KR100363832B1

KR100363832B1 - 혈액 탈색방법, 진단방법 및 진단키트

Info

Publication number: KR100363832B1
Application number: KR1020000005447A
Authority: KR
Inventors: 신형순; 신광순; 허태련; 정홍근
Original assignee: 주식회사 벤다이아 테크
Priority date: 1999-08-23
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2002-12-18
Also published as: WO2001014876A1; US20020028438A1; JP2003507741A; US20020028437A1; KR20010020628A; CN1321246A; AU3460800A

Abstract

본 발명은 혈액 탈색방법, 전혈을 이용하는 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로서, 본 발명은 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염, 아질산염 등의 산화제를 혈액에 첨가하는 단계를 포함하는 혈액 탈색방법, 상기 혈액 탈색방법 및 면역크로마토그래피 방법을 이용한 혈액내 항원 또는 항체 검출방법 그리고 진단키트에 관한 것이다.

Description

혈액 탈색방법, 진단방법 및 진단키트{Method for Bleaching the Blood, Diagnosis Method and Diagnosis Kit Using the Same}

본 발명은 혈액 탈색방법, 전혈을 이용하는 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산화제등을 이용한 혈액 탈색방법, 탈색된 전혈을 직접 면역크로마토그래피하여 간염바이러스등의 감염 여부를 진단하는 방법, 이러한 방법을 수행하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.

면역크로마토그래피 측정법 (Immunochromatographic assay: ICA)은 그 신속ㆍ간편함 때문에 신속시험 (Rapid test)이라고도 불리는데, 그 원리는 검체의 혈청 중에 들어 있는 항원이 금입자에 결합된 표식자 항체 (tracer antibody)와 반응한다음 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로스 (nitrocellulose)막 (이하, 'NC막'이라 한다)의 미세구멍 (micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체 (capture antibody)와 결합하여 발색띠를 형성함으로써 양성ㆍ음성을 육안으로 판별하는 것이다.

면역크로마토그래피 진단 방법은 절차가 간단하고 결과가 신속하게 나오기 때문에 호르몬 (Laitinen, M.P. 등,Acta. Chem. Scand.50, 141-147(1996)), 항원 (Sato, K.등,J. Clin. Microbiol.34, 1420-1423(1996)), 항체 (Vaughn, D.W.등,J. Clin. Microbiol.36, 234-238(1998)), 의약 성분 (Habib, M.P.등,Chest, 92, 129-134(1987)) 등의 검사에 현재 많이 이용되고 있다.

또한, 면역크로마토그래피 분석 방법을 이용하는 다수의 진단 키트가 상품화됨으로써 환자 스스로 가정에서 자신의 질병 상태를 용이하게 진단할 수 있게 되었다.

한편, 본 발명자는 상기 면역크로마토그래피 방법을 이용한 B형 간염 바이러스 표면 항원 (이하, 'HBsAg'라 한다)의 진단 키트를 개발하였다 (신형순 등,대한 바이러스 학회지, 27, No. 2, 137-141(1997)).

상기 진단 키트는 표면에 두 개의 눈에 보이지 않는 선이 그어져 있는 NC막 그리고 항체-금입자 컨쥬게이트가 건조 상태로 보관되어 있는 유리섬유 필터의 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있다. 상기 NC막의 눈에 보이지 않는 선에는 서로 다른 두 가지 항체가 즉, 아래쪽에는 항원에 대하여 특이성이 높은 모노클로날 항체가, 위쪽에는 항-마우스 항체가 고정되어 있다.

이렇게 구성되어 있는 키트의 웰에 검체를 가하면 유리섬유 필터에 건조 상태로 보관되어 있는 항체-금입자 컨쥬게이트가 다시 수화되고 검체 중의 항원과 결합하면서 동시에 모세관 현상에 의하여 NC막에 있는 미세구멍을 통하여 이동한다.

이어, 상기 보이지 않는 선에 고정되어 있는 항체가 항체-금입자 컨쥬게이트에 결합된 항원과 반응하면 항체-금입자 컨쥬게이트가 띠고 있는 붉은 색 때문에 눈에 보이는 선으로 나타나게 된다. 또한, 위쪽 선에 고정되어 있는 항-마우스 항체는 항원이 없더라도 항체-금입자 컨쥬게이트와 반응할 수 있으므로 매 검사마다 반드시 나타나야 하며 이것으로 검사가 적절하게 수행되었는 지 확인할 수 있다. 즉, 항원이 있으면 그 키트의 양성선에 고정된 항체와 반응하여 양성선과 대조선이 동시에 나타나고, 항원이 없으면 양성선은 나타나지 않고 대조선만 나타난다.

