CN103245786B - 一种细菌内毒素检测用分散组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌内毒素检测用分散组合物，它包括如下配比的成分：甘油1～20体积份、阴离子表面活性剂0.5～5重量份，非离子表面活性剂1～10体积份。本发明还公开了一种细菌内毒素检测用分散液及其制备方法。本发明细菌内毒素检测用分散组合物可以有效提高内毒素检测方法的准确度，简化内毒素检测步骤，具有良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及一种细菌内毒素检测用分散组合物。
背景技术
细菌内毒素是G-菌细胞壁上的特有结构，其主要成分是脂多糖，具很强的热原活性。当细菌内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时，则可导致不同程度的内毒素血症。因此，对于注射剂及其生产中所用的原辅料都应进行细菌内毒素的控制，以确保产品质量，保障用药安全。
细菌内毒素的检测常用方法是家兔热原法和鲎试剂法，目前运用较多的是鲎试剂法。采用该方法进行细菌内毒素检测之前，须进行干扰实验，排除供试品对鲎试剂实验的干扰，确保该方法的准确度。
对于非水溶性供试品，由于其与细菌内毒素检测用水不能互溶，混合后一段时间出现分层，导致难以有效检测。目前多采用的方法是在分层以前取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物，或者通过离心取水相部分进行干扰实验，但是取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物进行干扰实验需要稀释更大的倍数才能排除干扰甚至不能排除干扰；离心方法存在操作复杂、容易造成二次污染，出现假阳性，同时不能确保油相中的细菌内毒素完全溶解在水相中，在进行细菌内毒素检测时，容易出现假阴性等缺点。对于含有这类非水溶性原料的药品，虽然能够与水互溶，在采用细菌内毒素检测用水稀释时，仍然存在细菌内毒素在供试品中分散不均匀导致干扰不能成立的情况。
商君等，“油剂普鲁卡因青霉素注射液细菌内毒素检查方法的研究”，中国兽药杂志2000，34（1）：20～22，采用在样品中加入适量无菌、内毒素合格的0.1mol/L氢氧化钠、1%吐温-80溶液，并用0.1mol/L盐酸调节样品液的pH值，解决了油剂普鲁卡因青霉素注射液的溶解问题，但是该方法操作复杂，并且经研究，不能广泛应用于常用的非水溶性药品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的细菌内毒素检测用分散组合物。
本发明细菌内毒素检测用分散组合物，它包括如下配比的成分：甘油1～20体积份、阴离子表面活性剂0.5～5重量份，非离子表面活性剂1～10体积份。
所述重量份/体积份为g/ml。
其中，所述阴离子表面活性剂HLB值为1～20。优选地，所述阴离子表面活性剂的HLB值为12～20。
其中，所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种。
其中，所述非离子表面活性剂的HLB值为1～20。优选地，所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3～16.7。
其中，所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种。
优选地，它包括如下配比的成分：甘油10体积份、阴离子表面活性剂1重量份，非离子表面活性剂10体积份。
本发明细菌内毒素检测用的分散液，它包括前述述细菌内毒素检测用的分散组合物与注射用水或细菌内毒素检查用水，其中，甘油的浓度为0.1～2%（v/v）。
本发明前述分散液的方法，它包括如下步骤：
（1）取甘油，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，得甘油浓度为0.1%～2%（v/v）的溶液；
（2）分别取阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂溶于步骤（1）的溶液中，它们的浓度分别为0.1～0.4%（w/v）和0.1～1%（v/v）；
（3）将步骤（2）得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜过滤，即可。
本发明细菌内毒素检测用分散组合物使内毒素均匀分散在水相中，有效排除非水溶性供试品对鲎试剂实验的干扰，提高内毒素检测方法的准确度，简化内毒素检测步骤。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1内毒素检测报告，其中，管号1-8：标准曲线；9-10：离心法制备供试品溶液；11-12：阳性对照；13-14：实施例1分散液作为溶剂制备的供试品溶液1；15-16：实施例1分散液对照样品的制备1；17-18：实施例2分散液作为溶剂制备的供试品溶液2；19-20：实施例2分散液对照样品2；21-22：实施例3分散液作为溶剂制备的供试品溶液3；23-24：实施例3分散液对照样品3；25-26：实施例4分散液作为溶剂制备的供试品溶液4；27-28：实施例4分散液对照样品4；29-30：实施例5分散液作为溶剂制备的供试品溶液5；31-32：实施例5分散液对照样品5。
具体实施方式
本发明细菌内毒素检查法，指《中华人民共和国药典》（2010版第二部附录ⅪE）规定的细菌内毒素检查法。
实施例1本发明分散液的制备及应用
一、制备方法
（1）试剂选择
阴离子表面活性剂选择油酸钠，其HBL值为18；非离子表面活性剂选择聚山梨酯-80，其HBL值为15。
（2）实验器具及试剂热原的去除
所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250℃下干烤2h,去除其中的热原；油酸钠放置于除去热原的碘量瓶中，在150℃下干烤2h。
（3）分散液的配制
称取已经在150℃干烤2h的油酸钠0.1g，用细菌内毒素检测用水配制的1%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.1%的油酸钠溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，使得整个体系各原料的配比为：油酸钠0.1%（w/v），甘油1%（v/v）、聚山梨酯-801%（v/v），最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
（4）分散液溶液的内毒素去除
将得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。
（5）分散液溶液细菌内毒素验证实验
按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。
