DE3125181C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE3125181C2 DE3125181C2 DE3125181A DE3125181A DE3125181C2 DE 3125181 C2 DE3125181 C2 DE 3125181C2 DE 3125181 A DE3125181 A DE 3125181A DE 3125181 A DE3125181 A DE 3125181A DE 3125181 C2 DE3125181 C2 DE 3125181C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- lysate
- carbon atoms
- endotoxin
- formula
- sensitivity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber
Endotoxin aus einem Limulusamoebocyten-Lysat von durch die Anwesenheit
eines endogenen Lysat-Inhibitors herabgesetzter Empfindlichkeit
gegenüber Endotoxin. Die Erfindung betrifft auch ein Limulusamoebocyten-
Lysat-Reagenz zur Endotoxin-Bestimmung mit verbesserter Empfindlichkeit
gegenüber Endotoxin, das aus einer gepufferten wäßrigen Dispersion
von Limulusamoebocyten-Lysat besteht. Schließlich betrifft die
Erfindung die Verwendung des Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz für die
Endotoxin-Bestimmung.
Bekanntlich ist der LAL-Test zur Festellung von Endotoxinen
vielleicht der praktischste und empfindlichste Test zur Endotoxin-Bestimmung.
Tests mit handelsüblicher Prüfsubstanz verwenden Amoebocyten-
Lysat aus Limulus-Hämolymphe, die man aus Hufeisenkrabben erhält. Dieses
Lysat bildet zusammen mit geeigneten zweiwertigen Kationen, geeigneten
Puffern und anderen Bestandteilen ein LAL-Reagenz. Dieses Reagenz reagiert
dann während der Untersuchung mit dem Endotoxin unter Bildung
eines Gels. Herstellung von LAL-Reagentien haben bei der Herstellung
von Lysat der gewünschten Empfindlichkeit für die Endotoxin-Bestimmung
oft Schwierigkeiten. Die Empfindlichkeit ist auch von einer Herstellung
zur nächsten veränderlich. Diese Probleme werden wenigstens zum Teil
der Anwesenheit einer endogenen undefinierten Endotoxin-Inhibitor-Substanz
in dem Lysat (nachfolgend manchmal als Inhibitor bezeichnet) zugeschrieben.
Über die Natur des Inhibitors oder seine in-vivo-Funktion
in der Hufeisenkrabbe ist wenig bekannt. Elektrophoretische Studien
zeigen, daß der Inhibitor ein hochmolekulares Lipoprotein ist. Er kann
in der Amoebocyte die Funktion haben, die Abwehrreaktion gegen Koagulation
zu steuern. Es ist auch plausibel, daß der Inhibitor ein Membranbestandteil
ist, der bei der Zellzerstörung freigesetzt wird. Die Ungewißheit
über die Rolle und die Herkunft des Inhibitors ist verbunden
mit der Tatsache, daß der Inhibitionsmechanismus unklar ist. Vermutlich
blockiert der Inhibitor die enzymatische Reaktion in irgendeiner Weise,
entweder durch Assoziation mit dem Enzym selbst oder mit dem Endotoxin
oder mit beiden Stoffen. Es ist anzunehmen, daß das Progerinnungsenzym
wie einige andere Serin-Proteasen mit Calcium und Glycerophospholipid
komplex gebunden wird. Endotoxin ist selbst lipoid; daher wäre ein Inhibitor
mit Lipoprotein-Charakter mit beiden Komponenten in hohem Maße
verträglich.
Dafür, daß der Inhibitor ein Lipoprotein ist, spricht seine
Empfindlichkeit gegenüber Chloroform. Wie in der US-PS 41 07 077 beschrieben
ist, wird die Empfindlichkeit von LAL wesentlich verbessert, wenn
man das Lysat mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Chloroform,
behandelt, um den Inhibitor aus dem Lysat auszufällen. Die wäßrige
Phase wird dann gewonnen und zur Herstellung des LAL-Reagenz aufgearbeitet.
Bisher ist das oben erwähnte Lösungsmittelextraktionsverfahren
die schnellste Methode, um die LAL-Empfindlichkeit zu verbessern.
Unglücklicherweise hat die Methode mehrere Nachteile. Wegen
der unabdingbaren Notwendigkeit, bei der Lysat-Herstellung endotoxinfreie
Bedingungen einzuhalten, erhöht sich durch ein umfangreiches Extraktionsverfahren
und die anschließende Zentrifugierung die Wahrscheinlichkeit
von Produktmängeln. Wie in der Patentschrift bemerkt ist, verringert
die Lösungsmittelbehandlung die Beständigkeit des Lysats, so
daß die Herstellung in der Kälte schnell zu Ende geführt werden muß.
Der durch die Lösungsmittelbehandlung aus dem Lysat entfernte Niederschlag
enthält ferner viel Koagulogen, das erforderliche Gerinnungsprotein.
Die Einhaltung eines geeigneten Proteingehalts ist eine Voraussetzung
für die Bildung eines festen Gels während der Prüfung auf Endotoxin.
Offensichtlich ist unter diesen Umständen die Überwachung der
Empfindlichkeit des Reagenz schwierig. Chloroform, das mit dem meisten
Erfolg benutzte Lösungsmittel, ist durch seine unerwünschten Wirkungen
auf den Menschen bekannt. Die Gesundheit und Sicherheit des mit der
Herstellung befaßten Personals ist daher von beachtlicher Bedeutung.
Es ist offensichtlich, daß ein Verfahren, das diese latenten Gefahren
vermeidet und dabei doch die Empfindlichkeit im gewünschten Maße erhöht,
eine Verbesserung auf diesem technischen Gebiet bringen würde.
In GB-A 20 33 081 ist eine optische Methode zur Endotoxin-Bestimmung
beschrieben, bei der zunächst die Probe mit dem zu bestimmenden
Endotoxin mit dem Limulusamoebocyten-Lysat unter Bildung eines
Proteinkoagulats als Reaktionsprodukt in Kontakt gebracht wird. Erst
dann wird dieses Reaktionsprodukt mit einer oberflächenaktiven Mittel
behandelt. Durch diese nachträgliche Behandlung wird erreicht, daß
die zunächst schlechte Reproduzierbarkeit der nephelometrischen Meßwerte
verbessert wird.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur einfachen
und schnellen Erhöhung der Empfindlichkeit des LAL zu schaffen. Darüber
hinaus soll ein LAL-Reagenz zur Endotoxin-Bestimmung mit verbesserter
Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin geschaffen werden.