한편, 상기 진단 키트에 투입되는 검체로는 혈액에서 혈구 성분이 제거된 혈청이 이용되고있는데, 이는 혈액을 그대로 사용하면 적혈구에 의한 붉은 색으로 인해 시험 결과를 판독하는 데 시각적 장애를 초래하기 때문이다.

따라서, 현재는 채혈 후 혈액 응고 과정을 거친 다음 원심분리등의 방법으로 혈구를 제거하여 맑은 혈청만을 검체로서 진단에 사용하고 있다. 이러한 과정은 면역크로마토그래피 진단 키트를 사용하기 위하여 별도의 기구와 과정을 필요로 하므로 신속ㆍ간편하다는 면역크로마토그래피 측정법의 장점을 살릴 수 없는 문제점이 있다.

미국의 폴 주식회사 (Pall Corporation) 및 독일의 베링거 만하임(Boehringer Mannheim) 같은 회사들은 적혈구가 통과하지 못하는 필터를 키트에 부착시켜 혈구의 이동을 막아 혈장만 전개시키는 방법을 개발하여 신속시험 키트에 전혈을 사용할 수 있도록 하는 방법을 특허 받았다 (참조: WO 9603194; EP 586789). 그러나, 상기한 방법에 의하는 경우에는 혈액 응고에 의하여 NC막의 미세구멍이 막히거나 전개 후 혈액이 마르면서 염 농도가 높아짐에 따라 혈구가 파괴되어 빠져 나온 세포 내부물질 중의 붉은 색 성분에 의하여 NC막이 가리워 지는 문제가 야기된다.

본 발명자들은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 혈액 탈색방법을 개발하고 이를 종래의 면역크로마토그래피 진단 키트에 적용하는 경우에는 전혈로부터 신속ㆍ간편하게 혈액내 다양한 항원 또는 항체를 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈액 탈색방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혈액 탈색방법 및 면역크로마토그래피 방법을 이용한 혈액내 항원 또는 항체 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역크로마토그래피 진단 키트를 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명 혈액 탈색방법에 의한 탈색 양상을 나타낸 사진,

도 2는 본 발명 혈액 탈색방법에 의한 탈색 양상을 나타낸 흡광도 곡선.

본 발명은 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염, 아질산염 등의 산화제를 혈액에 첨가하는 단계를 포함하는 혈액 탈색방법을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 혈액 탈색방법 및 면역크로마토그래피 방법을 이용한 혈액내 항원 또는 항체 검출방법을 다른 특징으로 한다.

한편, 본 발명은 검출하고자 하는 항원에 대한 항체와 금입자로 구성된 금입자-항체 컨쥬게이트를 포함하는 유리섬유가 구비되어 있고 혈액 검체가 투입되는 검체용 웰; 그리고 검출하고자 하는 항원에 대한 항체가 결합되어 있는 양성선 및 항-마우스 항체가 결합되어 있는 대조선을 포함하는 NC막이 구비된 스트립을 포함하는 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서, 상기 키트는 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염 및 아질산염 등의 산화제를 포함하는 혈액 전처리 용액을 포함하는 혈액 전처리용 웰을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트를 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:

본 발명의 탈색방법에서 첨가되는 산화제는 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염, 아질산염 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 과산화수소, 차아염소산염 또는 과망간산염을 이용하는 것이고, 가장 바람직하게는 과산화수소를 이용하는 것이다.

본 발명에서 과산화수소가 산화제로서 가장 바람직한 이유는 과산화수소가 비교적 용이하게 적혈구의 세포막을 통과할 수 있고 적혈구내에는 과산화수소를 분해하는 효소인 카탈라제가 존재하여 과산화수소의 분해를 촉진시켜 주기 때문이다. 또한, 과산화수소는 탈색작용 이외에도 소독작용을 하기 때문에 혈액을 취급하는 도중 발생할 수 있는 부주의 감염으로부터 보호되고, 혈액 취급 단계가 대폭 생략되기 때문에 다른 방법에 비하여 상대적으로 안전하다.