a、细菌内毒素限值的确定
按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。
b、供试品的干扰试验
鲎试剂灵敏度复核试验
按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表1。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果
试验结果表明以上鲎试剂灵敏度复核均符合规定。
干扰试验
用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该分散液样品原液进行干扰试验。用细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素溶液。每一浓度的细菌内毒素溶液平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品各做2支阴性对照管。如果最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何均值（Es）和此浓度稀释液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何均值（Et）。
Es=lg-1(∑Xs/4) Et=lg-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和此浓度稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ），且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，认为供试品在该浓度下不干扰试验。干扰试验结果见表2。
表2 干扰试验结果
| 鲎试剂批号 | Es（EU/ml） | Et（EU/ml） | 结果 |
| 厂家1 | 0.015 | 0.015 | 不干扰 |
| 厂家2 | 0.015 | 0.015 | 不干扰 |
通过上述干扰试验的结果表明，鲎试剂选用0.015EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查均无干扰，该分散液可进行细菌内毒素检查。
检测结果显示，本发明分散液的细菌内毒素含量小于0.015EU/ml。
二、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素回收率实验
实验方法：选择大豆油为供试品，取5ml供试品,加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液,在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品溶液；取5ml细菌内毒素检测用水，加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液，在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为对照溶液，采用动态测定法对供试品溶液和对照溶液进行细菌内毒素含量测定。
实验结果参考附图1中管号13-14及15-16：供试品溶液和对照溶液中细菌内毒素回收率分别为92.1%和93.3%，说明内毒素均匀分散在溶液中，该分散液溶液不包裹非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中的细菌内毒素或包裹程度很小。
三、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素验证实验
（一）利用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对大豆油
原料进行细菌内毒素验证实验。
1.细菌内毒素限值的确定
1.1细菌内毒素限值的确定
依据大豆油的质量标准将本品的细菌内毒素限值的规定为每1g大豆油中含内毒素的量应小于1.0EU。
1.2最小有效稀释浓度（MVC）的确定
用0.25EU/ml的鲎试剂进行试验
2.供试品的干扰试验
2.1鲎试剂灵敏度复核试验
按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表3。
表3 鲎试剂灵敏度复核结果
以上结果显示所用鲎试剂灵敏度符合规定。
2.2干扰试验
供试品制备：取供试品，加到无热源碘量瓶中，用上述分散剂溶液将待测样品配制成浓度为250mg/ml、125mg/ml的不含细菌内毒素NPC系列，再分别用各个稀释浓度的供试品制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
2.2.1干扰预试验
干扰预试验用标示灵敏度λ=0.25EU/ml的鲎试剂进行。预试验结果见表4。
表4 干扰预试验结果
以上结果表明：试验结果有效，初步确定0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂对250mg/ml的供试品溶液做预试验无干扰。
2.2.2干扰试验
根据干扰预试验的结果用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂对250mg/ml的供试品溶液进行干扰试验。用细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品溶液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素溶液。每一浓度的细菌内毒素溶液平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品各做2支阴性对照管。如果最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何均值（Es）和此浓度供试品溶液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何均值（Et）。
Es=lg-1(∑Xs/4) Et=lg-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和此浓度供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ），且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，认为供试品在该浓度下不干扰试验。干扰试验结果见表5。
表5 干扰试验结果
3.结论
通过上述干扰试验的结果表明，分散剂溶液与大豆油混合后无明显分层，采用分散剂溶液配制成250mg/ml浓度的供试品溶液，鲎试剂选用0.25EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查无干扰，可进行大豆油细菌内毒素检查。
