用在抗原和抗体于溶液中均匀存在时，反应速度快。具有该优点的测定系统是均质测定系统，如果将抗原与抗体混合，则在极短时间内达到平衡状态，因此，通常在试剂混合后数分钟后就能开始测定的情况较多。目前为止，对这些测定系统报告了几种，代表性的是荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，简称为“FRET”)。其原理为下述现象：某个荧光分子(以下简称为供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(以下简称为受体)的激发光谱有重叠，它们接近至数纳米程度时，供体的荧光能量将受体激发，产生来自受体的荧光。以用二个抗体夹持抗原的夹心分析法(Sandwich assay)为例进行说明。对一个抗体标记供体、并对另一个抗体标记受体时，如果二个标记抗体抗原接近，则引起能量转移，产生受体的荧光信号。也就是说，与抗原的量相应，荧光信号也增加，因此，可以均质地定量抗原的量。然而，即使在抗原不存在的情况下，供体与受体也有一定的概率接近，因此，随之产生信号。该信号成为背景信号。
作为降低背景噪音的方法之一，考虑使用亲和性极高的抗体。根据该方法，可以降低测定系统中的抗体浓度，因此，供体与受体的非特异性接近减少，背景信号因而降低。然而，在现实中难以准备可在测定系统中利用的超高亲和性的抗体，即使能够准备，也不可能像进行将未结合的物质分离的工序(以下简称为B/F分离)的异质测定系统那样降低背景的信号。
另外，在发生抗原介导的抗体接近的情况下，并不能确立高效地引起2种荧光物质间的能量转移这样的标记方法。
发明内容
发明所要解决的问题
均质系统中存在反应速度高这样的优点，但存在S/N比不高这样的缺点。于是，在要求高S/N比的测定系统的情况下，大多采用进行B/F分离操作的异质测定系统。这是因为：通过B/F分离操作，可以将不参与反应的物质除去至系统外，因此可以大幅降低背景的信号，S/N比提高。因此，需要在水不溶性载体等上固定与测定对象物具有结合能力的物质(以下，用抗体进行例示)。然而，这样一来，测定对象物与抗体间的反应成为固液反应，因此，与均质反应相比，达到平衡为止耗费时间。
作为缩短反应时间的方法，存在使水不溶性载体逐渐微粒化的方法。这样一来，溶液中的抗体的分散度变高，因此，反应速度逐渐提高。可例示例如：使用磁微粒作为水不溶性载体、用磁力将微粒分离的方法。此外，随着微粒化进行，逐渐接近均质测定系统，因此，反应速度变速，但利用磁力分离等的简便的B/F分离逐渐变得困难，需要利用离心分离操作等的繁杂的分离。也就是说，构筑测定系统本身变得繁杂，在工业上的利用变得困难。
结果，考虑抗原抗体间的反应速度和简便的B/F分离工序这两者，现实的是使用可利用磁力等在短时间内进行B/F分离的数μm至亚微米程度的微粒作为水不溶性载体。
这样一来，为了实现高反应速度与简便的分离，需要进行数μm至亚微米程度的微粒化，但该尺寸的粒子是不透明的。因此存在下述问题：通过直接目视、吸收、荧光等对标记物进行检测的情况下，从检测器观察时不能检测到隐藏在粒子背面的标记物，特别是低浓度域的检测困难。
解决问题的方法
为了在短时间内实现高灵敏度测定，需要高S/N比的保持和反应速度的提高。对于前者，其课题是提高信号值、和降低噪音。对于后者，需要尽可能接近均质反应。于是，为了提高S/N比，对能进行B/F分离的材料、和具有与均质反应同等的反应速度的材料进行了各种研究，结果发现将纤维状物质用作抗原识别物质的固定场所，从而实现了本发明。
即本发明如下所述。
(1)一种检测对象物质的检测方法，其包括下述工序：
使a)与纤维状物质结合的第一识别物质、b)被标记的第二识别物质、及c)检测对象物质以分散状态接触；得到上述a、b、及c结合而成的复合物；将该复合物与未结合的b分离；对得到的该复合物的标记进行检测，
其中，第一识别物质和第二识别物质都可以与检测对象物质结合。
(2)根据(1)所述的方法，其中，纤维状物质是直链状态的纤维。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，纤维状物质是通过自组装化而构筑的纤维或通过静电纺丝法制作的聚合物。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，分离的方法是过滤分离、离心分离或电泳中的任一种。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，识别物质是针对检测对象物质的抗体。
以下，详细说明本发明。
本发明中使用的纤维状物质的形态可以是与第一识别物质结合、也可以是在溶液中以分散状态存在的形态，只要是例如PBS、TBS等这样的、具有在与生物化学有关的实验中通常利用的缓冲液中、包含蛋白质的缓冲液中能以分散状态存在的特性的纤维即可。例如，纤维状物质只要示出在溶液的上部与下部的浓度差为20％以内、优选为10％以内的状态，就没有问题。
纤维状物质不仅是由一根直链状的纤维构成的物质，还可例示在中途分支的物质、弯曲的物质、成为网状的物质，即使纤维的粗细不均匀，只要具有可以在溶液中以分散状态存在、可以进行过滤分离等的物性即可。然而，对天然物进行开纤而得到的纤维状物质中，在纤维解开的中途包含不规则分支这样的结构的情况较多，该结构多时，成为构筑的测定系统的背景信号增强的原因，因此，优选使该结构降低至在实际使用上没有问题的程度。该结构导致背景信号增强的明确理由尚未明确，但预想是因为金胶体等标记物被不规则的分支捕捉。
如上所述，本目的中优选利用直链状态的纤维。例如，肽、蛋白质通过自组装化而构筑的纤维、通过静电纺丝法制作的聚合物也优选在本目的中利用。
