CN112362601B - 一种压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法。目前还没有一种简单，快速，成本低的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法。本发明的步骤如下：利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；将蛋白标准溶液用PBS稀释液分别配制成标准品；吸取0.5mL油样加到2.5mL试管中，加入0.5mL的C液，超声震荡1min，静置5min分层，取下层为待测样品；向96孔板中依次加入步骤（2）制得的8个蛋白标准溶液20uL和待测样品20uL；用酶标仪测定562nm波长下的吸光度；计算标准曲线；根据样品中的蛋白含量鉴别样品为压榨油还是浸提油。本发明简单，快速，成本低。

Description

一种压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法
技术领域
本发明涉及食品检测中食用植物油的检测领域，特别是涉及一种压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，采用蛋白含量作为压榨植物油和浸提植物油的鉴别方法。
背景技术
食用植物油是利用植物果实或种子为原料制成食用油脂，如油茶籽油、橄榄油、亚麻籽油、花生油、油菜籽油等。食用植物油的获取方法有很多种，包括压榨法、浸提法、水酶提取法、超临界CO2萃取法、亚临界萃取法等多种工艺，但最常用的还是压榨法和浸提法两种植物油获取工艺。
溶剂浸提法是将原料于“6号溶剂”(又称抽提溶剂，为沸点在61℃～76℃间的石油馏分混合物)或正己烷、石油醚、丙酮等有机溶剂中加热浸泡提取，再通过真空脱去有机溶剂获得油脂的一种方法；压榨法是采用螺杆或液压方式对原料进行物理挤压，将油脂从种子中分离出来的一种方法。
压榨法与溶剂浸提法两种植物油的获取方法各有优缺点，一般来讲，压榨法获得的食用油色泽黄、味香，但压榨出油率较低，一般只有80～92％；溶剂浸提法出油率较高，一般可以达到95～98％，但溶剂浸提法获得的食用油香味较差，且含有大量的溶剂残留，即使经过精炼工艺处理后的成品浸提食用油，溶剂残留也无法完全去除，我国的食用植物油卫生标准GB2716-2018中对浸提成品植物油中溶剂残留的限量为20mg/kg。
食用油萃取溶剂对油脂具有很高的溶解性，食用植物的加工中采用溶剂提取法可以获得高的提取率，但6号溶剂、己烷、石油醚等低极性溶剂的高溶解能力，亦可能会导致许多外源性危害物残留在食用植物油中，包括多环芳烃、塑化剂等危害物，而加工过程中溶剂的重复使用和高温脱溶过程也导致了这一问题更加严重。所以，在实际生产中，一般压榨工艺是作为高端食用油采用的加工方法，浸提是低端食用油采用的加工方法，现阶段，为了降低生产成本，浸提食用植物油的原料，基本是利用压榨加工所剩余的榨饼，这一情况也使得浸提植物油的品质进一步下降。
原料的差异和产品品质的差异，使得浸提食用植物油和售价远低于压榨食用植物油的售价，以2019年市场价计，压榨油茶籽油价格为80～100元/500mL，浸提油茶籽油价格为50～60元/500mL，初榨橄榄油价格为100～200元/500mL，浸提橄榄果渣油为10～25元/500mL。对于普通消费者来讲，两种油基本上无法以目测鉴别，而国家标准亦是采用溶剂含量作为鉴别的依据(压榨植物油要求溶剂含量为0，浸提植物油≦20mg/kg)。巨大的价格差异和鉴别的难度，使得不法商人铤而走险，以浸提油冒充压榨油。
植物油的溶剂含量测定，GB 5009.262-2016采用气相色谱法，顶空进样，需要样品5g，检测1个样品需要40min以上(包括平衡时间和色谱分离检测时间)，即使连续进样也无法缩短检测时间。
油脂在植物体内是以甘油三酰酯的形式存在于油体中的，油体是一种亚细胞器，是直径大约为0.5～2.5μm的弹性球体或椭球体，油体中除了三酰甘油酯外，还包括磷脂和油体结合蛋白，三者存在的形式，即油体存在形式如图1所示。
综上所述，目前还没有一种简单，快速，成本低的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种简单，快速，成本低的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，其特点在于：所述快速鉴别方法的步骤如下：
(1)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；
(2)将蛋白标准溶液用PBS稀释液分别配制成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL的标准品；
(3)采用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液做为A液，将1.00g离子液体原料B溶于10mL的A液中配置成C液；
(4)精确吸取0.5mL油样加到2.5mL试管中，加入0.5mL的C液，25±5℃温度下，超声震荡1min或者以60rpm的频率振摇30min，静置5min分层，取下层为待测样品；
