KR100274188B1 - 한국형 씨형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2엔 단백질의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질(이하 "KHCV E2N 단백질" 이라함)의 정제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 유전자 재조합 효모에서 생성된 순도가 낮은 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질을 고순도의 단백질로 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라, KHCV E2N 이 발현된 재조합 효모 세포로부터 세포파괴와 가용성 단백질의 제거, 트리톤 X-100을 이용한 불용성 침전물의 세척, 8M 우레아를 사용한 침전 단백질의 용해, S-200 겔 투과 크로마토그래피 및 EPLC 모노 Q 이온교환 크로마토그래피를 거쳐 고순도의 KHCV E2N 단백질을 대량 정제할 수 있는 방법이 제공된다.

Description

한국형 씨 (C)형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2엔(2N) 단백질의 정제방법

제1도는 본 발명에 따른 유전자 재조합 효모로부터의 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질(KHCV E2H 단백질)의 정제과정의 개요를 도시한 것이고,

제2도는 본 발명에 따른 정제 과정중 각 단계에서 얻어지는 생성물들을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 KHCV E2N 단백질이 발현된 효모세포의 총 균질액과 본 발명에 따른 정제과정으로 정제된 KHCV E2N 단백질 최종 산물을 한국인 C형 간염 환자의 혈청을 사용하여 웨스턴 불롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 한국형 C형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질(이하 "KHCV E2N 단백질" 이라함)의 정제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 유전자 재조합 효모에서 생성된 순도가 낮은 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질을 고순도의 단백질로 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 바이러스성 간염은 간염 바이러스의 감염에 의해 발생되는 간 질환으로서, 지금까지는 그 주된 발병체로서 A 형 간염바이러스(HAV), B 형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염바이러스(HDV), 사이토메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)등이 단리 및 확인되어 왔다.

그러나, 최근에는 상기한 바이러스들에 의한 감염과는 다른 요소로 인해 발생된 간염 환자들이 있음이 보고되었다. 비A비B형 간염 (이하 "NANBH"이라함)으로 명명되는 이러한 간염은 물 및 식품을 통하여 전염되는 것과 혈액을 통하여 전염되는 것으로 분류되며, 수혈로 인해 발병되는 간염의 90%가 NANBH로 알려져 있다(Alter, H. J. et at., Lancet 2, 838-841(1975)). 더 나아가, 헌혈자의 1 내지 6% 가 NANB 바이러스 보균자로 간주되며, 감염환자의 40 내지 50% 가 만성간염으로 발전하고 또 그중 20% 정도가 간경변 및 간암으로 까지 진전되므로 (Dienstag, J. L. and Alter, H. J., Semin. Liver. Dis 6, 67-81(1986)), 특히 위험한 간염으로 간주된다.

특히 HCV와 밀접한 유연관계에 있는 플라비바이러스(flavi virus)의 경우, 외피와 제 1 비구조 유전자가 바이러스 감염시 숙주의 면역기작을 유도하는 주요 중화 항원결정기(neutralizing epitope)를 가지고 있는 것으로 공지되어 있다( Roehring, in The VIRUSES: "THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE", Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press(1986)). 또한 면역 친화 크로마토 그래피로 분리한 황색 열 바이러스(yellow fever virus)의 외피 단백질과 제 1 비구조 단백질 (NSI)은 감염에 대한 보호효과를 나타낼 수 있다는 보고도 있었다(Schlesinger, J., et al., J. Immuno. 135, 2805-2809(1985); Brandriss, M. W., et al., J. Infect. Diseases 161, 1134-1139(1990); Depres, P., et al., J. Gen. Virol. 72, 2811-2816(1991)).

따라서, HCV의 경우에도 이 외피 단백질과 제 1 비구조 유전자의 항원결정 기를 가진 폴리펩티드가 백신으로서 작용할 가능성이 높으며, 특히 이 외피 부분에 대한 항체의 형성은 C형 간염의 회복과 밀접한 관련이 있다는 보고가 있었다(Lesniewski, R, et al., p59; watanabe, p82, et al., 제 3 회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France(1991)).