另外，纤维的截面形状也没有特殊限定，不仅可以是圆形、四边形、菱形、星形等有对称性的形状，也可以是不具有确定形状的形状。此外，纤维可以一根一根地单独存在，或者也可以成为纤维多根聚集或多根聚集并扭结而成的形状、片状。
纤维状物质的大小取决于纤维状物质的形状、使用的溶液的蛋白质浓度、缓冲液的种类，不能一概地规定，但例如在1根直链状的纤维状物质的情况下，可例示直径为1纳米～数微米、优选为1纳米～500纳米、长度为100纳米～50微米的物质(以下，有时也简称为纳米纤维)，另外，纤维的长度相对于直径之比为2以上、优选为5以上、进一步优选为10以上，其上限没有特殊限定，可列举10000以下的直径。
对于本发明中使用的纤维状物质的种类而言，例如作为蛋白质系的纤维，可例示鞭毛、微管、淀粉状纤维、肌动蛋白丝、胶原、层粘蛋白、明胶等纤维。作为除蛋白质系以外的例子，可例示碳纳米纤维、纤维素纳米纤维、羧甲基纤维素纳米纤维、甲壳质纳米纤维、壳聚糖纳米纤维、它们的衍生物体等，也可以利用金、银、铜、钴、镍等金属纤维、氧化钛、氧化锌、氧化铝、氧化钨等金属氧化物纤维等。另外，也可以利用通过静电纺丝法等制作的纳米纤维。例如，若举出可以通过静电纺丝法制作的聚合物的一例，可例示将PVDF，聚苯乙烯、聚乳酸、尼龙、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯胺、聚氨基甲酸酯、聚羟基丁酸酯、聚己内酯、壳聚糖、胶原、纤维素等单独纺丝的方法；为了提高功能而将多个高分子混合后进行纺丝的方法；对共聚物进行纺丝的方法；将高分子以外的材料混合并进行纺丝的方法。另外，也可以例示由多个喷嘴同时对不同种的聚合物进行纺丝、将聚合物在未混合的状态下作为单一的纤维进行纺丝而得到的材料，但不限定于此。另外，也可以利用通过其它方法制作的纳米纤维。
另外，纳米纤维的制作方法也没有特殊规定。例如，可例示对微生物进行培养/提取而制作的方法；培养时添加各种材料进行培养的方法；将天然的材料粉碎的方法；使原料化学生长而制作的方法等。
对于识别物质，可以根据构筑的反应系统适宜选择。可使用例如蛋白质、肽、有机物质、无机物质、核酸等，作为蛋白质系的识别物质的例子，优选使用抗体等。识别物质的固定化方法只要是通过化学结合、任意的标签与纤维状物质结合即可。例如前者的情况下，可例示氨基彼此之间的反应、氨基与SH基间的反应、氨基与羟基间的反应等，但也可以是其它方法。另外，也可以通过遗传工程方法对纤维表面呈递官能团、并实施利用该官能团的固定化来实施。另外，作为后者的方法，可例示利用了标签肽与标签识别抗体的组合、生物素与亲和素的结合性的方法等。也可以用硅烷偶联剂等涂布其它纤维状物质，对表面进行改性后，使蛋白质等识别物质结合。另外，PVDF、PS这样的聚合物纤维等的情况下，可以通过疏水结合使抗体在聚合物表面固定化，也可以利用表面的官能团进行固定化。需要说明的是，在抗体与纤维状物质结合的情况下，不仅完整抗体、还可以例示F(ab’)2、Fab、scFv等抗原结合部位残留的形式的片段，但不限定于这些形式。
另外，使识别物质固定化的纤维可以通过冷藏、冷冻、冻结干燥等方法保存。此时，也可以根据需要添加各种稳定剂等。
在本发明中，使用第一识别物质和第二识别物质，但只要它们可同时与检测对象物质成为结合状态，它们可以相同也可以不同。
作为标记物质，可列举金胶体、色素、荧光色素、微粒、荧光微粒、酶等，通过与这些标记物质相应的检测方法进行检测即可。当然，为了提高灵敏度，通常也可以组合使用已知的方法。
关于检测对象物质，没有特殊限定，可对一般的免疫测定方法中测定的对象物质进行测定。例如，可例示抗原、蛋白质系的物质、低分子有机化合物、病毒、细菌、细胞等，但不限定于此。
在本发明中，首先，使a)与纤维状物质结合的第一识别物质、b)被标记的第二识别物质、及c)检测对象物质在溶液中以分散状态接触，形成a、b、及c结合而成的复合物。此时的接触顺序没有特殊限定，可以依次接触，另外也可以同时接触。优选为使a与c接触并结合后，将未结合的c过滤分离等而除去，然后使b接触的顺序，其具有优异的灵敏度，因而为优选方法。
另外，为了提高纤维状物质的分散性，可以在检测系统中添加添加剂。例如，可例示阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂。另外，也可以通过蛋白质或聚乙二醇等的添加提高纤维状物质的分散性。
识别物质与检测对象物质的反应时间根据识别物质的结合力、纤维状物质的大小、分散度而不同，但通常10分钟以下，优选为3分钟以下，进一步优选为1分钟以下。
接下来，将上述的a、b、及c结合而成的复合物与未结合的b分离。分离方法没有特殊限定，可利用过滤分离、离心分离、电泳等方法分离。作为过滤分离的方法，可使用过滤膜。此时，选择如上述的复合物不通过、未结合的b通过这样的过滤膜即可。例如，可例示出一般的滤纸、玻璃纤维、PVDF等材料、0.22、0.45、0.6微米的孔径尺寸的滤器等，但材质及膜厚没有特别限定。离心分离的方法可以通过结合有标记物的纤维状物质沉淀、而标记物不沉淀的重力加速度进行离心分离，从而进行分离。另外，利用电泳的方法可以利用一定的电场下的、结合有标记物的纤维状物质与标记物的转移度的差异进行分离。
然后，通过检测分离后的复合物的标记，从而可以对检测对象物质进行检测。此时的检测可以是定量的也可以是定性的。
发明的效果
如果像本发明这样，如果使水不溶性的载体的形态也变成纤维状物质，则可以随着纤维状物质的直径变细，在溶液中以分散的状态存在，如果不进行离心分离等操作，则在溶液中停留分散。此外，由于在长轴方向上具有充分的长度，因此，可以通过过滤等将纤维状物质容易地分离。也就是说，通过使用纤维状物质，可以构筑以均质系统进行反应、且能够容易地进行分离的、以至今为止的想法进行则具有相反的特征的测定系统。通过使用本发明的方法，与一般的异质测定系统相比，反应时间短，且可以构筑S/N比高的测定系统。