（二）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对前列地尔注射液进行细菌内毒素验证实验。
1.细菌内毒素限值的确定
1.1细菌内毒素限值的确定
依据前列地尔注射液的质量标准将本品的细菌内毒素限值的规定为每1ml本品细菌内毒素的量应小于0.5EU。
1.2最大有效稀释倍数（MVD）的确定
用0.125EU/ml的鲎试剂进行试验
2.供试品的干扰试验
2.1鲎试剂灵敏度复核试验
按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表6。
表6 鲎试剂灵敏度复核结果
以上结果显示所用鲎试剂灵敏度符合规定。
2.2干扰预试验
2.2.1供试品制备：将样品用配制的分散剂溶液逐级稀释2倍、4倍、8倍、16倍的不含细菌内毒素NPC系列，再分别用各个稀释级的供试品稀释剂制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
2.2.2干扰预试验用标示灵敏度λ=0.125EU/ml的鲎试剂进行。预试验结果见表7。
表7 干扰预试验结果
以上结果表明：试验结果有效，初步确定0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂对稀释4倍的供试品溶液做预试验无干扰。
2.2.3干扰试验
根据干扰预试验的结果用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂对稀释4倍的供试品溶液进行干扰试验。用细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品溶液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素溶液。每一浓度的细菌内毒素溶液平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品各做2支阴性对照管。如果最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何均值（Es）和此浓度供试品溶液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何均值（Et）。
Es=lg-1(∑Xs/4) Et=lg-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和此浓度供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ），且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，认为供试品在该浓度下不干扰试验。干扰试验结果见表8。
表8 干扰试验结果
3.结论
通过上述干扰试验的结果表明，该分散剂与前列地尔注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂可进行前列地尔注射液的细菌内毒素检查。
（三）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行细菌内毒素验证实验。
1.细菌内毒素限值的确定
1.1细菌内毒素限值的确定
依据丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的质量标准将本品的细菌内毒素限值的规定为每1ml本品细菌内毒素的量应小于0.5EU。
1.2最大有效稀释倍数（MVD）的确定
用0.125EU/ml的鲎试剂进行试验
2.供试品的干扰试验
2.1鲎试剂灵敏度复核试验
按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE“细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表9。
表9 鲎试剂灵敏度复核结果
以上结果显示所用鲎试剂灵敏度符合规定。
2.2干扰预试验
2.2.1供试品制备：将样品用配制的分散剂溶液逐级稀释2倍、4倍、8倍、16倍的不含细菌内毒素NPC系列，再分别用各个稀释倍数级的供试品稀释剂制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
2.2.2干扰预试验
干扰预试验用标示灵敏度λ=0.125EU/ml的鲎试剂进行，预试验结果见表10。
表10 干扰预试验结果
以上结果表明：试验结果有效，初步确定0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂对稀释4倍的供试品溶液做预试验无干扰。
2.2.3干扰试验
根据干扰预试验的结果用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂对稀释4倍的供试品溶液进行干扰试验。用细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品溶液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素溶液。每一浓度的细菌内毒素溶液平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和此浓度的供试品各做2支阴性对照管。如果最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何均值（Es）和此浓度供试品溶液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何均值（Et）。
Es=lg-1(∑Xs/4) Et=lg-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和此浓度供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ），且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，认为供试品在该浓度下不干扰试验。干扰试验结果见表11。
表11 干扰试验结果
3.结论
通过上述干扰试验的结果表明，该分散剂与丙泊酚中/长链脂肪乳注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂可进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的细菌内毒素检查。
实验结果说明，本发明分散剂溶液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实施例2 本发明分散液的制备及应用
