CN113652388A - 一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法，属于外泌体分离技术领域，一种高纯度外泌体提取试剂盒的提取方法，包括样本准备、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备和亲和捕获，本方案还提供一种高纯度外泌体提取试剂盒，包括盒体、盒盖以及装载在盒体内的采集管、滤器、试剂瓶，若干试剂瓶内分别封装有蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液、洗脱液、血液促凝剂和PBS缓冲液，本方案通过采用免疫亲和捕获法获取血液/体液中的外泌体，可以为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，所获得外泌体纯度高，可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析和液体活检标志物筛选。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体分离技术领域，更具体地说，涉及一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法。
背景技术
外泌体是细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，广泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁等体液中，它们包裹着核酸、蛋白、氨基酸、脂类等生物大分子，被受体细胞内吞后，可以释放上述效应物分子，参与调节细胞的生物学活动。探讨外泌体内生物大分子的组成，改造外泌体使其成为药物载体，已经成为当前生命科学重要的研究课题。
当前外泌体提取的主要方法有：1.差速离心法：运用最多，利用低速离心-高速离心交替原理将外泌体沉淀下来。优点：成本低，纯度高，适合制备大样本；缺点：设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤，容易造成脂蛋白等聚集2.密度梯度离心：利用蔗糖溶液形成从低到高的浓度阶层，通过离心，使外泌体集中在1.13-1.19g/ml的密度范围。优点：纯度高缺点：样本处理量低，设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤3.超滤膜离心分离法：外泌体大小比蛋白质大，利用超滤膜进行节流，将外泌体分离出来。优点：是简单高效，设备成本低，外泌体生物活性保存好缺点：是也存在纯度不高的问题，容易引起膜堵塞。另外，近年来也开发了一些新型的分离技术，如纳米线分离法、微流控法等，或者用核酸配适体亲和技术进行分离外泌体，但设备、成本要求高。
外泌体提取是上述研究的关键环节，而基因组学的研究对外泌体的获取提出了更高的要求，如何获取高纯度外泌体并满足基因组学的研究变得尤为重要。为此我们提出一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法来解决以上问题。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法，可以实现利用亲和捕获技术(免疫亲和法)，为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，利用本试剂盒获取的外泌体可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析。
2.技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，包括以下步骤：
S1、样本准备：
A.全血：
①采集管预先加入适量溶液A(按每5mL全血加20μL的比例)，将3mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30min至血液凝固；
②将上述血液在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
B.血浆：
①新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20μL的比例加入溶液A，轻微颠倒混匀，静置30min；
②将上述血浆在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
C.细胞上清或其它体液：
①将细胞上清或其它体液置于采集管中，在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清置于离心管中，重复离心一次；
②注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
③检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
①取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
②取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加溶液B定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL溶液B，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL溶液B至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；
S3、亲和捕获：
①将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，温度4℃下孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
②取抗体混合物6μL添加到上述获得的1mL上清中，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液；
③将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，温度4℃下孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合液。孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
④将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；
⑤将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体。
进一步的，所述步骤S3中的6μL抗体混合物中包含Anti-CD9、Anti-CD63和Anti-CD89各2ug。
进一步的，所述溶液A为血液促凝剂；所述溶液B为PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
进一步的，所述清洗液为牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5～2％。
进一步的，所述洗脱液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度0.1～0.2mol/L。
一种高纯度外泌体提取试剂盒，所述高纯度外泌体提取试剂盒包括盒体、盒盖以及装载在盒体内的采集管、滤器、试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别封装有蛋白A琼脂糖纯化珠1mL、抗体混合物70μL、清洗液22mL、洗脱液5mL、血液促凝剂150μL和PBS缓冲液2mL。