附图说明
图1是表达H48抗原的大肠杆菌。
图2是纯化后的H48抗原的电子显微镜照片。
图3是示出纯化后的H48抗原的SDS-PAGE图。
图4是示出肽结合鞭毛与肽识别抗体固定化金胶体的反应(1)的图。
图5是示出肽结合鞭毛与肽识别抗体固定化金胶体的反应(2)的图。
图6是反应(2)后的透射型电子显微镜照片。
图7是示出肽结合鞭毛与肽识别抗体固定化金胶体的反应(3)的图。
图8是示出肽结合鞭毛与肽识别抗体固定化金胶体的反应(4)的图。
图9是示出荧光素结合鞭毛与ALP标记抗荧光素抗体的反应(1)的图。
图10是示出使用了纤维状物质的BNP的夹心分析法的图。
图11是对样品进行过滤后的滤器的照片(实施例2)。
图12是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例2)。
图13是对样品进行过滤后的滤器的照片(实施例3)。
图14是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例3)。
图15是对样品进行过滤后的滤器的照片(实施例4)。
图16是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例4)。
图17是纯化后的半胱氨酸取代鞭毛的SDS-PAGE照片(实施例5)。
图18是纯化后的半胱氨酸取代鞭毛的透射型电子显微镜照片(实施例5)。
图19是使抗体在半胱氨酸取代鞭毛上固定化而得到的生成物的SDS-PAGE照片(实施例5)。
图20是利用抗体固定化鞭毛和抗体固定化金胶体进行浓度不同的BNP检测的膜滤器的照片(实施例5)。
图21是示出BNP浓度与膜滤器上的金胶体的吸光度的关系的图(实施例5)。
图22是对样品进行过滤后的滤器的照片(实施例6)。
图23是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例6)。
图24是通过分光光度计对吸光度进行测定的结果。(实施例7)。
图25是琼脂糖电泳后的凝胶的照片和对其进行解析的结果(实施例8)。
图26是对样品进行过滤后的滤器的照片(实施例9)。
图27是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例9)。
图28是短链纳米纤维的电子显微镜照片(实施例10)。
图29是对样品进行过滤后的滤器的照片和通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(实施例10)。
图30是对样品进行过滤后的滤器的照片(比较例1)。
图31是通过荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的图(比较例1)。
图32是通过鞭毛和粒子对显色强度之差进行比较的图(比较例1)。
具体实施方式
实施例
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于本实施例。
参考例1鞭毛纤维的制作
通过日本特开2000-279176号公报中记载的方法制作了鞭毛。若简单进行说明，则将编码大肠杆菌的H48抗原的基因在pET-19b(Novagen制)上克隆而得到的质粒、和具有T7-RNA聚合酶基因的质粒(pPG1-2)导入至大肠杆菌K12株的fliC突变株(YK4130)，在包含卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中在30℃下培养一晚。然后，利用JEM-1400plus(透射型电子显微镜：日本电子制)确认在大肠杆菌上形成鞭毛后(图1)，通过同一公报中记载的方法，将鞭毛以颗粒的形态回收。根据鞭毛的透射型电子显微镜照片和SDS-PAGE的结果，示出得到了高纯度的鞭毛纤维(图2、3)。
参考例2鞭毛纤维的肽修饰
在通过PBS制备成5mg/ml的参考例1中制作的H48鞭毛200ul中，添加1mg的sulfo-SMCC(Thermo制)，在室温下反应1小时。然后，使用级分分子量100K的超滤膜Amicon Ultra(Millipore制)，将未反应的试剂除去。然后，添加日本特开2012-140331号公报中记载的序列号10表示的肽1mg，在4℃下反应一昼夜。然后，使用与上述相同的超滤膜，将未反应的肽除去，得到了肽结合鞭毛。另外，通过在65℃下对上述肽结合鞭毛进行15分钟的加热处理，从而得到了肽结合鞭毛(单体)。
参考例3固定化有肽识别抗体的金胶体的制作
通过常规方法将作为识别BNP的环状部分的抗体的BM33-28(日本特开2012-140331号公报中记载的抗体)F(ab’)2化，用蒸馏水制备成100μg/ml。向在9ml的40nm的金胶体溶液(BBI制)中混合了1ml的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)而得到的溶液中，添加上述抗体溶液1ml。然后，在室温下反应10分钟，从而使抗体在金胶体上固定化。然后，添加0.55ml的1％聚乙二醇20000(和光纯药制)和1.1ml的10％BSA水溶液，以8000×g进行1分钟的离心分离，由此将固定有抗体的金胶体回收。用金胶体保存缓冲液(0.05％PEG20000、150mM NaCl、1％BSA、0.1％NaN3、20mM Tris盐酸缓冲液、pH8)多次清洗金胶体，以520nm的吸光度达到6.0的方式用同一缓冲液进行稀释，得到了肽识别抗体固定化金胶体。
参考例4肽结合鞭毛与肽抗体固定化金胶体的反应(1)
将参考例2中制作的各100μg的肽结合鞭毛和肽结合鞭毛(单体)、与参考例3中制作的肽识别抗体固定化金胶体(10μl)在室温下反应5分钟，用0.45μm的DuraporeMultiscreen滤器(Millipore制)进行过滤，将结果示于图4。需要说明的是，将仅过滤肽识别抗体固定化金胶体(10μl)的结果也示于图4。