一、制备方法
（1）试剂选择
阴离子表面活性剂选择油酸钠，其HBL值为18；非离子表面活性剂选择聚山梨酯-80，其HBL值为15。
（2）实验器具及试剂热原的去除
所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250℃下干烤2h,去除其中的热原；油酸钠放置除去热原的碘量瓶中，在150℃下干烤2h。
（3）分散液的配制
称取已经在150℃干烤2h的油酸钠0.2g，用细菌内毒素检测用水配制的2%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.2%的油酸钠溶液，然后加入0.5%聚山梨酯-80，使得整个体系各原料的配比分别为油酸钠：0.2%（w/v），甘油：2%（v/v）、聚山梨酯-80：0.5%（v/v），最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
（4）分散液溶液的内毒素去除
将得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。
（5）分散液溶液细菌内毒素验证实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测，检测结果为该溶液细菌内毒素含量小于0.015EU/ml。
二、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素回收率实验
选择大豆油为供试品，取5ml供试品,加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液,在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品溶液；取5ml细菌内毒素检测用水，加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液，在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为对照溶液，采用动态测定法对供试品溶液和对照溶液进行细菌内毒素含量测定。
实验结果参考附图1中管号17-18及19-20，供试品溶液和对照溶液中细菌内毒素回收率分别为95.4%和96.3%，说明内毒素均匀分散在溶液中，该分散液溶液不包裹非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中的细菌内毒素或包裹程度很小。
三、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素验证实验
（一）利用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对大豆油原料进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（一）的方法，细菌内毒素验证结果表明，该分散剂与大豆油混合后无明显分层现象，采用配制的分散剂溶液配制成250mg/ml浓度的供试品溶液，鲎试剂选用0.25EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查无干扰，可进行大豆油细菌内毒素检查。
（二）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对前列地尔注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（二）的方法，结果表明，该分散剂与前列地尔注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂可进行前列地尔注射液的细菌内毒素检查。
（三）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（三）的方法，结果表明，该分散剂与丙泊酚中/长链脂肪乳注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释8倍，采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂可进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的细菌内毒素检查。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实施例3 本发明分散液的制备及应用
一、制备方法
（1）试剂选择
阴离子表面活性剂选择油酸钠和油酸，其HBL值分别为18和1；非离子表面活性剂选择聚山梨酯-21，其HBL值为13.3。
（2）实验器具及试剂热原的去除
所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250℃下干烤2h,去除其中的热原；油酸钠放置除去热原的碘量瓶中，在150℃下干烤2h。
（3）分散液的配制：
称取已经在150℃干烤2h的油酸钠0.4g，用细菌内毒素检测用水配制的0.1%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.4%的油酸钠溶液，然后分别加入聚山梨酯-21和油酸的混合物，使它们的浓度为0.1%和0.1%，使得整个体系各原料的重量配比分别为油酸钠：0.4%（w/v），油酸0.1%（w/v）：甘油：0.1%（v/v）、聚山梨酯-21：0.1%（v/v），最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
（4）分散液溶液的内毒素去除
将得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。
（5）分散液溶液细菌内毒素验证实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。
检测结果为该溶液细菌内毒素含量小于0.015EU/ml。
二、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素回收率实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，选择大豆油为供试品，取5ml供试品,加入5ml含有1EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液,在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品溶液；取5ml细菌内毒素检测用水，加入5ml含有1EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液，在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为对照溶液，采用动态测定法对供试品溶液和对照溶液进行细菌内毒素含量测定。
