CN109251886B - 一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及外泌体分离技术领域，提供一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒，包括蛋白A磁珠、磁珠清洗液、FABP4抗体、1号清洗液和2号清洗液。其中FABP4抗体能够与待测血清中的脂肪组织来源外泌体结合，蛋白A磁珠能够与外泌体‑FABP4抗体相互作用，形成蛋白A磁珠‑FABP4抗体‑外泌体复合物，1号清洗液能够去除血清中非脂肪外泌体成分，2号清洗液则能够将“蛋白A磁珠‑FABP4抗体‑外泌体”复合物中的外泌体、FABP4抗体以及蛋白A磁珠之间的相互作用解离，实现从血清中特异性分离脂肪组织来源的外泌体。

Description

一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及外泌体分离技术领域，具体涉及一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是由细胞分泌到细胞外的囊泡结构，通常为30～120nm大小的膜包裹结构。外泌体可特异性地包裹一些蛋白、脂质或者核酸等物质，具有生物活性，能够被受体细胞吸收，实现细胞间的物质运输和信息传递。
脂肪组织主要由大量群聚的脂肪细胞构成，还有小部分的巨噬细胞等，是人体内重要的能量储存器官。脂肪组织还是人体中重要的内分泌器官，调控胰岛素的敏感性、血压水平、内皮功能以及炎症反应等重要的病理过程。由于脂肪具有重要的功能，脂肪过多和过少都不利于健康。正常脂肪具备抗炎等功能，而疾病状态下，反而成为促炎成分。
判读脂肪健康状态，从而对个体进行饮食和生活方式的科学指导，是目前预防医学和大众健康面临的重要问题。脂肪外泌体能够反映脂肪的健康状态，如何从外周血中快速提取这部分外泌体，并进行准确判读成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明为了解决现有技术无法从外周血中快速分离得到脂肪组织来源的外泌体的问题，提供了一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒，利用该试剂盒能够相对特异性等获取脂肪组织来源的外泌体。
本发明还提供了上述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒在制备判断脂肪功能状态试剂盒中的应用，通过判断脂肪组织来源的外泌体处于抗炎作用还是促炎作用来判断个体的脂肪功能状态。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒，包括以下组分：蛋白A磁珠、磁珠清洗液、FABP4抗体、1号清洗液和2号清洗液；
所述磁珠清洗液为pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液；
所述1号清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述1号清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～2％；
所述2号清洗液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液。
优选的，所述1号清洗液中的PBS缓冲液浓度为0.005～0.02mol/L；
所述甘氨酸溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
本发明提供了一种前述技术方案所述的试剂盒提取脂肪组织来源外泌体的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白A磁珠、叠氮化钠与水混合，得到磁珠混浊液，将所述磁珠混浊液进行第一离心，得到第一沉淀，将所述第一沉淀与磁珠清洗液混合后进行第二离心，得到的第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠；
(2)将所述步骤(1)得到的清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合，4℃孵育后进行第三离心，得到血清上清液和第三沉淀；
(3)以所述步骤(2)得到的第三沉淀作为所述步骤(1)中的蛋白A磁珠，按照步骤(1)操作，得到清洗后的蛋白A磁珠；
(4)将所述步骤(2)得到的血清上清液与FABP4抗体混合，18～25℃孵育，得到血清混合液；
(5)将所述步骤(4)得到的血清混合液、步骤(3)得到清洗后的蛋白A磁珠和1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场进行固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物；
(6)将所述步骤(5)得到的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与2号清洗液混合，振荡20～40min，以外置磁场进行固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体。
优选的，所述步骤(1)磁珠混浊液中叠氮化钠的质量体积百分数为0.02～0.08％，所述磁珠混浊液中蛋白A磁珠的浓度为8～15mg/mL。
优选的，所述步骤(1)中的磁珠清洗液体积为磁珠混浊液体积的0.01～0.05％；所述磁珠清洗液为浓度为0.005～0.02mol/L的PBS缓冲液；
所述步骤(2)中的待测血清与步骤(1)磁珠混浊液的体积比为1000～2000:0.1～0.5。
优选的，所述步骤(4)待测血清的体积与FABP4抗体的质量比为1～2mL:1～5μg。
优选的，所述步骤(5)得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物后，还包括：将蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场进行固液分离，弃去上清；重复上述步骤2～3次。
本发明前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒在制备判断脂肪功能状态试剂盒中的应用。
优选的，所述脂肪功能状态为脂肪的炎症功能状态。
本发明还提供了一种用于判断脂肪功能状态的诊断试剂盒，包括前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒中的组分、血清对照品、中和液、炎症效应荧光报告载体和转染试剂Lipofectamine 2000；
所述血清对照品为血清白蛋白溶液；
所述中和液为pH值为10～12的Tris溶液；
所述炎症效应荧光报告载体以psiCheck2TM为骨架，在其多克隆位点Nhe1插入插入序列，所述插入序列为4×RelA结合位点序列。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
本发明提供了一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒，包括蛋白A磁珠、磁珠清洗液、FABP4抗体、1号清洗液和2号清洗液。其中，FABP4抗体能够与待测血清中的脂肪组织来源外泌体结合，蛋白A磁珠能够与外泌体-FABP4抗体结合形成“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物，1号清洗液能够去除血清中的大部分杂质，2号清洗液则能够将“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物中的外泌体、FABP4抗体以及蛋白A磁珠之间的相互作用解离，进而实现从血清中特异性分离脂肪组织来源的外泌体。常规外泌体提取方法是针对所有组织来源的外泌体进行分离，而本发明提供的试剂盒则可以特异性提取脂肪来源的外泌体。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的试剂盒提取脂肪组织来源外泌体的方法，将蛋白A磁珠与叠氮化钠和水混合后离心，离心所得第一沉淀以磁珠清洗液清洗，得到清洗后的蛋白A磁珠；将待测血清与清洗后的蛋白A磁珠混合进行预清洗，利用蛋白A磁珠能够与抗体结合的特性将血清中的各种抗体去除；通过磁珠清洗液回收预清洗后的蛋白A磁珠，得到清洗后的蛋白A磁珠；将预清洗得到的血清上清液与FABP4抗体混合，孵育，利用FABP4抗体特异性吸附血清中的脂肪组织来源外泌体，得到血清混合液；向血清混合液、清洗后的蛋白A磁珠以及1号清洗液，蛋白A磁珠与FABP4抗体结合形成“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物，1号清洗液则能够去除非脂肪外泌体成分；将固液分离后得到的“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物与2号清洗液混合，2号清洗液能够将“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物分离为单体，进而固液分离取上清，即得脂肪组织来源的外泌体。本发明所述提取方法更为快速，仅需要24h即可完成，比常规外泌体提取方法的效率高；并且本发明提供的提取方法操作简便、不涉及昂贵的精密仪器，相比于常规外泌体提取方法需要低温高速离心机(需要离心机达到100000g以上)而言，本发明所述方法仅需要常规离心机即可完成，简便快捷，易于推广。
本发明提供了前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒在制备判断脂肪功能状态的试剂盒中的应用。利用前述技术方案所述试剂盒能够快速有效的提取得到脂肪组织来源外泌体，对脂肪组织来源外泌体的炎症功能状态分析，根据其外泌体具体表现为抗炎或促炎实现对个体脂肪的功能状态监测，为肥胖患者、糖尿病患者等代谢综合征患者检查以及健康预防筛查提供新的检查手段。
具体实施方式
本发明提供了一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒，包括以下组分：蛋白A磁珠、磁珠清洗液、FABP4抗体、1号清洗液和2号清洗液；
所述磁珠清洗液为pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液；
所述1号清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述1号清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～2％；
所述2号清洗液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液。
在本发明中，所述蛋白A磁珠具有与抗体结合的作用。在本发明中，所述蛋白A磁珠可以通过磁珠清洗液清洗而解除蛋白A磁珠与抗体之间的结合作用，可以在提取过程中循环回收利用。本发明对所述蛋白A磁珠的来源没有特殊限定，采用常规选用的市售商品即可，比如PierceTMProtein A Magnetic Beads。
在本发明中，所述磁珠清洗液起到解离蛋白A磁珠与抗体结合的作用。在本发明中，所述磁珠清洗液的使用浓度优选为0.005～0.02mol/L，更优选为0.01mol/L。在本发明中，所述磁珠清洗液的浓度优选为10×PBS缓冲液，使用时稀释到使用浓度。在本发明中，所述磁珠清洗液的pH值优选为7.4。
本发明对所述磁珠清洗液的来源无特殊限定，可以选择市售商品或自行制备。本发明优选的，所述磁珠清洗液可以按照以下方法制备：
以1000mL计，取NaCl 80g、Na2HPO4·12H2O 32.3g、NaH2PO4·2H2O 4.5g，加双蒸水900mL，用HCl/NaOH调pH值至7.4，最后定容为1000mL，得到磁珠清洗液的浓溶液，根据所需浓度稀释即可。
脂肪酸结合蛋白4(FABP4)，又称A-FABP或aP2，主要存在于脂肪组织和巨噬细胞中，在调节代谢和炎症反应中发挥着重要作用。本发明利用FABP4抗体能够与脂肪组织来源的外泌体表面抗原特异性结合，再利用蛋白A磁珠与FABP4抗体-外泌体结合形成复合物，利用外置磁场将带有蛋白A磁珠的“蛋白A磁珠与FABP4抗体-外泌体”从血清中分离，即能特异性分离得到脂肪组织来源的外泌体。
在本发明中，所述FABP4抗体优选为IgG型的FABP4抗体。本发明对所述FABP4抗体的来源无特殊限定，采用市售商品即可，比如Abcam，Anti-FABP4antibody(ab13979)。本发明在使用所述FABP4抗体时，优选的将其配制成溶液，所述FABP4抗体溶液的浓度优选为0.5～3μg/μL，所述FABP4抗体溶液的溶剂可以是1％BSA水溶液(1g BSA，溶于100mL水)或者0.01M、pH 7.2的PBS缓冲液。
在本发明中，所述1号清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数优选为0.05～0.2％，更优选为0.1％；所述1号清洗液中的PBS缓冲液浓度优选为0.005～0.02mol/L，更优选为0.01mol/L；所述1号清洗液中的PBS缓冲液的pH值优选为7.2～7.8，更优选为7.4。在本发明中，所述1号清洗液起到去除非脂肪外泌体成分的作用，提高最终分离的外泌体提取液纯度。本发明对所述1号清洗液的来源无特殊限定，自行配置即可，本发明优选的按照以下方式配制1号清洗液：以1000mL计，取5～20g牛血清白蛋白溶于0.005～0.02mol/L、pH7.2～7.8的PBS缓冲液，即得1号清洗液。
在本发明中，所述2号清洗液的pH值优选为3.0。在本发明中，所述2号清洗液起到使“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体”复合物解离的作用，2号清洗液能够使外泌体表面抗原与抗体之间、抗体与蛋白A之间的相互作用消失，从而获得能够用于后续检测的脂肪组织来源外泌体的提取液。在本发明中，所述2号清洗液的使用浓度优选为0.1～0.2mol/L，更优选为0.15mol/L。本发明对所述2号清洗液的来源无特殊限定，优选的按照以下方法制备：将0.1～0.2mol/L的甘氨酸溶液(以0.2mol/L为例，称取15.01g甘氨酸溶于水，最后定容到1L)，用盐酸调节至pH值2.8～3.5，得到2号清洗液。
本发明提供的试剂盒可以从外周血的血清中相对特异性的提取脂肪组织来源的外泌体，为脂肪组织来源的外泌体研究提供更为快捷，避免其他组织来源的外泌体干扰。
本发明提供了一种利用上述技术方案所述试剂盒的提取脂肪组织来源外泌体的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白A磁珠、叠氮化钠与水混合得到磁珠混浊液，将所述磁珠混浊液进行第一离心，得到第一沉淀，将所述第一沉淀与磁珠清洗液混合后进行第二离心，得到的第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠；
(2)将所述步骤(1)得到的清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合，4℃孵育，第三离心，得到血清上清液和第三沉淀；
(3)以步骤(2)得到的第三沉淀作为所述步骤(1)中的蛋白A磁珠，按照步骤(1)操作，得到清洗后的蛋白A磁珠；
(4)将步骤(2)得到的血清上清液与FABP4抗体混合，18～25℃孵育，得到血清混合液；
(5)将步骤(4)得到的血清混合液、步骤(3)得到清洗后的蛋白A磁珠和1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物；
(6)将步骤(5)得到的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与2号清洗液混合，振荡20～40min，以外置磁场固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体。
本发明将蛋白A磁珠、叠氮化钠与水混合得到磁珠混浊液，将所述磁珠混浊液进行第一离心，得到第一沉淀，将所述第一沉淀与磁珠清洗液混合后进行第二离心，得到的第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠。本发明通过这一步骤将蛋白A磁珠上结合的抗体去除，使得蛋白A磁珠能够反复回收利用，节约成本。
在本发明中，所述磁珠混浊液中叠氮化钠的质量体积百分数优选为0.02～0.08％，更优选为0.05％；所述磁珠混浊液中蛋白A磁珠的浓度优选为8～15mg/mL，更优选为10mg/mL。本发明将叠氮化钠与蛋白A磁珠配制成磁珠混浊液的目的是为了防止蛋白A在过程中降解，0.02～0.08％叠氮化钠能够发挥理想的防腐剂功能。
在本发明中，所述第一离心的条件优选为1000g离心20～50s，更优选的离心30s。
在本发明中，磁珠混浊液进行第一离心分离得到第一上清和第一沉淀，弃去第一上清，将第一沉淀与0.005～0.02mol/L磁珠清洗液混合，第二离心，固液分离得到的第二沉淀即为清洗后的磁珠。本发明优选的，所述第二离心的条件为1000g离心50～80s，更优选为60s。本发明优选的，所述步骤(1)中的磁珠清洗液体积为磁珠混浊液体积的0.01～0.05％；更优选为0.02％。
得到清洗后的磁珠后，本发明将所述步骤(1)得到的清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合，4℃孵育，第三离心，得到血清上清液和第三沉淀。本发明利用清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合的目的是：利用蛋白A磁珠与待测血清中的抗体结合的能力吸附待测血清中各种抗体，进而通过磁珠分离去除待测血清中的抗体，为下一步FABP4抗体与外泌体结合后分离纯化创造条件，防止其他抗体干扰。
在本发明中，若待测样品为非血清的血液样品，则利用本领域已知的血清提取方法从待测血液样品中分离血清，再进行本发明所述方法提取。本发明所述待测血清优选的来源于外周血。
本发明优选的，所述待测血清与所述磁珠混浊液的体积比为1000～2000:0.1～0.5，按照该比例将磁珠混浊液制备得到的清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合；所述体积比更优选为1200～1800:0.2～0.3。
在本发明中，所述4℃孵育的时间优选为18～25min，更优选为20min。在4℃的条件下，蛋白A磁珠与待测血清中的抗体能够充分结合，形成蛋白A磁珠-抗体复合物。
在本发明中，所述4℃孵育后的混合物离心的条件优选为4000g离心1.5～4min，更优选为2min。固液分离后，得到血清上清液和第三沉淀，第三沉淀主要为蛋白A磁珠-抗体复合物，而血清上清液中的各种抗体则被去除。
本发明将得到的第三沉淀作为蛋白A磁珠，按照前述蛋白A磁珠制成清洗后的蛋白A磁珠的步骤进行清洗，使得蛋白A磁珠上结合的抗体被解离下了，重新得到清洗后的蛋白A磁珠。所述具体的蛋白A磁珠清洗步骤如前所述，在此不再赘述。
得到血清上清液后，本发明将血清上清液与FABP4抗体混合，18～25℃孵育，得到血清混合液。所述孵育时间优选为30min，本发明在18～25℃下孵育能够使血清上清液中的脂肪组织来源外泌体与FABP4抗体结合，形成外泌体-FABP4抗体复合物，由于FABP4抗体的特异性仅能够识别脂肪组织来源的外泌体，有效的实现了特异性地从血清中结合脂肪组织来源外泌体的目的。本发明得到的血清混合液中，含有外泌体-FABP4抗体复合物。
本发明优选的，按照待测血清体积与FABP4抗体质量的比例1～2mL:1～5μg的比例，将血清上清液与FABP4抗体混合；所述比例更优选为1～2mL:2～3μg。
得到血清混合液以及清洗后的蛋白A磁珠后，本发明将血清混合液、清洗后的蛋白A磁珠和1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物。
在本发明中，所述清洗后的蛋白A磁珠与血清混合液的用量与其在前序步骤中与待测血清混合的用量相同，在此不再赘述。在本发明中，所述血清混合液与1号清洗液混合时，1号清洗液过量使用即可。比如将血清混合液与1号清洗液按照体积比1:1～2混合。
在本发明中，所述4℃孵育时间优选为10～16h，更优选为12～14h。本发明选择4℃进行孵育的目的是为了使蛋白A磁珠与FABP4抗体充分结合。
在本发明中，所述外置磁场可以是磁铁或其他能够制造外置磁场的装置，外置磁场能够吸附蛋白A磁珠，使得蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物大量聚集，弃去上清后即可得到“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物”。本发明优选的，可以将磁铁镶嵌于镂空的EP管架底部，装有待分离的EP管置于该EP管架即可分离，简单方便。
本发明优选的，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物后，还包括以蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场固液分离，弃去上清；重复上述步骤2～3次。本发明进行上述步骤的目的是利用1号清洗液对分离的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物进一步清洗，进一步去除杂质。本发明对所述蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与1号清洗液的混合比例无特殊限定，利用1号清洗液进行重悬即可。本发明所述4℃孵育时间优选为10～15h，更优选为12～14h。
得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物，本发明将蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与2号清洗液混合，振荡20～40min，以外置磁场固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体提取液。所述固液分离后的上清液中包含FABP4抗体和脂肪组织来源的外泌体，其中FABP4抗体会在后期重新与外泌体表面结合，但是对于后续的外泌体检测结果无明显影响。
在本发明中，所述2号清洗液的使用浓度优选为0.1～0.2mol/L，更优选为0.15mol/L。2号清洗液能够使外泌体表面抗原与抗体之间、抗体与蛋白A磁珠之间的相互作用消失，从而解离得到单独的脂肪组织来源外泌体、FABP4抗体以及蛋白A磁珠。
在本发明中，所述振荡优选的在室温下进行；所述振荡时间优选为30min。振荡是为了充分解离“蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物”。
本发明所述外置磁场固液分离的方式与前序步骤相同，在此不再赘述。固液分离取上清，即得脂肪组织来源的外泌体。
利用本发明提供的试剂盒血清样本中特异性的提取脂肪组织来源的外泌体只需要24h作用。本发明所述提取方法不但能够特异性地分离提取脂肪组织来源的外泌体，提取用到的也仅需常规离心机即可，不涉及昂贵的精密仪器，普适性更强。
本发明还提供了前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒在制备判断脂肪功能状态试剂盒中的应用；优选的，所述脂肪功能状态为脂肪的炎症功能。
具体的，本发明还提供了一种用于判断脂肪功能状态的诊断试剂盒，包括前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒的组分、血清对照品、中和液、炎症效应荧光报告载体和转染试剂Lipofectamine 2000；
所述血清对照品为血清白蛋白溶液；
所述中和液为pH值为10～12的Tris溶液；
所述炎症效应荧光报告载体以psiCheck2TM为骨架，在其多克隆位点Nhe1插入插入序列，所述插入序列依次为4×NFκB结合位点，该结合位点位于载体内海肾荧光素酶编码序列、TK启动子-萤火虫荧光素酶编码序列的上游。所述插入序列插入时为单酶切，单酶切后的片段小、且浓度高，可以连接。
在本发明中，通过前述技术方案所述试剂盒能够从血清样本中特异性提取脂肪组织来源的外泌体。所述提取试剂盒的组成如前所述，在此不再赘述。
在本发明中，所述血清对照品为血清白蛋白溶液，其中不含有外泌体，用于消除鉴别过程中可能造成的误差。在本发明中，所述血清白蛋白溶液在使用时，所述血清白蛋白溶液的质量体积浓度优选为3～8％，更优选为5％；本发明所述血清白蛋白溶液的来源优选为纯度超过98％的血清白蛋白溶液，如Sigma的A1933即可。本发明所述血清对照品在使用时，以血清对照品作为血清样品，按照前述技术方案所述提取脂肪组织来源外泌体的方法进行提取，所得的外泌体提取液将作为判断脂肪功能状态的对照值参与计算和分级。
在本发明中，所述中和液优选为pH10.5的0.05mol/L Tris溶液。本发明优选的，所述Tris溶液按照以下方法制备得到：6.057g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶于1L水，最后NaOH调pH9.5至10.5。本发明所述中和液是为了中和脂肪组织来源的外泌体提取液，在制备脂肪组织来源的外泌体提取液时采用了pH2.8～3.5的2号清洗液，为了消除2号清洗液酸性pH值对于判断脂肪功能状态中所用细胞的影响使用碱性的中和液将脂肪组织来源的外泌体提取液pH值调节至中性。
在本发明中，所述炎症效应荧光报告载体优选的通过基因工程手段自行构建得到，其方法是以“4×NFκB结合序列”作为插入序列，利用Nhe1酶切位点克隆至质粒psiCheck2TM。在本发明中，所述插入序列的多克隆位点优选为Nhe1。本发明优选的，所述插入序列中的NFκB结合序列优选为RelA结合序列GGGAATTTCC，所述4×NFκB是指4个拷贝的RelA结合序列，每个拷贝之间间隔一段spacer，两端涵盖Nhe1酶切位点，整个序列优选为：5’-GCTAGCGGGAATTTCCCCTTAAGGGAATTTCCCCTTAAGGGAATTTC CCCTTAAGGGAATTTCCGCTAGC-3’。通过本发明构建的炎症效应荧光报告载体进行双荧光素酶报告系统检测，其海肾荧光素酶受细胞内NFκB的活性调控，而萤火虫荧光素酶则是组成性表达，因此海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶活性的比值，可以反映细胞内NFκB的活性，从而反映外泌体处理对炎症的调节作用。
在本发明中，所述转染试剂Lipofectamine 2000来源于市售商品。
本发明利用所述判断脂肪功能状态的诊断试剂盒对待测血清中脂肪组织外泌体的功能状态进行判断，进而根据待测血清中脂肪组织外泌体的功能状态判断待测血清来源的机体中脂肪组织的功能状态。所述判断脂肪功能状态的方法优选按照以下步骤进行：
S1、分别以待测血清和血清对照品为样品，按照提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒的使用方法提取，加入中和液，4℃孵育10～16h，得到待测外泌体提取液和对照外泌体提取液；
S2、将293细胞接种至多孔板中培养，当细胞密度达到80％以上时，每孔加入300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL转染试剂Lipofectamine2000的混合液进行转染，设置6个孔，转染后在37度5％CO2饱和湿度条件下进行细胞培养，转染4～8h更换1次细胞培养基，所述细胞培养基为10％的胎牛血清的DMEM，DMEM和胎牛血清均为市售商品，如Hyclone的胎牛血清和DMEM；
S3、分别取S1制得的待测外泌体提取液和对照外泌体提取液与2×DMEM培养基等体积混合，分别得到待测混合液和对照混合液；
S4、取S3制备得到的待测混合液或对照混合液按照50μL/孔，加入S2所述6个含有转染后的293细胞孔中，每组重复3孔，加入待测混合液的3孔为试验组，加入待测混合液的3孔为对照组；
S5、按照S4步骤加入待测混合液或对照混合液24h后，检测试验组和对照组的荧光读数，取平均值，计算试验组荧光读数与对照组荧光读数的比值：
若比值≥0.1且＜1时为1级，则判断为炎症性脂肪；若比值≥1且＜5时为2级，则判断为中性脂肪；若比值≥5且＜10时为3级，则判断为炎症性脂肪；若比值≥10时为4级，则判断为炎症性脂肪。
在本发明所述步骤S1中，优选的将脂肪组织来源的外泌体提取液和中和液等体积混合。
本发明所述293细胞为使用者自行准备，可以通过实验室培养或者购买市售商品获得。
在本发明所述步骤S2中，293细胞的接种数量优选为0.1-0.5*105/孔，更优选为0.2*105/孔。在本发明中，所述293细胞接入的多孔板中含有0.5mL的DMEM细胞培养基。
在本发明中，所述转染温度优选为37度；所述转染时间优选为细胞进行无血清培养基处理6h后，将预先共孵育的300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL转染试剂Lipofectamine 2000混合液滴入细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，轻轻摇匀。本发明优选的，所述300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL转染试剂Lipofectamine 2000的混合液是预先将300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL转染试剂Lipofectamine 2000混合后，室温(20～30)℃下孵育5min得到的。
在本发明所述步骤S2中，所述转染后的培养条件优选为DMEM。在本发明中，所述步骤S4加入待测混合液或对照混合液的时机为转染后继续培养12h之后。
在本发明中，所述DMEM培养基来源于市售商品，终浓度为2×。本发明将待测外泌体提取液或对照外泌体提取液与2×DMEM混合是为了减少提取外泌体渗透压对结果的影响。
在本发明中，所述用于检测试验组和对照组的荧光读数的仪器优选为Promega的GloMax 20/20发光检测仪。但也可以用全波长酶标仪来检测。萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
本发明根据检测数据的比值定义测定的脂肪组织来源的外泌体功能状况，并根据外泌体的功能表现判断待测血清来源的机体中脂肪组织功能状态，可以实现对个体脂肪状态的科学评判。对于指导健身、减肥等活动的个体指导提供科学参考依据。
本发明所述诊断试剂盒可用于肥胖患者、糖尿病患者等代谢综合征人群的常规检测，还可用于健康预防的常规性筛查中。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒
蛋白A磁珠(PierceTM ProteinA/G Magnetic Beads)；
磁珠清洗液：1×pH7.4的PBS缓冲液；
FABP4抗体：IgG型抗体(Abcam，Anti-FABP4antibody(ab13979))；
1号清洗液：质量体积分数1％的牛血清白蛋白溶于0.01M、pH7.4的PBS缓冲液中；
2号清洗液：配制0.1～0.2M的甘氨酸溶液，用盐酸调节至pH3.0。
实施例2判断脂肪功能状态的诊断试剂盒
蛋白A磁珠2mg(PierceTM ProteinA/G Magnetic Beads)；
磁珠清洗液：1×pH7.4的PBS缓冲液；
FABP4抗体：IgG型抗体(Abcam，Anti-FABP4antibody(ab13979))；
1号清洗液：按照质量体积分数1％的牛血清白蛋白溶于0.01M的PBS缓冲液(pH7.4)中；
2号清洗液：配制0.1～0.2M的甘氨酸溶液，用盐酸调节至pH3.0；
中和液：配制0.01M的Tris溶液，以氢氧化钠调节至pH10.5；
炎症效应荧光报告载体：psiCheck2TM为骨架，在其多克隆位点Nhe1插入插入序列，所述插入序列为4×NFκB结合位点，该结合位点位于载体内海肾荧光素酶编码序列、TK启动子-萤火虫荧光素酶编码序列的上游。
转染试剂Lipofectamine 2000：购自Invitrogen。
实施例3
利用实施例1的试剂盒进行脂肪来源的外泌体提取
患者，男，BMI 34，年龄48岁，患有高血脂、脂肪肝和动脉粥样硬化。取该患者的外周血样3mL至试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，500g离心3min取上清，即获得待测血清。
(1)将蛋白A磁珠2mg和NaN30.1μg加水溶解，定容至200μL，得到磁珠混浊液，将磁珠混浊液以1000g离心30s，弃去上清得到第一沉淀，将第一沉淀与1mL磁珠清洗液混合，振荡后1000g离心1min，弃去上清，所得第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠。
(2)取待测血清1mL与步骤(1)得到的清洗后的蛋白A磁珠混合，4℃孵育20min，4000g离心2min，得到预清洗上清液和第三沉淀。
(3)将步骤(2)得到的第三沉淀按照步骤(1)进行清洗，得到清洗后的蛋白A磁珠。
(4)将步骤(2)得到的血清上清液与2μL、1μg/μL的FABP4抗体混合，室温孵育30min，得到血清混合液。
(5)将步骤(4)得到的血清混合液、步骤(3)得到清洗后的蛋白A磁珠和1mL的1号清洗液混合，4℃孵育12h，以外置磁场固液分离，弃去上清，向所得沉淀中继续添加1mL的1号清洗液，振荡后以外置磁场固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物。
(6)将步骤(5)得到的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与400μL的2号清洗液混合，室温振荡30min，以外置磁场固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体提取液。
实施例4
利用实施例2的诊断试剂盒进行脂肪功能状态判断
S1、以血清对照品为样品，按照实施例3的方法制备得到对照脂肪组织来源的外泌体提取液；
S2、分别将实施例3制备得到的脂肪组织离来源的外泌体提取液和上述对照脂肪组织来源的外泌体提取液与等体积的中和液混合，4℃孵育12h，得到待测外泌体提取液和对照外泌体提取液；
S3、将1800ng炎症效应荧光报告载体质粒加入300μL DMEM培养基，将6μLLipofectamine 2000加入300微升DMEM培养基，将上述质粒与Lipofectamine2000混合后，孵育5min，得到炎症效应荧光报告载体质粒和Lipofectamine 2000的混合液；向24孔板的孔中加入0.5mL/孔的细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，按照0.2*105的浓度将293细胞接种到装有细胞培养基的孔中(铺至少6个孔)，在37度、5％CO2的条件下培养至细胞密度80％时，每孔添加100微升质粒和Lipofectamine2000混合液(含有将300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL Lipofectamine 2000)，进行转染，共转染6个孔；转染后在37度、5％CO2的条件下进行培养，6h后更换一次细胞培养基；