혈액 검체에 상기 과산화수소를 첨가하면 과산화수소의 분해시 중간생성물인 히드록시 라디칼이 발생하여 적혈구내의 헤모글로빈 분자의 포르피린링을 파괴하여 철 이온을 헤모글로빈으로부터 분리시키므로 적혈구가 탈색된다.

상기 과산화수소의 양은 30 내지 0.01%가 바람직하고, 0.01% 미만인 경우에는 산화력이 약하여 혈구의 탈색 정도가 너무 미약하다는 문제점이 있고, 시판중인 과산화수소의 농도가 30%이기 때문에 이 농도를 초과할 수 없다.

한편, 산화제로서 과산화수소가 이용되는 경우에는 과산화수소가 분해될 때 생성되는 산소에 의한 거품을 억제하기 위하여 거품억제제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 거품억제제는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르 등과 같은 실리콘 계열류; 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 등과 같은 다가알코올류; Tween 80과 같은 계면활성제류 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 거품억제제로서 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물을 이용하는 것이다.

상기 거품억제제의 양은 0.001 내지 1%가 바람직하고, 0.001% 미만인 경우에는 거품억제력이 너무 약하고, 1%를 초과하는 경우에는 계면활성능력이 강하여 혈구를 용혈시키는 문제점이 있다.

또한, 과산화수소는 혈구내의 카탈라제에 의하여 물과 산소로 분해되므로 반응 초기에 과량으로 발생하는 거품의 원인인 산소의 발생을 억제하기 위하여 효소저해제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 효소저해제는 시안아미드, 아미노트리아졸, 아지드화 나트륨 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 효소 저해제의 양은 0.0001 내지 0.1%가 바람직하고, 0.0001% 미만인 경우에는 효과적으로 효소를 저해하지 못하므로 거품의 발생이 많고, 0.1%를 초과하는 경우에는 효소를 거의 완전하게 저해하기 때문에 히드록시 라디칼 발생이 지연되어 탈색반응도 대단히 천천히 일어난다.

상기한 바와 같이 거품억제제와 효소저해제를 첨가하여 거품을 효과적으로 억제하는 이유는 탈색반응 중에 발생하는 기포가 NC막의 미세구멍을 막아 검체의 이동을 방해하는 것을 억제하기 위해서이다.

본 발명 탈색방법에는 탈색반응을 촉진시키기 위하여 킬레이트제를 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하며, 킬레이트제는 혈액의 탈색시에 헤모글로빈으로부터 분리되는 철 이온과 신속하게 착화물을 형성하여, 본 발명 탈색반응을 촉진하는 역할을 한다.

또한, 상기 킬레이트제는 채혈시 발생되는 혈액 응고를 방지하는 항응고제의 역할도 수행한다.

본 발명에서 이용되는 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산, 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 혈액내 항원 또는 항체 검출방법은 종래의 면역크로마토그래피 방법에 의한 혈액 검체내 항원 또는 항체의 검출방법에 상기 혈액 검체를 과산화수소, 차아염소산염, 과망간산염, 중크롬산염, 아질산염 등의 산화제를 포함하는 혈액 탈색용 조성물로 전처리하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 혈액내 항원 또는 항체 검출방법의 바람직한 구현예에서, 상기 혈액 탈색용 조성물에 이용되는 산화제는 과산화수소가 바람직하다.

본 발명의 혈액내 항원 또는 항체 검출방법에 있어서, 상기 혈액 탈색용 조성물내 산화제로서 과산화수소를 이용하는 경우에는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르 등과 같은 실리콘 계열류; 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 등과 같은 다가알코올류; Tween 80과 같은 계면활성제류 등의 거품억제제; 및/또는 시안아미드, 아미노트리아졸, 아지드화 나트륨 등의 효소저해제를 추가적으로 첨가하여 혈액을 탈색시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 혈액내 항원 혹은 항체 검출방법에 있어서 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산, 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산 등의 킬레이트제를 추가적으로 첨가하여 혈액을 탈색시키는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 혈액내 항원 검출방법은 B형 간염 바이러스등의 전염성 물질이나 대장암, 간암 등과 같은 난치성 질환에 관련된 항원 검출등에 이용될 수 있고 항체 검출방법은 C형 간염 바이러스, HIV 등과 같은 혈중에서 낮은 농도로 존재하여 검출하기 곤란한 항원에 대한 항체의 검출등에 이용될 수 있으나, 다양한 항원 혹은 항체에 적용 가능하여 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서, 혈액 전처리용 웰에 포함된 혈액 탈색용 조성물에 이용되는 산화제는 가장 바람직하게는 과산화수소이다.