In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch
die im Kennzeichen von Anspruch 1 angegebene Maßnahme gelöst. Bevorzugte
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den
Unteransprüchen 2 bis 7.
Hinsichtlich des LAL-Reagenz wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch
das im Kennzeichen von Anspruch 8 angegebene Merkmal gelöst. Bevorzugte
Ausführungsformen des LAL-Reagenz ergeben sich aus den Unteransprüchen
9 bis 16.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt man LAL mit auf Grund
der Anwesenheit eines endogenen Inhibitors herabgesetzter Endotoxin-
Empfindlichkeit unter Lysat-Behandlungsbedingungen mit einer verstärkenden
Menge eines die Lysat-Empfindlichkeit verstärkenden Mittels, um den
Lysat-Inhibitor teilweise oder vollständig zu neutralisieren und dadurch
die LAL-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin zu steigern.
Es gibt gewisse Mindestkriterien, die der Eigenschaft der Verstärkung
der LAL-Empfindlichkeit zugrunde liegen. Dies bedeutet, daß die
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbaren Mittel für die Erhöhung
der LAL-Empfindlichkeit besitzen sollten (a) die Fähigkeit, die Lysat-
Empfindlichkeit auf eine geeignete Empfindlichkeit zu steigern, z. B.
auf das Zweifache oder mehr, (b) die Eigenschaft der Depyrogenierung,
d. h. der Entfernung oder Zerstörung von Endotoxin, durch
Ultrafiltration oder Säurebehandlung bei pH-Werten unter 5 oder alkalischer
Behandlung bei pH-Werten oberhalb 8 standzuhalten, (c) die Sterilisierfähigkeit,
z. B. durch Autoklavenbehandlung beispielsweise bei
oder oberhalb 121°C bei 1,05 bar für einen Zeitraum von 15 Minuten,
(d) die Fähigkeit zur Bildung wäßriger Lösungen von etwa 2% (Gewicht/
Volumen) bei 25°C, (e) die Fähigkeit zur Funktion in dem pH-Bereich etwa
von 6,0 bis etwa 9, (f) die Verträglichkeit mit Puffersubstanzen und
anderen in dem LAL-Reagenz benutzten Bestandteilen, und (g) die Verträglichkeit
mit bezug auf LAL und dessen Reaktion mit Endotoxinen.
Diese Verstärkungsmittel umfassen amphotere oberflächenaktive
Mittel, die in ihrer Struktur eine anionische und eine kationische Gruppe
haben. Veranschaulicht werden diese Mittel durch die Sulfobetaine der
folgenden Formel (nachfolgend Formel A):
worin
R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen,
Y irgendein unschädlicher, chemisch geeigneter Substituent, wie (1) Wasserstoff und (2) substituiertes oder unsubstituiertes niederes Alkyl mit beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Hydroxy, usw., bedeuten,
R₂ und R₃ ausgewählt sind unter substituiertem oder unsubstituiertem niederen Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Hydroxymethyl, Hydroxyäthyl, Hydroxypropyl, usw.
n = 0 oder 1,
R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, wenn n=0, und einen Alkylenrest mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, wenn n=1, und
R₅ ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen bedeuten.
R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen,
Y irgendein unschädlicher, chemisch geeigneter Substituent, wie (1) Wasserstoff und (2) substituiertes oder unsubstituiertes niederes Alkyl mit beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Hydroxy, usw., bedeuten,
R₂ und R₃ ausgewählt sind unter substituiertem oder unsubstituiertem niederen Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Hydroxymethyl, Hydroxyäthyl, Hydroxypropyl, usw.
n = 0 oder 1,
R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, wenn n=0, und einen Alkylenrest mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, wenn n=1, und
R₅ ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit beispielsweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen bedeuten.
Der Ausdruck "Alkylen", wie er hier benutzt wird, umfaßt
Polymethylenreste und andere zweiwertige gesättigte aliphatische Reste.
Demzufolge kann in der durch den Alkylenrest gebildeten, verbindenden
Gruppe eine Verzweigung vorliegen. Der Ausdruck "niederes" bedeutet
einen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
benutzten Sulfobetaine sind in der Technik bekannt und als zwitterionische,
oberflächenaktive Mittel beschrieben worden. Die Herstellung dieser
Verbindungen ist beispielsweise beschrieben von G. W. Fernley in "Journal
of American Oil Chemists Society", Januar 1978, Bd. 55, Seiten 98-103
und von R. Ernst in der US-PS 32 80 179 auf die hier bezug genommen
wird.
Bei den bevorzugten oberflächenaktiven Sulfobetainen sind
R₂ und R₃ in der obigen Struktur Methyl. Vorzugsweise bedeutet R₁ auch
Propylen.
Ein Typ des oberflächenaktiven Sulfobetains, der verwendet
werden kann, hat die obige Struktur, wobei n gleich 0 und R₄ ein Alkylrest
mit etwa 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein geradkettiger
Alkylrest, sind. Bei diesen oberflächenaktiven Sulfobetainen ist
Talgfettalkohol ein geeigneter Ausgangsstoff für die R₄-Komponente.
Dieser Alkohol weist ein Gemisch verschiedener Kettenlängen auf, wobei
eine typische Zusammensetzung etwa 66% C₁₈, 30% C₁₆, 4% C₁₄ und andere
enthält. Eine andere geeignete Quelle ist der Mittelschnitt von destilliertem
Kokosfettalkohol, der ebenfalls ein Gemisch verschiedener Kettenlängen
aufweist, wobei eine typische Zusammensetzung bei etwa 66% C₁₂,
23% C₁₄, 9% C₁₆ und 2% C₁₀ liegt.
Spezifische oberflächenaktive Sulfobetaine der obigen Struktur,
in der n gleich 0 ist, sind in der US-PS 35 39 521 angegeben, auf
die hier bezug genommen wird. Ein besonders bevorzugtes oberflächenaktives
Mittel dieses Typs ist N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-
1-propansulfonat, das im Handel von der Calbiochem-Behring Corp. unter
dem Warenzeichen ZWITTERGENT 3-14 erhältlich ist.