实验结果参考附图1中管号21-22及23-24，供试品溶液和对照溶液中细菌内毒素回收率分别为96.1%和96.7%，说明内毒素均匀分散在溶液中，该分散液溶液不包裹非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中的细菌内毒素或包裹程度很小。
三、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素验证实验
（一）利用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对大豆油原料进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（一）的方法，细菌内毒素验证结果表明，该分散剂与大豆油混合后无明显分层现象，采用配制的分散剂溶液配制成250mg/ml浓度的供试品溶液，鲎试剂选用0.25EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查无干扰，可进行大豆油细菌内毒素检查。
（二）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对前列地尔注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（二）的方法，结果表明，该分散剂与前列地尔注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂可进行前列地尔注射液的细菌内毒素检查。
（三）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（三）的方法，结果表明，该分散剂与丙泊酚中/长链脂肪乳注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释8倍，采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂可进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的细菌内毒素检查。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实施例4 本发明分散液的制备及应用
一、制备方法
（1）试剂选择阴离子表面活性剂选择油酸三乙醇胺，其HBL值为12；非离子表面活性剂选择聚山梨酯-20，其HBL值为16.7。
（2）实验器具及试剂热原的去除所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250℃下干烤2h，去除其中的热原。
（3）分散液的配制：
称取油酸三乙醇胺,用细菌内毒素检测用水配制的浓度为1%的甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.05%的油酸三乙醇胺溶液，然后加入1%聚山梨酯-20，使得整个体系各原料的重量配比分别为油酸三乙醇胺：0.05%（w/v）,甘油：1%（v/v）、聚山梨酯-20：1%（v/v），最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
（4）分散液溶液的内毒素去除：
将得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。
（5）分散液溶液细菌内毒素验证实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。
检测结果为该溶液细菌内毒素含量小于0.015EU/ml。
二、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素回收率实验：
按照实施例1步骤一（5）的方法，选择大豆油为供试品，取5ml供试品,加入5ml含有1EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液,在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品溶液；取5ml细菌内毒素检测用水，加入5ml含有1EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液，在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为对照溶液，采用动态测定法对供试品溶液和对照溶液进行细菌内毒素含量测定。
实验结果参考附图1中管号25-26及27-28，供试品溶液和对照溶液中细菌内毒素回收率分别为96.2%和97.2%，说明内毒素均匀分散在溶液中，该分散液溶液不包裹非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中的细菌内毒素或包裹程度很小。
三、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素验证实验
（一）利用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对大豆油原料进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（一）的方法，细菌内毒素验证结果表明，该分散剂与大豆油混合后无明显分层现象，采用配制的分散剂溶液配制成250mg/ml浓度的供试品溶液，鲎试剂选用0.25EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查无干扰，可进行大豆油细菌内毒素检查。
（二）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对前列地尔注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（二）的方法，结果表明，该分散剂与前列地尔注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂可进行前列地尔注射液的细菌内毒素检查。
（三）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（三）的方法，结果表明，该分散剂与丙泊酚中/长链脂肪乳注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释8倍，采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂可进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的细菌内毒素检查。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实施例5 本发明分散液的制备及应用