산화제로서 과산화수소를 이용하는 경우에는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르 등과 같은 실리콘 계열류; 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 등과 같은 다가알코올류; Tween 80과 같은 계면활성제류 등의 거품억제제; 및/또는 시안아미드, 아미노트리아졸, 아지드화 나트륨 등의 효소저해제를 혈액 전처리용 웰에 넣어서 사용될 혈액 탈색용 조성물에 추가하는 것이 바람직하다

한편, 거품억제제로서는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물을 이용하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물로서 실리콘 오일과 그라피트의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명의 진단 키트에 있어서 혈액 전처리용 웰에는 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산, 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산 등의 킬레이트제를 추가하는 것이 바람직하다.

상기 혈액 전처리용 웰은 상기 검체용 웰 및 상기 NC막이 구비된 스트립에 대하여 분리되거나 결합되어 설치될 수 있다.

또한, 본 발명 진단 키트는 사용자의 편의를 고려하여 혈액 검체를 취급할 피펫팅 수단을 추가적으로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명 진단 키트에 의한 항체의 검출은 상기한 구성의 단순한 변형에 의해 이루어진다. 즉, 검출하고자 하는 항체에 대한 항원을 금입자에 결합시키고, 양성선에도 검출하고자 하는 항체에 대한 항원을 결합시키는 것을 제외하고는 상기 진단 키트의 구성과 동일한 구성 및 작용을 갖는다.

본 발명의 진단 키트는 B형 간염 바이러스 항원 등의 검출이나 C형 간염 바이러스 및 HIV 등의 항체 검출에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

종래의 면역크로마토그래피 분석 키트는 혈액을 키트에 적용하기 이전에 혈액을 응고시키고 원심분리하여야 하는 불편함이 있으나, 본 발명의 진단 키트는 전혈 자체를 이용하므로 이러한 불편함이 제거되며, 개인이 스스로 진단할 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

산화제의 선택

본 발명의 혈액 탈색방법에서 이용되는 산화제의 작용을 확인하기 위하여 다음과 같이 실시하였다:

3% H₂O₂, 0.01 M NaOCl 또는 0.01 M KMnO₄가 포함된 PBS 190 ㎕에 혈액 10 ㎕를 첨가한 다음, 1분 동안 실온에서 항온처리하고, 각각의 혼합물에서 혈액이 탈색되는 양상을 관찰하였다.

H₂O₂로 처리된 혈액은 교반 없이도 신속하게 흰색으로 탈색되었으나, 0.01 M NaOCl, 0.01 M KMnO₄로처리된 혈액은 교반을 한 후에 서서히 갈색으로 변화되었다. 따라서, 본 발명에서 가장 바람직한 탈색제는 H₂O₂임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 혈구내에 H₂O₂를 분해하는 효소인 카탈라제는 존재하지만 NaOCl 또는 KMnO₄를 분해하는 효소는 없기 때문이다.

산화제의 양

H₂O₂의 농도에 따른 혈액 탈색 효과를 확인하기 위하여, 3% H₂O₂가 포함된PBS 용액을 연속적으로 2배씩 희석하여 1.500, 0.75, 0.375, 0.188, 0.094, 0.047, 0.023, 0.01 및 0.005% H₂O₂용액을 준비하였다. 이어, 준비된 각각의 H₂O₂용액 190 ㎕를 혈액 10 ㎕에 첨가한 다음, 1분 동안 실온에서 항온처리하고, 각각의 혼합물에서 혈액이 탈색되는 양상을 관찰하였으며, 관찰 결과는 첨부한 도 1과 같다. 도 1에서 (a)는 대조군으로서 H₂O₂를 첨가하지 않은 시료이고, (b)는 3% H₂O₂, (c)는 1.500% H₂O₂, (d)는 0.75% H₂O₂, (e)는 0.375% H₂O₂, (f)는 0.188% H₂O₂, (g)는 0.094% H₂O₂, (h)는 0.047% H₂O₂, (i)는 0.023% H₂O₂, (j)는 0.01% H₂O₂및 (k)는 0.005% H₂O₂를 첨가한 시료이다.

그 실험 결과 0.01% 미만인 경우에는 산화력이 약하여 혈구의 탈색 정도가 미약하고 그 이상의 농도에서는 효과적으로 탈색되었으므로 바람직한 H₂O₂의 농도는 30 내지 0.01%임을 확인할 수 있었다.

