JPH08122333A - 油性物質中のエンドトキシンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 油性物質中のエンドトキシンを合成基質法に
より簡便かつ正確に測定する方法を提供する。 【構成】 油性物質中のエンドトキシンをカブトガニ・
アメボサイト・ライセ―ト成分を用いた合成基質法で測
定するにあたり、油性物質を水に分散させてエンドトキ
シンの検出反応を行つたのち、水に難溶性の有機溶剤を
用いて油性物質を抽出除去し、その後に水相の比色定量
を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、油性物質中のエンドト
キシンの測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】エンドトキシンは、グラム陰性菌由来の
発熱性物質であつて、これが注射により体内に侵入する
と、発熱、シヨツクなどの症状を引き起こすことが知ら
れている。このため、最終製剤のみならず、製剤原料に
ついても、その混入について厳重な管理が必要となつて
いる。

【０００３】カブトガニ・アメボサイト・ライセ―ト成
分を用いたエンドトキシンの測定方法としては、ゲル化
法と合成基質法との二つが挙げられ、既にキツト化され
て、数社から市販されている。たとえば、ゲル化法とし
ては、プレゲル（Ｓ）〔生化学工業（株）〕やリムルス
（ＨＳ）テスト・ワコ―〔和光純薬（株）〕など、合成
基質法としては、トキシカラ―システムやエンドトキシ
ンテスト−Ｄ〔いずれも生化学工業（株）〕などを挙げ
ることができる。

【０００４】ゲル化法は、一般試験法「エンドトキシン
試験法」として、日本薬局方に収載されているが、反応
および測定時の振動に影響されやすく、また測定に際し
て主観が入りやすい。さらに、定性的な試験法であるの
で、定量的にエンドトキシンの濃度を求めるには、試料
の希釈系列を調製しなければならないという煩雑さがあ
るうえに、定量精度も低いという難点がある。これに対
して、合成基質法は、比色定量を行うので、客観的な測
定が可能であるとともに、ゲル化法の数十倍以上の感度
で定量ができるすぐれた方法である。

【０００５】しかし、これらの方法は、いずれも水系で
反応を行うため、油性物質中のエンドトキシンの含有量
を測定することは困難であつた。油性物質に対して、こ
れらの方法を適用する場合、油性試料を水に分散させた
うえで測定する方法が考えられる。しかるに、ゲル化法
は、検出感度が低いため、試料を希釈する必要がある場
合には、測定には適さない。また、合成基質法は、吸光
度を測定する比色定量であるため、油性物質が僅かに水
中に分散しただけで、その濁りが測定に大きく影響を及
ぼし、正確な測定値を得ることは不可能であつた。

【０００６】油性物質中のエンドトキシンの測定方法と
しては、特開平５−２３００８３号公報に、リン脂質中
のエンドトキシンを測定する方法が開示されている。こ
れは、リン脂質中のエンドトキシンを水で抽出したの
ち、水からリン脂質を除去し、その水に含まれるエンド
トキシンを測定する方法である。

【０００７】ところが、これと同様の方法で油性物質中
のエンドトキシンの測定を行つた場合、油性物質の多く
は水に分散させると水中でミセルを形成し、濁りを生じ
る。この濁りをなくすため、遠心分離操作により油性物
質と水とを分離することも可能であるが、高速回転で分
離する必要があるうえ、非常に容易に再分散するため、
濁りを完全に除去することは難しい。

【０００８】このことから、上記の方法では、濁りが比
色定量に影響し、油性物質全般に適用するのは困難であ
つた。また、ライセ―トと試料との反応前に、遠心分離
などの煩雑な操作を行うと、操作中にエンドトキシンが
混入する危険性が高くなり、測定結果の信頼性が低くな
るといつた問題も考えられた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な従来技術の問題点を解決し、油性物質中のエンドトキ
シンを簡便かつ正確に測定する方法を提供することを目
的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため、鋭意検討した結果、油性物質を水に
分散させた分散液を調製し、この分散液に対し直接エン
ドトキシンの検出反応を行つたのちに、水に難溶性の有
機溶剤を用いて油性物質を抽出除去し、その後に水相、
つまり油性物質が抽出除去された水相の比色定量を行う
ようにすると、濁りの問題を生じることなく、油性物質
中のエンドトキシンを正確にしかも簡便に測定できるこ
とを知り、本発明を完成するに至つた。