또한 외피 단백질중에서도 특히 외피 2 단백질의 아미노 말단 부분의 경우 종상이성(species heterogeninity)이 두드러져 면역기작과 밀접한 관련이 있을 것으로 추정되고 이 부분이 백신 개발의 일차적 목표가 될 가능성을 제시된 바 있다(Houghton, M., p20, 제 3 회 국제 HCV 심포지움, strasbourg, France(1991)).

또한 최근에는, HCV의 외피 유전자를 바쿨로 바이러스(baculo virus)를 이용하여 곤충세포에서 발현시킨 HCV 의 외피당 단백질인 gp35-24 를 이용하여 분석한 결과, C 형 간염환자의 2 내지 17% 정도에서 외피 단백질의 항체가 검출되고, 일부의 경우에서는 이 외피 단백질에 대한 항체가 생성된 후 몇달 뒤에 간염으로부터 회복되었다는 보고가 있었다(Matsuura, Y., et al., J. Virol, 66, 1425-1431(1992)). 이러한 사실은 낮은 비율의 경우지만 외피 단백질에 대한 항체가 중화 작용과 밀접한 관련이 있다는 것을 간접적으로 시사해주고 있지만, 그러나 대부분의 경우에는 외피 단백질에 대한 항체만으로는 간염에서 회복되지 못한다는 것을 시사해 주기도 한다.

즉, HCV 의 외피 단백질은 C 형 간염에 대한 백신개발에 있어서 큰 중요성을 가지고 있으나, 또한 백신은 외피 단백질외에도 1 개 또는 그 이상의 비구조 단백질의 항원 결정기를 복합 사용함으로써 가능할 수도 있다.

특히, 순수분리된 HCV 의 외피단백질 및 기타 특이항원들을 이용하여 이들 항원들에 대한 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체를 제조할 수 있으며, 이 항체들은 C 형 간염 환자의 혈청에서 HCV 항원을 검출하는데 사용함으로써 좀더 민감한 조기진단에 크게 공헌할 수 있고 특히 이 항체들중 중화 항원결정기에 대한 특이성을 가지고 있는 항체들은 수동 면역 치료법에 대해서도 크게 유용하다.

이것은 HCV 와 밀접한 유연 관계에 있는 페스티바이러스(pestivirus)의 일종인 돼지 콜레라 바이러스(hog cholera virus)의 바이러스 표면의 2개의 당 단백질인 gp 55와 gp 33에 대한 단일 클론 항체가 중화작용을 할 수 있어서 백신으로 사용할 수 있다는 보고(Weiland, E., et al., J. Virol. 64, 3563-3569(1990))와 플라비 바이러스의 일종인 YFV의 외피 단백질과 제 1 비구조 단백질(NS1)에 대한 단일 클론 항체가 바이러스 감염에 대한 보호 면역성을 유도할 수 있다는 보고(Brandriss, M. W., et al., J. Gen. Virol. 67 229-234(1986); Gould, E. A., et al., J. Gen. Virol. 66, 1369-1382(1985))를 참조하면 더욱 확실히 알 수 있다.

또한, 단일 클론 항체는 항 이디오타입 항체를 증가시키는데 사용될 수 있는데, 이는 HCV 항원의 면역원성 영역을 밝히는 것 뿐만 아니라 C 형 간염의 치료 및 진단에도 유용하게 사용할 수 있다는 것이 공지되어 있다.

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 미국형 및 일본형의 HCV 에 의해 코딩되는 단백질을 사용하는 것보다 감지도 및 특이도가 더 높은 한국형 HCV 에 대한 진단시약 및 백신을 개발하고자 노력하던중, 한국형 HCV 의 전체 유전자중 외피 1 (KHCV E1)과 외피 2(KHCV E2) 부분을 유전공학적인 방법으로 대장균 및 효모에서 발현시키는데 성공하고 이를 개시한 바 있으며(본 출원인의 선행 특허출원 제 91-25505 호 및 제 92-10039호 참조), 또한 대장균에서 유비퀴틴(Ubiquitin, 이하 UB 라함)과의 융합 단백질로서 발현된 UBE1, UBE2 아미노말단(UBE2N), UBE2 카르복시 말단(UBE2C)의 정제방법도 완성한 바 있다(본 출원인의 선행 특허출원 제 91-25506 호, 제 92-10039 호 참조). 특히, 본 출원인에 의해 규명된 것들중 하나인 KHCV E2N cDNA 를 발현시키는데 있어, 발현체로서 효모를 사용하고 KHCV E2N cDNA 앞에 유비퀴틴 유전자를 접합시키게 되면, 이후의 발현과정을 거쳐 생산되는 KHCV E2N 단백질은 초기에 유비퀴틴과 융합된 상태로 생성되나 유비퀴틴이 즉시 유비퀴티네이즈에 의해 떨어져 나가게 되어, N-말단의 메티오닌이 제거된 형태의 KHCV E2N 단백질을 직접 얻을 수 있으므로 따로 메티오닌을 제거하는 공정을 필요로 하지 않으며, 이러한 발현 시스템을 특허출원 제 92-10039 호로 출원한 바 있다.

