CN105911159A - β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法。首先取β‑谷甾醇标准品配成不同浓度，用气相色谱仪检测得到不同浓度的峰面积，经计算得到峰面积与浓度关系的标准曲线和计算公式。然后分别从油茶籽、橄榄果子提取的油茶籽油和橄榄油，或商品油取微量样品进行高温皂化处理，用石油醚萃取β‑谷甾醇，用气相色谱仪检测得到样品中β‑谷甾醇的峰面积，将峰面积代入标准曲线和计算公式，得到样品的β‑谷甾醇含量。最后，对所有油茶籽油、橄榄油的β‑谷甾醇含量作差异统计分析，得出油茶籽油、橄榄油的β‑谷甾醇含量。本发明样品前处理简单，数据直观可靠，重复性好。

Description

β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法

技术领域

本发明涉及食品检测中油脂检测领域，特别地，本发明涉及一种用β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别依据的气相色谱检测方法及判别标准。

背景技术

橄榄油是一种原产于地中海的古老油种，具有减少心脑血管疾病发生、改善人体消化系统功能、抗癌、防衰老、促进血液循环和神经系统发育等多种功效，其营养价值在世界早已得到公认，被誉为“液体黄金”，“植物油皇后”。油茶籽油是从山茶科油茶树种子中提炼出的中国本土古老的油种，其化学性质与橄榄油极其相似，尤其是脂肪酸组成。油茶籽油因其具有预防心血管疾病、抗氧化清除自由基等功效也具有很高的营养价值，有着“东方橄榄油”、“长寿油”的美誉。

中国是油茶的原产地，是世界上最大的油茶籽油生产国，深受国内消费者欢迎，因产量有限，近年来价格处于上涨趋势。国内市场的橄榄油主要从欧洲进口。橄榄油分为压油和溶剂提取的果渣油两类，通常压榨橄榄油作为食用油，价格较高，而果渣油一般作为工业用油，用于化妆品和日化用品、饲料，价格不高，甚至大大低于国产油茶籽油。过去中国市场出现的油茶籽油一般是其价格较低的棕榈油等。随着食用油检测中气相色谱仪的普遍采用，通过脂肪酸分布和含量，用其常用食用油冒充油茶籽油已很容易鉴别，近年来为此不法商人开始用脂肪酸分布和比例与油茶籽油相似的进口劣质果渣橄榄油冒充油茶籽油，在浙江省已查处多起用果渣橄榄油冒充油茶籽油的重大案件。据2012年8月8日衢州日报报道，该市质监部门曾针对用橄榄果渣油冒充油茶籽油的违法失信行为开展了专项治理。安徽省霍山县专项整治油茶籽油活动中也曾将“油橄榄果渣油”冒充油茶籽油作为查处内容。但迄今尚未见可有效鉴别橄榄油冒充油茶籽油的现成检测方法。

现行中国国标《GB11765-2003油茶籽油》中没有关于对脂肪酸组成类似的橄榄油的鉴别方法，公开的专利申请中有利用物理检测手段鉴别橄榄油品种及橄榄油品质的内容，如采用拉曼光谱特征峰信号强度比值的橄榄油快速检测方法(申请号200810106530.9)，但它所指的掺假油脂并未涉及油茶籽油和橄榄油的鉴别，且所需仪器价格昂贵，不易操作，数据分析繁琐。有关于油茶籽油鉴别的专利，如“一种鉴别油茶籽油真伪的简捷方法(申请号CN201010217382.5)”，根据该专利申请描述，利用油茶籽油含甾体成分与显色剂可显色的特点，可区别其他不含甾体的植物油，但该方法对橄榄油和其他含有甾体成分的植物油并不适用。此外，显色反应精确度不高，不适合定量分析。也有一些文献和标准有涉及油茶籽油掺伪的鉴别方法，主要依据是油茶籽油的脂肪酸组成，如浙江省地方标准《9种掺假山茶油定性鉴别气相色谱法(DBA3/T 735-200)》采用油茶籽油的脂肪酸组成：棕榈酸大于10％，油酸小于74％，亚麻酸大于0.6％，芥酸大于0.5％作为鉴别指标，但因橄榄油的脂肪酸组成也与此基本相似，所以该检测方法难以将油茶籽油与脂肪酸组成相似的橄榄油区别开来。周建平和郭华在“油茶籽油定量测定方法研究”(《中国油脂》2003年第28卷第2期55-57页)采用了醋酸酐-浓硫酸显色发鉴别油茶籽油中有色络合物方法，但其化学原理可能是与残留的茶皂素产生化学反应，但我们通过反复验证发现，该法效果不稳定，重现行不好，特别是对纯度较高的油茶籽油不适用。