【００１１】すなわち、本発明は、油性物質中のエンド
トキシンをカブトガニ・アメボサイト・ライセ―ト成分
を用いた合成基質法で測定するにあたり、油性物質を水
に分散させてエンドトキシンの検出反応を行つたのち、
水に難溶性の有機溶剤を用いて油性物質を抽出除去し、
その後に水相の比色定量を行うことを特徴とする油性物
質中のエンドトキシンの測定方法に係るものである。

【００１２】

【発明の構成・作用】本発明に適用される油性物質とし
ては、天然の動植物油や、この動植物油から精製あるい
は分解工程を経て得られる油や界面活性剤、またそれら
を原料とし、合成により得られる油や界面活性剤で、注
射剤、輸液などの成分として使用されうるものが挙げら
れる。具体例としては、トリグリセライド、ワツクスエ
ステルなどの油やソルビタン脂肪酸エステル、グリセロ
―ル脂肪酸エステル、リン脂質やそれらのエチレンオキ
サイド付加物などをはじめとする界面活性剤のうち、水
に難溶性のものが挙げられる。

【００１３】これらの油性物質に含まれるエンドトキシ
ンを測定するにあたり、まず、この油性物質を水に分散
させた分散液を調製する。水としては、エンドトキシン
の含有量の少ない、たとえば、蒸留水、蒸気圧減菌処理
した蒸留水、注射用蒸留水が好ましく用いられる。水の
使用量は、被測定物である油性物質に含まれるエンドト
キシンの含有量などに応じて適宜選択することができる
が、一般には、油性物質１に対し水が１０〜１，０００
倍（重量）となるようにするのが好ましい。分散液の調
製に際しては、撹拌機、乳化機などの一般に用いられる
ものを用いることができ、また超音波処理を行つてもよ
い。

【００１４】本発明では、このように調製される油性物
質の水分散液を用いて、エンドトキシンの検出反応を行
う。これは、合成基質法の常法にしたがつて、カブトガ
ニ・アメボサイト・ライセ―ト成分による酵素反応を行
わせ、さらにジアゾ化試薬により発色反応を行わせるも
のである。酵素反応では、反応試薬としてライセ―ト成
分と発色合成基質を添加する。エンドトキシンが存在す
ると、連鎖反応が起き、最終的にパラニトロアニリンが
遊離するので、これにジアゾ化試薬（ジアゾカツプリン
グ反応試薬）を添加して、アゾ色素に変換する。

【００１５】このように酵素反応および発色反応を行わ
せた水分散液は、これに油性物質が含まれて、濁りを生
じているため、このままでは、アゾ色素に基づく一定波
長の吸光度を測定しても、正確な比色定量は行えない。
そこで、本発明では、比色定量に先立ち、水に難溶性の
有機溶剤を用いて上記の油性物質を抽出除去する。この
抽出除去は、たとえば、水分散液に上記の有機溶剤を添
加し、遠心分離操作により有機溶剤と水相とを分離する
方式で行うことができる。

【００１６】ここで用いる有機溶剤としては、水に難溶
性で、遠心分離操作により水相と容易に分離できる、ク
ロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、ジエチルエ―テ
ルなどの中から、油性物質の種類に応じて自由に選択で
きる。水相より比重が大きいクロロホルム、塩化メチレ
ンなどを用いると、遠心分離後、水相が上層となり、引
き続く吸光度測定操作を簡便かつ迅速に行えるので、と
くに好ましい。