结果示出：在肽结合鞭毛的情况下，金胶体的颜色在滤器上残留，但在肽结合鞭毛(单体)的情况、和仅过滤肽识别抗体固定化金胶体的情况下，金胶体的颜色没有残留(白色)，因此，金胶体表面的抗体与鞭毛表面的肽结合，而在滤器上没有残留。
参考例5肽结合鞭毛与肽抗体固定化金胶体的反应(2)
使参考例2中制作的肽结合鞭毛50μg或参考例1中制作的鞭毛50μg、和参考例4中制作的抗体固定化金胶体5μl在室温下反应5分钟，用0.6μm的Durapore膜滤器(MerckMillipore制)进行过滤，将结果示于图5。根据这些结果示出，仅在肽结合鞭毛的情况下，在滤器上残留有金胶体的颜色，因此金胶体通过鞭毛表面的肽与鞭毛结合，而鞭毛没有将金胶体卷入。
参考例6参考例5的TEM拍摄
将参考例2中制作的肽结合鞭毛、与参考例3中制作的肽识别抗体固定化金胶体或市售的链霉亲和素固定化金胶体(BBI制)混合后，在贴附有火棉胶膜的筛网(日进EM制)上，用磷钨酸进行负染色，用JEM-1400plus拍摄了透射型电子显微镜照片(图6)。左侧的照片是肽结合鞭毛与肽识别抗体固定化金胶体混合的照片，右侧的照片是肽结合鞭毛与链霉亲和素固定化金胶体混合的照片。根据这些照片可确认，肽抗体固定化金胶体与肽结合鞭毛表面特异性结合。
参考例7肽结合鞭毛与肽抗体固定化金胶体的反应(3)
使参考例3中制作的抗体固定化金胶体(5μl)、和参考例2中制作的各种量(参照图中的数值)的肽结合鞭毛在室温下反应5分钟后，用0.6μm的Durapore膜滤器进行过滤。其结果，得到随着肽结合鞭毛的量减少，滤器上的金胶体的色调从红色逐渐变化成黑色的结果(图7)。由于已知金胶体通过接近而从红色逐渐变化成黑色，认为反应系统中存在的肽结合鞭毛的量逐渐减少时，在鞭毛上结合的金胶体接近，因此变化成黑色。由此也确认了金胶体在鞭毛上结合。
参考例8肽结合鞭毛与肽抗体固定化金胶体的反应(4)
对从将参考例3中制作的肽识别抗体固定化金胶体5μl与参考例2中制作的肽结合鞭毛10μg混合至进行过滤为止的时间进行各种变化(参照图中的数值)，观察此时的滤器的颜色(图8)。其结果，将两者混合后60秒之后，滤器的颜色几乎没有变化，由此确认了其为反应在极短时间内进行的测定系统。
参考例9荧光素结合鞭毛与ALP标记抗荧光素抗体的反应
将结合有荧光素的清蛋白作为免疫抗原，通过现有方法将抗荧光素抗体分离。然后，按照作为ALP标记试剂的LK-12(同仁化学制)的说明书制作了ALP标记抗荧光素抗体。
将参考例1中制作的1mg的H48鞭毛用PBS调整至5mg/ml的过程中，添加将NHS-荧光素(Thermo制)1mg溶解于20μl的DMSO而得到的全部量的溶液，在室温下反应1小时。然后，用级分分子量100K的超滤膜Amicon Ultra将未反应的试剂除去，得到了荧光素结合鞭毛。
然后，使1微克的荧光素结合鞭毛或参考例2中制作的肽结合鞭毛、与稀释了1000倍的ALP标记抗荧光素抗体(100μl)在室温下反应5分钟后，用参考例4中使用的滤器进行过滤。然后用200μl的PBS进行3次过滤清洗，在滤器上添加作为ALP用显色试剂的NBT/BCIN试剂(Roche制)，在室温下反应1小时。其结果，仅在荧光素结合鞭毛与ALP标记抗荧光素抗体的组合的情况下，滤器显色(图9)。由此确认了结合有ALP标记抗荧光素抗体的鞭毛在滤器上被捕捉。
实施例1利用抗体结合鞭毛与ALP标记抗体的BNP的检测
(1)抗体对鞭毛的结
在3mg的鞭毛(直径：约20nm、平均长度：1.2μm、直链状)中添加将1.2mg的SMCC(Thermo制)溶解于250μl的DMSO中而得到的溶液75μl，在室温下反应1小时。然后，通过参考例2中使用的级分分子量100K的超滤膜将未反应的试剂除去，由此制作了导入有马来酰亚胺基的鞭毛。接下来，在作为识别BNP的C末端的抗体的BC23-11(日本专利第5810514号公报中记载的抗体)3mg中，添加将1.2mg的Traut’s试剂(Thermo制)溶解于250μl的水中而得到的全部量的溶液，在室温下放置1小时。然后，用脱盐柱PD-10(GE制)将未反应的试剂除去，得到导入有SH基的BC23-11。然后，将导入有马来酰亚胺基的鞭毛和导入有SH基的BC23-11混合，在室温下反应3小时后，以40000rpm进行30分钟的超离心分离，将得到的颗粒溶解于PBS，由此得到了结合有BC23-11的鞭毛。
(2)标记有ALP的抗体的制作
用LK-12对参考例3中制作的、经F(ab’)2化的BM33-28进行ALP标记。
(3)BNP的检测
准备2根结合有BC23-11的鞭毛(10μg/100μl PBS)，分别添加2种BNP标准液100μl。BNP标准液使用AIA试剂用BNP标准液(东曹制)中的Cal1(BNP 0pg/ml)和Cal6(BNP 2420pg/ml)。使它们在室温下反应1小时后，用与参考例4相同的滤器进行过滤。进行添加200μl的PBS并进行过滤清洗的操作3次后，添加100μl的稀释了1000倍的标记有ALP的BM33-28，在室温下、在滤器上反应1小时，通过BNP形成结合有BC23-11的鞭毛与标记有ALP的BM33-28的夹心。然后，进行添加200μl的PBS并进行过滤清洗的操作3次。然后，添加在参考例9中使用的ALP显色试剂100μl，在室温下反应1小时，将结果示于图10。Cal1的情况下，几乎未观察到显色，但在Cal6的情况下，观察到深红色的显色。由此表示可在鞭毛上构筑由2种抗体夹持BNP的测定系统。
实施例2使用了抗体结合鞭毛和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)抗体对鞭毛的结合