钟冬莲等的《气相色谱-串联质谱法测定食用植物油中β-谷甾醇含量》《中国油脂》2015年第40卷第2期95-97页中有关于多种油脂，包括油茶籽油和橄榄油中β-谷甾醇含量的测定，杨春英等的《气相色谱-质谱联用法测定14种食用植物油中的植物甾醇》《中国粮油学报》2013年第28卷第2期123-125页中也有关于橄榄油中β-谷甾醇的测定，但两篇论文只涉及β-谷甾醇检测的方法学论证。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的主要在于提供一种β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法，包括以下步骤：

(1)取β-谷甾醇标准品，用色谱级正己烷配制成梯度溶液，通过GC测定，建立标准曲线；

(2)将橄榄果破碎去壳，用物理压榨法提取橄榄油；通过化学溶剂法提取油茶籽油；

(3)取微量标准橄榄油或者油茶籽油；橄榄油的取样量为5mg，油茶籽油为100mg；

(4)加入氢氧化钾-乙醇溶液对样品进行高温皂化处理；

(5)冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液后用石油醚萃取样品中的β-谷甾醇；

(6)静置分层，分离上清液后加入纯水，洗至中性；

(7)静置分层，分离上清液后加入少量无水硫酸钠；

(8)震荡后离心，取上清液并用氮气吹干；

(9)加入有机溶剂复溶后过膜；所述有机溶剂为正己烷，过0.45μm的有机膜；

(10)氮气吹干后加入正己烷复溶后进GC进行检测；

(11)将气相色谱图上β-谷甾醇峰面积参考标准曲线得到β-谷甾醇含量；对油茶籽油和橄榄油β-谷甾醇含量进行差异性分析；所述的差异性分析采用方差分析，得到橄榄油和油茶籽油中β-谷甾醇含量差别p值；

(12)利用GC-MS对样品中β-谷甾醇和标准品β-谷甾醇的出峰时间、碎片图和化学结构比对；

(13)确认β-谷甾醇适合作为鉴别茶籽油、橄榄油的标记物。

步骤(11)中所述标准曲线得出的线性回归方程：y＝0.3163x-1.7637，R²＝0.9999。

所述步骤(11)中，橄榄油、油茶籽油中β-谷甾醇含量分别为1.45±0.40mg/g和0.2±0.05mg/g，p＝0.0001，具有显著性差异。

所述步骤(4)中氢氧化钾-乙醇溶液浓度为2mol/L，添加量为5mL，皂化温度为85℃，皂化时间为60min。

所述步骤(8)中，离心速度为2000r/min，离心时间为5min。

所述步骤(11)气相色谱中，所用色谱柱为HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm，仪器为Agilent 7890A型气相色谱仪器。

进一步，所述气相色谱条件为：载气：氮气；进样口温度：250℃；检测器温度270℃；柱温100℃，2min，15℃/min升温至290℃，10min；进样量1μL，分流比50:1。

一种所述β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的应用，包括以下步骤：从待测的橄榄油或油茶籽油中取样品进行高温皂化处理，用石油醚萃取β-谷甾醇，用气相色谱仪检测得到待测样品中β-谷甾醇的峰面积，将峰面积代入所述的标准曲线，得到待测样品的β-谷甾醇含量；将待测样品的β-谷甾醇含量与参考橄榄油或参考油茶籽油中的β-谷甾醇含量相比较，判断待测的橄榄油或油茶籽油的种属来源或者真伪。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以β-谷甾醇为标记物，对橄榄油和油茶籽油进行鉴别，方法简便，一般具有气相色谱仪的实验室都可以进行；