【００１７】本発明では、このようにして油性物質が抽
出除去された水相について、比色定量を行うが、この
際、上記の有機溶剤による抽出操作を行うことで、ジア
ゾ化により生成したアゾ色素の色調は変化せず、常法ど
おりの吸収波長による比色定量が可能である。すなわ
ち、測定波長として、５３０〜５６０ｎｍの範囲を選択
でき、とくに好ましくは５４５ｎｍの波長で測定するこ
とができる。この波長での吸光度を測定し、検量線用の
標準液についての上記同様の吸光度との対比より、水相
中のエンドトキシンの量を測定でき、さらにこの測定値
よりもとの油性物質中のエンドトキシンの量を求めるこ
とができる。

【００１８】このように求められるエンドトキシンの量
は、油性物質による濁りの問題がないことから、従来に
比べてより正確な値となつており、とくに、この方法で
は、油性物質の抽出除去を、エンドトキシンの検出反
応、つまりライセ―トを用いた酵素反応および発色反応
の後に行つているため、抽出除去に用いる有機溶剤中の
エンドトキシンの混入などに起因した測定誤差を生じる
おそれがなく、この点からも測定結果の信頼性に高いも
のとなつている。

【００１９】

【発明の効果】以上のように、本発明の方法によれば、
油性物質中のエンドトキシンを簡便にかつ正確に定量す
ることができるから、医薬、食料品などの各種分野にお
いて、製品や原料の管理などの目的に大いに利用するこ
とができる。

【００２０】

【実施例】つぎに、実施例によつて本発明を具体的に説
明する。なお、実施例で使用した器具および装置は、す
べて２５０℃、５時間の乾熱減菌処理を行つたものを用
いた。また、測定結果に用いた「ＥＵ」は、エンドトキ
シン単位で、エンドトキシンによるＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌ
ｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）のゲル化活
性を表す単位である。

【００２１】実施例１ 油性物質として、親油性界面活性剤であるセスキオレイ
ン酸ソルビタン（ＭＯＮＴＡＮＥ ８３、ＳＥＰＰＩＣ
社製）を用い、この油性物質に含まれるエンドトキシン
の量を、以下の如く測定した。

【００２２】１００ｍｌのスクリユ―管に、セスキオレ
イン酸ソルビタン０．２ｇと注射用水５０ｇをはかりと
り、試験管ミキサ―により約３０秒間撹拌したのち、海
上電気（株）製の超音波破壊装置ＴＡ−５２８７を用い
て３０分間超音波処理した。これを、サンプル１とす
る。また、これとは別に、濃度既知のエンドトキシンス
タンダ―ドを添加したセスキオレイン酸ソルビタンの水
分散液を、上記と同様の操作により、調製した。

【００２３】試料として各１００μｌを用い、トキシカ
ラ―システム〔生化学工業（株）〕の操作法にしたがつ
て、酵素反応および発色反応を行つた。それぞれの発色
後の溶液に、クロロホルムを５００μｌずつ添加し、試
験管ミキサ―で約１０秒間撹拌したのち、遠心分離機
〔国産遠心機（株）Ｈ−２０００Ｃ〕を用いて、３，０
００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行つた。この遠心分離に
より得られた上清の水相について５４５ｎｍで比色定量
を行つた。検量線用の標準液の発色後の溶液について
も、クロロホルムを添加し、同様の操作を行つた。

【００２４】サンプル１を用いて測定した場合には、エ
ンドトキシンの濃度は、０．００２９ＥＵ／ｇとなり、
もとのセスキオレイン酸ソルビタン中の量に換算する
と、０．５８ＥＵ／ｇとなつた。また、以上の操作で得
られた値を基にして、エンドトキシンスタンダ―ドを添
加したときの吸光度から、サンプル１を用いて測定した
ときの吸光度を差し引き、実際に添加したエンドトキシ
ンの量に対する回収率を求めた結果を、下記の表１に示
した。なお、表中に示したエンドトキシンの添加量は、
試料１ｇに対して添加した量に換算して示している。