Ein anderer Typ der oberflächenaktiven Sulfobetaine, der
benutzt werden kann, hat die oben genannte Struktur, in der n gleich 1
und R₄ ein Alkylenrest mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen sind.
In diesen Sulfobetainen mit n gleich 1 ist R₅ ein Alkylrest mit etwa
8 bis 18 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist R₅ geradkettig. Wie
oben erläutert, sind Talgfettalkohol und Kokosfettalkohol geeignete
Ausgangsmaterialien für Alkylreste mit etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen.
Spezifische oberflächenaktive Sulfobetaine der obigen Struktur
mit n gleich 1 sind in der erwähnten US-PS 32 80 179 angegeben.
Besonders bevorzugte oberflächenaktive Sulfobetaine, die
in den erfindungsgemäßen Zubereitungen verwendet werden können, sind
3-(N,N-Dimethyl-N-acylamidopropylammonio)-2-hydroxypropan-1-sulfonat-e,
in denen sich die Acylgruppe von Talgfettalkohol oder Kokosfettalkohol
ableitet, wobei Kokosfettalkohol bevorzugt wird. Wie der Fachmann erkennt,
ergibt sich bei der normalen Herstellung dieser Talgfett- oder Kokosfettalkoholderivate
ein Gemisch von Sulfobetainen mit verschiedenen Kohlenstoffkettenlängen
der Acylgruppen. Wie oben erläutert, enthalten diese
Fettalkohole größtenteils Kohlenstoffkettenlängen, die zu Acylgruppen
mit der gewünschten Zahl von Kohlenstoffatomen, d. h. von etwa 8 bis
etwa 18 Kohlenstoffatomen, führen. Demzufolge sind diese aus Talg- oder
Kokosfettalkoholen erhaltenen Gemische zur Herstellung des oberflächenaktiven
Sulfobetains in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen brauchbar.
Ein für den Einsatz in dem Gemisch der Erfindung besonders bevorzugtes
Material dieser Art ist N-Kokosamido-propyl-N,N-dimethyl-N-2-
hydroxypropylsulfobetain, wofür ein Beispiel LONZAINE CS ist, das im
Handel von Lonza, Inc., Fair Lawn, New Jersey, erhältlich ist. Ein
anderes Beispiel hierfür ist VARION CAS, das im Handel von Sherex Chemical
Company, Inc., erhältlich ist.
Andere amphotere oberflächenaktive Mittel sind u. a. N-Alkylaminocarbonsäuren
mit langkettiger Alkylgruppe der Formel (nachfolgend
als Formel B bezeichnet):
die N-Alkyliminodicarbonsäuren mit langkettiger Alkylgruppe der Formel
(nachfolgend als Formel C bezeichnet):
und die N-Alkyl- oder -amidobetaine mit langkettiger Alkylgruppe der
Formel (nachfolgend als Formel D bezeichnet):
worin R₁, R₂, R₃, R₄, Y und n die gleiche Bedeutung wie in der Formel
A haben, M Wasserstoff oder salzbildendes Metall bedeutet und Y′ die
gleiche Bedeutung wie Y in Formel A hat. Y und Y′ können gleich oder
verschieden sein. Beispiele spezifischer amphoterer Detergentien sind
N-Alkyl-β-aminopropionsäure, N-Alkyl-β-iminodipropionsäure und N-Alkyl-
N,N-dimethylglycin. Die Alkylgruppe kann sich beispielsweise ableiten
von Kokosfettalkohol, Laurylalkohol, Myristylalkohol (oder einem Gemisch
aus Lauryl- und Myristylalkohol), hydriertem Talgalkohol, Cetylalkohol,
Stearylalkohol oder Mischungen dieser Alkohole. Die substituierten Aminopropion-
und Iminodipropionsäuren werden oft in Form der Natrium- oder
anderer Salze geliefert, die auch bei der praktischen Ausführung der
Erfindung eingesetzt werden können. Besondere Beispiele sind u. a. Kokosbetain,
das unter dem Namen EMCOL CC 37-18 von der Witco Chemical Corp.
verkauft wird, Kokosamidopropylbetain, das unter dem Namen LONZAINE CO
und VARION CADG von Lonza, Inc., bzw. Sherax Chemical Company verkauft
wird, N-Kokos-β-aminopropionsaures Natrium, das unter dem Namen
DERIPHAT 151 von der Henkel Corp. verkauft wird, Dinatrium-Lauryl-
β-iminodipropionat, das unter dem Namen DERIPHAT 160 von der Henkel
Corp. verkauft wird, sowie Dinatrium-N-Talg-β-iminodipropionat, das
unter dem Namen DERIPHAT 154 von der Henkel Corp. verkauft wird.
Beispiele anderer amphoterer Detergentien sind die Fettimidazoline,
wie jene, die durch Umsetzung einer langkettigen Fettsäure
(z. B. mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen) mit Diäthylentriamin und Monohalogencarbonsäuren
mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen hergestellt werden,
z. B. 1-Kokos-5-hydroxyäthyl-5-carboxy-methylimidazolin.
Spezifische Beispiele sind u. a. Kokosimidazolin, das im
Handel unter dem Namen AMPHOTERGE K-2 von Lonza, Inc., erhältlich ist,
Caprindicarboxyimidazolin, das im Handel unter dem Namen AMPHOTERGE KJ 2
von Lonza, Inc., erhältlich ist, und Kokosdicarboxyimidazolin, das vermischt
mit sulfatierten oberflächenaktiven Stoffen im Handel unter dem
Namen AMPHOTERGE 2 WAS MOD von Lonza, Inc. erhältlich ist.
Andere Beispiel von Verstärkungsmitteln sind u. a. anionische
synthetische oberflächenaktive Stoffe, die generell als Verbindungen
beschrieben werden, die in ihrer Molekülstruktur hydrophile und lipophile
Gruppen enthalten und in einem wäßrigen Medium unter Bildung
von Anionen ionisieren, welche die lipophile Gruppe und die hydrophile
Gruppe enthalten. Die Alkylarylsulfonate, die Alkansulfate und die
sulfatierten oxyäthylierten Alkylphenole sind Beispiele des anionischen
Typs oberflächenaktiver Verbindungen.