按照现有方法，对BM33-28进行蛋白酶消化及还原，制作了BM33-28的Fab’化抗体。接下来，对参考例1中制作的1mg/ml的鞭毛溶液500μl(PBS、10mM EDTA溶液)添加250mM的SM(PEG)12(Thermo制)的DMSO溶液6μl，在室温下反应1小时。然后，用PD-10(GE制)除去未反应的试剂后，添加BM33-28的Fab’化抗体4mg，以反应液量达到1ml的方式添加PBS，在室温下反应2小时。然后，用参考例2中使用的级分分子量100K的超滤膜除去未反应的Fab’化抗体，由此制作了结合有BM33-28的Fab’化抗体的鞭毛。
(2)抗体对金胶体的固定化
金胶体使用Wine red chemical公司制的直径60nm的金胶体(WRGH1-60NM)。在250μl的金胶体溶液中添加pH9.2的10mM Tris-HCl溶液250μl。向其中添加0.1mg/ml的BC23-11溶液(10mM Tris-HCl)500μl，静置15分钟。进一步添加250mM的Methyl-PEG-NHS-Ester(Theromo制)的DMSO溶液10μl，静置30分钟。接着，添加BSA和聚乙二醇20000(和光纯药制)的混合液1000μl，静置15分钟。然后，以8000g进行9分钟的离心操作，废弃变得透明的上清。重复进行添加BSA和聚乙二醇20000的混合液1000μl、并进行离心分离的操作。最终，使颗粒在金胶体保存用的缓冲液300μl中悬浮，以达到OD520＝6.0的方式使用金胶体保存用的缓冲液稀释金胶体溶液，得到了BC23-11固定化金胶体。
(3)BNP的检测
使用结合有通过上述方法制作的BM33-28的鞭毛及BC23-11固定化金胶体，如下所述地进行BNP测定。首先，在1μg的BM33-28结合鞭毛中添加BC23-11固定化金胶体溶液20μl，准备6份用PBS调整至25μl的混合液。接下来，分别添加AIA试剂用BNP标准液(东曹制)的Cal1～6(BNP 0、15、42、157、599、2420pg/ml)各225μl，静置5分钟。然后，使用Bio dot SF装置(BIORAD制)、并利用0.65μm的Durapore膜滤器进行了吸引过滤。将膜上残留的金胶体的状态示于图11。另外，用荧光色谱读取器：C10066(浜松光子制)对由膜上的金胶体带来的显色强度进行测定，将结果示于图12。确认了由金胶体带来的显色强度与BNP浓度相应地变强。由此表示可构筑能用目视检测BNP的夹心分析法的系统。
实施例3使用了抗体结合纤维素和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)抗体对纤维素的结合
将2％纤维素(直径约0.65μm、长度约4.8μm)溶液(Sugino Machine公司制)2ml以100×g离心5分钟，将得到的上清以15000rpm离心5分钟，回收沉淀物。用70％乙醇水溶液(pH 3.7)制作三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)-硅烷(东京化成制)的5％溶液，在通过上述离心分离得到的沉淀物中添加本溶液1ml，在室温下反应2小时。然后，以15000rpm离心分离5分钟后，回收沉淀。用乙醇进行2次清洗操作，使沉淀干燥(70℃、3小时)。在干燥物中添加0.2mg/ml的BM33-28溶液(50mM碳酸钠Buffer pH8.5)500μL，使其悬浮，在4℃下彻夜反应。1ml的添加PBS，以15000rpm离心分离5分钟后回收沉淀。用PBS进行2次清洗操作，使沉淀悬浮在500μl的PBS中，得到了BM33-28固定化后的纤维素。
(2)抗体对金胶体的固定化
BC23-11固定化后的金胶体使用实施例2中制作的物质。
(3)BNP的检测
准备了6份在用PBS稀释了5倍的BM33-28结合纤维素20μl中添加BC23-11固定化金胶体溶液20μl而得到的混合液。接下来，分别添加与实施例2相同的BNP标准液210μl，静置5分钟。然后使用Bio dot SF装置、并用0.65μm的Durapore膜滤器进行了吸引过滤。将膜上残留的金胶体的状态示于图13。另外，将用荧光色谱读取器测定由膜上的金胶体带来的显色强度而得到的结果示于图14。确认了由金胶体带来的显色强度与BNP浓度相应地变强。由此表示，使用纤维素纤维，可构筑可通过目视检测BNP的夹心分析法的系统。
实施例4使用了抗体结合壳聚糖(直径约0.4μm、长度约3.5μm)和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)壳聚糖所具有的氨基向硫醇基的转化
首先，以达到0.05％(重量/体积)的方式使壳聚糖在1ml的PBS溶液中悬浮。接下来，以15000rpm对该溶液进行5分钟的离心，将壳聚糖以颗粒的形态回收。然后，在该颗粒中添加酸性Traut’s溶液(100mM CH3COONa、2mg/ml 2-亚氨基硫烷盐酸盐、pH5.0)1ml后进行超声波破碎，在室温下反应1小时。在反应后该溶液中添加200μl的中和溶液(1M三(羟基甲基)-氨基甲烷、100mM Gly Cl、pH8)。以15000rpm离心5分钟。
在成为颗粒的壳聚糖中添加1ml的PBS溶液后进行超声波破碎，以15000rpm离心5分钟。进行利用PBS的该清洗操作合计3次后，在成为颗粒的壳聚糖中添加100mM CH3COONa(pH5)1ml。如上所述地制备了将氨基转化成硫醇基后的壳聚糖。
(2)马来酰亚胺基向抗体中的导入
将1mg的BC23-11在PBS溶液中调整为1mg/ml的浓度。接下来，以达到250mM的方式将SM(PEG12)溶解于二甲基亚砜中，向抗体溶液中添加1μl。使该溶液在室温下反应1小时后，添加1M Tris-HCl缓冲液(pH8)，使反应停止。然后使该抗体溶液600μl通过PD-10柱(GE公司制)，对100mM CH3COONa(pH5)进行缓冲液交换。然后，将该柱的洗脱液用级分分子量30000的超滤膜浓缩至500μl，制成了导入有马来酰亚胺基的抗体。