【００２５】

【表１】

【００２６】この表１から明らかなように、いずれの添
加量に関しても、良好な回収率が得られており、本発明
のエンドトキシンの測定方法により、サンプル中のエン
ドトキシンを簡便に精度よく測定することができた。

【００２７】比較例１ 実施例１と同様の方法で、トキシカラ―システムによる
発色反応までを行い、その後、クロロホルムによるセス
キオレイン酸ソルビタンの抽出除去を行わず、５４５ｎ
ｍで比色定量を行つた。ここでは、セスキオレイン酸ソ
ルビタンの濁りの影響を考慮し、酵素反応時に酵素を添
加しないブランクを調製し、そのときの吸光度をサンプ
ル１を用いたときの吸光度から差し引いた。

【００２８】実施例１と同じセスキオレイン酸ソルビタ
ン中のエンドトキシンの濃度は、マイナスの数値（−
２．５ＥＵ／ｍｌ）となり、測定できなかつた。また、
実施例１の場合と同様に、エンドトキシンスタンダ―ド
を添加した試料の回収率を求めたところ、下記の表２に
示す結果が得られた。この結果は、試料として用いたセ
スキオレイン酸ソルビタンが不均一に分散し、濁りとな
つているため、正確に比色定量を行うことができなかつ
たことを示している。

【００２９】

【表２】

【００３０】実施例２ 油性物質として、卵黄レシチンを用いて、エンドトキシ
ンの測定を行つた。試験管に、卵黄レシチン〔片山化学
工業（株）〕を１０ｍｇはかりとり、注射用水５ｍｌを
加え、試験管ミキサ―により撹拌した。さらに、３０分
間超音波処理した分散液から、１００μｌ採取し、実施
例１と同様にして、反応（酵素反応および発色反応）、
抽出、測定を行つた。吸光度と試料１ｇあたりに換算し
たエンドトキシンの濃度を、後記の表３に示した。な
お、上記の測定は、同一分散液を用いて３回行つたが、
ばらつきも少なく良好であつた。

【００３１】比較例２ 実施例２と同様の卵黄レシチンの分散液を用い、酵素反
応、発色反応を行つたのち、クロロホルムによる抽出を
行わず、比色定量した場合の結果を、表３に示した。卵
黄レシチンの濁りの影響で、実施例２より非常に高い数
値を示しており、測定は困難であることがわかつた。ま
た、この比較例についても、３回測定を行つたが、結果
のばらつきも大きかつた。

【００３２】

【表３】

【００３３】実施例３ 実施例１のセスキオレイン酸ソルビタンの場合と同様の
方法により、精製大豆油〔山桂産業（株）製〕の０．５
重量％分散液を調製した。超音波処理後、約５分間静置
し、上層に分離した精製大豆油をピペツトで除いた残り
の分散液を測定に用いた。実施例１と同様に反応させた
のち、抽出、遠心分離し、水相の吸光度を測定した。そ
の結果、分散液のエンドトキシンの濃度は０．０２６Ｅ
Ｕ／ｍｌで、もとの精製大豆油中に換算して、５．２Ｅ
Ｕ／ｍｌであつた。

【００３４】比較例３ 実施例３で用いた精製大豆油の０．５重量％分散液と精
製大豆油を用い、日本薬局方収載のゲル化法による測定
を行つた。いずれの場合も、ゲルの生成は認められず、
エンドトキシンの検出は行えなかつた。前者の場合は分
散液中のエンドドキシンの濃度がゲル化法の検出限界に
達しておらず、また後者の場合は大豆油による酵素反応
の阻害のためと考えられた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 油性物質中のエンドトキシンをカブトガ
   ニ・アメボサイト・ライセ―ト成分を用いた合成基質法
   で測定するにあたり、油性物質を水に分散させてエンド
   トキシンの検出反応を行つたのち、水に難溶性の有機溶
   剤を用いて油性物質を抽出除去し、その後に水相の比色
   定量を行うことを特徴とする油性物質中のエンドトキシ
   ンの測定方法。