Die Alkylarylsulfonate sind eine Klasse synthetischer anionischer
oberflächenaktiver Mittel, die durch die allgemeine Formel (nachfolgend
als Formel E bezeichnet) repräsentiert wird:
(R₆)n₁ · (Y)Ar · (SO₃M)n₂
worin R₆ ein gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit
etwa 1 bis etwa 24 Kohlenstoffatomen, wobei wenigstens ein R₆ wenigstens
8 Kohlenstoffatome aufweist, n₁ eine Zahl von 1 bis 3, n₂ eine Zahl
von 1 bis 2, Ar ein Phenyl- oder Naphthylrest sind und Y und M die gleiche
Bedeutung wie in Formel B haben. R₆ kann beispielsweise Methyl, Äthyl,
Hexyl, Octyl, Tetraoctyl, iso-Octyl, Nonyl, Decyl, Dodecyl, Octadecyl
und dergl. sein.
Beispielhafte Verbindungen für Alkylarylsulfonate sind u. a.
Natriumdodecylbenzolsulfonat, Natriumdecylbenzolsulfonat, Ammoniummethyldodecylbenzolsulfonat,
Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, Natriumoctadecylbenzolsulfonat,
Natriumnonylbenzolsulfonat, Natriumdodecylnaphthalinsulfonat,
Natriumhexadecylbenzolsulfonat, Kaliumeikososylnaphthalinsulfonat,
Äthylaminundecylnaphthalinsulfonat und Natriumdocosylnaphthalinsulfonat.
Die Alkylsulfate sind eine Klasse synthetischer anionischer
oberflächenaktiver Mittel, die durch die folgende allgemeine Formel
(nachfolgend als Formel F bezeichnet) repräsentiert wird:
R₅OSO₃M
worin R₅ und M die gleiche Bedeutung wie in Formel B haben.
Beispielhafte Verbindungen der Alkylsulfat-Klasse anionischer
oberflächenaktiver Mittel sind u. a. Natriumoctadecylsulfat, Natriumhexadecylsulfat,
Natriumdodecylsulfat, Natriumnonylsulfat, Ammoniumdecylsulfat,
Kaliumtetradecylsulfat, Diäthanolaminooctylsulfat, Triäthanolaminooctadecylsulfat
und Ammoniumnonylsulfat.
Die sulfatierten oxyäthylierten Alkylphenole sind eine Klasse
synthetischer anionischer oberflächenaktiver Mittel, die durch die folgende
allgemeine Formel (nachfolgend als Formel G bezeichnet) repräsentiert
wird:
worin A Sauerstoff, Schwefel, eine Carbonamid-Gruppe, eine Thiocarbonamid-
Gruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiocarbonsäureestergruppe
und z eine ganze Zahl von 3 bis 8 bedeuten und R₅ und M die gleiche
Bedeutung wie in Formel B haben.
Beispielhafte Verbindungen aus der Klasse der sulfatierten
oxyäthylierten Alkylphenole unter den anionischen oberflächenaktiven
Mitteln sind u. a. Ammoniumnonylphenoxy-tetraäthylenoxysulfat, Natriumdodecylphenoxytriäthylenoxysulfat,
Äthanolamindecylphenoxytetraäthylenoxysulfat
und Kaliumoctylphenoxytriäthylenoxysulfat.
Andere Beispiele für LAL-Verstärkungsmittel sind u. a. nichtionische
oberflächenaktive Verbindungen, die allgemein als Verbindungen
beschrieben werden, die nicht ionisieren, aber durch eine Sauerstoff
enthaltende Seitenkette, wie etwa Polyoxyäthylen, hydrophile Eigenschaften
annehmen, und wobei der lipophile Teil des Moleküls von Fettsäuren,
Phenol, Alkoholen, Amiden oder Aminen herrührt. Die Verbindung werden
gewöhnlich dadurch hergestellt, daß man ein Alkylenoxid, wie Äthylenoxid,
Butylenoxid, Propylenoxid und dergl., mit Fettsäuren, gerad- oder verzweigtkettigen
Alkoholen mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen, Phenolen,
Thiophenolen, Amiden und Aminen unter Bildung von Polyoxyalkylenglycoäthern
und -estern, Polyoxyalkylenalkylphenolen, Polyoxyalkylenthiophenolen,
Polyoxyalkylenamiden und dergl. umsetzt. Im allgemeinen setzt
man vorzugsweise etwa 3 bis etwa 30, insbesondere 10 bis 30, Mole Alkylenoxid
je Mol Fettsäure, Alkohol, Phenol, Thiophenol, Amid oder Amin um.
Beispielhaft für diese nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittel sind die Produkte, die man erhält durch Umsetzung von Alkylenoxid
mit einem aliphatischen Alkohol mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen,
wie etwa Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Octadecyl-, Dodecyl-, Tetradecylalkohol
und dergl., mit Monoestern sechswertiger Alkohole, deren Estergruppe
10 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, wie Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat
und Sorbitanmonopalmitat, mit einem Alkylphenol, in dem die
Alkylgruppe zwischen 4 und 20 Kohlenstoffatome enthält, wie Butyl-,
Dibutyl-, Amyl-, Octyl-, Dodecyl-, Tetradecyl- und dergl., sowie mit
einem Alkylamin, in dem die Alkylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält.
Beispielhafte Verbindungen synthetischer, nicht-ionischer
Mittel sind u. a. die Produkte, die man durch Kondensation von Äthylenoxid
oder Propylenoxid mit den folgenden Verbindungen erhält: Propylenglycol,
Äthylendiamin, Diäthylenglycol, Dodecylphenol, Nonylphenol,
Tetradecylalkohol, N-Octadecyldiäthanolamid, N-Dodecylmonoäthanolamid,
Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleat, das unter dem Namen TWEEN 80
verkauft wird, sowie Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonolaurat, das unter
dem Namen TWEEN 20 verkauft wird.
Andere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel sind u. a.
langkettige tertiäre Aminoxide entsprechend der folgenden allgemeinen
Formel (nachfolgend als Formel H bezeichnet):
R₅R₇R₈N → O
worin R₅ die gleiche Bedeutung wie in Formel A hat und R₇ und R₈ Methyl-
oder Äthylreste bedeuten. Der Pfeil in der Formel ist die übliche Darstellung
einer semipolaren Bindung. Beispiele von Aminoxiden, die für
den Einsatz nach der Erfindung geeignet sind, sind u. a. Dimethyldodecylaminoxid,
Dimethyloctylaminoxid, Dimethyldecylaminoxid, Dimethyltridecylaminoxid,
Dimethylhexadecylaminoxid.
Kationische oberflächenaktive Mittel können ebenfalls als
LAL-Verstärkungsmittel verwendet werden. Diese Mittel sind jene oberflächenaktiven
Verbindungen, die eine organische hydrophobe Gruppe und
eine kationische löslichmachende Gruppe enthalten. Typische kationische
löslichmachende Gruppen sind Amin und quaternäre Gruppen. Diese kationischen
oberflächenaktiven Mittel werden durch die folgende allgemeine
Formel (nachfolgend als Formel I bezeichnet) dargestellt
worin R₅, Y und Y′ die gleiche Bedeutung wie in Formel C haben. Ein
Beispiel ist QUATERNARY O, das von Ciba-Geigy Corp. erhältlich ist.
Andere Beispiele geeigneter synthetischer kationischer oberflächenaktiver
Mittel sind die Diamine, wie etwa jene der Formel (nachfolgend
als Formel J bezeichnet):
R₉NHC₂H₄NH₂
worin R₉ eine Alkylgruppe mit etwa 12 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet,
wie z. B. N-2-Aminoäthylstearylamin und N-2-Aminoäthylmyristylamin, sowie
amid-gebundene Amine, wie jene der Formel (nachfolgend als Formel K
bezeichnet):
R₅CONHC₂H₄NH₃
wie z. B. N-2-Aminoäthylstearylamid und N-2-Aminoäthylmyristylamid, sowie
ferner quaternäre Ammoniumverbindungen, bei denen im typischen Fall
eine der an das Stickstoffatom gebundenen Gruppen eine Alkylgruppe mit
1 bis 3 Kohlenstoffatomen einschließlich solcher Alkylgruppen mit 1
bis 3 Kohlenstoffatomen und inerten Substituenten, wie Phenylgruppen,
ist, und ein Anion, wie Halogenid, Acetat, Methylsulfat usw., anwesend
ist. Typische quaternäre Ammoniumverbindungen sind Äthyldimethylstearylammoniumchlorid,
Benzyldimethylstearylammoniumchlorid, Benzyldimethylammoniumchlorid,
Trimethylstearylammoniumchlorid, Trimethylcetylammoniumbromid,
Dimethyläthyldilaurylammoniumchlorid, Dimethylpropylmyristylammoniumchlorid
und die entsprechenden Methosulfate und
Acetate.
Andere geeignete kationische oberflächenaktive Mittel werden
durch die Formel (nachfolgend als Formel L bezeichnet) repräsentiert:
worin R₅ die gleiche Bedeutung wie in Formel A hat und jedes a eine
ganze Zahl von 1 bis 15 ist. Ein Beispiel ist das Polyäthylenglycolamin
des hydrierten Talgs, in dem R₅ den Talgrest darstellt und a+a einen
mittleren Wert von 5 hat. Es ist erhältlich von der Ciba-Geigy Corp.
unter dem Handelsnamen BINA COBA 3001.
Wie oben erwähnt, wird das Lysat-Verstärkungsmittel in verstärkenden
Mengen benutzt, d. h. ausreichenden Mengen, um den endogenen
Endotoxin-Inhibitor in dem Lysat zu neutralisieren oder teilweise zu
neutralisieren. Im allgemeinen ist dies eine Menge von etwa 0,001 bis
1,0% (w/v), vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 0,05% (w/v), bezogen
auf das Gesamtvolumen des Lysats. Häufig stören Mengen, die über eine
verstärkende Menge hinausgehen, die Fähigkeit des LAL, während der
Prüfung mit dem Endotoxin zu reagieren.
LAL kann durch die in der Technik bekannten Verfahren hergestellt
werden, z. B. nach dem Verfahren der GB-PS 15 22 127, auf die
hier bezug genommen wird.
Beispielsweise wird die Hämolymphe von gesunden Exemplaren
des Limulus Polyphemus in einer gerinnungshemmenden Salzlösung gesammelt,
wie allgemein von Levin und Bang in dem Aufsatz "Gerinnbares Protein
im Limulus: Seine Lokalisierung und die Kinetik seiner Koagulation durch
Endotoxin", Thromb. Diath. Haemorrh. 19 (1968) 186-197, beschrieben
wurde. Die Amoebocyten werden gesammelt und mit der gerinnungshemmenden
Salzlösung gewaschen, und die Amoebocyten werden durch Zentrifugieren
von dem Antikoagulierungsmittel getrennt.
Die abgetrennten Amoebocyten werden in Wasser suspendiert,
und die osmotische Zerstörung der Zellen wird durch mechanische Bewegung
vervollständigt. Die Zellreste werden durch Zentrifugieren von
dem Lysat abgetrennt, und die Lysat-Fraktionen werden vereinigt und
bei 0 bis 4°C aufbewahrt.
Zur Herstellung des LAL-Reagenz werden die vorerwähnten
LAL-Fraktionen im allgemeinen auf einen geeigneten pH-Bereich, z. B.
5,5 bis 8,5, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, mit einer geeigneten Puffersubstanz
gepuffert. Geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise Tris(hydroxymethyl)-
aminomethan, Tris(hydroxymethyl)aminomethanmaleat, 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure,
Morpholinpropansulfonsäure, N-2-Hydroxyäthylpiperazin-
N′-2-äthansulfonsäure, Triäthanolamin, Imidazol und Tris(hydroxymethyl)
imidazol. Dann kann das LAL-Reagenz auf Serumampullen, die z. B.
1,2 oder 5,2 ml Lösung enthalten, verteilt und lyophilisiert werden.
Normalerweise werden die Ampullen nach der Lyophilisierung abgedichtet
und gekühlt (1 bis 5°C).
Die Empfindlichkeit des LAL-Reagenz gegenüber Endotoxin
wird durch Zugabe niedriger Konzentrationen zweiwertiger und einwertiger
Kationen weiter gesteigert. Calcium- und Manganionen sind die bevorzugten
zweiwertigen Ionen, wenngleich andere Erdalkaliionen, wie Magnesium-
und Strontiumionen oder andere zweiwertige Ionen eingesetzt werden können.
Magnesium- und Strontiumionen sind ebenfalls bevorzugte zweiwertige
Ionen. Natriumionen sind die bevorzugten einwertigen Ionen, jedoch können
auch andere einwertige Ionen, insbesondere Alkalimetallionen, wie
Lithiumionen, eingesetzt werden. Die Chloride (CaCl₂, NaCl, usw.) sind
geeignete Quellen für diese Ionenzusätze, wenngleich auch andere Salze
verwendet werden können. Vorzugsweise werden diese Elektrolyte in Mengen
zugesetzt, die die Endotoxin-Empfindlichkeit steigern, z. B. liegt bei
dem zweiwertigen Kation (z. B. Ca²⁺) die Konzentration in dem Bereich
von 0,0001 bis 0,4 molar, und für das einwertige Kation (z. B. Na⁺) liegt
die Konzentration in dem Bereich von 0,01 bis 0,4 molar.
Das LAL-Reagenz kann auch herkömmliche Hilfsstoffe, wie
Stabilisatoren, einschließlich Lactose, enthalten. Diese Hilfsstoffe
werden bei der Verwendung in geringeren Mengen zugesetzt, die ausreichen,
um die beabsichtigten Qualitäten zu erreichen, jedoch nicht die gewünschten
Eigenschaften der LAL-Reagentien beeinträchtigen.
Alle obigen Arbeitsgänge werden ausgeführt unter Lysatbehandlungsbedingungen,
die gewährleisten, daß das Endprodukt steril und frei
von Endotoxin ist. Maßnahmen, die die Freiheit von Endotoxin gewährleisten,
sind in der Technik bekannt. Beispielsweise können anorganische
Zusätze (CaCl₂, NaCl, usw.) durch Erhitzen der trockenen Salze auf 250°C
für einen Zeitraum von wenigstens 120 Minuten frei von Endotoxin gemacht
werden. Organische Zusätze müssen gewöhnlich wegen ihrer Schmelzpunkte
usw. gelöst und sauer (pH<5) oder alkalisch (pH<9) gemacht werden,
und die Lösung muß zur Zerstörung irgendwelcher anwesender Endotoxine
30 bis 60 Minuten oder länger bei 121°C im Autoklaven behandelt werden.
Wie erwähnt, ist die Erfindung ferner gerichtet auf ein
LAL-Reagenz, das als den wesentlichen Bestandteil eine wäßrige Dispersion
von LAL, ein die LAL-Empfindlichkeit verstärkendes Mittel entsprechend
obiger Beschreibung in einer das Lysat verstärkenden Menge, sowie
eine puffernde Menge eines geeigneten, oben beschriebenen Puffers enthält.
Wahlweise können die oben beschriebenen einwertigen und zweiwertigen
Kationen in die Lysatempfindlichkeit steigernden Mengen enthalten
sein, um die Empfindlichkeit des Lysats gegenüber Endotoxin weiter zu
erhöhen.
Normalerweise liegt das Lysat in dem erfindungsgemäßen Reagenz
in einer Endotoxin bestimmenden Menge vor, z. B. in einer Menge, die
ausreicht, um Endotoxine in einer anschließenden LAL-Untersuchung auf
Endotoxin zu bestimmen. Im allgemeinen ist dies eine Menge, die etwa
0,007 bis etwa 0,5 ng/ml, vorzugsweise etwa 0,007 bis etwa 0,050 ng/ml
FDA-Bezugsendotoxin EC-2 feststellt. Das vorerwähnte LAL-Reagenz wird
vorzugsweise lyophilisiert.
Gemäß der Erfindung kann das LAL-Reagenz zur Endotoxin-
Bestimmung unter Endotoxin bestimmenden Bedingungen nach der Methode
benutzt werden, wie sie beispielsweise in der GB-PS 15 22 127 und in
den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung; alle Teile
bedeuten Gewicht/Volumen, wenn nichts anderes angegeben ist.
Limulus-Lysat wurde hergestellt nach einem Verfahren, das
gegenüber dem ursprünglich von Levin und Bang (Thromb. Diath. Haemorrh.
19, (1969) 186) beschriebenen Verfahren modifiziert wurde. Hufeisenkrabben,
Limulus polyphemus, wurden aus dem Atlantik in der Nähe von Beaufort,
N. C., entnommen. Etwa 500 ml Haemolymphe wurden durch Herzpunktion
mit einer Nadel von 1,27 mm Durchmesser entnommen und in einer endotoxinfreien
Zentrifugenglasflasche von 1 Liter Inhalt gesammelt, die 500 ml
einer 0,125% N-Äthylmaleimid enthaltenen, endotoxinfreien, auf 42°C
erwärmten 3%igen Salzlösung enthielt. Die Zentrifugenflasche, welche
die Haemolymphe/Antikoagulierungsmittel-Lösung enthielt, wurde 8 Minuten
auf 42°C erwärmt und dann 10 Minuten bei 150 g zentrifugiert. Das überstehende
Plasma wurde dekantiert, und die Amoebocytentablette wurde
erneut in Antikoagulierungsmittellösung suspendiert. Die Zellen wurden
abermals wie zuvor durch Zentrifugieren tablettiert. Die zusammengepreßten
Zellen wurden erneut in pyrogenfreier 0,9%iger Salzlösung suspendiert
und in ein depyrogeniertes 50-ml-Zentrifugenrohr aus Kunststoff überführt.
Die gewaschenen Zellen wurden wiederum bei 150 g zentrifugiert. Nach
Dekantieren der Salzlösung wurden die zusammengepreßten Amoebocyten
durch Zugabe von pyrogenfreiem Wasser zur Injektion in einem Verhältnis
von 7 ml Wasser zu 3 ml zusammengepreßte Zellen zerstört. Nach Mischen
in einem Wirbelmischer für einen Zeitraum von 10 bis 15 Sekunden wurden
die lysierten Zellen 24 Stunden bei 1 bis 5°C aufbewahrt. Die Zellreste
wurden durch Zentrifugieren bei 1500 g für einen Zeitraum von etwa 15
Minuten sedimentiert. Das Lysat wurde dekantiert und bei 0 bis 4°C
aufbewahrt. Der Zellrückstand wurde verworfen.
Es wurden Standard-Lösungen des FDA-Bezugsstandard-Endotoxin
Lot EC-2 in pyrogenfreiem Wasser zur Injektion hergestellt. Die Wiederherstellung
von 1 µg Endotoxin mit 10 ml Wasser in einer Ampulle lieferte
eine Ausgangskonzentration von 0,1 µg/ml. Die Ampulle wurde auf einem
hin und her gehenden Schüttler 1 Stunde geschüttelt. Es wurden fortlaufende
Verdünnungen vorgenommen, um die folgenden Endotoxin-Konzentrationen
zu erhalten: 10 ng/ml, 1 ng/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml,
31,25 pg/ml, 15,6 pg/ml und 7,8 pg/ml. Nach der Herstellung wurden die
Endotoxin-Lösungen bis zu 48 Stunden aufbewahrt und dann verworfen.
Andere benutzte Endotoxin-Standard-Lösungen waren Lösungen des FDA-
Bezugsendotoxin Lot Nr. 1 von Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli
Endotoxin Lot 071857 (Difco) sowie eine in unserem Laboratorium hergestellte
Umformulierung von Bezugsendotoxin Lot EC-2. Die aus dem Endotoxin
von E. coli Lot 071857 hergestellten Endotoxin-Standardlösungen hatten
die folgenden Konzentrationen: 6,25, 12,5, 50, 75, 100, 150 und 200 pg/ml.
Lysat-Verdünnungen von 25 bis 70% wurden in einem 0,1 m
Puffer von pH=7,0 hergestellt, der gewöhnlich Tris, d. h. Tris(hydroxymethyl)-
aminomethan, war. Andere benutzte Puffer waren u. a. Imidazol,
Trisimidazol, Triäthanolamin, Trismaleat, N-2-Hydroxyäthylpiperazin-
N-2-äthansulfonsäure (HEPES), 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure (PIPES)
und Morpholinpropansulfonsäure (MOPS).
Um die Empfindlichkeit des Lysats zu bestimmen, wurde 0,1 ml
von jeder dieser Endotoxin-Verdünnungen mit 0,1 ml Lysat in depyrogenierten
Glasröhrchen mit Schraubkappe der Größe 10×75 mm vereinigt und
eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse wurden in der Weise
bestimmt, daß man jedes Rohr allmählich um 180° umdrehte. Ein Pfropfen,
der nach dem Umdrehen unversehrt blieb, zeigte einen positiven Endotoxin-
Test an.
Stammlösungen des Mittels zur Verstärkung der LAL-Empfindlichkeit
wurden in Konzentrationen bis zu 10% (w/v) aktive Bestandteile in
wäßriger Lösung hergestellt. Am häufigsten betrug die Konzentration
1% (w/v). Obgleich das Verfahren von einem Mittel zu dem nächsten in
den Mengen variierte, war in 50 ml wäßriger Lösung genug Material gelöst,
um bei Verdünnung auf 100 ml die gewünschte Konzentration zu liefern.
Die Lösung enthielt auch 7,5 ml 0,05 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan
nämlich TRIZMA BASE, Sigma Chemical Company, und 1 ml 2 n NaOH, so daß
sich ein End-pH-Wert von 11 ergab. Das Mittel in alkalischer Lösung
wurde 12 Stunden oder länger bei 0 bis 4 gelagert, um eine vollständige
Depyrogenierung zu gewährleisten. Nach Einstellung der Lösung auf
einen pH-Wert von etwa 8 wurde sie 15 Minuten oder länger bei 1,05 bar
und 121°C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert wurde schließlich
eingestellt auf pH=7,0±0,5. Die Konzentration des Mittels wurde
berechnet, und die Verdünnung so vorgenommen, daß sich die gewünschte
Endkonzentration ergab. Alkaliempfindliche Mittel wurden durch Säurebehandlung
depyrogeniert, bei der HCl und Tris-Puffer anstelle von NaOH
bzw. TRIZMA BASE benutzt wurden.
Die wie oben beschrieben hergestellten Lösungen des Mittels
wurden dem Lysat während der Verdünnung mit der Puffersubstanz zugesetzt.
Die zugesetzte Menge variierte mit dem jeweiligen Mittel; der Konzentrationsbereich
für alle getesteten Mittel war 0,001 bis 1,0% (w/v) Endkonzentration
in der Lysat-Lösung. Die Reihenfolge der Zugabe der Komponenten
führte nicht zu einer Änderung der sich ergebenden Lysat-Empfindlichkeit.
Das die LAL-Empfindlichkeit verstärkende Mittel ZWITTERGENTTM
3-14, N,N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, ein von der Calbiochem-
Behring Corp. verkauftes Sulfobetain, wurde wie oben beschrieben depyrogeniert
und auf eine Endkonzentration von 1% (w/v) verdünnt. Der Lysatansatz
9CZC wurde als 50%ige Verdünnung mit 0,1 m Trismaleat-Puffer,
pH=7,0, hergestellt. Das Verstärkungsmittel wurde zugesetzt, um Endkonzentrationen
an Lysat von 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075 und 0,10%
(w/v) zu erhalten. Eine Vergleichsprobe enthielt pyrogenfreies Wasser
anstatt des oberflächenaktiven Mittels. Die Lysat-Verdünnungen wurden
über Nacht bei 0 bis 4°C aufbewahrt und am folgenden Tag mit einer
Reihe von Verdünnungen von speziell zubereitetem EC-Endotoxin (bezeichnet
EC) geprüft. Die Ergebnisse (Tabelle I) zeigen den wirksamen Konzentrationsbereich
für das Verstärkungsmittel und die Gesamtzunahme der
Lysat-Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin im Vergleich zu dem Vergleichslysat.