거품억제제의 선택 및 농도

본 발명에서 산화제로서 과산화수소가 이용되는 경우에는 과산화수소가 분해되면서 생성되는 산소에 의한 거품을 억제하기 위하여 바람직한 거품억제제를 다음과 같이 선택하였다:

1.5% H₂O₂가 포함된 PBS 용액 180 ㎕에 5% 'Sag 471' (실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물; OSi Specialties 사, US), 이소프로필알코올 또는 폴리프로필렌 글리콜 10 ㎕를 첨가한 다음, 각각의 용액에 10 ㎕의 혈액을 첨가하여, 거품이 억제되는 정도를 관찰하였다. 실험 결과 Sag 471이 거품억제제로서 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

한편, 거품억제제의 적합한 양을 결정하기 위하여 1.5% H₂O₂,Sag 471 0.2500%, 0.125%, 0.0625%, 0.0313%, 0.0156%, 0.0078%, 0.0039%, 0.0020% 및 0.0010%가 포함된 PBS 용액 각각을 준비하였다. 상기 용액 190 ㎕에 혈액 10 ㎕를 첨가한 다음 거품이 억제되는 양상을 관찰하였으며, 그 결과 0.001 내지 1% Sag 471의 양이 적합함을 알 수 있었다.

효소저해제의 농도

본 발명 혈액의 탈색방법에서 산화제로서 과산화수소가 이용되는 경우, 초기 단계에서 격렬하게 발생하는 거품의 원인인 카탈라제의 활성을 효과적으로 억제하기 위하여, 효소저해제인 NaN₃의 적합한 농도를 다음과 같이 확인하였다:

0.05% NaN₃및 1.5% H₂O₂를 포함하는 PBS를 1.5% H₂O₂를 포함하는 PBS로 2배씩 연속적으로 희석하여 0.025%, 0.0125%, 0.006%, 0.003%, 0.0016%, 0.0008%, 0.0004% 및 0.0002% NaN₃를 포함하는 용액을 준비하였다. 이어, 상기 각각의 용액 190 ㎕에 혈액 10 ㎕를 첨가하여 탈색 및 거품 억제되는 양상을 관찰하였으며, 그 결과 0.0001 내지 0.1%의 NaN₃가 적합함을 알 수 있었다.

항응고제의 효과

본 발명에서 이용되는 혈액은 채혈시 혈액의 응고를 막기 위하여 항응고제를 첨가하는데 가장 널리 사용되고 있는 헤파린, 구연산염 또는 EDTA등으로 실험결과에 미치는 항응고제의 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

채혈 즉시 혈액 1 ㎖에 0.1% 헤파린, 1M 구연산염 또는 1M EDTA 10 ㎕을 각각 첨가하여 응고를 막고 0.003% NaN₃, 0.016% Sag471 및 1.5% H₂O₂를 포함하는 PBS 190 ㎕에 항응고제가 포함된 각각의 혈액 10 ㎕를 첨가하여 탈색 및 거품 억제되는 양상을 관찰하였으며, 그 결과 EDTA가 가장 적합함을 알 수 있었다.

탈색 반응온도

본 발명의 혈액 탈색방법에 대한 온도의 효과를 확인하기 위하여 전처리용액 (1.5% H₂O₂,0.016% Sag471, 0.003% NaN₃및 5mM EDTA를 포함하는 PBS) 190 ㎕에 혈액 10 ㎕를 첨가한 다음, 각각 8℃, 실온 및 37℃로 유지하여 탈색되는 양상을 관찰하였다.

그 결과 8℃에서는 탈색이 거의 일어나지 않았고 실온 및 37℃에서는 신속하게 탈색되었으므로 실온에서도 효과적으로 탈색시킬 수 있음을 확인하였다.

혈액 검체의 양

본 발명의 혈액 탈색방법에서 사용되는 혈액 검체의 적합한 양을 결정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다:

1.5% H₂O₂,0.016% Sag471, 0.003% NaN₃및 5mM EDTA를 포함하는 PBS 190 ㎕에 혈액 시료 10, 20, 30 및 40 ㎕를 각각 첨가한 다음, 혈액이 탈색되는 양상을 관찰하였다.