(3)抗体对壳聚糖的结合
混合将氨基转化成硫醇基后的壳聚糖溶液500μl、和导入有马来酰亚胺基的抗体溶液500μl，在4℃下反应一昼夜。然后，向该反应液中添加1M Tris-HCl缓冲液(pH8)200μl，进行中和。接下来，将该溶液以15000rpm离心5分钟，将结合有抗体的壳聚糖以颗粒的形态回收。在该颗粒中添加1ml的PBS溶液并进行超声波破碎后，以15000rpm离心5分钟，对结合有抗体的壳聚糖进行清洗。进行该清洗合计3次后，使结合有抗体的壳聚糖在500μl的PBS溶液中悬浮，并进行超声波破碎。将该溶液作为BC23-11结合壳聚糖。
(4)抗体对金胶体的敏化
向直径40nm的金胶体(BBI制)溶液4.5ml中添加50mM KH2PO4(pH7)溶液500μl。然后，在该溶液中添加500μl的30μg/ml的BM33-28，在室温下进行10分钟的敏化。然后，向该溶液中添加1％PEG20000溶液275μl和10％BSA溶液550μl，以8000g在10℃下离心15分钟。离心后，废弃上清，使颗粒在1ml的金胶体保存溶液中悬浮。然后，将该溶液以8000g在10℃下离心15分钟，将金胶体以颗粒的形态回收。然后，在该颗粒中添加1ml的金胶体保存液，使其悬浮，再次以8000g在10℃下离心15分钟。在该颗粒中添加500μl的金胶体保存溶液，制成BM33-28敏化金胶体。
(5)BNP的检测
在与实施例2中使用的同样的BNP校准溶液200μl中添加BM33-28敏化金胶体10μl。接下来向该溶液中添加BC23-11结合壳聚糖1μl，充分搅拌。将该溶液在室温下静置5分钟后，用孔径尺寸为0.65μm的Durapore膜滤器进行过滤。将过滤后的膜回收，对校准溶液通过的位置拍摄照片(图15)。另外，用剪刀裁切该位置，用荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量。实验的结果可确认，由于BNP的存在，在膜上出现条带(图16)。
实施例5使用了抗体固定化后的半胱氨酸取代鞭毛和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)半胱氨酸取代鞭毛的制作
通过遗传工程方法制作用半胱氨酸取代大肠杆菌的H48抗原中的1处氨基酸而成的突变体。首先，将具有对参考例1中使用的H48抗原进行编码的基因的质粒作为模板使用，利用正向引物序列GTGCAGGTTCCGCAACTGCCAACC与反向引物序列AATTATCAATCTGAACAGGTGTA对进行反向PCR，由此，构筑了对H48抗原的第291位的苏氨酸被半胱氨酸取代而成的突变体H48-T291C进行编码的质粒。
接下来，通过参考例1中示出的方法，回收半胱氨酸取代鞭毛纤维。将回收的鞭毛用非还原条件下的SDS-PAGE进行解析，确认了以高纯度将鞭毛纤维分离(图17)。另外，用透射型电子显微镜观察回收的鞭毛，确认了示出鞭毛的结构(图18)。
(2)抗体对半胱氨酸取代鞭毛的固定化
用PBS将180μg的BC23-11调整为浓度5.0mg/mL，添加SM(PEG)6(Thermo制)6nmol，在室温下反应1小时。然后，使用Zeba Spin Desalting Columns(Thermo制)将未反应的试剂除去，得到了导入有马来酰亚胺基的抗体。接下来，将45μg的马来酰亚胺基导入抗体与45μg的半胱氨酸取代鞭毛混合，在室温下反应30分钟。然后，使用级分分子量1000K的透析膜(Spectrum制)，用试样溶液的1000倍量的PBS进行5次12小时的透析，由此将未反应的马来酰亚胺基导入抗体除去。用非还原条件下的SDS-PAGE对得到的生成物进行解析，确认得到了作为目标的抗体固定化鞭毛291-PEG6-BC(图19)。
(3)抗体固定化后的金胶体的制作
BM33-28固定化金胶体Au70-BM(Fab’)通过实施例2中记载的方法制作。抗体使用在蛋白酶消化后用2-巯基乙烷进行部分还原而得到的Fab’片段化抗体。金胶体使用粒径70nm的WRGH1-70NM(Wine red chemical制)。
(4)BNP的检测
使用(2)中制作的抗体固定化鞭毛291-PEG6-BC和(3)中制作的抗体固定化金胶体Au70-BM(Fab’)，通过以下的方法进行BNP的夹心分析法。测定试样使用了实施例2中使用的BNP标准液。首先，将浓度调整至0.4mg/mL的抗体固定化鞭毛8μL、浓度调整至OD520＝6.0的抗体固定化金胶体8μL、及测定试样100μL混合，在37℃下静置30分钟从而进行反应。然后，使用Bio dot SF装置，用孔径0.65μm的Durapore膜滤器进行吸引过滤，观察在膜滤器上残留的金胶体的着色(图20)。另外，使用荧光色谱读取器测定由金胶体带来的吸光度(图21)。其结果，通过目视及吸光度测定可确认测定试样中的BNP浓度越高，由膜滤器上的金胶体带来的吸光度越大。
实施例6使用了抗体结合胶原和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)马来酰亚胺基向来自水母的胶原的导入
在用PBS制备成1mg/ml的来自水母的胶原(海月研究所制)600μl中加入250mM的SM(PEG)12的DMSO溶液24μl。然后，在室温下反应1小时后，加入1M的Tris盐酸缓冲液(pH8.0)76μl，使反应停止。反应后通过用PBS溶液平衡化后的PD-10柱(GE公司制)，除去未反应的试剂，由此得到导入有马来酰亚胺基的胶原。
(2)抗体所具有的氨基向硫醇基的转化
