JPS5977357A - 生物学的試料中のヘモグロビンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的物質、たとえば、糞便、尿または胃
液中のヘモグロビンの定量法、さらに詳しくは、ヘモグ
ロビンをポルフィリンに転化し、ヘモグロビンまたはヘ
ム関連化合物から誘導されたこれらのポルフィリン類を
単離および分離し、そしてポルフィリンのレベルを測定
することを含む、このようなヘモグロビンの定量法に関
する。

この定量は、好ましくは、蛍光測定のような手段により
達成する。

生物学的物質、たとえば、糞便、尿および胃液中のヘモ
グロビンの増大量の存在を測定するために、種々の急速
スクリーニング試験が、現在存在する。これらの試験は
、医学専門家を通じて腸の癌についての主なスクリーニ
ング試験として使用されている。種として糞便に適用で
きる、これらの試験のいくつかは、ヘモグロビンのペル
オキシダーゼ様（プソイドペルオキシダーゼ）活性に基
づく間接試験である。これらの試験において、無色のロ
イコ染料は、ヘモグロビンの存在下に、適当な過酸化物
の添加後、着色するようになる。これらの試験は、定量
的データを与えず、そして比較的高い百分率の誤った陽
性および陰性の結果を含有する。本発明者の１９８０年
９月２４日付けの先行特許出願第１９０，３９９号は、
生物学的物質、たとえば、糞便、尿または胃液中のヘモ
グロビンのレベルを測定する改良法を記載する。この改
良法によると、試験試料を集めかつ準備し、試料中のヘ
モグロビンの非蛍光性ヘム部分を蛍光性ポルフィリンに
転化し、次いで転化された蛍光を測定するという概念に
より、このような試料中のヘモグロビンを定量すること
ができる。この一般的アプローチおよび方法は、先行の
急速スクリーニング非定鼠的技術より有意な改良であり
、こうして多くの場合において高度に満足すべき、かつ
許容されうべきものであるが、定量の精度においてさら
に改良される余地がなお存在する。

転化されたポルフィリン類の定量、たとえば。

前記特許出願中に記載されている方法、に基づく定量試
験の１つの制限は、試験試料中の不純物の存在の結果生
ずる。これらの不純物はポルフィリンの定量を変更し、
こうしてヘモグロビンの定量の精度に影響を及ぼす。こ
れは、定量を蛍光測定により実施するとき、とくに真実
である。たとえば、糞便のような生物学的物質は、ヘモ
グロビンから誘導されたポルフィリンの波長に類似する
波長において蛍光を発する多くの化合物を含有する。こ
れらの潜在的汚染物質は、自然に産出するポルフィリン
類、たとえば、ヘモグロビンからではなく、その代わり
クロロフィルのようなポルフィリン類から誘導されるコ
ブロボルフィリンを包含する。これらの潜在的汚染物質
は、ポルフィリンの最大蛍光の領域と一致する蛍光を有
する種々の顔料および医薬を含む多数の他の化合物を。

また包含しうる。これらのような汚染物質の蛍光は、転
化されたヘモグロビンから誘導される蛍光を通常超え、
こうしてここに記載する型の試験における蛍光測定に有
意に影響を及ぼす。

したがって、ヘモグロビンから誘導されたポルフィリン
類を、ポルフィリンの定量を用いるヘモグロビンの定量
試験において、精製しかつ単離する手順が必要である。

本発明は、ヘモグロビンのポルフィリンへの転化から誘
導されたポルフィリン類を単離および分離することによ
って、ポルフィリンの定量を用いる定量的ヘモグロビン
試験における制限を克服する。この方法は、一般に、有
意な汚染性要素、たとえば、蛍光を妨害する根源を試料
から分離することができる、抽出手順を含む。この抽出
手順後、試料はヘモグロビンおよびヘム関連物質カラ誘
導されたポルフィリン類のみを含む。こうして、これら
のポルフィリン類のみの蛍光を測定することにより、生
物学的試料中のヘモグロビンの精確な量を測定すること
ができる。結果は、この丁順後、測定された蛍光の９０
％以上がプロトポルフィリンおよびヘム化合物から誘導
された他のポルフィリン類によるものであることを示し
た。