(5)向96孔板中依次加入步骤(2)制得的8个蛋白标准溶液20uL和待测样品20uL；
(6)向96孔板中依次加入200uL的BCA工作液，于37℃下放置20min，用酶标仪测定562nm波长下的吸光度；
(7)计算标准曲线，并根据标准曲线和样品吸光度计算样品中的蛋白浓度；
(8)根据样品中的蛋白含量鉴别样品为压榨油还是浸提油，蛋白含量大于0.07mg/g的为压榨油，蛋白含量小于0.01mg/g的为浸提油。
作为优选，本发明步骤(7)中，所述标准曲线得出的线性回归方程为：
Y＝1.2711x+0.1965，R2＝0.9956；
式中，Y为吸光度；x为样品中蛋白浓度，单位mg/mL；R2为决定系数。
作为优选，本发明所述步骤(8)中，压榨成品油茶籽油中的蛋白含量为0.1797±0.1410mg/g，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量为0.0058±0.0039mg/g；压榨成品橄榄油中的蛋白含量为0.5462±0.2556mg/g，浸提成品橄榄油中的蛋白含量为0.0014±0.0010mg/g；压榨成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.3562±0.1543mg/g，浸提成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.0056±0.0037mg/g。
作为优选，本发明所述步骤(3)中，离子液体原料B是1-辛基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑溴盐中的一种。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：油体的结构一般情况下较为稳定，其中外层的油体结合蛋白和磷脂形成的膜对油体具有较强的保护作用。油脂获取过程，即采用物理破碎、挤压、加热，或化学溶剂，或酶来破坏原料的完整性，并破坏油体膜的完整性和保护作用，使油体中的甘油三酯自由流出。压榨制油工艺是采用物理挤压达到目的，溶剂浸提制油工艺是采用有机溶剂来达到这一目的。由于两种工艺原理的不同，导致两种工艺获得植物油中蛋白含量的差异。压榨法将油体挤碎，使得部分油体膜中的蛋白随着甘油三酯一起流出；而浸提工艺是采用加热破坏油体稳定性，再利用有机溶剂与甘油三酯极性相近可以互溶的特性，将油体中的甘油三酯溶解带出原料，而油体膜蛋白极性与萃取溶剂差异较大，很难被萃取溶剂溶解。工艺的差异使得压榨食用植物油中的蛋白含量远高于浸提食用植物油中蛋白含量。
本发明即是利用上述理论，分析了大量压榨和浸提食用植物油中的蛋白含量，获得了一种简单、快速的鉴别压榨与浸提食用植物油的方法，本发明具有如下优点：
(1)简单，快速，10分钟内可以同时鉴别88个样品(96孔板)；
(2)成本低，平均每个样品仅需0.5元左右(以2019年上海碧云天生物技术公司BCA测试试剂盒价格计)；
(3)所需样品量少，仅需0.5mL样品；
(4)操作简单，没有复杂的预处理过程；含量测定结果检出后，对照对比数据即可得出鉴定结果；
(5)标准样品与测试样品同时检测，获得标准曲线与拟合方程的同时检测样品；避免了先进行标准品的测试后进行样品的测试，可能因仪器漂移而带来的误差。
本发明采用现有的BCA蛋白测试试剂盒，利用酶标仪直接进行植物油中蛋白含量的快速检测，根据油中蛋白质的含量，判定待测样品的来源属于压榨工艺获取还是浸提工艺获取，方法快速、准确。
B液：KH2PO4能为蛋白质提供适宜的pH值范围，因此本发明可以选KH2PO4作为成相盐。
C液：离子液体与KH2PO4构成的双水相体系：本发明优选1-辛基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑溴盐。离子液体与盐之间在一定浓度上由于排斥作用互不兼容而形成两相体系。与传统的有机溶剂相比，离子液体具有不可燃性，电导率高，热稳定性及化学稳定性高，不易挥发等优势，因而作为环境友好的绿色溶剂在样品萃取中具有极大的潜力。其提供的萃取环境可以维持蛋白质和酶的化学结构、生物活性和光学活性。其操作设备简单，容易放大，操作方便，萃取效率高，不存在有机溶剂残留问题等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例和/或现有技术中的技术方案，下面将对实施例和/或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有技术中油体存在形式的示意图。
图2是本发明实施例中压榨油茶籽油和浸提油茶籽油中蛋白含量对比的示意图。
图3是本发明实施例中压榨橄榄油和浸提橄榄油中的蛋白含量对比的示意图。
图4是本发明实施例中压榨亚麻籽油和浸提亚麻籽油中蛋白含量对比的示意图。