在用PBS制备成1mg/ml的2ml的BC23-11中加入制备成2mg/ml的PBS溶液的Traut’s试剂44μl。然后，在室温下反应1小时后，加入100mM甘氨酸、1M的Tris盐酸缓冲液(pH8.0)456μl，使反应停止。反应后，通过用PBS溶液平衡化后的PD-10柱，除去未反应的试剂。由此将抗体所具有的氨基转化成硫醇基。
(3)抗体对来自水母的胶原的标记
混合导入有马来酰亚胺基的胶原、和将氨基转化成硫醇基后的抗体，在4℃下反应一昼夜。然后，将该溶液放入1000k cut的透析膜(spectrum制)中，用PBS溶液进行透析，除去未被胶原标记的抗体。由此制备了被抗体标记的胶原。
(4)抗体对金胶体敏化
取出直径40nm的金胶体(BBI公司制)溶液4.5ml，向该溶液中添加50mM KH2PO4(pH7)溶液500μl。然后，加入30μg/ml的BNM33-28水溶液500μl，在室温下进行10分钟的敏化。然后，向该溶液中添加1％PEG2000溶液275μl和10％BSA溶液550μl，以8000g在10℃下离心15分钟。离心后的颗粒在1ml的金胶体保存溶液中悬浮。然后，将该溶液以8000g在10℃下离心15分钟，将金胶体以颗粒的形态回收。然后，向该颗粒添加1ml的金胶体保存液，使其悬浮，在相同条件下进行离心。向该颗粒添加500μl的金胶体保存溶液，制成BNM33-28敏化金胶体。
(5)BNP的检测
在与实施例1中使用的同样的校准溶液200μl中加入BNM33-28敏化金胶体10μl，接下来，添加用BC23-11标记后的胶原20μl，充分搅拌。将该溶液在室温下静置5分钟后，用孔径尺寸为0.65μm的Durapore膜滤器进行过滤(图22)。另外，用荧光色谱读取器对条带的浓度进行定量的。实验的结果可确认，由于BNP的存在，在膜上出现条带(图23)。
实施例7利用了离心分离的BNP的检测
使用实施例2中制作的BM33-28结合鞭毛、和使用LK-12制作的经ALP标记后的BC23-11。
准备2份在10μg的BM33-28结合鞭毛中添加300μl的用PBS稀释了1000倍的BC23-11-ALP而得到的溶液。接下来，分别添加与实施例1相同的BNP标准液300μl，静置15分钟。然后，以40000rpm进行30分钟的离心分离，使BNP介导的BM33-28结合鞭毛与BC23-11-ALP的复合物沉淀。除去上清后，使沉淀在1ml的PBS中悬浮，再次在相同条件下离心分离后，将沉淀回收，由此除去了未反应的BC23-11-ALP。重复该操作2次。接下来，添加1mg/ml的对硝基苯基磷酸(pNPP)溶液(1M二乙醇胺、0.5mM MgCl2)1ml，30分钟后测定405nm的吸光度。将结果示于图24。根据结果确认了，由于BNP的存在，来自基质的吸光度上升。由以上的结果表示，BNP介导的BM33-28结合鞭毛和BC23-11-ALP的复合物、与未形成复合物的BC23-11-ALP能够离心分离，因此可利用离心分离作为复合物的检测方法。
实施例8利用了电泳分离的BNP的检测
将实施例2中制作的3μg的BM33-28结合鞭毛和BC23-11固定化金胶体20μl混合，准备2份用PBS调整为30μl的溶液。接下来，分别添加与实施例1相同的BNP标准液20μl，静置5分钟。然后，使用0.7％的琼脂糖凝胶，用电泳装置(Mupid-exu、ADVANCE公司制)在135V下进行30分钟的电泳(TAE缓冲液)。将拍摄的凝胶示于图25A。由于金胶体带负电，因此，如果施加电压，则向正极侧迁移。BC23-11金胶体、BNP及BM33-28结合鞭毛的复合物的分子变大，因此，变得难以在琼脂糖凝胶中迁移，与未形成复合物的BC23-11金胶体相比，迁移距离变短。图25A中、a1、b1是琼脂糖凝胶的孔(well)的部分，a2、b2是来自复合物的金胶体显色部分，a3、b3是来自未形成复合物的BC23-11金胶体的显色部分。图25B中示出用图像解析软件(ImageJ)对A的图像进行处理的结果。对a2、b2进行比较可知，在BNP存在下进行了电泳的b2的情况下，来自金胶体的显色强度强。使用imajeJ求出a2、b2的面积，为a2：2955、b2：7860，根据该结果也可知通过复合物的形成，金胶体的电泳距离变短。
根据以上的结果表示，利用琼脂糖凝胶电泳，能够将借助BNP的BM33-28结合鞭毛和BC23-11固定化金胶体的复合物、与未形成复合物的BC23-11固定化金胶体分离。
实施例9使用了直链纤维、支化纤维的情况的背景值的比较
用PBS调整纤维溶液，从而分别使未固定有抗体的鞭毛、胶原(海月研究所制)、壳聚糖(BiNFi-s8、Sugino Machine制)、纤维素(BiNFi-s5、Sugino Machine公司制)成为图26中记载的浓度。将纤维溶液100μl、与实施例1相同的BNP标准液中的cal1(0pg/ml)100μl、和实施例2中记载的BC23-11固定化金胶体20μl混合后，使用Bio dot SF装置，用0.65μm的Durapore膜滤器进行了吸引过滤。将膜上残留的金胶体的状态示于图26。另外，使用荧光色谱读取器测定由膜上的金胶体带来的显色强度，将结果示于图27。根据结果确认了，对于直链纤维而言，即使在分析时增加使用的纤维量，背景也几乎不上升，但在使用支化纤维的情况下，随着纤维量的增加，背景上升。
实施例10使用了静电纺丝纤维(PVDF)的测定系统
(1)PVDF纳米短纤维的制作
用DMF/丙酮(60/40)将PVDF(SOLEF公司制)溶解至达到12.5wt％，使用NANON-1(MECC制)、并使用以3000rpm旋转的Φ200转筒收集器，通过静电纺丝法制作了取向性纳米纤维(20KV、1.0ml/hr)。纤维直径约为400nm。以100μm间隔将得到的纳米纤维切断，得到了长度为100μm的PVDF纤维。