本発明の抽出手順によると、生物学的試料中のヘモグロ
ビンから誘導されたポルフィリン類を単離することがで
き、こうして蛍光を測定し、かつ試料中のヘモグロビン
を精確に定量することができるが、さらに、とくに糞便
を用いたとき、ヘモグロビンのポルフィリンへの外部か
ら刺激される化学的転化が存在しない第２試験試料につ
いて抽出り順をまた実施することにより、追加の利益を
ｆｌすることができる。胃腸管内に入るヘモグロビン顔
ネ゛Ｌの変動する部分、しばしばその主要部分は。

ある種の腸の細菌類によりポルフィリン類に転化される
ことが発見された。これらの細菌類およびそれらの正確
な生成物は、よく明らかにされてきていない。それらは
、いわゆる「嫌気性生物」であり、胃腸管内、とくに大
腸内に存在すると信じられる。これらの細菌類によりヘ
モグロビンヘムから形成されるポルフィリン類は、定−
Ｍ：すべきポルフィリン類の一部分となる。本発明によ
る手順にしたがうポルフィリンの定量を外部から刺激さ
れた転化の不存在で実施するとき１ｍｍ類によってのみ
転化されたヘモグロビンの量を測定できる。細菌類によ
ってのみ転化されたヘモグロビンを定量するこの第２試
験試料からのデータを、合計のヘモグロビンを定量する
第１試験試料からのデータと比較することにより、出Ｉ
Ｉ）１の位置に関する有意な情報を得ることができる。

たとえば、合計のヘモグロビンの読に比較して、腸内細
菌によってのみ転化されるヘモグロビンの読が比較てき
低い比率（１０％より小さい程度）であるとき、胃腸管
内の山崩は比較的低いことが示されるであろう。これに
対して、比較的高い（３０または４０％より大きい程度
）比率は、胃腸管内の上部における出血を示すであろう
。多くの場合において、腸管内におけるヘモグロビンの
半分より多くは腸の細菌によりポルフィリン類に転化さ
れうろことが、示された。

本発明の抽出−手順は、好ましくは、３つの抽出工程を
含む。第１は、蛍光を測定しようとするポルフィリン類
、ならびに種々の他の物質、たとえば、天然に産出する
ポルフィリン類およびクロロフィルを抽出して、鉄塩類
、顔料類および種々の他の非特異的蛍光性物質を残す。

この初期の抽出上程を達成するためのいくつかの異なる
方法が存在するが、本発明の好ましい方法は、ポルフィ
リン類を酢酸エチルと酢酸との混合物中へ抽出すること
を包含する。

上の」：程において鉄塩類および種々の非特異的蛍光性
物質を除去したのち、天然に産出するポルフィリン、た
とえば、コプロポルフィリンを分離および除去する。本
発明の好ましい方法において、これはブチルアルコール
を酢酸エチル：酢酸根に加え、次いで木醜化ナトリウム
と酢酸カリウムとのアルカリ性７昆合物とともに振盪す
るこたのよって実施する。天然に産出するポルフィリン
類ならびに汚染性蛍光を示すある種の他の物質をこのア
ルカリ性混合物中に抽出し、こうしてヘモグロビンから
誘導されたポルフィリン類を含有する酢酸エチル：ブチ
ルアルコール相からそれらを除去することができる。

ｉ３に、ヘモグロビン（関連するヘム化合物）から誘導
されたポルフィリン類をクロロフィル、主要な糞便の汚
染物質、から抽出する。好ましい方法において、ヘモグ
ロビンから誘導されたポルフィリン類をリン酸中に抽出
し、酢酸エチル：ブチルアルコール相中にクロロフィル
を残す。ｌの抽出手順を用いる糞便試料について実施す
る試験において、測定された蛍光のほぼ９０％〜９９％
はプロトポルフィリンとヘム化合物から誘導されたポル
フィリン誘導体類とによることが発見された。

したがって、本発明の目的は、生物学的試料中のヘモグ
ロビンのレベルを定量する改良された方法を提供するこ
とである。

本発明の他の目的は、転化されたポルフィリン類の蛍光
測定に基づく定量的ヘモグロビン試験におい−（、ヘモ
グロビンおよび関連するヘム化合物から誘導されたポル
フィリン類を単離する方法を提供することである。