一、制备方法
（1）试剂选择
阴离子表面活性剂选择油酸钾，其HBL值为20；非离子表面活性剂选择聚山梨酯-80，其HBL值为15。
（2）实验器具及试剂热原的去除
所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250℃下干烤2h,去除其中的热原；油酸钾放置除去热原的碘量瓶中，在150℃下干烤2h。
（3）分散液的配制
称取已经在150℃干烤2h的油酸钾0.15g,用细菌内毒素检测用水配制的1%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.15%的油酸钾溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，使得整个体系各原料的重量配比分别为油酸钾：0.15%（w/v）,甘油：1%（v/v）、聚山梨酯-80：1%（v/v），最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
（4）分散液溶液的内毒素去除
将得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。
（5）分散液溶液细菌内毒素验证实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。
检测结果显示，该溶液细菌内毒素含量小于0.015EU/ml。
二、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素回收率实验
按照实施例1步骤一（5）的方法，选择大豆油为供试品，取5ml供试品,加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液,在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品溶液；取5ml细菌内毒素检测用水，加入5ml含有0.5EU/ml细菌内毒素标准品的分散液溶液，在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为对照溶液，采用动态测定法对供试品溶液和对照溶液进行细菌内毒素含量测定。
实验结果参考附图1中管号29-30及31-32，供试品溶液和对照溶液中细菌内毒素回收率分别为91.5%和92.4%，说明内毒素均匀分散在溶液中，该分散液溶液不包裹非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中的细菌内毒素或包裹程度很小。
三、分散液溶液用于非水溶性液体或含有该类液体的注射剂细菌内毒素验证实验
（一）利用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对大豆油原料进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（一）的方法，细菌内毒素验证结果表明，该分散剂与大豆油混合后无明显分层现象，采用配制的分散剂溶液配制成250mg/ml浓度的供试品溶液，鲎试剂选用0.25EU/ml灵敏度进行细菌内毒素检查无干扰，可进行大豆油细菌内毒素检查。
（二）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对前列地尔注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（二）的方法，结果表明，该分散剂与前列地尔注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂可进行前列地尔注射液的细菌内毒素检查。
（三）采用经细菌内毒素检测合格的分散液溶液作为稀释剂，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行细菌内毒素验证实验。
按照实施例1步骤三（三）的方法，结果表明，该分散剂与丙泊酚中/长链脂肪乳注射液混合后无分层现象，可利用该分散剂将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释8倍，采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂可进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的细菌内毒素检查。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
实验结果说明，本发明分散液可使内毒素均匀分散在体系中，实现非水溶性液体或含有该类液体的注射剂中内毒素限量的准确检测。
对比实验：
一、离心法细菌内毒素回收率
（一）供试品制备：
1、离心法供试品制备
选择实验样品为大豆油，用细菌内毒素检测用水稀释细菌内毒素标准品至浓度为0.25EU/ml，取等体积浓度为0.25EU/ml的细菌内毒素标准品与大豆油在漩涡混合器上混合5次，每次30s，然后用离心机在2500r/min下分离10min，取下层清液作为供试品；
2、阳性对照
用细菌内毒素检测用水稀释至浓度为0.25EU/ml的细菌内毒素标准品作为阳性对照。
3、分散液作为溶剂的供试品制备
选择实验样品为大豆油，分别用上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5配制的分散液溶液稀释细菌内毒素标准品至浓度为0.5EU/ml，取等体积浓度为0.5EU/ml的细菌内毒素标准品与大豆油在漩涡混合器上混合5次，每次30s，作为供试品1、供试品2、供试品3、供试品4、供试品5；
4、分散液对照样品的制备
用上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5配制的分散液溶液分别稀释细菌内毒素标准品至浓度为0.25EU/ml，分别作为对照样品1、对照样品2、对照样品3、对照样品4和对照样品5。
（二）细菌内毒素回收率实验
采用动态测定法对以上样品进行其中细菌内毒素检查，实验结果见图1。
由图1可以看出，采用细菌内毒素检查用水与大豆油的混合物通过离心取水相部分测定细菌内毒素含量，得到的供试品溶液细菌内毒素回收率小于阳性溶液细菌内毒素回收率，说明离心法不能确保油相中的细菌内毒素完全进入水相，部分内毒素被油相中的油脂成分包裹或吸附，利用该方法进行细菌内毒素检测容易出现假阴性；采用本发明分散液溶液与大豆油相互混合，得到的各供试品溶液细菌内毒素回收率与其相应的对照溶液相比较，细菌内毒素回收率接近，与阳性溶液相比较，回收率接近，说明采用分散液有利于使包裹或者吸附在油相中的细菌内毒素从中释放出来，提高细菌内毒素检测的准确性。