进一步的，所述盒体包括提拉隔板，所述提拉隔板的一侧设有与采集管相匹配的试剂瓶支架，所述提拉隔板的另一侧设有保温隔仓，所述保温隔仓的底部设有滤器抽屉，所述保温隔仓的顶部设有与试剂瓶相匹配的试剂瓶支架，所述提拉隔板的顶部设有提拉把手，所述盒盖为剖面N字型的盖体结构，所述盒盖顶部设有与提拉把手相匹配的豁口。
进一步的，所述保温隔仓内设有多条纵向排布的水囊，所述水囊的底部设有保温填充层，所述保温隔仓的顶部设有若干贯穿的吸热孔。
进一步的，所述保温填充层为表面喷涂有机硅的膨胀珍珠岩结构。
进一步的，所述盒体的底部设有减震层，所述减震层的海绵垫结构。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本方案通过采用免疫亲和捕获法获取血液/体液中的外泌体，可以为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，所获得外泌体纯度高，可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析和液体活检标志物筛选。
(2)本方案提供的提取方法更为快速，仅需要14h即可完成，比常规外泌体提取方法的提取时间更短；并且本发明提供的提取方法操作简便、不涉及昂贵的精密仪器，相比于常规外泌体提取方法需要低温高速离心机(需要离心机达到10000g以上)而言，本发明所述方法仅需要常规离心机即可完成，简便快捷，易于推广。
(3)通过带有采集管架、提拉隔板、滤器抽屉、试剂瓶支架的盒体结构设计，在使用过程中，通过提拉隔板进行盒体的整体转移，试剂瓶及采集管安装稳定，不易晃动，操作便捷，利用带有水囊、保温填充层、吸热孔的保温隔仓的结构设计，将盒体从冰柜中取出后，利用水囊的结冰体的融化吸热和保温填充层的保温效果，可通过吸热孔将盒体内试剂瓶部位的热量长时间吸收，进而有效保持了试剂瓶内试剂的存储条件，有效提升了使用寿命。
附图说明
图1为本发明中提出的全血样本准备流程图；
图2为本发明中提出的血浆样本准备流程图；
图3为本发明中提出的细胞上清或其它体液样本准备流程图；
图4为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒提取方法流程图；
图5为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒物料表示意图；
图6为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒的结构示意图；
图7为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒的内部结构示意图；
图8为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒的爆炸结构示意图；
图9为本发明中提出的高纯度外泌体提取试剂盒的剖面结构示意图；
图10为本发明中提出的盒体的结构示意图。
图中标号说明：
盒体1、采集管架11、提拉隔板12、滤器抽屉13、试剂瓶支架14、保温隔仓15、吸热孔151、水囊152、保温填充层153、减震层16、盒盖2。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1：
请参阅图1和图4，一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，包括以下步骤：
S1、样本准备：
全血：
①采集管预先加入适量溶液A(按每5mL全血加20μL的比例)，将3mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30min至血液凝固；
②将上述血液在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4，其中溶液A为血液促凝剂；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
①取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
②取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加溶液B定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL溶液B，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL溶液B至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；其中溶液B为PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值7.4；
S3、亲和捕获：
①将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，温度4℃下孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
②取抗体混合物6μL添加到上述获得的1mL上清中，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液，其中6μL抗体混合物中包含Anti-CD9、Anti-CD63和Anti-CD89各2ug；
③将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，温度4℃下孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合液。孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
④将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；其中清洗液为牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5～2％；
⑤将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体；其中洗脱液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度0.1～0.2mol/L。
实施例2：
请参阅图1，其中与实施例1中相同或相应的部件采用与实施例1相应的附图标记，为简便起见，下文仅描述与实施例1的区别点。该实施例2与实施例1的不同之处在于：
S1、样本准备：
B.血浆：
①新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20μL的比例加入溶液A，轻微颠倒混匀，静置30min。
②将上述血浆在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4，其中溶液A为血液促凝剂；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备......
S3、亲和捕获......
实施例3：
请参阅图1，其中与实施例1中相同或相应的部件采用与实施例1相应的附图标记，为简便起见，下文仅描述与实施例1的区别点。该实施例3与实施例1的不同之处在于：
S1、样本准备：
C.细胞上清或其它体液：
①将细胞上清或其它体液置于采集管中，在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清置于离心管中，重复离心一次；
②注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
③检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备......
S3、亲和捕获......