S4、分别取S2制得的待测外泌体提取液和对照外泌体提取液与2×DMEM培养基等体积混合，分别得到待测混合液和对照混合液；
S5、将S4制得的待测混合液或对照混合液按照50μL/孔，加入S3所述6个含有转染后的293细胞孔中，每组重复3孔，加入待测混合液的3孔为试验组，加入待测混合液的3孔为对照组；
S6、按照S5步骤加入待测混合液或对照混合液24h后，检测试验组和对照组的荧光读数，取平均值，得到试验组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为12.5，对照组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为0.78，将试验组荧光读数除以对照组荧光读数得到其比值为16.03。由于该比值≥10属于4级，因而判断该患者的脂肪状态为炎症性脂肪。
实施例5
利用实施例2的试剂盒进行脂肪状态判断
选择一位健康的志愿者作为正常对照，该志愿者性别女，BMI29，年龄36岁，取该患者的外周血样3mL至试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，500g离心3min取上清，即获得待测血清。。
(1)将蛋白A磁珠2mg和NaN30.1μg加水溶解，定容至400μL，得到磁珠混浊液，将磁珠混浊液以1000g离心40s，弃去上清得到第一沉淀，将第一沉淀与1mL磁珠清洗液混合，振荡后1000g离心1min，弃去上清，所得第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠。
(2)取待测血清1.5mL，分别与的清洗后的蛋白A磁珠混合，4℃孵育20min，4000g离心1.5min，得到预清洗上清液和第三沉淀。
(3)将步骤(2)得到的第三沉淀按照步骤(1)进行清洗，得到清洗后的蛋白A磁珠。
(4)将步骤(2)得到的血清上清液与2μL、1.2μg/μL的FABP4抗体混合，室温孵育30min，得到血清混合液。
(5)将步骤(4)得到的血清混合液、步骤(3)得到清洗后的蛋白A磁珠和1.5mL的1号清洗液混合，4℃孵育10h，以外置磁场固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物。
(6)将步骤(5)得到的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与400μL的2号清洗液混合，室温振荡35min，以外置磁场固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体提取液。
(7)以血清对照品为样品，按照步骤(1)～(6)制备得到对照脂肪组织来源的外泌体提取液；
(8)分别将得到的脂肪组织离来源的外泌体提取液和上述对照脂肪组织来源的外泌体提取液与等体积的中和液混合，4℃孵育12h，得到待测外泌体提取液和对照外泌体提取液；
(9)将1800ng炎症效应荧光报告载体质粒加入300微升DMEM培养基，将6μLLipofectamine 2000加入300微升DMEM培养基，将上述质粒与Lipofectamine2000混合后，孵育5min，得到炎症效应荧光报告载体质粒和Lipofectamine 2000的混合液；向24孔板的孔中加入0.5mL/孔的细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，按照0.2*105的浓度将293细胞接种到装有细胞培养基的孔中(铺至少6个孔)，在37度、5％CO2的条件下培养至细胞密度80％时，每孔添加100微升质粒和Lipofectamine2000混合液(含有将300ng炎症效应荧光报告载体质粒与1μL Lipofectamine 2000)，进行转染，共转染6个孔；转染后在37度、5％CO2的条件下进行培养，6h后更换一次细胞培养基；
(10)分别取(8)制得的待测外泌体提取液和对照外泌体提取液与2×DMEM培养基等体积混合，分别得到待测混合液和对照混合液；
(11)将(10)制得的待测混合液或对照混合液按照50μL/孔，加入S3所述6个含有转染后的293细胞孔中，每组重复3孔，加入待测混合液的3孔为试验组，加入待测混合液的3孔为对照组；
(12)按照(10)步骤加入待测混合液或对照混合液24h后，检测试验组和对照组的荧光读数，取平均值，得到试验组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为0.95，对照组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为1.28，将试验组荧光读数除以对照组荧光读数得到其比值为0.74。由于该比值≥0.1且＜1属于1级，因而判断该患者的脂肪状态为抗炎性脂肪。
实施例6
患者，女，BMI 25，年龄56，糖尿病患者，还患有动脉粥样硬化和高血脂，取3mL外周血样，按实施例5的操作完成脂肪外泌体提取和炎症状态检测。得到试验组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为4.65，对照组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为1.28，将试验组荧光读数除以对照组荧光读数得到其比值为6.84。。由于该比值≥5且＜10属于3级，因而判断该患者的脂肪状态为炎性脂肪。
实施例7