실험결과 30 ㎕ 이하의 양에서는 완전하게 탈색되었지만 40 ㎕에서는 불완전하여 약간의 색깔이 남아 있지만 양성선을 가리지는 않았다. 따라서 혈액 시료의 양은 본 발명 혈액 전처리용액에 대하여 20 vol.% 이내가 적합함을 알 수 있었다. 그러나 각 성분을 증가시키면 혈액을 가하는 비율을 증가시킬 수 있다.

실시예 2

본 발명의 혈액 탈색방법에서 가장 바람직한 탈색 조성물인 1.5% H₂O₂, 0.016% Sag 471, 0.003% NaN₃및 5 mM EDTA를 포함하는 PBS 190 ㎕에 혈액 검체 10 ㎕를 첨가한 다음, 1분 동안 실온에서 항온처리하고, 탈색정도를 분광측정기 (TIDAS II, J&M사, 독일)로 확인하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 탈색 처리된 혈액 (----)은 탈색 처리되지 않은 혈액 (●--●)과 비교하여 520 ㎚와 600 ㎚ 사이의 흡광도가 현저하게 감소되었으나 300 ㎚와 320 ㎚ 사이의 흡광도는 다소 증가하였다.

실시예 3

HBsAg를 진단할 수 있는 면역크로마토그래피 진단 키트를 본 발명에 따라 다음과 같이 제작하였다:

진단 키트는 두 부분으로 이루어진 카세트형으로 제작하였는데 그 외에도 혈액 전처리용액이 들어 있는 에펜도르프 튜브와 혈액을 취급할 때 사용되는 스포이드로 구성하였다. 첫 번째의 스트립 부분에는 미세구멍의 크기가 0.8 ㎛인 NC막을 설치하고, 상기 NC막의 중간부에 HBsAg에 대한 폴리클로날 항체 (이하, '항-HBs'라 한다; Sigma사, 미국)가 고정화된 양성선을 만들고, 염소 항-마우스 IgG (Sigma사, 미국)가 고정화된 대조선을 상기 NC 막의 상단부에 만들었다.

두 번째의 검체용 웰의 밑에 장착되는 항-HBs-금입자 컨쥬게이트는 다음과 같이 제조하였다: 단세포군 항-HBs (Sigma사, 미국) 6 ㎍을 금입자 (BBI사, 영국) 현탁액 1 ㎖에 첨가한 다음, 10분 동안 교반하였다. 이어, 항-HBs-금입자 컨쥬게이트를 BSA로 10분 동안 블록킹하고, 11,000 g에서 1 시간 동안 4℃에서 원심분리하여 수집하였다. 그런 다음, 5% BSA 및 0.1% 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 최종적으로, 컨쥬게이트를 동일한 완충액으로 현탁하였으며, 현탁액의 OD₅₈₀은 5였다.

이렇게 하여 제조된 항-HBs-금입자 컨쥬게이트 현탁액으로 유리섬유 (Milipore사, 미국)를 적시고, 37℃에서 3 시간 동안 건조시켰다.

혈액 전처리용액이 들어 있는 에펜도르프 튜브에는 1.5% H₂O₂, 0.016% Sag471, 0.003% NaN₃및 5 mM EDTA를 포함하는 PBS용액 160 ㎕를 첨가하고, 진단 키트의 보관 및 운반시 누출되지 않도록 덮개를 설치하였다.

실시예 4

상기 실시예 3에서 제작한 본 발명의 진단 키트를 이용하여 HBsAg의 검출을 다음과 같이 실시하였다:

먼저, 검체 혈액 시료는 고대 의대 구로병원을 내원한 환자들로부터 채혈하여 ELISA 방법 (Enzygnost HBsAg, Boehringer Mannheim사, 독일)으로 B형 간염이 각각 음성과 양성으로 판정된 혈액을 이용하였다.