상기에서 발현된 KHCV E2N 단백질을 정제하는데 있어서, 기존의 단백질 정제 에 사용하던 원심 분리방법, 컬럼 크로마토그래피 방법등은 불용해 상태로 발현된 단백질의 정제에 적용하기에는 어려움이 많고, 또 종래의 HCV 단백질 정제에 사용하던 SDS 를 함유한 완충액을 이용한 용출, 6M 우레아 존재하의 용출과 컬럼크로마토 그래피등의 방법은 절차가 복잡하고 완제품의 순도가 약 80%정도로 낮다는 문제점이 있다(국제특허출원 공개 번호 WO 89/84669). 또한 본 출원인이 출원한 재조합 박테리아 세포 배양에서의 UB-E2N 단백질의 정제방법(특허출원 제 92-10039 호)인 세포파괴 및 용해가능한 단백질의 제거, 트리톤 X-100 과 트리스 완충액을 이용한 불용성 침전물의 세척, 우레아를 이용한 불용성 침전물 용해, S-200 겔 투과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 우레아의 제거 및 페닐 크로마토그래피에 의한 정제방법을 본 단백질의 정제에 적용하기에는 어려운 점이 있었다. 따라서, 본 발명의 목적은 유전자 재조합 효모로부터 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질(KHCV E2N 단백질)을 고순도로 대량 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서,

가) KHCV E2N cDNA와 유비퀴틴 유전자가 발현되어 있는 유전자 재조합 효모세포를 파괴한 후 용해된 상태의 물질을 제거하는 단계 ;

나) 얻어진 세포 침전물을 계면활성제와 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 세척하여 가용성 물질을 제거하는 단계 ;

다) 얻어진 침전물을 우레아를 함유하는 완충액에 용해시켜 침전된 물질을 제거하는 단계 ; 및

라) 얻어진 단백질 용액으로부터 KHCV E2N 단백질을 수집하는 단계 ; 를 포함하여, 유전자 재조합 효모로부터 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이항원인 외피 2N 단백질(KHCV E2N 단백질)을 정제하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따라 사용되는 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 알킬페닐 에테르(Triton X-100)이 바람직하고, 우레아를 함유하는 완충액은 바람직하게는 우레아를 6 내지 9M 농도, 특히 바람직하게는 8M 농도로 함유하며, 염화나트륨은 0.1 내지 0.5M 농도, 특히 바람직하게는 0.2M 농도로 사용된다. 우레아 및 염화나트륨의 농도가 상기 상한치나 하한치를 넘으면 정제효율이 떨어진다.

이하, 본 발명의 정제 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 정제과정에 앞서, 한국형 C 형 간염 바이러스의 KHCV E2N cDNA 와 유비퀴틴(UB)의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 효모세포(Saccharomyces cerevisiae)를 4% 포도당이 함유된 루이신(leucine) 결핍 배지에서 선별 배양한 다음, 5% 포도당이 함유된 YEP 배양액에서 6 시간 배양하고, 다시 2% 포도당이 함유된 YEP 배양액에서 60 시간정도 배양하여 KHCV UB E2N 융합 단백질을 생성시킨다. 이때 세포내에서 유비퀴티네이즈에 의하여 유비퀴틴이 떨어져 나가므로 KHCV E2H 단백질로 전환된다.

