FI76434B - Foerfarande foer bestaemning av hemoglobinhalten i ett biologiskt prov. - Google Patents

Description

7 6 4 3 4

Menetelmä hemoglobiinipitoisuuden määrittämiseksi biologisessa näytteessä - Förfarande för bestämning av hemoglo-binhalten i ett biologiskt prov Tämä keksintö koskee yleisesti menetelmää hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisessa näytteessä, kuten ulosteessa, virtsassa tai mahanesteessä, joka menetelmä käsittää testinäytteen valmistamisen mainitusta biologisesta aineesta, hemoglobiinin muuttamisen mainitussa testinäytteessä porfyriiniksi, ja hemoglobiinista peräisin olevan porfyriinin pitoisuuden määrittämisen mainitussa testinäytteessä. Tämä määritys suoritetaan edullisesti esimerkiksi fluoresenssimääri-tyksenä. Menetelmälle on tunnusomaista, että ennen porfyriinin pitoisuuden määrittämistä hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit erotetaan uuttamalla testinäytteessä olevista erilaisista epäpuhtauksista, joka uuttomenetelmä käsittää seuraavat kolme uuttovaihetta: 1) lisätään orgaanista liuotinta, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit raudasta, 2) testinäyte yhdistetään uuttoreagenssin kanssa, joka käsittää liukoisen suolan sisältävän alkalisen liuottimen, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit luonnossa esiintyvistä porfyriineistä ja 3) lisätään vahvaa happoa, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit klorofyllistä.

Erilaisia nopeita seulontatestejä (screening tests) kohonneiden hemoglobiiniarvojen määrittämiseksi biologisissa aineissa kuten ulosteessa, virtsassa ja mahanesteessä on nykyään käytettävissä. Näitä testejä käytetään yleisesti lääketieteessä suolistokasvainten primäärisenä seulonta-testinä. Jotkut näistä testeistä, joita primäärisesti käytetään ulostetta varten, ovat epäsuoria testejä, jotka pe- 2 76434 rustuvat hemoglobiinin peroksidaasityyppiseen (pseudoper-oksidaasi) aktiviteettiin. Näissä testeissä värittömät leukoväriaineet muuttuvat hemoglobiinin läsnäollessa värillisiksi sopivan peroksidin lisäämisen jälkeen. Nämä testit eivät kuitenkaan anna kvantitatiivisia arvoja ja ne sisältävät verraten suuren prosenttimäärän vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia. Aikaisemmassa patenttihakemuksessani FI 82 1798 (FI-patentti 73839) on kuvattu parannettu menetelmä hemoglobiinipitoisuuden määrittämiseksi biologisessa näytteessä, kuten ulosteessa, virtsassa tai mahanesteessä. Tämä parannettu menetelmä sallii hemoglobiinin kvantitatiivisen määrittämisen tällaisessa näytteessä keräämällä ja valmistelemalla testinäyte, muuttamalla näytteen hemoglobiinin ei-fluoresoiva hemiosa fluoresoivaksi porfyriiniksi ja sitten mittaamalla muutetun porfyriinin fluoresenssi. Vaikkakin tämä yleinen ajatustapa ja menetelmä tarkoittavat huomattavaa parannusta aikaisempiin nopeisiin ei-kvantitatiivisiin seulontatesteihin nähden, ja on siten erittäin tyydyttävä ja käyttökelpoinen monessa tapauksessa, on kuitenkin vielä parantamisen varaa kvantitatiivisen määrityksen tarkkuuden suhteen .

Eräs muutettujen porfyriinien määritykseen perustuviin kvantitatiivisiin testeihin, kuten edellä mainitussa patenttihakemuksessani kuvattuun menetelmään liittyvä rajoitus on se, joka johtuu testinäytteessä esiintyvistä epäpuhtauksista. Nämä epäpuhtaudet muuttavat porfyriinin määritystä mikä puolestaan vaikuttaa hemoglobiinimäärityksen tarkkuuteen. Tämä pätee erityisesti tapauksissa, jois-. sa porfyriinien määritys tapahtuu fluoresenssimittauksena. Biologiset aineet, kuten uloste, sisältävät useita yhdisteitä, jotka fluoresoivat aallonpituuksilla, jotka ovat lähellä hemoglobiinista saatujen porfyriinien aallonpituuksia. Nämä potentiaaliset epäpuhtaudet käsittävät luonnossa esiintyvät porfyriinit, kuten koproporfyriinin, joka li 3 76434 ei ole peräisin hemoglobiinista, ja suun kautta saadut porfyriinit, kuten klorofyllin. Nämä potentiaaliset epäpuhtaudet voivat sisältää myös lukuisia muita yhdisteitä, mukaan lukien erilaisia pigmenttejä ja lääkkeitä, joiden fluoresenssi sattuu samalle alueelle maksimaalisen porfy-riinifluoresenssin kanssa. Tällaisten epäpuhtauksien fluoresenssi on normaalisti suurempi kuin muutetusta hemoglobiinista saatu fluoresenssi, ja niinpä se vaikuttaa huomattavasti fluoresenssimittaukseen edellä esitetyn tyyppisessä testissä.

Näin ollen tarvitaan menetelmä hemoglobiinista saatujen porfyriinien puhdistamiseksi ja eristämiseksi hemoglobiinin kvantitatiivisessa testissä, jossa käytetään porfyrii-nimääritystä.

Esillä oleva keksintö eliminoi sellaisiin kvantitatiivisiin hemoglobiinitesteihin liittyvät rajoitukset, joissa käytetään porfyriinimääritystä, eristämällä ja erottamalla porfyriinit, jotka muodostuvat hemoglobiinin muuttuessa porfyriiniksi. Tämä menetelmä käsittää yleisesti uuttopro-sessin, joka sallii sellaisten oleellisten epäpuhtausele-menttien, kuten fluoresenssia häiritsevien lähteiden poistamisen testinäytteestä. Käyttämällä tätä uuttomenetelmää näyte sisältää vain hemoglobiinista ja vastaavista hemi-yhdisteistä muodostuneita porfyriinejä. Näin ollen mittaamalla näiden porfyriinien fluoresenssi voidaan hemoglobiinin määrä biologisessa näytteessä mitata tarkasti kvantitatiivisesti. Tulokset ovat osoittaneet, että käyttämällä tätä menetelmää yli 90 % mitatusta fluoresenssista on peräisin protoporfyriinistä ja muista, hemiyhdisteistä saaduista porfyriineistä.

Vaikkakin esillä olevan keksinnön mukainen uuttomenetelmä sallii biologisessa näytteessä olevien, hemoglobiinista saatujen porfyriinien eristämisen, ja täten fluoresenssin 4 76434 mittaamisen ja hemoglobiinin tarkan määrittämisen näytteessä, voidaan saavuttaa muita etuja, erityisesti uloste-näytteen ollessa kysymyksessä, suorittamalla uuttomenetel-mä myös toiselle testinäytteelle, jossa ei ole suoritettu hemoglobiinin ulkoisesti stimuloitua kemiallista muuttamista porfyriiniksi. On todettu, että vaihteleva, usein suuri osa siitä hemoglobiinipigmentistä, joka saapuu ruuansulatuskanavaan, muuttuu porfyriineiksi tiettyjen suo-listobakteereiden vaikutuksesta. Näitä bakteereita ja niiden täsmällisiä tuotteita ei ole hyvin määritelty. Oletetaan niiden olevan nk. "anaerobeja" joiden oletetaan olevan läsnä ruuansulatuskanavassa, erityisesti paksusuolessa. Hemoglobiinin hemistä näiden bakteereiden avulla muodostuneet porfyriinit muodostavat osan mitattavista porfy-riineistä. Jos keksinnön mukainen porfyriinimääritys suoritetaan ilman minkäänlaista ulkoisesti stimuloitua muuttumista, voidaan määrittää pelkästään bakteereiden avulla muuttuneen hemoglobiinin määrä. Vertaamalla tuloksia tästä toisesta testinäytteestä, jossa määritetään vain bakteereiden avulla muuttunut hemoglobiini, tuloksiin ensimmäisestä testinäytteestä, jossa määritetään kokonaishemoglobiini, voidaan saada arvokkaita tietoja vuotokohdan sijainnista. Esimerkiksi, jos saadaan verraten alhainen suhde pelkästään suolistobakteereiden avulla muutetun hemoglobiinin lukemien ja kokonaishemoglobiinia tarkoittavien lukemien välillä (suuruusluokkaa alle 10 %) on oletettavissa, että vuoto esiintyy verraten alhaalla ruuansulatuskanavassa. Toisaalta verraten suuri suhde (suuruusluokkaa yli 30 tai 40 %) osoittanee vuodon tapahtuvan ruuansulatuskanavan yläosassa. On osoittautunut, että monessa tapauksessa yli puolet suoliston hemoglobiinista voi muuttua porfyriineiksi suolistobakteereiden avulla.

Keksinnön mukainen uuttoprosessi sisältää siis edullisesti kolme uuttovaihetta. Ensimmäinen käsittää porfyriinien uuttamisen, joiden fluoresenssi halutaan mitata, kuten il 5 76434 myös erilaisten muiden aineiden, kuten luonnossa esiintyvien porfyriinien ja klorofyllin uuttamisen, jolloin jäljelle jäävät rautasuolat, pigmentit ja erilaiset muut ei-spesifiset fluoresoivat aineet. Vaikkakin on olemassa monta erilaista tapaa suorittaa tämä alustava uuttovaihe, suoritetaan porfyriinien uutto esillä olevan keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan etyyliasetaatin ja etikkahapon seokseen.

Rautasuolojen ja erilaisten ei-spesifisten fluoresoivien aineiden poistamisen jälkeen edellisessä vaiheessa, erotetaan ja poistetaan luonnossa esiintyvät porfyriinit kuten koproporfyriini. Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan tämä tapahtuu lisäämällä ensin butyylialkoholia etyyliasetaatti :etikkahappo-faasiin ja ravistelemalla sitten ka-liumhydroksidin ja kaliumasetaatin alkaliseoksella. Luonnossa esiintyvät porfyriinit samoinkuin eräät muut aineet, jotka vaikuttavat epäpuhtauksina fluoresenssiin, uutetaan tähän alkaliseokseen ja poistetaan täten etyyliasetaatti: butyylialkoholifaasista, joka sisältää hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit.

Kolmanneksi hemoglobiinista (ja muista läheistä sukua olevista hemiyhdisteistä) peräisin olevat porfyriinit uutetaan klorofyllistä, joka on huomattava fluoresoiva uloste-epäpuhtaus. Edullisen menetelmän mukaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit uutetaan fosforihappoon, jolloin klorofylli jää jäljelle etyyliasetaatti:butyylialko-holi-faasiin. Testeissä, jotka on suoritettu käyttäen ulostenäytteitä ja edellä mainittua uuttomenetelmää, on todettu noin 90-95 % mitatusta fluoresenssista johtuvan protoporfyriinistä ja muista, hemiyhdisteistä saaduista porfyriini johdannaisista.

Keksinnön tarkoituksena on näin ollen aikaansaada paran nettu menetelmä hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisessa näytteessä.

6 76434

Keksinnön tarkoituksena on myös aikaansaada menetelmä, jossa hemoglobiinista ja läheisistä hemiyhdisteistä peräisin olevat porfyriinit eristetään muutettujen porfyriinien fluoresenssimittaukseen perustuvassa kvantitatiivisessa hemoglobiinitestissä.

Esillä olevan keksinnön eräs lisätarkoitus on aikaansaada menetelmä hemoglobiinista ja läheisistä hemiyhdisteistä peräisin olevien porfyriinien eristämiseksi kvantitatiivisessa hemoglobiinitestissä, joka käsittää muutettujen porfyriinien fluoresenssin mittaamisen, jolloin pääosa fluoresoivista epäpuhtauksista, käsittäen luonnossa esiintyvät porfyriinit ja klorofyllin, erotetaan hemoglobiinista peräisin olevista porfyriineistä.

Esillä olevan keksinnön lisätarkoituksena on aikaansaada parannettu kvantitatiivinen testi ulosteessa esiintyvää hemoglobiinia varten, jonka perusteella voidaan saada tietoja vuotokohdan suhteellisesta sijainnista ruuansulatuskanavassa .

Keksinnön nämä ja muut päämäärät selviävät oheisen piirustuksen, keksinnön edullista suoritusmuotoa tarkoittavan selityksen ja oheisten patenttivaatimusten perusteella.

Piirustuksen ainoa kuvio esittää kaaviomaisesti keksinnön mukaista uuttomenetelmää.

Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto on erityisen käyttökelpoinen kvantitatiivisena testinä biologisessa näytteessä olevaa hemoglobiinia varten, jolloin tällaisessa näytteessä oleva hemoglobiini muutetaan porfy-riiniksi ja määritetään tällaisten porfyriinien pitoisuus.

Edullisen menetelmän mukaan kerätään näyte biologisesta aineesta, jonka kvantitatiivinen hemoglobiinipitoisuus on 7 76434 tarkoitus määrittää, ja yhdistetään se reagenssin kanssa hemoglobiinin hemiosan muuttamiseksi porfyriiniksi. Vaikkakin on selvää että esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää mitä erilaisimpien biologisten näytteiden yhteydessä, on menetelmä erityisen käyttökelpoinen sellaisten biologisten näytteiden kuten ulosteen, virtsan tai mahanesteiden yhteydessä. Varsinainen menetelmä näytteen keräämiseksi biologisesta aineesta voi olla mikä tahansa aikaisemmin tunnetuista menetelmistä.

Näytteen keräämisen jälkeen näyte yhdistetään reagenssin kanssa hemoglobiinin hemiosan muuttamiseksi porfyriiniksi. Eräs tapa tämän muuttoreaktion aikaansaamiseksi on selitetty FI-patenttihakemuksessani 82 1798, (FI-patentti 73839) jonka mukaan näyte yhdistetään reagenssin kanssa, joka käsittää pelkistävän hapon ja pelkistävän suolan. Tarkemmin sanottuna parhaana pidetty reagenssi tämän muu-tosreaktion aikaansaamiseksi käsittää seoksen, jossa on pelkistävää happoa, kuten 2,0- tai 2,5-molaarista oksaalihappoa ja pelkistävän suolan, kuten ferro-oksalaatin tai ferrosulfaatin 1,5 - 2,5 % liuosta. Yhdistämällä tehokas määrä tätä reagenssia testinäytteen kanssa, muutetaan näytteen sisältämän hemoglobiinin hemiosa porfyriiniksi. Vaikkakin tietynasteinen muuttuminen esiintyy jo huoneen lämpötilassa, muuttoreaktion nopeus ja tehokkuus kasvaa kohotetussa lämpötilassa. Edullisen suoritusmuodon mukaan näytettä kuumennetaan 20 minuuttia noin 100 °C:n lämpötilassa. On ilmeistä että tämän muutosreaktion aikaansaamiseksi voidaan käyttää myös muita menetelmiä. Kun muutosre-aktio on tapahtunut voidaan saada kvantitatiivisia tietoja alkuperäisessä näytteessä olleen hemoglobiinin määrästä määrittämällä hemoglobiinista muutetun kokonaisporfyriinin määrä. Tämä käsittää sekä hemoglobiinista suolistobaktee-reiden avulla sekä edellä selitetyn oksaalihappo: ferro-sulfaattisysteemin avulla muutetut porfyriinit.

8 76434

Menetelmän tässä vaiheessa muutetussa testinäytteessä kuitenkin esiintyy useita epäpuhtauksia, jotka vaikuttavat mahdollisuuteen määrittää hemoglobiinista peräisin olevien porfyriinien pitoisuus tarkasti, erityisesti silloin kun porfyriinien pitoisuus määritetään fluoresenssimittauksel-la. Näin ollen keksintö koskee myös menetelmää hemoglobiinista peräisin olevan porfyriiniosuuden eristämiseksi tai erottamiseksi, häiritsevien komponenttien, kuten luonnossa esiintyvien porfyriinien, klorofyllin ja erilaisten muiden aineiden eliminoimiseksi, joiden fluoresoiva aallonpituus lankeaa muutettujen porfyriinien aallonpituuden kohdalle ja näin ollen vaikuttaa kvantitatiivisen hemoglobiinimäärityksen tarkkuuteen.

Tämä menetelmä sellaisten porfyriinien eristämiseksi ja erottamiseksi, jotka ovat peräisin pelkästään hemoglobiinin hemiosan muuttumisesta, tapahtuipa tämä joko baktee-reiden tai valittujen kemikaalien avulla tai muita menetelmiä käyttäen, käsittää kolme yleistä uuttovaihetta. Ensimmäinen näistä vaiheista, joka on merkitty vaiheena A piirustuksessa, käsittää sen, että osamäärä testinäytettä ravistellaan liuottimen kanssa, joka kykenee uuttamaan ne porfyriinit, joiden lopullinen määritys halutaan suorittaa, nimittäin hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit. Liuottimena tulisi myös olla sellaiset ominaisuudet, jotka jättävät jälkeensä mahdollisimman monta systeemissä olevista muista epäpuhtauksista, erityisesti raudan. Edullisessa menetelmässä joka on merkitty vaiheena A piirustuksessa, tämä liuotin on orgaaninen liuotin, kuten etyyliasetaatti (EtOAc), joka sisältää pienen määrän jääetik-kaa (HOAc). Etikkahapon tarkoituksena on muutettujen porfyriinien uuttamisen varmistaminen ja rautasuolan (rautaasetaatin) liukenemisen varmistaminen ja sen poistuminen vesi faasissa. Menetelmän aikana osa muutettua por-fyriiniä sisältävästä testinäytteestä lisätään etyyliasetaatti : etikkahappo-liuokseen . Kun seosta on ravisteltu

II

9 7 6 4 3 4 ja se on saanut laskeutua, testinäytteessä olevat porfy-riinit, sekä luonnossa esiintyvät porfyriinit että muutetut porfyriinit ja klorofylli, uutetaan seoksen etyyliasetaatti retikkahappo-faasiin ja rauta, erilaiset pigmentit, lääkkeet ja muut aineet jäävät jäljelle vesipitoiseen faasiin. Tämän alustavan uuttovaiheen aikana lisätään myös kaliumasetaattia uuton parantamiseksi. Kaliumasetaatin (KOAc) ensisijaisena tarkoituksena on suuressa määrin muuttaa oksaalihappo kaliumoksalaatiksi, ja siten vähentää seoksen happamuutta sen estämiseksi, että osa porfyrii-neistä menetetään vesifaasiin. Edullisen menetelmän mukaan osa muutettua porfyriiniä sisältävästä testinäytteestä yhdistetään kuuden osan kanssa etyyliasetaatti: etikkahappo-liuotinta (joka sisältää 20 osaa etyyliasetaattia yhtä osaa kohti etikkahappoa) ja kahden osan kanssa kolme-molaarista kaliumasetaattia.

On mahdollista käyttää muita liuotinsysteemejä kuin etyyliasetaattia ja etikkahappoa tässä alustavassa uuttovai-heessa, edellyttäen että ne suorittavat halutut toiminnat ja uuttavat ainakin kaikki hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit, mutta jättävät jälkeensä tai eivät uuta tiettyjä muita epäpuhtauksia, erityisesti rautaa. Muita liuotinsysteemejä, kuten etyleenidikloridia, kloroformia, perkloorietyleeniä, hiilitetrakloridia, tributyylifosfaat-tia, sykloheksanonia, etikkahappoa, bentseeniä, eetteriä, tolueenia ja amyylialkoholia on kokeiltu joko sellaisenaan tai yhdistelmänä, ja kaikki uuttavat porfyriineja vaihte-levassa määrin; etyyliasetaatti:etikkahappo-systeemiä pidetään kuitenkin parhaimpana. Systeemin stabiliteetin ylläpitämiseksi ja sen happamuuden vähentämiseksi, jolloin porfyriinien osittainen häviäminen voidaan estää, on myös mahdollista käyttää muita aineita kuin kaliumasetaattia; tämän tulisi kuitenkin mieluimmin olla aine, joka ei aiheuta sakkaa vesipitoisessa faasissa. Natriumsuolat, kuten natriumasetaatti, muodostavat esimerkiksi liukenematonta 10 7 6 4 3 4 natriumoksalaattia käytettynä edullisena pidetyssä menetelmässä. Kaliumoksalaatti pysyy kuitenkin liukoisessa muodossa näissä olosuhteissa. On kokeiltu myös kaliumin (tai ammoniumionin) sitraattia, fosfaattia ja muita suoloja, mutta kaliumasetaatti on edullisin suola. Tämän alustavan uuttovaiheen jälkeen suoritetaan toinen uuttovaihe. Toisessa vaiheessa,joka on merkitty vaiheena B piirustuksessa, osa vaiheen A etyyliasetaattifaasista lisätään ensin butyylialkoholiin (BuOH). Sen jälkeen tähän seokseen lisätään vesipitoinen liuotin, joka uuttaa useita epäpuhtauksia, mukaan lukien luonnossa esiintyvät porfyriinit, kuten koproporfyriinit, etyyliasetaatti:butyylialkoholi-faasista, mutta joka jättää jälkeensä hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit. Tämän aikaansaamiseksi on suotavaa, että tämä vesipitoinen liuotin on vahvasti alkali-nen, ja että se sisältää verraten suuren konsentraation liukenevaa suolaa. Edullisen menetelmän mukaan yhdistetään osa vaiheen etyyliasetaattifaasista kaliumhydroksidin ja kaliumasetaatin seoksen kanssa paremman alkalisuuden ja korkeamman kaliumsuolakonsentraation saavuttamiseksi. Tarkemmin sanottuna edullisen menetelmän mukaan yhdistetään yksi osa etyyliasetaattifaasia vaiheesta A 0,4 osan kanssa butyylialkoholia ja kolmen osan kanssa seosta, jossa on kolmemolaarista kaliumasetaattia sisältävää yksimolaarista kaliumhydroksidia. On todettu että tämä reagenssi on tehokas uuttamaan käytännöllisesti kaiken epäpuhtauksina esiintyvistä luonnollisista porfyriineistä ja muita epäpuhtauksia etyyliasetaatti: butyylialkoholi-faasista. Bu-tyylialkoholi lisätään tämän erityisen uuttovaiheen B tehokkuuden parantamiseksi. Sen tehtävänä on lisätä niiden porfyriinien liukoisuutta etyyliasetaattiin, jotka ovat peräisin hemoglobiinista, ja estää niiden menettäminen ve-sifaasiin. Vaikkakin butyylialkoholi, kaliumhydroksidi ja kaliumasetaatti ovat edullisimpia komponentteja toisessa uuttovaiheessa, on ajateltavissa, että voidaan käyttää muita komponentteja edellyttäen, että ne täyttävät vai- n 76434 heelle B asetetun halutun päämäärän, joka on pelkästään niiden porfyriinien uuttaminen, jotka eivät ole peräisin hemoglobiinista, ja muiden epäpuhtauksien uuttaminen etyyliasetaatti faasi s ta .

Keksinnön mukaisen menetelmän tässä vaiheessa, sen jälkeen kun reagenssit vaiheessa B on sekoitettu ja seoksen on annettu laskeutua, näyte käsittää vesipitoisen faasin, joka sisältää ne porfyriinit, jotka eivät ole peräisin hemoglobiinista sekä myös etyyliasetaatti: butyylialkoholi-faasin, joka sisältää klorofylliä ja hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit. Sitten suoritetaan kolmas uuttovaihe. Kuten vaiheena C piirustuksessa on esitetty, tämä kolmas uuttovaihe käsittää vaiheen B etyyliasetaatti:butyyli-alkoholi-faasin osan yhdistämisen liuottimen kanssa, joka pystyy uuttamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit kuitenkin jättäen jälkeensä klorofyllin, joka on oleellinen fluoresoiva epäpuhtaus ulosteessa. Edullisen menetelmän mukaan tämä liuotin on kaksimolaarisen fosfori-hapon ja etikkahapon yhdistelmä suhteessa noin 9:1. On ajateltavissa että voidaan käyttää muita vahvoja happoja, kuten kloorivetyhappoa, fosforihapporetikkahappo-liuotti-men asemesta, vaikkakin viimemainittua pidetään edullisimpana .

Edullisen menetelmän mukaan lisätään yhteen osaan etyyliasetaatti : butyylif aasia vaiheesta B kolme osaa fosfori-happo :etikkahappo-komponenttia. Vaikkakin myös muut kon-sentraatiot voivat olla tyydyttäviä pidetään edellä mainittua parempana. On huomattava että vaiheessa B lisätty butyylialkoholimäärä, ja joka jää etyyliasetaattisbutyyli-alkoholi-faasiin vaiheessa C, on tietyssä määrin tärkeä kolmannen uuttovaiheen tehokkuuden kannalta. Erityisesti mainittakoon että liian suuren butyylialkoholimäärän lisääminen vaiheessa B aikaansaa sen, että osa hemoglobiinista peräisin olevista porfyriineista jää vaiheen C

12 764 34 etyyliasetaatti :butyylialkoholi-faasiin . Niinpä tulisi vaiheessa B lisätyn butyylialkoholimäärän olla pienempi kuin se määrä joka aikaansaa tämän tuloksen. Samanaikaisesti on kuitenkin lisättävä riittävästi butyylialkoholia vaiheessa B pitämään tässä vaiheessa hemoglobiinista peräisin oleva porfyriini etyyliasetaatti:butyylialkoholi-faasissa.

Menetelmän tässä vaiheessa pohjalla oleva fosforihappo: etikkahappo-vesipitoinen faasi sisältää hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit, kun taas päällä oleva etyylialkoholi :butyylialkoholi-faasi sisältää klorofyllin ja muut epäpuhtaudet mukaan lukien rasvaliukoiset yhdisteet. Näyte tästä fosforihappo:etikkahappo-vesifaasista, joka sisältää hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit, voidaan sitten tutkia porfyriinien pitoisuuden ja siten hemoglobiinipitoisuuden määrittämiseksi alkuperäisessä tes-tinäytteessä. Vaikkakin voidaan käyttää erilaisia menetelmiä porfyriinien pitoisuuden määrittämiseksi tässä muutetussa näytteessä, käsittää edullinen menetelmä fluore-senssimäärityksen käyttämisen. Vertaamalla muutetun näytteen porfyriinien fluoresenssia tunnetuista hemoglobiini-konsentraatioista valmistettujen standardien fluoresenssiin, voidaan laskemalla saada selville tietoja testinäyt-teessä olevasta hemoglobiinipitoisuudesta. Tähän asti testatuissa ulostenäytteissä on todettu että yli 90 % tässä viimeisessä uutteessa mitatusta fluoresenssista johtuu hemiyhdisteistä peräisin olevista porfyriineistä.

Suorittamalla edellä mainittu uuttomenetelmä voidaan saada parannettuja tuloksia hemoglobiinin kvantitatiivisessa testissä, jossa testinäytteen sisältämä hemoglobiini ensin muutetaan porfyriiniksi ja sen jälkeen määritetään tämän porfyriinin pitoisuus. Uuttovaiheet ovat erityisen käyttökelpoisia jos muutettujen porfyriinien määrä määritetään fluoresenssilla. Käyttämällä tätä menetelmää voidaan he-

II

13 764 34 moglobiinin määrä testinäytteessä määrittää tarkasti kvantitatiivisesti .

Esillä olevaan keksintöön liittyvä toinen aspekti on että se myös sallii mielekkään informaation saamisen mitä tulee vuodon sijaintiin, kun biologinen näyte on uloste. Tämä aikaansaadaan toistamalla edellä kuvattu menetelmä mitä tulee sekä testinäytteen valmistelemisen suhteen jne., että uuttomenetelmän suhteen, paitsi että käytetään sitruunahapon liuosta tai jotakin muuta ei-pelkistävää systeemiä pelkistävän hapon ja pelkistävän suolan muodostaman reagenssin asemesta. Koska sitruunahappo ei ole pelkistävä happo eikä täten pelkistävästi muuta hemoglobiinin hemiosaa porfyriiniksi, mitään huomattavaa ulkoisesti stimuloitua hemoglobiinin muuttumista porfyriiniksi ei esiinny. Niinpä ainoat hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit, jotka esiintyvät tässä näytteessä ennen (ja jälkeen) uuttovaiheiden suorittamista on protoporfyriini ja muut porfyriinit, jotka luonnossa esiintyvät suolisto-bakteerit ovat muuttaneet hemoglobiinista. Edellä kuvattujen uuttovaiheiden suorittamisen jälkeen testinäytteille, jotka on yhdistetty sitruunahapon kanssa, määritetään por-fyriinien pitoisuus esimerkiksi fluoresenssimääritystä käyttäen. Tätä tietoa käytetään sitten alkuperäisessä testinäytteessä olleen hemoglobiinimäärän laskemiseksi, joka on muuttunut porfyriiniksi luonnossa esiintyvien bak-teereiden vaikutuksesta. Tämä määrä on luonnollisesti pienempi kuin se määrä, joka saadaan käyttämällä pelkistävän hapon ja pelkistävän suolan systeemiä, sillä tämän viimemainitun menetelmän kanssa käytetty menettelytapa käsittää porfyriinit, jotka ovat läsnä sitruunahapossa bakteeri-muunnoksen jälkeen kuten myös ne, jotka ovat peräisin siitä kun lisämääriä hemoglobiinia on muutettu porfyrii-neiksi pelkistävän hapon ja pelkistävän suolan muodostaman reagenssin vaikutuksesta. Vertaamalla näissä kahdessa näytteessä määritettyjä suhteellisia hemoglobiinimääriä 14 7 64 34 keskenään, voidaan saada arvokkaita tietoja vuotokohdan sijainnin suhteen. Esimerkiksi, jos sitruunahapponäytteen arvo on alle 5 tai 10 % oksaalihappo: ferrosulfaattihappo-näytteestä, tämä indikoi sitä että vuoto esiintyy verraten alhaisessa kohdassa ruuansulatuskanavassa, sillä tällöin on luonnossa esiintyvillä aineilla kuten suolistobakteereilla vähemmän aikaa hemoglobiinin muuttamiseksi porfy-riineiksi. Se voi myös tarkoittaa sitä että suolistobakteereita on tapettu sopivilla antibioottisilla lääkkeillä. Toisaalta mikäli tämä prosenttiluku on noin 30 tai suurempi, tämä tarkoittanee että vuotokohta on ilmeisesti korkeammalla ruuansulatuskanavassa. Tällöin on luonnossa esiintyvillä suolistobakteereilla ollut pitempi aika muuttaa hemoglobiinia porfyriiniksi.

Vaikkakin esillä olevan keksinnön edullista suoritusmuotoa tarkoittava selitys on ollut erittäin spesifinen, ovat monet muutokset mahdollisia keksinnön puitteissa. Niinpä esitetyt patenttivaatimukset määräävät keksinnön suojapii-rin eikä niinkään edullista suoritusmuotoa tarkoittava selitys .

Claims (8)

1. Menetelmä hemoglobiinipitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisessa aineessa, kuten ulosteessa, virtsassa tai mahanesteessä, joka menetelmä käsittää testinäytteen valmistamisen mainitusta biologisesta aineesta, hemoglobiinin muuttamisen mainitussa testinäytteessä porfyriiniksi, ja hemoglobiinista peräisin olevan porfyriinin pitoisuuden määrittämisen mainitussa testinäytteessä, tunnettu siitä, että ennen porfyriinin pitoisuuden määrittämistä hemoglobiinista peräisin olevat porfy-riinit erotetaan uuttamalla testinäytteessä olevista erilaisista epäpuhtauksista, joka uuttomenetelmä käsittää seuraavat kolme uuttovaihetta: 1. lisätään orgaanista liuotinta, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit raudasta, 2. testinäyte yhdistetään uuttoreagenssin kanssa, joka käsittää liukoisen suolan sisältävän alkalisen liuottimen, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit luonnossa esiintyvistä porfyriineistä ja 3. lisätään vahvaa happoa, joka on tehokas erottamaan hemoglobiinista peräisin olevat porfyriinit klorofyllistä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vaihe 2) käsittää butyylialkoholin yhdistämisen testinäytteen kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että alkalinen liuotin sisältää kaliumhydrok-sidia, ja liukoinen suola sisältää kaliumasetaattia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vaiheessa 1) käytetty orgaaninen liuotin ie 764 34 on etyyliasetaatti, butyylialkoholi, amyylialkoholi, kloroformi, perkloorietyleeni, hiilitetrakloridi, sykloheksa-noni, tributyylifosfaatti, tolueeni, etikkahappo tai ety- leenidikloridi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vaiheessa 3) käytetty vahva happo on fos-forihapon ja etikkahapon seos.

6. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu testinäyte on ensimmäinen testinäyte, ja että mainittu uuttomenetelmä suoritetaan toiselle testinäytteelle, jossa hemoglobiinia ei ole keinotekoisesti muutettu porfyriiniksi, ja määritetään hemoglobiinista peräisin olevan porfyriinin määrä mainitussa toisessa testinäytteessä, jossa se on luonnollisesti muuttunut, ja että verrataan sitä mainitussa ensimmäisessä testinäytteessä olevan hemoglobiinista peräisin olevan porfyriinin määrään. i

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että yhdistetään mainittu toinen testinäyte ei-pelkistävän hapon kanssa, joka ei muuta oleellisia määriä hemoglobiinia porfyriiniksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu sokkoreagenssi on sitruuna-happo . Patentkrav;