图5是本发明实施例中蛋白含量的标准曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本实施例中压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法的步骤如下：利用增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒中的试剂进行，该增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒采购上海碧云天生物技术公司BCA测定试剂盒，货号P0010。
(1)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；
(2)将蛋白标准溶液用PBS稀释液分别配制成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL的蛋白标准品；
(3)采用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液(A液)，将1.00g离子液体原料B溶于10mL的A液中配置成C液；
(4)精确吸取0.5mL油样加到2.5mL试管中，加入0.5mL的C液，25℃温度下超声震荡1min，再静置5min分层，取下层液为待测样品；
(5)向96孔板的孔中，依次加入20μL步骤(2)配置的8个蛋白标准品和步骤(4)获得的待测样品；
(6)向96孔板中分别加入200μL的BCA工作液，于37℃下孵化20min；
(7)放入酶标仪中，于562nm波长下测定吸光度；
(8)根据标样浓度和吸光值计算标准曲线，根据标准曲线、样品吸光值，计算样品中的蛋白含量，根据蛋白含量得出是压榨植物油还是浸提植物油。
关于步骤(3)中，在样品准备环节，也可以油样不进行任何处理，直接将20μL原始食用油样品依次加入96孔板，加入BCA工作液，在酶标仪562nm下测试，也可以将原始食用油样品和离子液体原料B各0.5mL混合后，25℃超声震荡1min，静置5min后分层，取下层液相20μL加入96孔板，分别加入200μL的BCA工作液，于37℃下孵化20min，用酶标仪在562nm下测试。第二种方法采用离子液体提取减少了油相中色素、甾醇、磷脂等各种复杂元素的干扰，精度和准确度均有很大提高，表1为同一食用油样品直接测试和离子液体原料B提取后测试的结果对比，每种方法均进行了6次重复。
表1：直接测试与提取后测试的精度比较(n＝6)
测试方法 蛋白含量结果mg/g 变异系数
油样品直接测试 0.3218±0.0779 14.89％
油样经离子液体提取后测试 0.3336±0.0048 1.43％
用油样直接测试的方法，其结果的变异系数达到14.89％，误差较大；而采用油样经离子液体提后再进行测试的方法，变异系数仅为1.38％，测试结果精度提高10倍以上。
实施例2。
本实施例中压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法的步骤如下：
(1)超市采购、企业抽样、京东商城采购、以及实验室自制油样共计116个，其中热压榨油茶籽油32个，冷压榨油茶籽油9个，浸提油茶籽油19个，初榨橄榄油18个，浸提橄榄果渣油13个，压榨亚麻籽油11个，浸提亚麻籽油14个；
(2)利用GB/T 5526的比重法测定每一个油样的密度；
(3)用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液10mL，再加入1.00g 1-辛基-3-甲基咪唑溴盐，配置成0.10g/mL的离子液体；
(4)精确吸取0.5mL油样加入1.5mL具塞试管中，再向具塞试管中注入步骤(3)配置的离子液体0.5mL，超声振荡1min，静置5min，取下层液相为待测样；每个样品重复三次；
(5)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；配置成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL的蛋白标准品；
(6)分别吸取20μL蛋白标准品和待测样品依次加入96孔板中，再依次加入200μL的BCA工作液，于37℃下孵化20min；
(7)放入酶标仪中，于562nm波长下测定吸光度；
(8)根据标样浓度和吸光值计算标准曲线，根据标准曲线、样品吸光值和密度，计算样品中的蛋白含量；
(9)获得蛋白浓度与吸光度的标准曲线拟合方程为：
Y＝1.2711x+0.1965，R2＝0.9956
其中：y为吸光度，x为样品中的蛋白浓度，单位mg/mL；
(10)根据下式，计算每个油样品中蛋白含量的平均值：
Figure BDA0002753576910000061
(11)根据计算结果，分别获得压榨油和浸提油中蛋白的含量范围，如表2所示：
表2：三种压榨油与浸提油中蛋白含量的测试结果
Figure BDA0002753576910000062
Figure BDA0002753576910000071
将表2中的平均值通过附图的形式进行比对，图2为压榨油茶籽油和浸提油茶籽油中蛋白含量对比，图3为初榨橄榄油和浸提橄榄油中的蛋白含量对比，图4为压榨亚麻籽油和浸提亚麻籽油中蛋白含量对比。采用本实施例中的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法得到油样品中的蛋白含量数值，然后对照表2得出该油样品为压榨植物油或浸提植物油，方便、快速、准确。