本発明のほかの目的は、天然に産出するポルフィリン類
およびクロロフィルを含む主要な蛍光汚染性物質がヘモ
グロビンから誘導されたポルフィリン類から分離される
、転化されたポルフィリン類の蛍光測定に基づく定量的
ヘモグロビン試験において、ヘモグロビンおよび関連す
るヘム化合物から誘導されたポルフィリン類を単離する
手順を提供することである。

本発明の他の目的は、胃腸管内の出血の相対的位置を決
定する情報を得ることができる、糞便中のヘモグロビン
の改良された定量法を提供することでる。

本発明のこれらの目的および他の目的は、図面、好まし
い方法の説明および特許請求の範囲を谷照すると、明ら
かとなるであろう。

本発明の好ましい方法は、このような試料中のヘモグロ
ビンをポルフィリンに転化し、次いでこのようなポルフ
ィリンを定量する。生物学的試料中のヘモグロビンの定
量的試験にとくに適用でき　　　・る。

好ましい方法において、定量的ヘモグロビンのレベルを
必要とする生物学的物質の試料を集め。

ヘモグロビンのヘム部分をポルフィリンに軸化する試薬
と組み合わせる。本発明の方法は多くの異なる種類の生
物学的試料と関連して使用できることが考えられるが、
生物学的試料、たとえば、糞便、尿および胃液にとくに
応用できる。生物学的物質を集める実際の手順は、いく
つかの既知の手順のいずれの１つであることもできる。

試料を集めたのち、試料をヘモグロビンのヘム部分をポ
ルフィリンに転化する試薬と組み合わせる。この転化を
達成する１つの手段は、本発明者による１９８０年９月
２４日伺けの同時係属特許出願第１９０，３９９号に記
載されており、この手段において、試料を還元性酸およ
び還元性塩からなる試薬と組み合わせる。さらに詳しく
は、この転化を達成するために好ましい試薬は、環元性
酸、たとえば、２．０〜２．５モルのシュウ酸および１
．５〜２．５％の環元性塩、たとえば、シ、つ酸第−鉄
または硫酸第一鉄の溶液の混合物から構成される。この
試薬の有効量を試験試料と絹み合わせることによって、
試料中のヘモグロビンのヘム部分はポルフィリンへ転化
される。ある転化は室温においてさえ起こるが、この転
化の速度および効率は高温において増大される。好まし
い方法において、試料を約１００°Ｃに２０分間加熱す
る。種々の他の手段を使用してこ転化を達成することが
できる。転化が完結したとき、ヘモグロビンから軸化さ
れた合計の転化したポルフィリンのレベルを測定するこ
とにより、もとの試験試才′１において表されたヘモグ
ロビンのレベルについての情報を得ることができる。こ
れは、腸内細菌ならびに前述のシュウ酸：硫酸第一鉄系
によりヘモグロビンから転化されたポルフィリン類から
構成されている。

しかしながら、この手順のこの段階において、とくにポ
ルフィリンのレベルを蛍光測定により決定するとき、ヘ
モグロビンから誘導されたポルフィリンのレベルを精確
に測定する可能性に影響を及ぼす、いく種類かの汚染物
質が転化された試験試料中に通常存在する。転化された
ポルフィリンの蛍光の波長と一致する波長を有する、妨
害性成分、たとえば、天然に産出するポルフィリン類、
クロロフィルおよび種々の物質を排除する目的で、ヘモ
グロビンから誘導されるポルフィリンのその部分な単離
ま吹は分離する手順をも包含する。