(2)抗体对PVDF纳米纤维的固定化
将PVDF纤维分散于甲醇中，进行离心(15000rpm、5分钟)，由此，在沉淀中得到PVDF纤维。使沉淀分散于0.2M碳酸钠缓冲液(pH9.4)中，进行离心，废弃上清，由此将甲醇除去。接下来，将参考例3中制作的BM33-28的蛋白酶消化片段(F(ab‘)2)调整至浓度1μg/ml(0.2M碳酸钠缓冲液(pH9.4))，向上述沉淀添加1mL，在4℃下彻夜静置。通过离心操作(15000rpm、5分钟)，将未在纤维固定化的抗体除去后，在沉淀中添加1％BSA溶液(PBS)1mL，在室温下静置1小时，由此进行封端操作。然后，用PBS重复3次清洗的操作后，添加100μl的PBS，由此得到了抗体结合PVDF纤维溶液。将使用显微镜(Minscope TM-1000日立株式会社制)观察抗体结合PVDF纤维的图像示于图28。
(3)BNP的检测
准备2份混合有抗体结合PVDF纤维20μl和实施例2中记载的BC23-11结合金胶体20μl的溶液。接下来，分别添加与实施例1相同的BNP标准液100μl，静置5分钟。静置后，使用Bio dot SF装置，用0.65μm的Durapore膜滤器进行了吸引过滤。将在膜上残留的金胶体的状态、和使用荧光色谱读取器进行测定的结果也示于图29。根据结果确认了，由于BNP的存在，由金胶体带来的显色强度变强。由此表示，在使用了PVDF纤维的情况下，也可构筑本发明的测定系统。
比较例1使用了抗体结合微粒和抗体固定化金胶体的BNP的检测
(1)BM33-28对微粒的固定化
在白色微粒(粒径：3μm、表面修饰：-NH2、胶乳粒子、Micromer制)悬浮溶液(5.64×10-1pM)100μL中加入50mM的KH2PO4(pH8.0)200μL。添加250mM的SM(PEG)6(Thermo制)的DMSO溶液5μL，在室温下反应30分钟，将马来酰亚胺基导入微粒表面后，以5000g重复2次10分钟的离心操作，由此将未反应的试剂除去。
然后，添加制备成0.1mg/mL(5mM KH2PO4、pH 8.0)的实施例2中记载的Fab’化的BM33-28抗体500μL，在室温下反应30分钟。接下来，添加80mM的HS-PEG 6-OMe(SIGMA-ALDRICH公司制)10μL，对未反应的马来酰亚胺基进行封端，然后添加10％的BSA溶液100μL，进行封端。然后，用PBS进行2次清洗的操作，由此将未反应的抗体除去。使沉淀物在PBS缓冲液500μL中悬浮，得到了BM33-28固定化微粒。
(2)BNP的检测
分别混合BM33-28固定化微粒溶液20μL、实施例2中制作的BC23-11标记金胶体溶液20μL、及与实施例2相同的BNP标准液各210μL，静置5分钟。接下来，使用Bio dot SF装置、并用0.65μm的Durapore膜滤器进行了吸引过滤。将膜上残留的金胶体的状态示于图30。另外，将使用荧光色谱读取器测定由膜上的金胶体带来的显色强度的结果示于图31。根据图30、图31可确认，由金胶体带来的显色强度与BNP的浓度相应地变强。
(3)数据的比较
将使用了实施例2中记载的鞭毛的分析系统、和采用本比较例的分析的用荧光色谱读取器测定的显色强度测定结果示于表1。
[表1]
Figure GDA0001963086600000191
根据表1对使用了鞭毛、微粒的分析系统的显色强度的变化量(来自cal1的显色强度变化量、ΔmABS)进行计算，将结果示于图32。其结果确认了，使用了纤维(鞭毛)的分析系统与使用了微粒的分析系统相比，在低浓度区域(cal2-1、cal3-1)，ΔmABS大。在ΔmABS小的情况下，利用目视的判定变得困难。因此，在本发明的实施中，示出更优选使用纤维而不是微粒。
参照特定的实施方式详细地说明了本发明，但本领域技术人员应该明确，只要不脱离本发明的本质和范围，可以施加各种变更、修正。
需要说明的是，在此引用2016年8月9日申请的日本专利申请2016-156775号、2016年11月7日申请的日本专利申请2016-217584号的说明书、2017年2月2日申请的日本专利申请2017-017706号、2017年4月7日申请的日本专利申请2017-077086号及2017年5月24日申请的日本专利申请2017-102715号的说明书、权利要求书、附图及说明书摘要的全部内容，引入其作为本发明的说明书的公开内容。

Claims (5)

1.一种检测对象物质的检测方法，其包括下述工序：
使a)与纤维状物质结合的第一识别物质、b)被标记的第二识别物质、及c)检测对象物质以分散状态接触；
形成上述a、b、及c结合而成的复合物；
将该复合物与未结合的b分离；
对得到的该复合物的标记进行检测，
其中，第一识别物质和第二识别物质都可以与检测对象物质结合，所述纤维状物质是直链状态的纤维，
上述a、b、及c构筑均质系统进行反应，
上述纤维状物质的直径为1纳米～500纳米、长度为100纳米～50微米。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，纤维状物质是通过自组装化而构筑的纤维、或通过静电纺丝法而制作的聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，分离的方法是过滤分离、离心分离或电泳中的任一种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，识别物质是针对检测对象物质的抗体。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，识别物质是针对检测对象物质的抗体。
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