实施例3。
本实施例中压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法的步骤如下：
(1)将未知工艺成品油茶籽油，加入量桶，用比重天平称量，根据GB/T 5526计算其密度为
Figure BDA0002753576910000072
(2)用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液10mL，再加入1.00g 1-辛基-3-甲基咪唑溴盐，配置成0.10g/mL的离子液体；
(3)取20℃温度的上述油茶籽油样品0.5mL和20℃温度的上述离子液体0.5mL加入2.5mL具塞试管中，在20℃，40KHz频率下超声震荡1min，静置5min，取下层相待用；重复三次；
(4)利用上海碧云天生物技术公司增强型BCA测定试剂盒中的蛋白标准品、配置BCA标准液、PBS稀释液，配置成浓度为0.00、0.01、0.04、0.10、0.30mg/mL蛋白标准溶液；
(5)分别吸取20μL上述5份蛋白标准溶液和3份待测样品依次加入96孔板中，再分别加入200μL的BCA工作液，于37℃下孵化20min；
(6)放入赛默飞荧光酶标仪中，于562nm波长下测定吸光度；
(7)计算标准样品拟合曲线为：y＝1.4452x+0.1829，R2＝0.991；样品中蛋白含量为0.0012±0.0002mg/mL，根据密度计算得到样品中蛋白含量为0.0013±0.0002mg/g。
因为压榨成品油茶籽油中的蛋白含量为0.1797±0.1410mg/g，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量为0.0058±0.0039mg/g；压榨成品橄榄油中的蛋白含量为0.5462±0.2556mg/g，浸提成品橄榄油中的蛋白含量为0.0014±0.0010mg/g；压榨成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.3562±0.1543mg/g，浸提成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.0056±0.0037mg/g；所以，得出样品密度处于浸提工艺生产的油茶籽油，即该未知工艺成品油茶籽油为浸提油茶籽油。
实施例4。
本实施例中压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法的步骤如下：
(1)将未知工艺成品橄榄油，根据GB/T 5526计算其密度为
Figure BDA0002753576910000081
(2)用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液10mL，再加入1.00g 1-辛基-3-甲基咪唑溴盐，配置成0.1g/mL的离子液体；
(3)取温度为25℃的上述橄榄油样品0.5mL和温度为25℃的上述离子液体0.5mL混匀，在25℃温度下，以60rpm的频率振摇30min，静置5min，取下层液相待用；重复三次；
(4)利用上海碧云天生物技术公司增强型BCA测定试剂盒中的蛋白标准品、配置BCA标准液、PBS稀释液，配置成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL蛋白标准溶液；
(5)分别吸取20μL上述8份蛋白标准溶液和3份待测样品依次加入96孔板中，再分别加入200μL的BCA工作液，于37℃下孵化20min；
(6)放入赛默飞荧光酶标仪中，于562nm波长下测定吸光度；
(7)计算标准样品拟合曲线为：y＝1.2711x+0.1956，R2＝0.9956；该标准曲线如图5所示。
样品中蛋白含量为0.7127±0.0322mg/mL，根据密度计算得到样品中蛋白含量为0.7813±0.0353mg/g；
(8)因为压榨成品油茶籽油中的蛋白含量为0.1797±0.1410mg/g，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量为0.0058±0.0039mg/g；压榨成品橄榄油中的蛋白含量为0.5462±0.2556mg/g，浸提成品橄榄油中的蛋白含量为0.0014±0.0010mg/g；压榨成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.3562±0.1543mg/g，浸提成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.0056±0.0037mg/g；所以，该未知工艺成品橄榄油样品为压榨工艺生产的橄榄油，即为压榨成品橄榄油。
实施例5。
本实施例中的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法的步骤如下：
(9)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；