細菌類または選択された化学物質または他の手段により
、ヘモグロビンのヘム部分の転化からのみ誘導されるポ
ルフィリン類を単離および分離するこの手順は、３つの
一般の抽出工程を含む。図面中に工程Ａとして示されて
いるこれらの工程の第１工程は、究極の定量を望むポル
ソイリン類、すなわち、ヘモグロビンから誘導されたポ
ルフィリン類、を抽出できる溶媒とともに、ある量の試
験試料を振盪することを含む。この溶媒は、種々の汚染
物質、とくに鉄、のできるだけ多くを系中に残す性質を
も有する。図面中に工程Ａとして示されている好ましい
方法において、この溶媒は有機溶媒、たとえば、少量の
氷酢酸（ＨＯＡｃ）を含有する酢酸エチル（Ｅ　ｔ　Ｏ
Ａ　ｃ）である。この酢酸の目的は、転化されたポルフ
ィリン類の抽出を保証し、かつ鉄塩類（酢酸鉄）の溶解
および水相中へのその除去を保証することである。この
手順中、転化されたポルフィリンを有する試験試料の一
部分を酢酸エチル：酢酸溶液へ加える。この組み合わせ
を振盪しかつ沈降させたのち、試験試料中のポルフィリ
ン類、天然に産出するポルフィリン類ならびに転化され
たポルフィリン類およびクロロフィルの両者、はこの混
合物の酢酸エチル：酢酸相中へ抽出され、そして鉄、種
々の顔料類、医薬類および他の物質は水相中に残留する
であろう。この初期の抽出工程の間、酢酸カリウムをま
た加えて抽出の性能を改良する。酢酸カリウム（ＫＯＡ
Ｃ）の主目的は、シュウ酸の多くがシュウ酸カリウムに
転化し、こうして混合物の酸度を減少してポルフィリン
の一部分が水相中へ失われるのを避けることである。好
ましい方法において、転化された試験試料を有する試験
試料の１部を酢酸エチル：酢酸溶液（２０部の酢酸エチ
ル＝１部の酢酸からなる）の６部および３モルの酢酸カ
リウムの２部と組み合わせる。

酢酸エチルあおよび酢酸以外の種々の系をこの初期の抽
出工程において利用できることが考えられるが、ただし
それらはヘモグロビンから誘導されたポルフィリン類の
少なくともすべてを抽出できるが、種々の他の汚染物質
、とくに鉄、を残すかあるいは抽出しないものである。

他の溶媒系、たとえば、二塩化エチレン、クロロホルム
、ペルクロロエチレン、四塩化炭素、リン酸トリブチル
、シクロヘキサン、酢酸、ベンゼン、エーテル、トルエ
ンおよびアミルアルコールを単独であるいは組み合わせ
で試験し、そしてすべては変化する程度にポルフィリン
類を抽出するが、酢酸エチル：酢酸系は好ましい。また
、酢酸カリウム以外の物質を使用して、系の安定性を維
持し、かつ酸度を減少してポルフィリンの一部分の損失
を回避することが考えられるが、これは、ｋ了ましくは
、水相中の沈殿の形成を回避する物質であるべきである
。ナトリウム塩、たとえば、酢酸ナトリウト、は、本発
明の好ましい方法において使用するとき、不溶性シュウ
酸ナトリウムを生ずる。しかしながら、シュウ酸カリウ
ムはこれらの条件ドで可溶性にとどまる。カリウムのク
エン酸エン１翼ト　　リン酸塩および池の塩類（または
アンモニウムイオン）も試験したが、酢酸カリウムは好
ましい塩であった。

この初期り程後、第２抽出工程を実施する。図面中に−
に程Ｂどして示す第２抽出工程において、工程Ａからの
この酢酸エチル相の一部分をまずブチルアルコール（Ｂ
ｕＯＨ）へ加える。次いで、コプロポルフィリンのよう
な天然に産出するポルフィリン類を包含する、多数の不
純物を酢酸エチル：ブチルアルコール相から抽出するが
、ヘモグロビンから誘導されたポルフィリンを残す、水
性溶媒をこの混合物へ加える。これを達成するためには
、この水性溶媒は強アルカリ性であり、かつ比較的高い
濃度の可溶性塩を含有することが、好ましい。好ましい
方法において、工程Ａからの酢酸エチル層の一部分を水
酸化カリウムと酢酸カリウムとの混合物と混合して、よ
りすぐれたアルカリ度とカリウム塩の高い濃度を達成す
る。より特定的には、好ましい方法は、工程Ａからの酢
酸エチル層の１部を、ブチルアルコールの０．４部およ
び３モルの酢酸カリウムを含有する１モルの水酸化カリ
ウムの混合物の３部と組み合わせることを包含する。こ
の試薬は、酢酸エチル：酢酸相から汚染性の天然に産出
するポルフィリン類および追加の不純物の事実−Ｆすべ
てを抽出するために有効であることが、わかった。ブチ
ルアルコールは、この特定の抽出工程の性能を改良する
ために加えられる。その目的は、ヘモグロビンから誘導
されたポルフィリン類の酢酸エチルｉｆ溶性を増大しか
つ水相中へのその損失を減少することにある。ブチルア
ルコール、水酸化カリウムおよび酢酸カリウムはこの第
２抽出工程の好ましい成分であっるが、ヘモグロビンか
ら誘導されないポルフィリン類および他の不純物のみを
酢酸エチル層から抽出するという、■程Ｂの所望目的を
達成するかぎり、他の成分を代わりに使用できるであろ
う。