二、用其他溶液作为稀释剂，对非水溶性液体或含有该类液体的注射剂进行细菌内毒素验证实验
（一）用细菌内毒素检测用水作为稀释剂
1、实验样品为大豆油验证实验方法采用实施例1中步骤三（一）进行。
（1）干扰试验
供试品制备：取供试品，加入无热原碘量瓶中，加入细菌内毒素检查用水，将样品制成250mg/ml、125mg/ml、62.25mg/ml、31.125mg/ml的不含细菌内毒素NPC系列，充分混合后，立即取样。再分别用各个稀释浓度的供试品制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
干扰预试验用标示灵敏度λ=0.25EU/ml的鲎试剂进行预试验结果见表12。
表12 干扰预试验结果
以上结果表明：大豆油用细菌内毒检测用水混合均匀静置后出现明显分层现象，当样品用细菌内毒素检查用水稀释至浓度为31.125mg/ml时，供试品阳性结果显示仍然为阴性，干扰预试验结果无效。
2、实验样品为前列地尔注射液，验证实验方法采用实施例1中步骤三（二）进行。
（1）供试品制备
取供试品，用细菌内毒素检查用水将样品逐一稀释2、4、8、16倍的不含细菌内毒素NPC系列，再分别用各个稀释倍数的供试品制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
（2）干扰预试验
干扰预试验用标示灵敏度λ=0.25EU/ml的鲎试剂进行。预试验结果见表13。
表13 干扰预试验结果
以上结果表明：前列地尔注射液用细菌内毒检测用水逐一稀释到16倍时，供试品阳性结果显示仍然为阴性，干扰预试验结果无效。
3、实验样品为丙泊酚中/长链脂肪乳注射液，验证实验方法采用实施例1中步骤三（三）进行。
（1）供试品制备
取供试品，用细菌内毒素检查用水将样品逐一稀释2、4、8、16倍的不含细菌内毒素NPC系列，再分别用各个稀释倍数的供试品制成含有细菌内毒素的PPC系列，同时做2管水阴性、2管水阳性。
（2）干扰预试验
干扰预试验用标示灵敏度λ=0.25EU/ml的鲎试剂进行。预试验结果见表14。
表14 干扰预试验结果
以上结果表明：丙泊酚中/长链脂肪乳注射液用细菌内毒检测用水逐一稀释到16倍时，供试品阳性结果显示仍然为阴性，干扰预试验结果无效。
根据实验结果可以看出，采用细菌内毒素检查用水作为稀释剂，稀释到大于最大有效稀释倍数（MVD）或小于最小浓度(MVC)时也不能完全排除供试品对实验的干扰。
（二）采用实施例1方案中，不添加甘油的分散液作为稀释剂
称取已经在150℃干烤2h的油酸钠0.1g，用细菌内毒素检测用水溶解，配制成浓度为0.1%的油酸钠溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，最后用细菌内毒素检测用水配制的0.1mol/L HCl溶液调节pH在6-8左右。
实验样品选择为大豆油、前列地尔注射液、丙泊酚中/长链脂肪乳注射液；采用上述不添加甘油的分散液作为稀释剂，验证实验方法分别采用采用实施例1中的步骤三进行。
实验结果：
1、大豆油与分散液混合均匀静置后无明显分层现象，再将该混合溶液利用分散液稀释至浓度为250mg/ml，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂不能排除干扰。
2、前列地尔注射液与该分散液混合均匀静置后无明显分层现象，但利用该分散液将前列地尔注射液稀释4倍，采用灵敏度为0.125的鲎试剂不能排除干扰。
3、丙泊酚中/长链脂肪乳注射液与分散液混合均匀静置后无明显分层现象，但利用该分散液将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液稀释到4倍，采用0.125EU/ml鲎试剂不能排除干扰。
可以看出，缺少甘油时，虽然分散液能够让油性溶液有效分散，但是仍难以排除干扰，说明甘油是本发明分散液的必要成分。
（三）用文献报道的方法作为稀释剂（商君等，“油剂普鲁卡因青霉素注射液细菌内毒素检查方法的研究”，中国兽药杂志2000，34（1）：20～22）
将0.1mol/L氢氧化钠与1ml吐温-80溶液混合后，再用0.1mol/L盐酸调节溶液的pH值，并将该溶液在126℃高压灭菌2小时。
实验样品选择为大豆油、前列地尔注射液、丙泊酚中/长链脂肪乳注射液；采用上述文献报道的方法配制的溶液作为稀释剂，验证实验方法分别采用采用实施例1中步骤三进行。
实验结果显示与上述采用细菌内毒素检查用水作为稀释剂时实验结果相同，干扰预实验均无效，说明采用文献报道的方法在配制的溶液的过程中未进行细菌内毒的控制与含量检测，并且也不能排除供试品对实验的干扰。
综上，本发明分散液可以使供试品内的细菌内毒素均匀分散，有效排除非水溶性液体或含有该类液体的注射剂供试品对鲎试剂实验的干扰，使得采用鲎试剂法检测该类品种的细菌内毒素具有可行性，同时减少稀释步骤，简化细菌内毒素检测操作，避免引入二次污染，降低细菌内毒素检测中假阳性或者假阴性的几率，具有良好的应用前景。
Claims (4)
1.一种细菌内毒素检测用分散组合物，其特征在于：它包括如下配比的成分：甘油1~20体积份、阴离子表面活性剂0.5~5重量份，非离子表面活性剂1~10体积份；
所述重量份/体积份为g/ml；
所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种，且不为油酸；所述阴离子表面活性剂的HLB值为12~20；
所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种；所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3~16.7。
2.根据权利要求1所述分散组合物，其特征在于：它包括如下配比的成分：甘油10体积份、阴离子表面活性剂1重量份，非离子表面活性剂10体积份。
3.一种细菌内毒素检测用分散液，其特征在于：它包括权利要求1或2任意一项所述细菌内毒素检测用的分散组合物与注射用水或细菌内毒素检查用水，其中，甘油的浓度为0.1~2%（v/v）。
4.一种制备权利要求3所述分散液的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取甘油，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，得甘油浓度为0.1%~2%（v/v）的溶液；
（2）分别取阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂溶于步骤（1）的溶液中，它们的浓度分别为0.1~0.4%（w/v）和0.1~1%（v/v）；
（3）将步骤（2）得到的溶液用孔径为100nm微孔滤膜过滤，即可。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant |