NO803479L - Fremgangsmaate til paavisning og kvantitativ bestemmelse av blod - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til påvisning og kvantitativ bestemmelse av blod under anven--. deise av en peroksydaseindikator!i . I Påvisning av blod i avførijngsprøver kan føre til tidlig;

diagnose av tykktarmskreft. Endetarmskreft påvist hos pasienter uten symptomer lokaliseres vanligvis uten at lymfekjertler er involve! rt. Dersom påvisning blirj J utsatt til | sjI tadiet med symptomer er lymfekjertlene involvert i ca. 40% av tilfellene.

De pasienter som nyter fordelene med tidlig diagnose har

30% bedre mulighet til å overleve sammenliknet med de pasienter som har en sen diagnose.

Hemoglobin, som er en peroksydase, kan påvises og bestemmes kvantitativt ved hjelp av en peroksydaseindikator som inneholder et redusert eller avfarget fargestoff samt! hydrogen- ! 11 peroksyd. Peroksydaser katalyserer spaltingen av peroksyd til|. j • vann og oksygen. Det frigjorte akseptoroksygen oksyderer det j reduserte indikatorfargestoff, hvorved den oksyderte tilstands \ farge fremkalles. Der er et direkte forhold mellom fargeintenj-siteten som utvikles og peroksydspaltingen, som på sin side ' i er forbundet med mengden peroksydase som foreligger i en prøve. Ved måling av fargeintensiteten, f.eks. ved måling av absorpsjon ved valgfri bølgelengde, er kvantitativ bestemmelse av en per-;

oksydase I mulig. j I !

Blod kan således bestemmes ved å anvende kolometriske tester basert på reaksjonen mellom hemoglobin bg en peroksydaseindikator, såsom hydrogenperoksyd, og enten o-tolidin eller guajakgummi. Andre reagenser er blitt beskrevet, men o-tolidih-f og guajakgummitestene er kommersielt tilgjengelige og har vært: benyttet ved påvisning av blod. Blodtester i vanlig bruk omfatter preparater av guajakgummi, fortynnete alkoholiske løs-ninger av guajak, o-tolidintabletter samt en guajakslide. På-' i l i Mi

liteligheten og følsomheten for disse tester kan bestemmes ved1 å måle blod uavhi engig under anvendelse av 51 Cr-meri kede røde ! i: !j |', 1j blodceller.

Det er reist alvorlig tvil om pålitéligheten for noen j av disse peroksydaseindikatortester på grunn- av den store , '!

' I 1 j hyppighet av falske positive resultater. Slike villedende

i resultater fører til unødvendig utførelse av, ytterligere, kost-bare og ubehagelige diagnosetester..

Falske positive.resultater kan skyldes nærværet av andre peroksydaser enn hemoglobin i avføring, som kan frembringe j j positive reaksjoner. Plantperoksydaser, klorofyll, og dyre-hemoglobin og -myoglobin kan overleve fordøyelse og frembringe 1 en positiv reaksjon. Tarmbakterier kan også danne peroksydaser. Andre falske positive resultater kan opptre på grunn av for--jdøyelsen av visse matvarer, f. eks. bananer, rødt kjøtt samt t

Falske positive resultater! unngås med i noen av de til- | . 1 gjengelige, anvendte peroksydaseindikatortester på bekostning!

av følsomhet. Nedsatt følsomhet ;overfor skjullt blod resulterer selv om de er effektive når det jgjelder å nedsette antallet jjfalske; positive resultater, i falske negative1 resultater som.-, forsinker diagnosen. Falske negJtive resultater kan også skyl-j ; , • • i I ' , . 1 , ij ti des [I nærvære■ t av viti amin C i avføring. Il ; ; i i 1 1 'i . 'i N : I >i

Feile resultater med kjente kolorimetriske peroksydase-tester kan også forårsakes av pigmentet i avføringen, som ,i i blander seg med fargen til peroksydaseindikatorfargestoffet. !, 1 , Dessuten kan reduksjonsmidler i avføringen forstyrre peroksy-j ;j . dåsens virkning. I ' ,

Kommersielt tilgjengelige peroksydaseindikatorpreparater for påvisning av blod er alle halvkvantitative, dvs. at de gir1 resultater som uttrykkes som 0, +, ++ etc. Kvantitativ bestem-ii nielse, såsom den som er tilgjengelig ved påvisning under anven-51 celler, mulig. 1 ' deise av Cr-merkede celler, er ikke mulig. Resultatenes halvkvantitative natur viste seg å være resultatet av virkningen j 1 av en inhibitor av hemoglobinaktivitet i avføring. Inhibitoren;<1>er effektiv i høye! fortynninger av avføring i vann, og dens i virkningi er er bare! fullstendig eliminert v' e' d ' en fort' ynning på ilj! i' 1:8. 000. Blod påvises bare når det foreligger i overskudd i j(j j forhold til inhibitorbehovet. Idet dette kan opptre på blodnivåer!

MM I

hvor prognose er dårlig, minsker disse inhibitorer følsomhet' bg , i

hindrer kvantitativ måling. ; ■ i!

Nærværet av en inhibitor av peroksydasereaksjon i urin I forstyrrer også påvisning og utelukker nøyaktig kvantitativ j j ij

i 1 'i ■ il' bestemmelse av myoglobin eller hemoglobin. Som for avføring angis avlesninger om nærværet av blod på en 0-++++-skala. j .

Inhibitorens i virkninger kan overvinnes ved anvendelse j av substrat, enten kromogen eller peroksyd. Idet|høye konsens trasjoner av peroksyd nedsetter hemoglobinaktivitet, kan det '■

tilsettes overskudd av j f argestof f. Selv om dette imuliggjør \ > påvisning av hemoglobin i urin eller avføring, ,gjør den varier-ende mengde inhibitor nøyaktig kvantitativ bestemmelse umulig.|

Det foreligger derfor et behov for fremgangsmåter til j påvisning av blod, som er følsomme nok til å påvise små mengder hemoglobin pålitelig mens de skjelner fra andre peroksydaser. < Dessuten foreligger det et behov for en nøyaktig kolorimetrisk<:>test for kvantitativ påvisning av blod, slik at det ved å følge serier av avføringsprøver er mulig å bestemme enten en blødning forekommer tilfeldig eller øker i volum.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kjenne-tegnes ved følgende trekk: a) surgjøring av en væskeformet testprøve med en organisk syre, b) fraskilling av den væskeformete del. av, testprøven fra; den j faste del, i ' i c) føring av den surgjorte, væskeformete del■gjennom én i elektronegativt ladet membran, \ j; d) vasking av membranens overflate for fjerning av tilbakeblevne testprøvevæsker, i ' ' j ■ ; e) behandling av den vaskete overflate med éh peroksydaseindikatorsubstans som er egnet til å påvise hembglobin, samt |' f) iakttageI lse av fargen av den vaskete mémb, ranoverflate. j i!,

I tillegg ui tføres kvantitativ bestemmelse av blod i en j i !-;

prøve ved sammenlikning av membranens farge som fremkommer ved' i behandling av prøven ifølge de ovennevnte trinn a)-f) med en standardisert fargeguide.<1>i

Oppfinnelsen har særlig anvendelse for påvisning og kvantitativ bestemmelse av blod i avføring. Avføringsprøver kan 1 ; fremstilles for behandling ved fremgangsmåten ved! å suspendere j I avføring i en vandig bufferløsning og behandle den resulterende suspensjon med lysozym. \

Ved utøvelse av oppfinnelsen påvises blod' ved hjelp av én ,! peroksydaseindikatorsubstans som frembringer en fargereaksjon !i I i nærvær av pero: kI sydaser, såsom hemoglobin. V1 ed å sørge for 1 1 '{ ! !' eliminering av virkningene av substanser som, forstyrrer hemo- ! globins peroksydasevirkning er det ifølge oppfinnelsen frembrakt' en mege|t følsom, pålitelig kolorimetrisk perpksydaseindikator- i test, som er selektiv overfor hemoglobin i blod. Ifølge oppfinnelsen er det også muliggjort kvantitativ bestemmelse av hemoglobinet i en prøve. | i i

I vid forstand omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fråskillelse av hemoglobinet i én prøve fra de, substanser som .|■[ < konkurrerer med eller forstyrrer, hemoglobinets'peroksydase-aktivitet. Det fraskilte hemoglobin bringes deretter i kontakt.;

■ 1 i ' ■ i : ; 1, med en peroksydaseindikatorsubstans hvis fargeforandring nøyaktig angir nærværet av hemoglobin. Dessuten gjenspeiler intensiteten av fargeforandringen den relative mengde av hemoglobinet i prøven. ,

Særlig vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte til påvisning av blod i en prøve fra mennesker. Modning av fargebæreren i i

! ■ ' 1<:><<>'i ; indikatorsubstansen viser nærværet av hemoglobin.

Graden av fafgebærermodning er et mål på mengden av hemp-f globin i prøven, som på sin side er direkte forbundet med mengden blod i prøven. Ved å sammenlikne intensiteten! av fargene som ij '

<:>i 'il<1>''il' dannes ved behandlingen av forskjellige prøver ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vurdering av de relative méngder av blod i; i prøvene således mulig. Aktuell kvantitativ b: estei mmelse av r j; blodet i en prøve kan oppnås ved å sammenlikne fargen som opp - ' står ved,behandlingen av testprøven med en standard fargeguide j

p i som er utviklet ved å underkaste prøver som inneholder kjente

i mengder hemoglobin! for påvisningsmetoden ifølge oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbar for påvisning I

i 'o''li og kvantitativ bestemmelse av blod i prøver fra mennesker, såsom , avføring og urin. ,

For formålet! med oppfinnelsen må hemoglobinet fra en prøve ., være løst i en forholdsvis klar vandig løsning pa behandlings.- , •\[tidspunktet. Når prøven som skal analyseres er avføring gir<1>i! suspendering av avføringen i en vandig løsning etterfulgt av<j>j' behandling med et enzym en vandig prøve som er egnet for behahd- jl ling ifølge oppfinnelsen. j 1 I1

En akseptabel suspensjon av avføring kan fremstilles ved i'

;å anvende en vandig buf f erløsning, såsom en vandig glykokolløs-i i ning. Avføringen kan suspenderes i løsningen ved enkel rysting

gav en løsusnspiengnesn joni . • eEt nhlvukekr et annpern øvmeråøte r sionm nteir l deeft feker ti1 (vd! ai nnåner t deen t hgojmeoli d-! re;'r,

|å fremstille en homogen suspensjon kan også , benyt,tes. Ca. 1 p::6-sentige avf øringssuspens joner foretrekkes f ori utførelsen av : i den foreliggende oppfinnelse. Slike suspensjoner! kan fremstilles ved å kombinere 10 g avføring me|d hver ml fortynningsmiddel. ! j ■

i Nærværet av visse stoffer,) såsom baktériéfragmenter, ;! ji j I forstyrrer den videre, bearbeidelse av avføringssuspensjonen

ved fremgangsmåten ifølge oppfinjnelsen. Nærmere bestemt danner lj , visse stoffer i avf øringssuspens'joner en uklar, oppåliggende . li

'I ■' j! i væske ved sentrifugering av suspensjonen og/eller tetter filtre t|;

i „ I ' I<1>' ,<;>'

og hindrer således,lettvint separering og konsentrering av : j 1 ! det oppløste hemoglobin. Fordøyelse av disse forstyrrende subj-!,! stanser ved hjelp av enzymer har vist seg å resultere i vandige'

prøver av avføring som lettvint kan behandles ifølge oppfin- j !| 1 nelsen. De forstyrrende substanser består i høy grad av poly-'I sakkarider, og det må således anvendes et enzym som er spesi- i fikt overfor polysakkarider. Lysozym er et særligj egnet enzym

for dette formål. Effektiv fordøyelse av forstyrrende substanser

il i i en 1 prosentig avføringssuspensjon kan oppnås ved å behandle1

I

suspensjonen med cå. 1 mg/:mL lysozym i 5-15 minutter ved ca. <pH , 8 og 371C. Hemoglobininnholdet i suspensjoner som'behandles j: j, på denne måte kan lettvint analyseres ved hjelp av fremgangs-1 jl" måten ifølge oppfinnelsen. I i!

Urinprøver behøver ikke å suspenderes og fordøyes før ^ analyse ifølge oppfinnelsen. Hemoglobinet er løst i urinen ; j> som selv er en egnet vandig løsning for analyse ifølge-oppfin- i; il nelsen. ' . , , |

For formålene med oppfinnelsen skal det forstås at hen- ;<:>I' visninger til testprøver betyr vandige løsninger som inneholder l,i prøvens hemoglobin og som har tilstrekkelig klarhet til å mulig-<<>'gjøre lettvint separering og konséntrering av hemoglobinet ved I I ;'

fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Slike prøver, kan omfatte<1>

■ i selve prøven eller kan være løsninger avledet fra prøven, såsom de ovenfor beskrevne enzymbehandlete avføringssuspensjoner. j ,

Ved utøvelsen av oppfinnelsen surgjøres testprøven for å øke adsorpsjon av hemoglobin på elektronegative membraner. Selv om uorganiske syrer i noen grad vil øke hemoglobinadsorpsjon,j er organiske syrer mye mer effektive surgjørere. I Eddiksyre og; I , 1 j' sitronsyre er begge egnete organiske syrer for dette formål, i : i i

Konsentrasjonen av syre i testprøven påvirker graden av i hemoglobinadsorpsjon. Testprøver som inneholder mellom 0,1 og ; 1

10% organisk syre oppviser betydelig hemoglobinadsorpsjon på ! elektronegative membraner. Optimale resultater oppnås med prøver1 som inneholder 1% organisk syre. For store mengder organisk syre bør unngås idet hemoglobinet påvirkes ugunstig.

Ifølge en foretrukket utførelsesmåte surgjøres test- I ' prøven hvoretter den væskeformete del av den surgjorte prøve, li klares ved separering fra den faste del ved anvendelse av væslte-faststoffsepareringsteknikk. Klarning kan imidlertid utføres j i før surgjøring. j ;:■■'!'}

Sentrifugering og filtrering er effektive separerings-

metoder for anvendelse ifølge!oppfinnelsen. Sentrifugering ved 3000 omdr./min i 5-15 minutter frembringer en tilstrekkelig I klaret testvæske. Fortrinnsvis utføres imidlertid klaring vedj hjelp av elektropositive filtre. 0,65-2,0 pm elektropositive j

filtre gir resultater som er sammenliknbare med sentrifugering og forenkler og forkorter klaringsprosessen. I

Etter klaring konsentreres hemoglobinet i testprøven på

en membranoverflate. Dette utføres ved å føre den klarete væske gjennom et filter som er i stand til å adsorbere hemoglobinet!.:, Elektronegative filtre med en porøsitet på ca. 1 um har vist 'seg å være effektive hemoglobinadsorpsjonsmidler ved utøvelsen av. oppfinnelsen. Særlig 1 um elektronegative Amerace-, Millipore-, Filterite- og Cox-filtre anvendes.

Selv om mange elektronegative filteroverflater er i stand til å adsorbere hemoglobin, inneholder et antall filtre natur-

lig forekommende, ikke-biologiske peroksydaser som vil reagere med peroksydaseindikatorsystemet og gi falske positive resul-| tater. For, formålene med den foreliggende oppfinnelse skal det med hemoglobinadsorpsjonsmidler forstås slike adsorpsjonsmidlsr som inneholder små mengder av ikke-biologiske peroksydaser og som gir reproduserbare negative resultater i 'tester med hemd-globinfrieI i t' estpI røver når de behandles iføi lge op' p! finnelsen. ,111 ; 1 um ■! Améracefilteret er et særlig egnet hemoglobinadsorpsjonsmiddel1. 1 i

i 11 i i M De1 andre ovennevnte filtre inneholder litt høyere konsentrasjoner av ikke-biologiske peroksydaser enn Ameracefilteret. Men disse r ! I ■ l andre filtre gir1 likevel tilfredsstillende resultater ved utøvelse

I I

av den foreliggende oppfinnelse på grunn av at med hemoglobin-frie væsketestprøver er bakgrunnsfargenivåene så lave at de 1 leses .som negative når det gjelder nærvær|av blod.i 1 .

Etter avsetning av hemoglobinet på membranen!, vaskes memrburtaf! ønoreves rvfal, natleign vifos i 1 r vefd jerå nilneg de av små remsteengr .deav r vti ! aensdtviæg skløers1 n. iVng askav ingen' 1 ! !1 j 1 ■ !

organisk syre gjeI nnom filteret én eller fli ere gani ger. En 1 pror <' sentig eddiksyreløsning er et akseptabelt vaskemiddel. j

Nærværet av hemoglobin på den vaskete membran kan deretter, påvises ved å behandle membranoverflaten med en peroksydase- 1<:>indikatorsubstans som er i stand til å påvise hemoglobin. Etter 2-r5 minutter iakttas filterets farge. Dersom det opptrer fargebærermodning, er nærværet av hemoglobin indikert. Fravær av farge indikerer fravær av hemoglobin. Peroksydaseindikatorsubstanser inneholder vanligvis avfarget eller redusert fargestoff samt hydrogenperoksyd. For formålene ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder en fore- , trukket substans o-tolidin og hydrogenperoksyd. Fortrinnsvis er like volumer av 2 prosentig hydrogenperoksyd og 0,5 prosentig o-tolidin (dvs. 5 mg/ml o-tolidin) kombinert til dannelse av indikatorsubstansen. |

Graden av fargebærermodning er direkte forbundet med hemd-globinmengden på filteret. Intensiteten av den , utjviklete farge er således et mål på hemoglobinmengden i testprøvén. Den nøyak-| 1 tigé hémoglobinmengde kan bestemmes ved sammenlikning med en i ' ■;

i 1 t standardisert fargeguide eller^diagram.<1>

Et standardisi ert diagram fi or anvendelse ved kvantitativ<.>i

! 1

bestemmelse av hemoglobinmengdene i testprøver kan fremstilles ved å underkaste en serie prøver som inneholder kjente mengder hemoglobin for hemoglobinpåvisningsmetoden ifølge oppfinnelsen. Ved å teste en serie prøver som inneholder trinnvis økende mengde av hemoglobin under identiske betingelser og prege de , j resulterende farger på et diagram, kan det fremstilles en gradert fargeguide for anvendelse som en standard ved kvantitativ bestemmelse av hemoglobin i testprøvene. For å gjøre nøyaktigheten ved den kvan■ titative be, stemmelse av hemoglobin ved frei mgangsmåteni I ■ ifølge oppfinnelsen størst mulig, bør reagensene<p>g betingelsene som anvendes for åi analyse testprøven tilsvare de' som anvendes 1 ved fremlstilling av i den graderte standard så mye som mulig. j ! ,

I . i I I En foretrukket mate for analyse av hemoglobin i avføring! 1 : ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter, følgende sekvens, av trinn: Avføringen tilberedes for analyse ved å tilsette 100 mg avføring til 10 ml bufferløsning. Bufferløsningen inneholder 100 mg lysozympulver, 375 mg glykokoll og 75 mg bikarbonat løst i tilstrekkelig destillert vann tilt å gi 100 ml løsning. Denne j bufferløsning har en pH på 8,0-8,5, inneholder 1 mg/ml lysozym i og er 0,05 M glykokoll.<;>Avføringen og bufferløsningen blandes grundig til dannelse av en homogen suspensjon. Den resulterende test1 prøve anbringes der1 etter ved 37 C i 15 minu1tter. Umiddelbart deretter tilsettes 1 ml 10 prosentig eddiksyre til røret: DerettKer lakrilnag reus tdføen ress uvrged joå rte ledave jf øterisntgpsrøsvuespn engs jejonnno. m en plast-|j enhet som muliggjør seriebehandling gjennom en klaringsanord-; I " 1 ning og et hemoglobinadsorpsjonsmiddel. Enheten omfatter et 25 ml 2 pm elektropositivtFinitefilter anbrakt i en plastholder som er, plassert på den øvre ende av en hul sylinder hvis nedre , ende eir i væsketett forbindelse med hemoglobinadsorpsjonsmidlet. 3 ml avføringtestprøve anbringes; i klaringsenhetens reservoar. Det'utøves sug, hvorved prøven trekkes gjennom klaringsanord-j, ningen og deretter;gjennom hemoglobinadsorpsjonsmidlet. Ifølgé en i mest foretrukket ' utførelsesform er adsorpsI jonsm1 idlet et ; ■ e! l1 ektronegativt ladet Amerace A-30 filter. 1 ! I |i , i!11 Behandling gjennom klaringsenheten og adsorpsjonsmidletj: h ' kan utføres ved å anvende et instrument som vil forsegle filteret mot den nedre ende av klaringssylinderenheten og som omfatterj en anordning for frembringelse av sug og trekking- av filtratet, inn i et avfallsreservoar. ,,. I ,

Etter at prøven er filtrert gjennom hemoglobinadsorpsjons-! midlet,jvaskes adsorpsjonsmidlet for fjerning av resterende av-; føringsvæsker ved å trekke 5 ml 1 prosentig eddiksyre gjennom , ; det. 1 ml indikatorsubstans tilsettes deretter til og, trekkes umiddelbart gjennom hemoglobinadsorpsjonsmidlet. Etter 2-5; minutter iakttas dien modnete farge'på filteroverflaten, og, der---som det er ønskelig med kvantitative resultater sammenliknes1 i! l ' ' ' i 1 ; i den med en standard fargeguide. Dersom fargeintensiteten på filteroverflaten av en<1>testprøve er større enn den høyeste verdi

som er vist på en fargeguide, kan testen gjentas med en ti ganger mer fortynnet testprøve. I dette tilfelle multipliseres den 1 j'

mengde som gjenspeiles av den tilsvarende farge på guiden med, ,,,, 10 for å gi mengden hemoglobin i testprøven. j ! En standard fargeguide ijcan fremstilles ved å underkaste!!' : j i 1 " 'ili' avføringsprøver som inneholder kjente, økende mengder hemoglobin'

<!><!>

for samme trinn som er angitt j ovenfor når det gjelder testprøjver. Graderingene av farger som er utviklet på denne måte kan benyttes for å frembringe en standard fargeguide for kvantitative ana-! !'

I : ; . !

lyser.Fargeguiden kanjom ønskelig monteres på jet testkort hvor j hemoglobinadsorpsjonsmidlet er innlagt. j '

Oppfinnelsen vil bli nærmere forklart ved hjelp av de ii li

i etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

I de nedenfor beskrevne kliniske tester ble følgende materialer og fremgangsmåter benyttet ved utøvelse av oppfin-

i nelsen: i

Lysozym- buffer: Lysozym, glykokoll samt bikarbonat ble : formalt i kulemølle, og en blanding av 100 mg lysozympulver, < \ 375 mg glykokoll og 75 mg bikarbonat ble innkapslet. En kapsejl ble tømt i en 100 ml beholder, og destillert vann ble tilsatt; for å danne 100 ml løsning. Dette fortynnete forråd inneholdt 1 mg/ml lysozym og 0,05 M glykokoll og hadde eri endelig pH på 8,0r8,5.. ; |<;>|<:>Avføringstestprøve: En miniatyrsk je i av IpTast fylt med j.j j , avføring Inneholdt ca. 100 mg avføring. Skjeen som inneholdt: avføringen ble anbrakt i et rør med skrukapsel,,og1 10 ml av : i den ovenfor beskI revne buf f erløsning ble in! nført1 , i røret, hv' o1 r' -; I<1>etter kapselen bjle anbrakt på dette og røret ble igrundig rystetttil dannelse av en homogen suspensjon av avføringen. Prøven ble' deretter oppbevart ved 37°C i 15 minutter, og umiddelbart deretter ble 1 ml 10 prosentig eddiksyre tilsatt til røret. Den surgjorte avføringssuspensjon ble deretter klaret slik som ; beskrevet nedenfor.

Klaring: Et 25 mm 2 um elektropositivt Finitefilter ble anbrakt i en plastholder som var plassert på den øvre del av en hul sylinder, hvis nedre ende var i væsketett forbindelse med hemoglobinadsorpsjonsmidlet. 3 ml avføringstestprøve ble tilsatt til reservoaret i klaringsenheten. Det ble utøvet sug hvorved prøven ble trukket gjennom klaringsanordningen og der- . etter i gjennom et arj eal med 10 mm diameter av hemoglobinadsorpi -' sjonsmidlet.. ; ,

i : ' ■ 1 • \ ;

i Hemoglobinadsorpsjonsmidler: Elektronegativt ladete Amerace A-30 f_ iltre ble ben. yttet som hemoglobinadsorpsjonsmiddel. 1 , , i|

Vasking: Hemoglobinadsorpsjonsmidlet ble deretter vasket; to ganger med 5 ml! 1 prosentig eddiksyre for fjerning av res- |i |

' l. i terende avføringsvæsker ved å trekke syren gjennom adsorpsjonsmidlet.

Peroksydaseindikator: 1 volumdel av 5 mg/ml o-tolidin ' til 1 volumdel 2 prosentig hydrogenperoksyd ble benyttet som ; ; | indikatorsubstans.''

Peroksydaseprøving: 1 ml indikatorsubstans ble tilsatt j i<1>til og umiddelbart trukket gjennom det behandlete område med diameter på 10 mm av hemoglobinadsorpsjonsmidlet. Etter 2-5 minutter ble,den modnete farge på filteroverflaten iakttatt og sammenliknet med en fargeguide.

Standardisert fargeguide: Kjente mengder av hemoglobin ble tilsatt til normale, 1 prosentige avføringssuspensjoner i glyko-kollbuffer ved pH 8 inneholdende 1 mg/ml lysozym. Prøver ble i-holdt på 37°C i 15 minutter, og deretter ble det tilsatt til ! slutt 1% eddiksyre til hver prøve. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 3000 omdr./min i 15 minutter, og 3 ml av hver oppårliggende væske ble filtrert gjennom et areal med 10 mm diameter av ét Amerace A-30 hemoglobinadsorpsjonsmiddel.j Hvert adsorpsjbns-middel ble vasket to ganger med 5 ml (hver vasking) 1 prosentig eddiksyre for fjerning av resterende avføringssuspensjon frai j filteret, pen behandlete overflate med diameter på 10 mm av ,' i hvert adsorpsjonsmiddel ble behandlet med ■ 1 ml peroksydase- j j 'j indikator som umiddelbart ble trukket gjennom hémoglobinadsorp-|-<!>sjonsmidlet. Etter 2-5 minutter fargegivermodning ble graden'i < ' \ av farge på adsor! psjonsmiddeloverflaten fotografert. Et farge-i t : ''■j trykk ble f' remstilt av hvert resultat og preget:på ' et kort, I : ! i hvorved det ble fremstilt et gradert fargediagram. i

Resultater u Avføringsprøver fra ti frivillige som ikke

hadde noen mage-<1>eller tarmsykdomshistorie ble vurdert ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Vurdering, av avføringsprøvene med guajaktesten og hemoculttesten ble også I utført i overensstemmelse med produsentenes instruksjoner. Resultatene- av disse vurderinger var følgende: i

Avføring fra ti frivillige ble behandlet med en liten j mengde jern som finnes i vitamintillegg (10 mg/g avføring) og, testene ble gjentatt slik som beskrevet ovenfor. Resultatene var følgende:

i

Avføringen fra de ti frivillige ble behandlet med hemoglobin i en sluttmengde på 1 mg/g avføring. Testene ble gjentatt slik som beskrevet ovenfor og ga følgende|resultater: |<:>

Det skal beI merkes at de positive resultater med guajak- I 1 i og hemoculttestene ikke er større i disse prøver enn i prøvene som beskrevet ovenfor og som ikke inneholdt tilsatt hemoglobin, j Dobbeltprøver av hemoglobinbehandlet avføring som beskrevet ovenfor ble også behandlet med askorbinsyre (10 mg/g avføring), og testene ble gjentatt med følgende resultater:, i ■, i

Eksempel l 2 i j .. | ' ' ' 1 iI

i j ' ■! I. ' En pasient med blødende magesår avga en| prøve av avføring i i i ■ ■ ' '11 som ble1 behandlet slik som beskrevet i eksempel ,1. Idet det !''ifølge oppfinnelsen bare påvises friskt avgitt blod fra tykk- | j tarmen var resultatene av denne test negative. Guajaktesten '. var svakt positiv, og hemoculttesten var også si vakt positiv.-j j ! \1

Eksempel 3 I ' ' <■

i

En pasient som var akutt syk med et blødende sår i tykk<L>tarmen (basert på radiologisk diagnose) avga en avføringsprøvé

som ble behandlet slik som beskrevet i eksempel 1. Søylerense-studier av denne avføring krevde over 3 timers behandling og antydet at der var 2,5 mg blod pr. g avføring. En positiv verdi på 2,0 blod/g avføring ble oppnådd når påvisningsmetoden ifølge oppfinnelsen ble benyttet og resultatene av denne sammenliknet med en standard. Guajak- og hemoculttestene var negative. -\

Eksempel 4 i Fremgangsmåte til behandling av urinprøver: Det ble ikke benyttet noen lysozymbufferløsning. Ufortynnet urin ble behandlet med!eddiksyre for å gi en sluttkonsentrasjon på 1%. Den anvendte klaringsanordning var et 0,65 umFinitefilter for fjerning ay

1 ' ■ j I ' < I 1 i bakterier som hadde peroksydaser. 3 ml av|urinen som inneholdt ,1: eddiksyre ble anbrakt i reservoaret i klaringssylinderen. Ved

å anvende materialene og fremgangsmåten som beskrevet i eksemr-pel 1 ble prøven trukket gjennom klaringsanordningen og hemo-i: globinadsorpsjonsmidlet, og adsorpsjonsmidlet ble behandlet med eddiksyrevaskingl og indikator. 1 ! : i

Urinprøver fra ti frivillige som tilsynelatende var normale ble testet angående nærvær av peroksydase ifølge [ den ovenfor beskrevne fremgan; gsmåte. Alle resultater var i negative. ii

Eksempel 5 !

Seks pasienter ble vurdert for bestemmelse av om de utskilte peroksydaser (hemoglobin eller myoglobin) i deres urin eller ikke. Testene ble utført slik som beskrevet i eksempel 4. Adsorpsjons-midlets farge ble sammenliknet med en standard. ,Resultatene var tilgjengelige for legen i løpet av to minutter etter at prøvene var mottatt. Disse' resultater og den endelige diagnose er angitt nedenfor:

Selv om de viste verdier ikke kan identifiseres som hemo-

i 1 ! globin; eller myoglobin antydet sorteringen umiddelbart at ytterligere! vurdering var nødvendig.

Eksempel 6

For å vurdere adsorpsjonen av hemoglobin på forskjellige!

filtre ved utøvelsé av den foreliggende oppfinnelse ble følgende

i 'i ' ' ■ tester utført:,

3 ml prøver av 0,0 5 M glykokoll behandlet med hemoglobin

for å oppnå ca. 0,500 absorpsjon ved 630 nm etter 1 minutt ble behandlet med den endelige konsentrasjon av syre som er angitt.! , PIrI øvene ble deretter ledet gjennom de angitte filt! re (-, = nega-j ! !1 tivt ladet filter og + = positivt ladet). Alle filtre hadde ;j ij j ;

porøsitet1 på ca. 1 um. Filtratene ble prøvet på uadsorbert j' j hemoglobin ved tilsetning av 1 ml av peroksydaseindikatoren som er beskrevet i eksempel 1 til 3 ml filtratprøver og etter 1 minutts måling av absorpsjonen ved 630 nm. Resultatene av 'l 1 ■ 1 1 disse tester er angitt i tabell 1. |:

Disse forsøk viser at hemoglobin tilsatt til glykokoll- j bufferløsninger adsorberes effektivt på elektronegative filteroverflater bare dersom bufferen er surg jort med organiske syrer.; I Effektiviteten av ;hemoglobinadsorps jon på f ilteroverf laten er, ' i |forbundet med ty, pen og konsentrai sjonen av den ■ an. vendte syre.1 ' ■ j ■• j-Eddiksyre og sitro! nsyre var mer ef: fektive su1 ' ri gi jørere enn uorgani'iske':syrer.; Overskudd av uorganiske eller organiske; syrer tilsatt. 1" til hemoglobinløsninger påvirket hemoglobinet skadelig. Resul1;- , I i I ■ j ,1 tåtene; med elektropositivt ladete filteroverflater indikerer i 1 i ; ' i ; • • : • . ineffe! ktiviteten for disse filté1 roverflater f; or a, dsorpsjo. n av hemoglobin. !! I 1 ( Eksempel 7 j i1 ' ' ' Det ble utført forsøk for å bestemme virkningen av enzymer j på det suspenderte materiale i avføringssuspensjoner. Et over-' ' skudd (10 mg/ml) av pronase, pankreatin, trypsin eller lysozym j ble tilsatt til representative avf øringssuspens joner. Etter 30 minutter ved 37 C og pH 8 ble prøvene sentrifugert ved 3000 i ! omdr./min (klinikk sentrifuge), og de oppåliggende væsker ble i vurdert angående klarhet målt ved 540 nm. Bare lysozym viste klar oppåliggende væske. i i 1 i<.>i ! i ,''!''! Eksempel 18 ; l; i i i . I ■<;><!>; Virkningene av lysozymbehandling på uklarheten hos væskef , delen : av ! avføringi ssuspens joner ble vurdert ved behandling å' v i , i j;' ' ■ , | 1 3 ml prover av 1 prosentig avføring i 0,05 M 'glykokoll ved'pH j ;j 8 og 37°C med de sluttkonsen tras joner av lysozym som er angitt; • !,j i for de angitte tidsrom. Prøver ble umiddelbart sentrifugert ,<:>J, | ved 3000 omdr./min i 5 minutter, og oppåliggende væsker ble [ t prøvet angående uklarhet ved måling av absorpsjon ved 540 nm. J Resultatene er angitt i tabell 2. ! !' !

I ;i ■! Eksempel 9 i , Den relative effektivitet av sentrifugering og forskjellige filtre for å atskille testprøvenes faste del og væske-iformete del ved utøvelsen av oppfinnelsen ble undersøkt. 4 ml;! hemoglobin ble tilsatt til 100 ml av en 1 prosentig avførings-!

I !.

psurøsvpe enusjjtoen n vheemd opgH lob8 ion g bilne naehnoveldnednt de som 1 mkog/nmtl rollyls. oAzylmle . Epn røvdeobr bbellte - .;

1 '• O ' i • i holdt pa 37. C i 15 minutter, og deretter ble 13 ml prøver ledet | i gj. ennom<1>en 25 mm ki laringsanordI ning eller sentrifugert ved : i ■ i ! 1 3000 omdr./min som antydet i tabell 3. Oppåflyténde væsker , I

fra sentrifugeringen eller de klarete filtrater ible. deretter i j| le. det gjennom et hemogl■ obinadsorbsjonsmiddel, hvoretter ads, oi rp- j:, iP.

sjonsmidlet ble vasket; med eddiksyre og behandlet med 1 ml i i;

indikator slik som beskrevet i eksempel 1. Antall mg hemoglobin j! pr. g avføring i kontrollen og testprøvene ble deretter bestemt ;| ved sammenlikning av fargen som var impregnert i filteroverflaten med fargeguiden, noe som uttrykte resultatene som mg hemoglobin

pr. g avføring.

Dobbeltprøver ble testet bare på uklarhet etter klaring ved å måle prosent transmisjon ved 540 nm. Resultatene av disse tester er angitt i tabell 3.

Resultatene av disse forsøk antyder at 'anvendelsen av

1 eller 2 pm Finite-filtre er å foretrekke. Ved å anvende disse kan en prosess på 5 sek. erstatte en mer omstendelig sentri- |! i fugeringsprosess som kan kreve opptil 15 minutter.

De falske positive resultater fra anvendelsen av en

5 um klaringsanordning for kontrollprøven representerer en naturlig forekommende ikke-hemoglobinperoksydase, såsom en vegetabilsk eller bakteriell peroksydase. Slike falske positive resultater kan unngås ved anvendelse av klaringsanordninger på mindre enn 5 um ved utøvelsen av oppfinnelsen. I

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til påvisning av blod i prøver fra mennesker, karakterisert ved følgende trekk: j a) surgjøring av en væskeformet testprøve med en organisk i1 i I syre, i 1 1 I' I b) fraskilling av den væskeformete del av testprøven fi1 rai i den faste del, | h M c) føring av den surg jorte, væskeformete del, gjennom én <1> ' elektronegativt ladet membran som er i stand til å adsorbere1 i jj i ,, > ' !i , 'i ; I hemoglobin1, . ! .; d) vasking av membranens overflate for fjerning av tilb' akéi| -i. blevne testprøvevæsker, ! ■ ; 1 l j"| e) behandling av den vaskete overflate med en peroksydase-\ indikatorsubstans som er egnet til å påvise hemoglobin, samt I; f) iakttagelse' av fargen av den vaskete membranoverflate. 1

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav l,i 1 k a r a- k t e r ii i I |-|1 <1> sert ved' at testprø ven omfatter urin. : • I !

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav l,; i j ka' ra.' k' . te' r i! ' i - 1 i t'1 sert vedj at prøven omfatter avføring. j I ' I '#

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakteri- ' ' 1 I sert vedj at testprøven omfatter en 'avføringssuspensjon klaret ved hjelp av et enzym som er i stand til å fordøye polysakkarider. I I i 5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakteri-! sert ved at testprøven av avføringen er en 1 prosentig suspensjon av avføring i vandig glykokollbufferløsning, og at suspensjonen er behandlet med lysozym for klaring av suspensjonen.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at behandlingen med lysozym utføres ved ca. pH 8 og 37°C i 5-15 minutter.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at det anvendes ca. 1 rag lysozym pr. ml sus>-pensjoh. , 'i <;> =j| i-5

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakteri-; sert ved åt den organiske syre tilsettes til prøven [ for å frembringe en sluttkonsentrasjon av syre på ca. 1%. i 9l Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den organiske syre er sitronsyre. , 1 10. F-remgangsmåte i samsvar med krav 1, karakteri |-sert ved at den organiske syre er eddiksyre. 1

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, k a r a k t e r; i, -; sert, ved at testprøven deles i en væskeformet del og' en fast del ved sentrifugering av den surgjorte prøve og> i' \\ ■ dekantering av den| resulterende oppåliggende væske. j <1> 12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,! k a r a k t e r ij ,-' sert v e d ^ at testprøven deles i en væskeformet del og j i en fast del ved å lede den surgjorte prøve gjennom en elektropositiv klaringsanordning som har en porøsitet på fra 0,6 5 til 2,0 p..' I1

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakteri-; s e' r t ved at den elektronegativt ladete membran har en porøsitet på ca. 1 um.

<1><!>

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, kair.akteri-s e r t ved at membranen vaskes med 1 prosentig eddiksyre. ! , i

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, klarakteri- | sert ved at peroksydaseindikatorsubstansen inneholder t o-tolidin og hydrogenperoksyd. ! ' ! i i i 16. j Fremgangsmåte i samsvar med krav 15 , : ■ k a r a k t e r ij, - 1 i i ■ sert ved at substansen inneholder 1 volumdel 2 prosentig hydrogenperoksyd for hver volumdel vandig løsning av 0,5 | prosentig o-tolidih. <1> s17! iI e . r. Ft remvganegd små m te at i bsloamdesvt ar i mpreød vken rav bes1t, emmkes akrvi Iaanktittaetivr t i ■ ,- H ■ ;! mveed d esn ammfaenrgleikgnuiindg e uav tvfikalreget n vesod m å iaukndtetraks apstå e mpemrøbvreanr ovsoem rfilnanteen - j : ' j <!> holder kjente mengder hemoglobin for fremgangsmåten ifølge ; <!> ' et a <y> kravene 1-16. ' | i ' :1

18. <1> Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, til påvisning avjblod :. i avføring, karakterisert ve;d at det dannes ' ;' en væskeformet testprøve ved å behandle en 1 prosentig suspehsjoni av avføring i glykokollbuf f er med ca. 1 mg lysozym pr. ml sus'- j| pensjon ved ca. pH 8 og 37 C i 5-15 minutter, og at trinnene a)- f) utføres som følger: || a) surgjøring av testprøven med lysozymbehandlingen av , > ■ l . !■■ l| suspensjonen ved tilsetning av en organisk syre til suspensjonen jj for frembringelse av en sluttkonsentrasjon på ca. 1%, . | j' j b) deling av den surgjorte prøve i en væskeformet del ogien' fast del ved å lede testprøven gjennom en elektropositiv klarings anordning som har en porøsitet på 0,65-2,0 pm, . I 1 ; i |I j! c) føring av det klarete filtrat gjennom en elektronegativt ladet membran som er i stand til å adsorbere hemoglobin, '.\ d) vasking av membranens overflate med 1 prosentig eddik| n\ syre for fjerning av tilbakeblevne testprøvevæsker, <Å> ''. e) behandling av den vaskete overflate med en peroksydaseindikatorsubstans som inneholder o-tolidin og hydrogenperoksyd <1>» samt I 'j f) iakttagelse av fargen av den behandlete membranoverflåte.

19. Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nærværet av blod i avføring, karakterisert ved at en avføringsprøve underkastes fremgangsmåten ifølge krav 18 hvoretter fargen på den behandlete membranoverflate sammenliknes j med en standard som gjenspeiler fargene av kjente mengder av, hemoglobin som er underkastet fremgangsmåten ifølge krav 18.