本発明の方法のこの時点において、工程Ｂにおける試薬
を混合しかつ沈降させたのち、試料は、ヘモグロビンか
ら誘導されないポルフィリン類を含む水相と、またクロ
ロフィルおよびヘモグロビンから誘導されたポルフィリ
ン類を含む酢酸エチル：ブチルアルコール相とからなる
。次いで、第３抽出ま、程を実施する。図面の工程Ｃに
より示すように、この第３抽出：、Ｃ程は１工程Ｂから
の酢酸エチル：ブチルアルコール相の−ｆ’ＦＲ分を、
ヘモグロビンから誘導されたポルフィリン類を抽出する
と同時にクロロフィル、糞便の主要な蛍光性成分、を残
ずために有効な溶媒と組み合わせることを含む。好まし
い方法において、この溶媒は、２モルのリン酸と酢酸と
のほぼ９：１の組み合わせである。他の強酸類、たとえ
ば、ａ１酸、をリン酸：酢酸の代わりに同様に使用する
ことができると考えられるが、後者は好ましい。

好ましい方法は、工程Ｂからの酢酸エチル：ブチルアル
コール相の１部をリン酸：酢酸成分の３部に加えること
を包含する。種々の他の濃度も満足すべきものであろう
が、上は好ましい。工程Ｂにおいて加えられ、そして［
程Ｃにおける酢酸エチル：ブチルアルコール相中に残留
する量は、第３抽出工程の実施においである程度重要で
あることを、述べるべきであろう。詳しくは、工程Ｂに
おいて多過ぎる量のブチルアルコールを加えると、工程
Ｃの酢酸エチル：ブチルアルコール相中にヘモグロビン
から誘導されたポルフィリンが多少残留するであろう。

こうして、工程Ｂにおけるブチルアルコールの添加量は
、この結果を生じるよりも少量であるべきである。しか
しながら、同時に、その工程においてヘモグロビンから
誘導されたポルフィリンを酢酸エチル：ブチルアルコー
ル相中に保持するために１−分なブチルアルコールを加
えなくてはならない。

この丁順のこの時点において、底部のリン酸：酢酸水性
相はヘモグロビンから誘導されたポルフィリン類を含む
が、酢酸エチル：ブチルアルコール相はクロロフィルと
脂溶性化合物を含む他の汚染物質とを含有する。次いで
、ヘモグロビンから誘導されたポルフィリン類を含有す
るこのリン酸：酢酸水性相の試料を、ポルフィリンのレ
ベルについて４１１定し、こうしてもとの試験試料中の
ヘモグロビンのレベルを決定することができる。

種／（の手段を用いてこの転化された試料中のポルフィ
リンのレベルを測定することができるとか考えられるが
、好ましい方法は蛍光測定を包含する。ポルフィリン類
および転化された試料の蛍光を既知の濃度のヘモグロビ
ンから調製した標準のイ１１゛光レベルと比較すること
により、試験試料中のヘモグロビンのレベルに関する情
報を４算することができる。今日まで試験された糞便試
料において、この最後の抽出において測定された蛍光の
９０％を越えるものはヘム化合物から誘導されるポルフ
ィリン類であることが、わかった。

上の手順を実施することにより、試験試料中のヘモグロ
ビンをまずポルフィリンに転化し１次いでこのようなポ
ルフィリンのレベルを決定する、ヘモグロビンの定酔的
試験において、改良された結果を得ることができる。抽
出工程は、転化されたポルフィリンのレベルを蛍光測定
により決定する場合、とくに適用することができる。こ
の手順を利用すると、試験試料中のヘモグロビンを精確
に定量することができる。