이어서, 상기 배양액을 원심분리하여 효모세포를 침전시키고, 이 침전된 세포를 완충액에 현탁시킨 다음 직경 0.4mm 의 유리구슬을 70%(v/v)의 비율로 첨가하여 균질분쇄기로 세포막을 파괴하여 효모 균질액을 얻는다. 이때 상기에서 얻어진 효모세포 균질액의 일부를 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 도데실황산나트륨(SDS: sodium dodecyl sulfate)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 타우빈(Towbin)등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, 4350-4354 (1979))에 따라 임모빌론 P 필터로 옮긴 후, 이 필터를 C 형 간염에 감염된 한국인 환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린을 이용하여 웨스턴-블롯팅(western blotting)하여 KHCV E2N 항원 단백질의 존재를 확인한다.

그 결과, 재조합 효모에서 발현시킨 분자량 20,000 달톤 정도의 KHCV E2N 단백질이 C 형 간염에 감염된 사람의 혈청과 면역학적으로 특이하게 반응하므로, 이 단백질이 HCV 의 특이항원이라는 것을 확인할 수 있다. 이어서, 상기에서 수득한 효모균질액을 원심분리기로 원심분리하여 용해된 상태의 단백질을 제거하여 불용성 침전물을 얻는다. 이 침전물을 1% 트리톤 X-100 과 0.2M 염화 나트륨을 함유한 완충액으로 현탁시키고 교반시킨 다음 원심분리하여 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻는다. 다시, 이 침전물을 8M 우레아를 함유한 완충액으로 용해시킨 후 원심분리하여 상등액 만을 취한 다음, 이를 YM1O 한외 여과막을 이용하여 농축시키고, 8M 우레아를 함유한 완충액으로 평형시킨 S-200 세파크릴(Sephacryl, Pharmacia) 컬럼에 통과시켜 크로마토그래피하고, 용출되는 단백질 용액의 분획들을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 확인한 후, KHCV E2N 단백질을 포함하는 특정 분획만을 별도로 수집한 다음, FPLC 모노 Q 이온교환수지 컬럼에 통과시키고, 흡착된 단백질을 0 내지 0.2M 염화나트륨의 농도 구배를 포함하는 완충제를 가하여 용출되는 단백질 용액의 분획들을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 확인한 후 KHCV E2N 단백질을 포함하는 특정 분획만을 별도로 수집함으로써, 한국형 HCV 의 특이항원인 KHCV E2N 항원을 대량으로 추출 정제할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세히 설명한다. 하기의 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니 다.

[실시예 1] 재조합 효모세포의 배양

HCV 의 특이항원인 외피 2N 단백질(E2N)과 유비퀴틴(UB)의 유전자를 포함하는 운반체 pYLBC-A/G-UB-E2N에 의해 형질 전환된 효모 세포를 4% 포도당 10㎖를 함유하는 루이신(leucine) 결핍 배양액(배양액 1 ℓ당 아미노산이 없는 효모질소기질 (Yeast nitrogen base with out amino acids, Difco, U.S. A) 6.7g 과 루이신이 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g)에 접종하여 30℃에서 12 시간동안 진탕시켜 선별 배양한 다음 이를 종자균으로 사용하였다.

상기의 효모 종자균을 5% 포도당 100㎖를 함유하는 YEP 배양액 (2% 효모 추출물, 3% 펩톤, Deltown Chemursic, Connecticut, U.S.A)으로 옮기고, 30℃의 배양온도에서 약 60 시간동안 진탕배양하여 파장 650nm에서의 흡광도가 10 정도가 되 었을 때 원심분리기(Beckman J-6B, Rotor H. S. 4.2)에서 3.500r.p.m 의 속도로 25분간 원심분리하여 효모 세포를 침전시켰다.

[실시예 2] 효모세포의 파괴과정

실시예 1 의 배양액에서 침전된 재조합 효모 세포들을 50ml의 완충액 1 (20mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 2mM B-머캅토에탄올, 1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드, 1μg/ml 펩스타틴 A)중에 현탁시킨 다음, 직경 0.4mm의 유리구슬을 총부피의 70%(v/v)까지 첨가한 뒤 균질분쇄기로 4℃에서 5 분씩 3 번 분쇄하여 세포막을 파괴시켰다. 파괴된 세포용액을 여과지(Whatman, 3MM U.S.A)를 통해 진공 여과시킴으로써 유리구슬을 제거하여 효모 균질액을 얻었다.