患者，男，BMI 33，年龄38，轻度脂肪肝、无其他异常，取3mL外周血样，按实施例5的操作完成脂肪外泌体提取和炎症状态检测。得到试验组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为2.15，对照组海肾荧光素/萤火虫荧光素酶活性比值为1.08，将试验组荧光读数除以对照组荧光读数得到其比值为1.99。由于该比值≥1且＜5属于2级，因而判断该患者的脂肪状态为中性脂肪。
对比例1提取外泌体的常规方法
超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定。
1)取1mL待测血清，300g 10min离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；
2)取步骤1)离心得到的上清液1进行10000g 30min离心以消除大囊泡；
3)取步骤2)离心得到的上清液2进行100,000g超高速离心2h以沉淀外泌体；
4)取步骤3)离心得到的上清液3重悬后重复步骤3)，合并沉淀，即得外泌体。
表1常规外泌体提取方法与本发明所述脂肪来源外泌体提取方法的比较
对比例1 实施例3
外泌体种类 各种组织来源 脂肪组织来源
仪器要求 低温超高速离心机 常规离心机
血清等样本得率 低 高
表1中，由于血清属于粘性生物液体，采用对比例1所述方法提取各种组织来源的外泌体时，沉淀效率较低；而采用本发明所述方法则可以从血清中快速有效的提取到脂肪组织来源的外泌体，不受血清自身粘性的干扰。
可以看出，本发明提供的脂肪组织来源的外泌体提取方法理论得率高，不要求昂贵精密仪器，易于推广。
综上所述，本发明提供的试剂盒可以快速有效的从血清中特异性提取得到脂肪组织来源的外泌体，为脂肪组织的研究提供基础材料。本发明提供的诊断试剂盒通过对脂肪来源外泌体状态的检测和分级，能够有效反应出样本来源的个体脂肪组织功能状态，为健康活动以及代谢紊乱综合患者提供新的检查手段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用
<130> ZDC18FP00258
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctagcggga atttcccctt aagggaattt ccccttaagg gaatttcccc ttaagggaat 60
ttccgctagc 70

Claims (6)

1.一种利用提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒提取脂肪组织来源外泌体的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白A磁珠、叠氮化钠与水混合，得到磁珠混浊液，将所述磁珠混浊液进行第一离心，得到第一沉淀，将所述第一沉淀与磁珠清洗液混合后进行第二离心，得到的第二沉淀即为清洗后的蛋白A磁珠；
(2)将所述步骤(1)得到的清洗后的蛋白A磁珠与待测血清混合，4℃孵育后进行第三离心，得到血清上清液和第三沉淀；
(3)以所述步骤(2)得到的第三沉淀作为所述步骤(1)中的蛋白A磁珠，按照步骤(1)操作，得到清洗后的蛋白A磁珠；
(4)将所述步骤(2)得到的血清上清液与FABP4抗体混合，18～25℃孵育，得到血清混合液；
(5)将所述步骤(4)得到的血清混合液、步骤(3)得到清洗后的蛋白A磁珠和1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场进行固液分离，弃去上清，得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物；
(6)将所述步骤(5)得到的蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与2号清洗液混合，振荡20～40min，以外置磁场进行固液分离，取上清，即得脂肪组织来源的外泌体；
所述的试剂盒，包括以下组分：蛋白A磁珠、磁珠清洗液、FABP4抗体、1号清洗液和2号清洗液；
所述磁珠清洗液为pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液；
所述1号清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述1号清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～2％；
所述2号清洗液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1号清洗液中的PBS缓冲液浓度为0.005～0.02mol/L；
所述甘氨酸溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)磁珠混浊液中叠氮化钠的质量体积百分数为0.02～0.08％，所述磁珠混浊液中蛋白A磁珠的浓度为8～15mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的磁珠清洗液体积为磁珠混浊液体积的0.01～0.05％；所述磁珠清洗液为浓度为0.005～0.02mol/L的PBS缓冲液；
所述步骤(2)中的待测血清与步骤(1)磁珠混浊液的体积比为1000～2000:0.1～0.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)待测血清的体积与FABP4抗体的质量比为1～2mL:1～5μg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)得到蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物后，还包括：将蛋白A磁珠-FABP4抗体-外泌体复合物与1号清洗液混合，4℃孵育，以外置磁场进行固液分离，弃去上清；重复上述步骤2～3次。
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