本発明の方法のそれ以−りの面は、生物学的試料が糞便
であるとき、出血に関する追加の意味ある情報を得るこ
ともできるということである。これは前述の手順を、試
験試料の調製など、ならびに抽出ニ［程の両者に関して
反復することによって達成され、ただしクエン酸または
他の非還元性系を還元性酸：環元性基試薬の代わりに使
用する。クエン酸は環元性酸ではなく、こうしてヘモグ
ロビンのヘム部分のポルフィリンへの転化の還元機能を
はださないので、ヘモグロビンの外部的に刺激されたポ
ルフィリンへの転化は起こらない。こうして、抽出［５
程の適用の前（および後）に試験試料中に存在するヘモ
グロビンから誘導されたポルフィリン類そのものは、プ
ロポルフィリンと、天然に存在する腸内細菌類によりヘ
モグロビンから転化された他のポルフィリン類である。

クエン酸と組み合わされた試験試料について前述の抽出
工程を実施したのち、ポルフィリンのレベルの測定は蛍
光測定のような手段により行う。次いで、このデータを
用いて、天然に存在する細菌類によりポルフィリンに転
化されている、試験試料中のヘモグロビンの量を計算す
る。この量は、もちろん、環元性酸：環元性基試薬を用
いて計算されたＨ、Ｘよりも少ない。なぜなら、この後
者の試薬を用いて実施する７’＝Ｉ明は、＃ｌＩ菌類の
転化の結果としてクエン酸中に存在するポルフィリン類
ならびに環元性酸：環元性塩試薬中の結果としてポルフ
ィリンに転化される追加のヘモグロビンから誘導された
ものを含むからである。：れらの２つの試料において定
量されたヘモグロビンの相対量を比較することにより、
出血に関する価値ある情報を得ることができる。たとえ
ば、クエン酸試料の値がシュウ酸：硫酸第一鉄の試料の
それより５〜ｌＯ％だけ小さい場合、このことは、出血
が胃腸管内の相対的に低い点において起こっていること
を示すであろう。なぜなら、腸内細菌類のような天然に
存在する物質がヘモグロビンをポルフィリンに転化する
ための時間が短いからである。また、腸内細菌類は適当
な抗生薬物により破壊されてしまっていることも、それ
は意味しうる。他方において、この百分率が約３０％だ
け大きい場合、これは出血が多分この腸管内においてよ
り高いことを示すであろう。こうして、天然に存在する
腸内細菌類は、ヘモグロビンをポルフィリンに転化する
より長い時間を有するであろう。