(10)将蛋白标准溶液用PBS稀释液分别配制成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL的标准品；
(11)采用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液做为A液，将1.00g离子液体原料B溶于10mL的A液中配置成C液；
(12)精确吸取0.5mL油样加到2.5mL试管中，加入0.5mL的C液，25±5℃温度下，超声震荡1min或者以60rpm的频率振摇30min，静置5min分层，取下层为待测样品；
(13)向96孔板中依次加入步骤(2)制得的8个蛋白标准溶液20uL和待测样品20uL；
(14)向96孔板中依次加入200uL的BCA工作液，于37℃下放置20min，用酶标仪测定562nm波长下的吸光度；
(15)计算标准曲线，并根据标准曲线和样品吸光度计算样品中的蛋白浓度；
(16)根据样品中的蛋白含量鉴别样品为压榨油还是浸提油，蛋白含量大于0.07mg/g的为压榨油，蛋白含量小于0.01mg/g的为浸提油。
步骤(8)中，压榨成品油茶籽油中的蛋白含量为0.1797±0.1410mg/g，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量为0.0058±0.0039mg/g；压榨成品橄榄油中的蛋白含量为0.5462±0.2556mg/g，浸提成品橄榄油中的蛋白含量为0.0014±0.0010mg/g；压榨成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.3562±0.1543mg/g，浸提成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.0056±0.0037mg/g。
步骤(3)中，离子液体原料B是1-辛基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑溴盐中的一种。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，其特征在于：所述快速鉴别方法的步骤如下：
(1)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，配制蛋白标准溶液、PBS稀释液和BCA工作液；
(2)将蛋白标准溶液用PBS稀释液分别配制成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.600、0.900mg/mL的标准品；
(3)采用高纯水配置质量百分浓度为40％的KH2PO4溶液做为A液，将1.00g离子液体原料B溶于10mL的A液中配置成C液；
(4)精确吸取0.5mL油样加到2.5mL试管中，加入0.5mL的C液，25±5℃温度下，超声震荡1min或者以60rpm的频率振摇30min，静置5min分层，取下层为待测样品；
(5)向96孔板中依次加入步骤(2)制得的8个蛋白标准溶液20uL和待测样品20uL；
(6)向96孔板中依次加入200uL的BCA工作液，于37℃下放置20min，用酶标仪测定562nm波长下的吸光度；
(7)计算标准曲线，并根据标准曲线和样品吸光度计算样品中的蛋白浓度；
(8)根据样品中的蛋白含量鉴别样品为压榨油还是浸提油，蛋白含量大于0.07mg/g的为压榨油，蛋白含量小于0.01mg/g的为浸提油。
2.根据权利要求1所述的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，其特征在于：步骤(7)中，所述标准曲线得出的线性回归方程为：
Y＝1.2711x+0.1965，R2＝0.9956；
式中，Y为吸光度；x为样品中蛋白浓度，单位mg/mL；R2为决定系数。
3.根据权利要求1所述的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，其特征在于：所述步骤(8)中，压榨成品油茶籽油中的蛋白含量为0.1797±0.1410mg/g，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量为0.0058±0.0039mg/g；压榨成品橄榄油中的蛋白含量为0.5462±0.2556mg/g，浸提成品橄榄油中的蛋白含量为0.0014±0.0010mg/g；压榨成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.3562±0.1543mg/g，浸提成品亚麻籽油中的蛋白含量为0.0056±0.0037mg/g。
4.根据权利要求1所述的压榨植物油和浸提植物油的快速鉴别方法，其特征在于：所述步骤(3)中，离子液体原料B是1-辛基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑溴盐中的一种。
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