(2)该方法重复性好，结果可靠，加标回收率95％-100％，相对标准差在1.47％-3.26％；

(3)该方法取样量少，极大的减少了样品的损耗，检测效率高；

(4)该方法能对目前没有鉴别橄榄油和油茶籽油的统一标准提供极大参考；

(5)该方法直接从原料中提取油脂，极大避免了加工过程中对β-谷甾醇含量的影响和人为添加的因素。

附图说明

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

图1是β-谷甾醇标准曲线图谱；

图2是油茶籽油与橄榄油β-谷甾醇含量差异分析；

图3是提取油茶籽油GC-MS图谱；

图4是提取油茶籽油中β-谷甾醇结构式；

图5是鲜榨橄榄油GC-MS图谱；

图6是鲜榨橄榄油中β-谷甾醇结构式；

图7是β-谷甾醇标样GC-MS图谱；

图8是β-谷甾醇标样结构式。

具体实施方式

本发明系统地论证了多种自提和市售橄榄油及油茶籽油中β-谷甾醇的含量，建立了一种基于β-谷甾醇含量鉴别橄榄油和油茶籽油的气相色谱检测方法及判别标准。本发明采用化学方法，以最为常用的气相色谱仪为检测工具，通过简单的前处理过程，能够较好的分离β-谷甾醇，通过峰面积的比较可直接做出结果判断，通过外标法建立标准曲线则可以定量测定油品中的β-谷甾醇浓度，从而鉴别橄榄油和油茶籽油，方法重复性好，数据直观可靠。

1、取β-谷甾醇标准品，配制成梯度溶液，用气相色谱仪器检测，通过浓度和峰面积的关系得到标准曲线和浓度计算公式。

2、从油茶籽和橄榄果子中提取油茶籽油和橄榄油，油茶籽油的提取采用化学溶剂法，提取溶剂为正己烷，橄榄油的提取采用物理压榨法。

3、取微量(茶油为100mg，橄榄油为5mg)待测样品于30mL试管中，加入5mL的2mol/LKOH-乙醇溶液；置于85℃水浴锅中皂化1h后移出冷却；加入5mL饱和NaCl溶液，再加入4mL石油醚；充分震荡后静置分层，取上清液于试管中，加入4mL纯水水洗至中性，取上层液体于另一试管中，并加入少量无水硫酸钠；震荡后以2000r/min离心5min；转移上清液于新试管中，氮吹至无液体；加入2mL正己烷(分析纯)充分溶解后过过膜(ф13*0.45μm有机滤膜)；再次氮吹至干，100μL正己烷(色谱纯)复溶后进行气相色谱检测。检测步骤如下：

4、气相色谱分析：用Agilent 7890A型气相色谱仪测定脂肪酸，用安捷伦化学工作站采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用β-谷甾醇标样来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为外标法。

5、谱图采集处理：采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定性；采用外标法定量，即通过不同浓度β-谷甾醇标准样品的峰面积建立标准曲线，将待测样品峰面积代入标准曲线可计算出相应浓度。

6、气相色谱分析条件：色谱条件：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；载气：高纯氮气；进样口温度：250℃；检测器(FID)温度270℃；柱温100℃(2min)，15℃/min升温至290℃(10min)；进样量1μL，分流比50:1。

7、利用GC-MS对样品中β-谷甾醇和标准品β-谷甾醇的出峰时间、碎片图和化学结构比对。GC-MS色谱条件和GC相同，质谱条件为：溶剂延迟3.5min；离子源：EI；离子源温度：230℃；电子能量70eV；MSD传输线温度：250℃；β-谷甾醇定性离子m/z 231.2和329.3。

实施例一：建立标准曲线

以正己烷为溶剂，配制浓度为20-600mg/L的β-谷甾醇标准溶液。以β-谷甾醇浓度(mg/L)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标做标准曲线(如图1)，β-谷甾醇的线性回归方程：y＝0.3163x-1.7637(R²＝0.9999)。最低检出限(LOD)：以基线噪音的3倍所对应的浓度为标准，本方法为3.57μg/mL。

检测具体样品时，将样品中β-谷甾醇峰面积代入回归方程可计算得到样品浓度，再将浓度代入以下计算公式，可换算得到相应的含量(μg/g)：

$X=\frac{C_s\×V\×{10}^{-6}}{m}$

式中：X：原样品油中β-谷甾醇含量，单位为毫克每克(mg/g)；

Cs：进样溶液中β-谷甾醇含量，由样中β-谷甾醇面积代入标准曲线计算所得，单位为毫克每升(mg/g)；

V：进样溶液总体积，单位为微升(μL)；

m：前处理时待测样品取样量，单位为克(g)。

实施例二：样品采集及β-谷甾醇含量测定

1、油茶籽及橄榄果采集及油脂提取

本实施例中所检测的共有20种油茶籽油和橄榄油(表1)。其中编号1-11的油茶籽和编号13-16的橄榄果由中国林业科学研究院亚热带林业研究所提供。

表1待检测样品明细

将鲜橄榄果粉碎后取出果核，加入少量水，充分粉碎并搅拌后离心，上清液即为鲜榨橄榄油。取适量油茶籽仁置于50℃烘箱中一定时间。从烘箱中取出后冷却至室温，精确称量烘干后的油茶籽仁6g，用剪刀将油茶籽仁剪碎置于玻璃管中，按料液比1:5g/mL加入正己烷，在水浴温度50℃条件下超声辅助萃取30min后离心分层，取上清。将含有油茶籽油的上清液旋蒸后烘干至恒重后即得油茶籽油。

2、样品前处理

取微量(茶油为100mg，橄榄油为5mg)待测样品于30mL试管中，加入5mL的2mol/LKOH-乙醇(5.6g氢氧化钾，50mL无水乙醇)溶液；置于85℃水浴锅中皂化1h后移出冷却；加入5mL饱和NaCl溶液，再加入4mL石油醚；充分震荡后静置分层，取上清液于试管中，加入4mL纯水水洗至中性，取上层液体于另一试管中，并加入少量无水硫酸钠；震荡后以2000r/min离心5min；转移上清液于新试管中，氮吹至无液体；加入2mL正己烷(分析纯)充分溶解后过过膜(0.45μm有机滤膜)；再次氮吹至干，100μL正己烷(色谱纯)复溶后进样。

3、仪器及条件

仪器型号：Agilent 7890A；色谱条件：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；载气：高纯氮气；进样口温度：250℃；检测器(FID)温度270℃；柱温100℃(2min)，15℃/min升温至290℃(10min)；进样量1μL，分流比50:1。

4、检测结果

将前处理后通过气相色谱检测出的β-谷甾醇的峰面积代入β-谷甾醇标准曲线可定量计算出β-谷甾醇在每一样品中的实际浓度。再将浓度代入以下计算公式，可换算得到相应的含量(μg/g)：式中：X：样品油中β-谷甾醇含量，单位为毫克每克(mg/g)；Cs：进样溶液中β-谷甾醇浓度，由样品中β-谷甾醇峰面积代入标准曲线计算所得，单位为毫克每升(mg/g))；V：进样溶液总体积，单位为微升(μL)；m：前处理时待测样品取样量，单位为克(g)。

14种油茶籽油中β-谷甾醇含量的检测结果如表2所示，6种橄榄油中β-谷甾醇含量的检测结果如表3所示。

表2各种油茶籽油β-谷甾醇含量测定结果

表3各种橄榄油的β-谷甾醇含量测定结果

5、橄榄油和油茶籽油中β-谷甾醇含量分析

将24种油茶籽油和6种橄榄油中β-谷甾醇含量进行对比(图2)，结合表2和表3中可以看出橄榄油、油茶籽油中β-谷甾醇含量分别为1.45±0.40mg/g和0.2±0.05mg/g，橄榄油的β-谷甾醇含量是油茶籽油的7.25倍，具有显著性差异(p＝0.0001＜0.01)，此结果表明β-谷甾醇是一种有效的鉴别橄榄油和油茶籽油的标记物。

实施例二：β-谷甾醇加标回收

取0.1g油茶籽油，按具体实施方法中的描述进行样品前处理，每个样品重复5次。同时取0.1g油茶籽油样品两份，分别添加含有0.1mg/g和0.4mg/g的β-谷甾醇标准溶液进行加标回收实验。方法精密度与回收率见表4。结果标明该方法回收率在100％-95％之间，相对标准偏差在1.47％-3.26％之间。

表4油茶籽油中加标回收实验结果

实施例三：GC-MS对样品中β-谷甾醇和标准品比对

1、样品前处理

取微量(茶油为100mg，橄榄油为5mg)待测样品于30mL试管中，加入5mL的2mol/LKOH-乙醇(5.6g氢氧化钾，50mL无水乙醇)溶液；置于85℃水浴锅中皂化1h后移出冷却；加入5mL饱和NaCl溶液，再加入4mL石油醚；充分震荡后静置分层，取上清液于试管中，加入4mL纯水水洗至中性，取上层液体于另一试管中，并加入少量无水硫酸钠；震荡后以2000r/min离心5min；转移上清液于新试管中，氮吹至无液体；加入2mL正己烷(分析纯)充分溶解后过过膜(0.45μm有机滤膜)；再次氮吹至干，100μL正己烷(色谱纯)复溶后进样。