【図面の簡単な説明】

唯一の図面は、本発明の抽出手順を表示する略図である
。 図面の庁舎（白書に変更なし） （ニ ）−１１）才、。ルフィリソ　　　　　匠〃ｚグロロブ
イ、し　　　　回四 コツ０ロヤ・０ルフイリソ　　　２ 手続補正書 昭和Ｊ″８年ｌ１月、２４日 ２、発明の名称 ／ｉオｂイ的右八へ料やのへモク゛【りし７の・之を５
敷６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 外　体、’ｒ、　　’）−し″エン′ソ・オフ゛・ガ°
・ユニへ°−レティ　オフ′°・ミネンク ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、生物学的物質の試験試料を準備し、前記試験試料中
   のヘモグロビンをポルフィリンに転化し、 ヘモグロビンから誘導されたポルフィリン類を前記試験
   試料中の種々の汚染物質から分離する目的で、少なくと
   も１回の抽出工程からなる抽出手順を実施し、そして 前記試験試料中のへ七グロビンから誘導されたポルフィ
   リンのレベルを１Ｎ１１　定する。 ことを特徴とする、生物学的試料中のヘモグロビンの定
   量法。 ２、前記抽出手順は、ヘモグロビンから誘導されたポル
   フィリン類を、前記試験試料中の次ぎの汚染物質、すな
   わち、 ａ、鉄、 ｂ、天然に産出するポルフィリン類、 Ｃ、クロロフィル、および 顔料および他の妨害物質、 の少なくとも１種のから分離するために有効である第１
   抽出工程を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記抽出手順は、ヘモグロビンから誘導されたポル
   フィリン類を鉄から分離するために有効な第１抽出工程
   を含む、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記抽出手順は、ヘモグロビンから誘導さ゛れたポ
   ルフィリン類を鉄から分離するために有効な有機溶媒を
   加えることを含む、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記第１抽出工程は、酢酸エチル、ブチルアルコー
   ル、アミルアルコール、クロロホルム、ペルクロロエチ
   レン、四塩化炭素、シクロヘキサノン、リン酸トリブチ
   ル、トルエン、酢酸および塩化エチレンから成る群より
   選ばれた有機溶媒の添加を含む、特許請求の範囲第４項
   記載の方法。 ６、前記ｆｆ５ｌ抽出工程は、有効な量および比率の酢
   酪エチル：酢酸の混合物の添加を含む、特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ７、前記第１抽出工程は、酸度を低下するための有効量
   の適当な塩の添加を含む、特許請求の範囲第４項記戦の
   方法。 ８、前記酸度を低下する塩は、酢酸カリウムである、特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記抽出手順は、ヘモグロビンから誘導されたポル
   フィリン類を天然に、産出するポルフィリン類から分離
   するだめの第２抽出工程を含む、特許請求の範囲第３項
   記載の方法。 ｌＯ１前記第２抽出工程は、ヘモグロビンから１誘導さ
   れたポルフィリン類を天然に産出するポルフィリン類か
   ら分離するために有効な可溶性塩を含有するアルカリ性
   溶媒の添加を含む、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、前記第２抽出工程は、有効量の水酸化カリウドの
   添加を含む、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、第２抽出工程は、水酸化カリウムおよび酢酸カリ
   ウムからなる可溶性塩の添加を含む、特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 １３、有効量のブチルアルコールを添加し、次いでヘモ
   グロビンから誘導されたポルフィリン類を天然に産出す
   るポルフィリン類から分離するために有効な可溶性塩を
   含有する有効量のアルカリ性溶媒の添加を含む、特許請
   求の範囲第９項記載の方法。 １４、前記第２抽出工程を、前記第１抽出工程の生成物
   に適用する、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １５、前記抽出手順は、ヘモグロビンから誘導されたポ
   ルフィリン類をクロロフィルから分離するために有効な
   第３抽出工程を含む、特許請求の範囲第９項記載の方法
   。 １６、前記第３抽出工程は、ヘモグロビンから誘導され
   たポルフィリン類をクロロフィルから分離するために有
   効な強酸の添加を含む、特許請求の範囲第１５項記載の
   方法。 １７、前記強酸は、リン酸および酢酸の混合物からなる
   、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、前記第３抽出工程は、前記第２抽出工程の生成物
   に適用される、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １９、前記生物学的物質は、糞便、尿および胃液である
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２０、前記試験試料中のヘモグロビンから誘導されたポ
   ルフィリンのレベルを蛍光測定により測定することを含
   む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２１、前記試験試料は第１試験試料であり、そして前記
   方法は、ヘモグロビンがポルフィリンに転化されなかっ
   た第２試験試料について前記抽出手順を実施すること、
   および前記第２試料中のヘモグロビンから誘導されたポ
   ルフィリンのレベルを１１１６定することを含む、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。　　□ ２２、前記第１試験試料中のポルフィリンのレベルを前
   記第２試験試料中のポルフィリンのレベルと比較するこ
   とを含む、特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、前記試験試料は第１試験試料であり、そして前記
   方法は胃腸管内の細菌によりヘモグロビンから誘導され
   たポルフィリン類のみを含有する第２試験試料中のポル
   フィリン類のレベルを測定することを含む、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ２４、前記第２試験試料を、有意な量のヘモグロビンを
   ポルフィリンに転化しないブランク試薬と組み合わせる
   ことを含む、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、前記ブランク試薬は非還元性酸である、特許請求
   の範囲第２４項記載の方法。 ２６、前記ブランク試薬はクエン酩である、特許請求の
   範囲第２５項記載の方法。 ２７、前記第１試験試料中の合計のポルフィリン類のレ
   ベルを前記第２試験試料中のポルフィリン類のレベルと
   比較することを含む、特許請求の範囲第２３項記載の方
   法。 ２８、前記第１試験試料および前記第２試験試料中のヘ
   モグロビンを定量し、そしてそれを比較することを含む
   、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２９、前記生物学的試料は糞便である、特許請求の範囲
   第２５項記載の方法。