本方案通过采用免疫亲和捕获法获取血液/体液中的外泌体，可以为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，所获得外泌体纯度高，可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析和液体活检标志物筛选，本方案提供的提取方法更为快速，仅需要14h即可完成，比常规外泌体提取方法的提取时间更短；并且本发明提供的提取方法操作简便、不涉及昂贵的精密仪器，相比于常规外泌体提取方法需要低温高速离心机(需要离心机达到10000g以上)而言，本发明所述方法仅需要常规离心机即可完成，简便快捷，易于推广。
实施例4：
请参阅图5-10，一种高纯度外泌体提取试剂盒，高纯度外泌体提取试剂盒包括盒体1、盒盖2以及装载在盒体1内的采集管、滤器、试剂瓶，若干试剂瓶内分别封装有蛋白A琼脂糖纯化珠1mL、抗体混合物70μL、清洗液22mL、洗脱液5mL、血液促凝剂150μL和PBS缓冲液2mL，盒体1包括提拉隔板12，提拉隔板12的一侧设有与采集管相匹配的试剂瓶支架14，提拉隔板12的另一侧设有保温隔仓15，保温隔仓15的底部设有滤器抽屉13，保温隔仓15的顶部设有与试剂瓶相匹配的试剂瓶支架14，提拉隔板12的顶部设有提拉把手，盒盖2为剖面N字型的盖体结构，盒盖2顶部设有与提拉把手相匹配的豁口，保温隔仓15内设有多条纵向排布的水囊152，水囊152的底部设有保温填充层153，保温隔仓15的顶部设有若干贯穿的吸热孔151，保温填充层153为表面喷涂有机硅的膨胀珍珠岩结构，盒体1的底部设有减震层16，减震层16的海绵垫结构。
通过带有采集管架11、提拉隔板12、滤器抽屉13、试剂瓶支架14的盒体1结构设计，在使用过程中，通过提拉隔板12进行盒体1的整体转移，试剂瓶及采集管安装稳定，不易晃动，操作便捷，利用带有水囊152、保温填充层153、吸热孔151的保温隔仓15的结构设计，将盒体1从冰柜中取出后，利用水囊152的结冰体的融化吸热和保温填充层153的保温效果，可通过吸热孔151将盒体1内试剂瓶部位的热量长时间吸收，进而有效保持了试剂瓶内试剂的存储条件，有效提升了使用寿命。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，包括以下步骤：
S1、样本准备：
A.全血：
①采集管预先加入适量溶液A(按每5mL全血加20μL的比例)，将3mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30min至血液凝固；
②将上述血液在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
B.血浆：
①新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20μL的比例加入溶液A，轻微颠倒混匀，静置30min；
②将上述血浆在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
C.细胞上清或其它体液：
①将细胞上清或其它体液置于采集管中，在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清置于离心管中，重复离心一次；
②注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
③检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
①取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
②取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加溶液B定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL溶液B，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL溶液B至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；
S3、亲和捕获：
①将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，温度4℃下孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
②取抗体混合物6μL添加到上述获得的1mL上清中，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液；
③将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，温度4℃下孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合液，孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
④将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；
⑤将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，其特征在于：所述步骤S3中的6μL抗体混合物中包含Anti-CD9、Anti-CD63和Anti-CD89各2ug。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，其特征在于：所述溶液A为血液促凝剂；所述溶液B为PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，其特征在于：所述清洗液为牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5～2％。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，其特征在于：所述洗脱液为pH2.8～3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度0.1～0.2mol/L。
6.根据权利要求1-5所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述高纯度外泌体提取试剂盒包括盒体(1)、盒盖(2)以及装载在盒体(1)内的采集管、滤器、试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别封装有蛋白A琼脂糖纯化珠1mL、抗体混合物70μL、清洗液22mL、洗脱液5mL、血液促凝剂150μL和PBS缓冲液2mL。
7.根据权利要求6所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述盒体(1)包括提拉隔板(12)，所述提拉隔板(12)的一侧设有与采集管相匹配的试剂瓶支架(14)，所述提拉隔板(12)的另一侧设有保温隔仓(15)，所述保温隔仓(15)的底部设有滤器抽屉(13)，所述保温隔仓(15)的顶部设有与试剂瓶相匹配的试剂瓶支架(14)，所述提拉隔板(12)的顶部设有提拉把手，所述盒盖(2)为剖面N字型的盖体结构，所述盒盖(2)顶部设有与提拉把手相匹配的豁口。
8.根据权利要求7所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述保温隔仓(15)内设有多条纵向排布的水囊(152)，所述水囊(152)的底部设有保温填充层(153)，所述保温隔仓(15)的顶部设有若干贯穿的吸热孔(151)。
9.根据权利要求8所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述保温填充层(153)为表面喷涂有机硅的膨胀珍珠岩结构。
10.根据权利要求7所述的一种高纯度外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述盒体(1)的底部设有减震层(16)，所述减震层(16)的海绵垫结构。
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