2、仪器条件

仪器型号：Agilent 6890B；色谱条件：HP-5MS UI(30m×0.25mm×0.25μm)超高惰性毛细管柱；载气：高纯氦气；进样口温度：250℃；柱温100℃(2min)，15℃/min升温至290℃(10min)；进样量1μL。质谱条件：溶剂延迟3.5min；离子源：EI；离子源温度：230℃；电子能量70eV；MSD传输线温度：250℃；β-谷甾醇定性离子m/z 231.2和329.3。3、结果分析

油茶籽油和橄榄油经过前处理后，样品通过GC-MS检测(如图3和图5)，与质谱库中数据对比后相似度最高的物质为β-谷甾醇。直接用β-谷甾醇标样进入GC-MS检测(如图7)，发现保留时间完全吻合，β-谷甾醇标准品的质谱图见图8，样品中β-谷甾醇的质谱图见图4和图6。由以上可见样品中β-谷甾醇和标准品β-谷甾醇的保留时间、化学结构式和离子碎片一致。

Claims (8)

1.一种β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取β-谷甾醇标准品，用色谱级正己烷配制成梯度溶液，通过GC测定，建立标准曲线；

（2）将橄榄果破碎去壳，用物理压榨法提取橄榄油；通过化学溶剂法提取油茶籽油；

（3）取微量标准橄榄油或者油茶籽油；橄榄油的取样量为5 mg，油茶籽油为100 mg；

（4）加入氢氧化钾-乙醇溶液对样品进行高温皂化处理；

（5）冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液后用石油醚萃取样品中的β-谷甾醇；

（6）静置分层，分离上清液后加入纯水，洗至中性；

（7）静置分层，分离上清液后加入少量无水硫酸钠；

（8）震荡后离心，取上清液并用氮气吹干；

（9）加入有机溶剂复溶后过膜；所述有机溶剂为正己烷，过0.45 μm的有机膜；

（10）氮气吹干后加入正己烷复溶后进GC进行检测；

（11）将气相色谱图上β-谷甾醇峰面积参考标准曲线得到β-谷甾醇含量；对油茶籽油和橄榄油β-谷甾醇含量进行差异性分析；所述的差异性分析采用方差分析，得到橄榄油和油茶籽油中β-谷甾醇含量差别p值；

（12）利用GC-MS对样品中β-谷甾醇和标准品β-谷甾醇的出峰时间、碎片图和化学结构进行比对；

（13）确认β-谷甾醇适合作为鉴别茶籽油、橄榄油的标记物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（11）中所述标准曲线得出的线性回归方程：y=0.3163x-1.7637，R²=0.9999。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（11）中，橄榄油、油茶籽油中β-谷甾醇含量分别为1.45±0.40 mg/g和0.2±0.05 mg/g，p=0.0001，具有显著性差异。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中氢氧化钾-乙醇溶液浓度为2mol/L，添加量为5 mL，皂化温度为85 ℃，皂化时间为60 min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，离心速度为2000 r/min，离心时间为5 min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（11）气相色谱中，所用色谱柱为HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，仪器为Agilent 7890A型气相色谱仪器。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的气相色谱条件为：载气：氮气；进样口温度：250 ℃；检测器温度270 ℃；柱温100 ℃，2 min，15 ℃/min升温至290 ℃，10 min；进样量1 μL，分流比50:1。

8.一种如权利要求1所述β-谷甾醇作为橄榄油和油茶籽油鉴别标记物的应用，其特征在于，包括以下步骤：从待测的橄榄油或油茶籽油中取样品进行高温皂化处理，用石油醚萃取β-谷甾醇，用气相色谱仪检测得到待测样品中β-谷甾醇的峰面积，将峰面积代入所述的标准曲线，得到待测样品的β-谷甾醇含量；将待测样品的β-谷甾醇含量与参考橄榄油或参考油茶籽油中的β-谷甾醇含量相比较，判断待测的橄榄油或油茶籽油的种属来源或者真伪。