이어, 상기 혈액 시료 30 내지 40 ㎕를 혈액 전처리용액이 들어 있는 에펜도르프 튜브에 첨가한 다음, 1분 동안 탈색반응을 하였다. 그런 다음, 탈색이 완료된 혈액을 스포이드를 이용하여 검체용 웰에 첨가하고 전개 속도 및 양성선, 대조선의 발색 양상을 관찰하였다. 전개 후 2분이 경과하자 양성선이 나타나기 시작하여 시간이 경과함에 따라 색이 짙어 졌으며 3분이 경과하자 대조선이 나타났으나, 붉은 색 입자가 이동하는 것으로 보아 반응이 완결되지 않았음을 알 수 있었고, 이 현상은 약 5 분 경과 후까지 계속 되었다. 양성 반응은 전체적으로 2분 내에 시작되어 5분 정도면 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 혈액 탈색방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 혈액 탈색방법 및 면역크로마토그래피 방법을 이용한 혈액내 항원 또는 항체 검출방법을 제공한다. 한편, 본 발명은 면역크로마토그래피 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 항원 또는 항체 검출방법 및 진단 키트는 종래의 면역크로마토크래피 방법에 있어서 혈액 검체를 원심분리하거나 여과하는 번거로움이 제거되어 신속, 간편하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 혈청을 이용하는 많은 진단을 개인적으로 스스로 실시할 수 있도록 하며, 휴대와 실온보관이 가능함에 따라 검사가 필요한 현장이라면 어느 곳에서도 이용이 가능하다.

Claims

(a) 과산화수소, 차아염소산염 및 과망간산염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 산화제 0.15-30%; 및 (b) 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르, 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 및 Tween 80으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 거품억제제 0.001-1%를 포함하는 혈액 전처리용액을 혈액에 첨가하는 단계를 포함하는 혈액 탈색방법.
제 1 항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소임을 특징으로 하는 혈액 탈색방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물은 실리콘 오일과 그라피트의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물임을 특징으로 하는 혈액 탈색방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혈액 전처리용액은 시안아미드, 아미노트리아졸 및 아지드화 나트륨 으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소저해제 0.0001-0.1%를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 혈액 탈색방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 혈액 전처리용액은 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산 및 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 킬레이트제 1-20 mM를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 혈액 탈색방법.
면역크로마토그래피 방법에 의한 혈액 검체내 항원 또는 항체의 검출방법에 있어서, 상기 혈액 검체를 (a) 과산화수소, 차아염소산염 및 과망간산염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 산화제 0.15-30%; 및 (b) 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르, 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 및 Tween 80으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 거품억제제 0.001-1%를 포함하는 혈액 전처리용액으로 탈색하는 단계를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 혈액내 항원 또는 항체 검출방법.
제 8 항에 있어서, 상기 혈액 전처리용액은 산화제로서 0.15-30%의 과산화수소를 포함함을 특징으로 하는 혈액내 항원 또는 항체 검출방법.
제 9 항에 있어서, 상기 혈액 전처리용액은 시안아미드, 아미노트리아졸 및 아지드화 나트륨으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소저해제 0.0001-0.1%; 그리고 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산 및 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 킬레이트제 1-20 mM를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 혈액내 항원 또는 항체 검출방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액내 항원 또는 항체 검출방법은 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 또는 HIV의 검출에 이용됨을 특징으로 하는 혈액내 항원 또는 항체 검출방법.
검출하고자 하는 항원에 대한 항체와 금입자로 구성된 금입자-항체 컨쥬게이트를 포함하는 유리섬유가 구비되어 있고 혈액 검체가 투입되는 검체용 웰; 그리고 검출하고자 하는 항원에 대한 항체가 결합되어 있는 양성선 및 항-마우스 항체가 결합되어 있는 대조선을 포함하는 NC막이 구비된 스트립을 포함하는 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서,

상기 키트는 과산화수소, 차아염소산염 및 과망간산염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 산화제 0.15-30%를 포함하는 혈액 전처리용액을 포함하는 혈액 전처리용 웰을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소임을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 13 항에 있어서, 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물, 소수성 실리카, 실리콘 오일, 실리콘 폴리에테르, 이소프로필알코올, 폴리프로필렌 글리콜 및 Tween 80으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 거품억제제 0.001-1%가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 실리콘 오일과 소수성 입자의 혼합물은 실리콘 오일과 그라피트의 혼합물 또는 실리콘 오일과 메톡시기로 치환된 히드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물임을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 14 항에 있어서, 시안아미드, 아미노트리아졸 및 아지드화 나트륨 으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소저해제 0.0001-0.1%가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 16 항에 있어서, 에틸렌디아민테트라아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-테트라아세트산 및 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 킬레이트제 1-20 mM가 추가적으로 포함됨을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 혈액 전처리용 웰은 상기 검체용 웰 및 상기 NC막이 구비된 스트립에 대하여 분리되어 있거나 결합되어 설치됨을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 진단 키트는 피펫팅 수단을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.
제 12 항, 제 13항 또는 제 15항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단 키트는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 또는 HIV 감염의 진단에 이용됨을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 진단 키트.