[실시예 3] 특이항원 발현의 확인

실시예 2 의 효모 균질액을 램리(Laemmli, et al., Nature, 227,680(1970))의 방법에 따라 SDS 존재하에서 15% 폴리 아크릴 아미드 겔에서 전기영동하였고, 여기서 유비퀴틴이 세포내에서 단리되고, E2N 단백질이 약 20,000 달톤정도의 크기로 발현되는 것을 확인하였다.

이후, 겔상에서 분리된 단백질을 타우빈(Towbin, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 76,4750(1979))의 방법에 따라 임모빌론 P 필터(9MILLIPORE, cat #IPUH O0010, pore size 0.45㎛)로 블롯팅(blot)시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈 20 이 함유된 PBS(10mM 인산, pH7.0, 0,15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2 시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄(blocking)시켰다. 이후, 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS에 한국인 C형 간염환자의 혈청을 1:20으로 희석시켜 첨가하고, 상온에서 1 시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.05% 트윈 20 을 함유한 PBS 로 5 분씩 4 회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20 을 함유한 PBS 에 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab., Anti-Human IgG-HRP)을 1:1,500 으로 희석시켜 첨가한 다음 상온에서 1 시간 동안 진탕시켜 반응시키고, 0.05% 트윈 20 을 함유한 PBS 로 5 분씩 4 회 세척한 다음 50mM 트리스 완충용액(pH 7.5)으로 2 회 세척하였다.

이 필터를 400μg/ml의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소가 함유된 50mM 트리스 완충용액을 가하여 발색시켰다. 제 3 도의 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 총 세포 균질액중에서 E2N 단백질만이 C 형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다. 이 웨스텐-블롯팅의 결과를 통해, 발현된 E2N 단백질이 HCV 의 특이항원임을 확인하였다.

[실시예 4] 기용성 단백질의 제거과정

실시예 2 의 효모세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA 14)를 사용하여 11,000 r.p.m 에서 25 분간 원심분리하여 가용성 단백질을 제거함으로써 E2N 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 얻었다.

[실시예 5] 1% 트리톤 X-100 과 염화나트륨을 이용한 세척과정

실시예 4 의 불용성 침전물을 100ml 의 1% 트리톤 X-100 과 0.2M 염화나트륨을 함유한 완충액 2(20mM 트리스, pH8.0, 1mM EDTA, 10mM B-머캅토 에탄올)중에 현탁시킨 다음 상온에서 1 내지 2 시간정도 교반시키고 원심분리기로 원심분리하여 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다.

[실시예 6] 8M 우레아를 사용한 침전물의 용해와 S-200 겔 투과 크로마토그래 피

실시예 5 의 세척된 불용성 침전물을 100ml의 8M 우레아를 함유한 완충액 3(5OmM 카보네이트, pH 9.5, 1mM EDTA, 10mM B-머캅토 에탄올)중에 현탁시키고 상온에서 2 시간 동안 교반시켜 용해시킨 다음 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 상등액만을 취했다. 상기의 상등액 100ml 를 YM1O 한외 여과막 농축기(Amicon)를 사용하여 5ml 까지 농축한 다음, 이를 원심분리기(J2-21, JA21 Rotor)에서 15,000 r.p.m 으로 25 분간 원심분리하여 상등액만을 취하고, 이를 8M 우레아를 함유한 완충액 3 으로 평형시킨 S-200 수지컬럼(Pharmacia LKB, 2.5cm x 90cm, U.S.A)에 시간당 40ml 의 속도로 통과시키면서 겔 여과 크로마토그래피하여 용출되는 단백질들을 3ml의 분획들로 수집하고, 이 분획들을 SDS 폴리아크릴 아미드 겔에서 전기영동하여 E2N 단백질을 포함하는 특정 분획들만을 별도로 수집하였다.

[실시예 7] FPLC-모노-Q-이온교환 크로마토그래피

실시예 6 에서 수집한 약 21ml 의 E2N 을 포함한 단백질 용액을 8M 우레아를 포함한 완충액 3 으로 미리 평형시킨 FPLC-모노-Q-이온교환수지 컬럼(Pharmacia, HR 5/5, 0.5cm x 5cm, U.S.A)에 0.6ml/min 의 속도로 통과시키고, 다시 동일 완충액을 통과시켜 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다. 이어서, 18ml 의 0 내지 0.2M 의 염화나트륨 선형 농도 구배를 포함한 동일 완충액을 가하여 겔에 흡착되어 있던 단백질들을 용출시키고, 0.6ml 의 분획들로 수집한 다음, 이 분획들을 15% SDS 폴리아크릴 아미드 겔에서 전기영동하여 순수한 E2N 단백질만을 포함하는 특정 분획을 별도로 수집함으로써 95% 이상의 순도를 가진 E2N 단백질 약 8mg 을 얻었다(제 2 도 참조).

제 2 도에서, M 라인은 표준 단백질의 분자량을 나타내고, 1 번 라인은 표준 세포 단백질을, 2 번 라인은 KHCV E2N 세포 파괴후의 전체 균질액을, 3 번 라인은 전체 균질액중 원심분리한 침전물을, 4 번 라인은 1% 트리톤 및 0.2M 염화나트륨을 이용한 세척후의 침전물을, 5 번 라인은 8M 우레아로 용해시킨 단백질을, 6 번 라인은 S-200 겔 투과 크로마토그래피후에 수집한 단백질 용액을, 마지막으로 7 번 라인은 FPLC 모노 Q 크로마토그래피후의 정제된 KHCV E2N 단백질을 각각 나타낸다.

상기 정제과정을 통해 얻어진 KHCV E2N 단백질을 한국인 C 형 간염 환자의 혈청을 이용하여 웨스턴 블룻팅한 결과(제 3 도 참조), 정제된 최종산물인 KHCV E2N 단백질이 한국형 HCV 에 대한 특이항원임을 확인하였다.

제 3 도에서, A 는 SDS 폴리아크릴 아미드 겔에서 전기염(SDS-PAGE)한 후 코마시 블루(Coomassie Blue)로 염색한 도면이고, B 는 SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 도면으로서, M 라인은 표준 단백질의 분자량을, 1 번 라인은 표준 세포 균질액을, 2 번 라인은 KHCV E2N 세포의 전체 균질액을, 3번 라인은 정제된 KHCV E2N 단백질을 각각 나타낸다.

이상에서와 같이, 본 발명을 통해 HCV 의 특이항원인 E2N 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라 대장균에서 생산되는 유비퀴틴과 융합된 단백질들과는 다르게 유비퀴틴 부분이 단리된 상태로 정제할 수 있기 때문에 더욱 정확한 C 형 간염 진단방법을 제공할 수가 있으며, 특히 E2N 단백질을 항원으로 사용하여 HCV 항원에 대한 특이항체를 만들 수 있게 됨으로써 HCV에 대한 백신개발에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

Claims (5)

1. 가) KHCV E2N cDNA 와 유비퀴틴 유전자가 발현되어 있는 유전자 재조합 효모세포를 파괴한 후 용해된 상태의 물질을 제거하는 단계: 나) 얻어진 세포 침전물을 계면활성제와 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 세척하여 가용성 물질을 제거하는 단계: 다) 얻어진 침전물을 우레아를 함유하는 완충액에 용해시켜 침전된 물질을 제거하는 단계; 및 라) 얻어진 단백질 용액을 사용하여 S-200 겔 투과 크로마토그래피 및 FPLC 모노 Q 이온교환 크로마토그래피를 연속적으로 실시함으로써 KHCV E2N 단백질을 수집하는 단계를 포함하는, 유전자 재조합 효모로부터 한국형 C 형 간염 바이러스의 특이 항원인 외피 2N 단백질(KHCV E2N 단백질)을 정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 나)의 계면활성제가 폴리에틸렌글리콜 알킬페닐에테르임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 다)의 우레아의 농도가 6 내지 8M 이고, 염화나트륨의 농도가 0.1M 내지 0.5M 임을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 우레아를 함유하는 완충액이 5mM 카보네이트, 1mM EDTA 및 10mM B-머캅토 에탄올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 우레아를 함유하는 완충액이 9.5 의 pH 를 가짐을 특징으로 하는 방법.