Es wurden Standard-Endotoxin-Lösungen hergestellt für E. coli
Endotoxin 072857, FDA-Bezugsendotoxin EC-2 und K. pneumoniae FDA-Bezugsansatz
Nr. 1. Das Lysat wurde mit 0,1 m Tris-Puffer, pH=7,0, und der
Lösung des Verstärkungsmittels, ZWITTERGENTTM 3-14, verdünnt, so daß
sich eine 30%ige Lysat-Verdünnung ergab, die 0,02% (w/v) ZWITTERGENT 3-14
enthielt. In der Vergleichsprobe wurde das Mittel durch Wasser ersetzt.
Die Lysatprobe wurde durchgeführt mit jeder Endotoxin-Verdünnungsreihe.
Zweiundzwanzig im Handel erhältliche LAL-Verstärkungsmittel
wurden durchgemessen, um ihre Wirkungen auf die Lysat-Empfindlichkeit
gegenüber Endotoxin zu bestimmen. Es wurden Lösungen von jedem Mittel
hergestellt und dem Lysatansatz 9FI bis auf Endkonzentrationen in dem
Bereich von 0,001 bis 0,20% (w/v) zugesetzt. Die Lysatproben wurden
dann mit reformuliertem FDA-EC-Endotoxin (EC) getestet. In Tabelle III
sind die Mittel in der Reihenfolge abnehmender Wirksamkeit aufgelistet.
Die wirksamste geprüfte Konzentration in dem Lysat und ihre entsprechende
Lysat-Empfindlichkeit sind angegeben. Die Empfindlichkeit von Vergleichslysat
(50% Verdünnung), das kein Mittel enthält, ist ebenfalls aufgeführt.
Zur Feststellung, daß die erhöhte Empfindlichkeit, die in
dem mit dem Verstärkungsmittel behandelten Lysat beobachtet wurde,
während der Lyophilisierung erhalten bleibt, wurde eine 30%ige Lysat-
Verdünnung in 0,05 m Tris-Puffer mit und ohne 0,02% ZWITTERGENTTM 3-14
(Endkonzentration im Lysat) hergestellt. 1,2 ml Lysat-Lösung wurden
in jede Serumampulle von 10 ml Inhalt gegeben. Die Proben wurden bei
-35°C eingefroren und während einer Trocknungszeit von etwa 32 Stunden
unter 50 µ Vakuum lyophilisiert. Die Ampullen wurden mit Spalt-Gummistopfen
und Metallkappen abgedichtet. Das gefriergetrocknete Lysat wurde
mit 1,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion wieder hergestellt und
dann mit FDA-Bezugsendotoxin EC-2 geprüft. Das Vergleichslysat ohne
das Verstärkungsmittel hatte eine Empfindlichkeit von 62,5 pg/ml. In
Gegenwart des Verstärkungsmittels war die Empfindlichkeit des Lysats
um das Zweifache auf 31,2 pg/ml verbessert.
Limulus-Lysat-Tagessammelansatz ODH, der etwa eine Woche
alt war, wurde als 40%ige Verdünnung in 0,05 m Tris(hydroxymethyl)aminomethanmaleat-
Puffer, pH=7,0, mit Endkonzentrationen von 0,06 m CaCl₂
und 0,01 m MnCl₂ und 0,03% ZWITTERGENTTM 3-14 zubereitet. Diese Lösung
wurd in aliquoten Mengen von 1,2 ml auf 8 ml Ampullen verteilt, bei
-45°C eingefroren und mit einer Trocknungszeit von etwa 28 Stunden
unter 50 µ Vakuum lyophilisiert. Die Ampullen wurden mit Spalt-Gummistopfen
abgedichtet und mit Schraubkappen aus Kunststoff überkappt. Das gefriergetrocknete
Lysat wurde mit 1,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion
wieder hergestellt und mit FDA-Bezugsendotoxin EC-2 geprüft. Die Empfindlichkeit
des mit Verstärkungsmittel behandelten, lyophilisierten Lysats
betrug 62 pg/ml. Eine zum Vergleich hergestellte 40%ige Verdünnung
von LAL ohne Verstärkungsmittel wurde vor der Lyophilisierung geprüft
und hatte eine Empfindlichkeit von 1 ng/ml.
Limulus-Lysat-Tagessammelmengen mit einer Empfindlichkeit,
die gleich oder größer als 500 pg/ml E. coli Endotoxin 1CF war, wurden
vereinigt und als eine 40%ige Verdünnung in 0,025 m Tris(hydroxymethyl)-
aminomethanmaleat-Puffer, pH=7,0, mit Endkonzentrationen von 0,02 m MgCl₂,
0,01 m SrCl₂, 0,01 m CaCl₂ und 0,025% ZWITTERGENTTM 3-14 zubereitet.
Diese Lösung wurde in aliquoten Mengen von 1,2 ml und 5,2 ml auf 10 ml-
Ampullen verteilt und bei -50°C eingefroren. Die Proben wurden während
einer Trocknungszeit von etwa 72 Stunden unter 100 µ Vakuum lyophilisiert.
Das lyophilisierte Produkt wurde je nach dem Ausgangsvolumen des Lysats
mit 1,2 ml oder mit 5,2 ml pyrogenfreiem Wasser zur Injektion wieder
hergestellt. Bei Prüfung mit E. coli-Endotoxin 1CF im Anschluß an die
Lyophilisierung war die Empfindlichkeit des mit Verstärkungsmittel behandelten,
lyophilisierten Lysats bei den beiden Probegrößen 25 pg/ml,
verglichen mit einer Empfindlichkeit der Vergleichsprobe von 500 pg/ml.
Claims (17)
1. Verfahren zur Herstellung eines Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz
mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin aus einem Limulusamoebocyten-
Lysat von durch die Anwesenheit eines endogenen Lysat-Inhibitors
herabgesetzter Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin, dadurch gekennzeichnet,
daß man dem Limulusamoebocyten-Lysat ein die Lysat-Empfindlichkeit
verstärkendes Mittel zusetzt, das man auswählt unter
- (I) amphoteren oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formeln
worin
R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis 4 C-Atomen,
Y und Y′ Wasserstoff, niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,
R₂ und R₃ niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,
n die Zahl 0 oder 1,
R₄ ein Alkyl mit 8 bis 18 C-Atomen, wenn n=0, oder ein Alkylenrest mit 1 bis 6 C-Atomen, wenn n=1,
R₅ ein Alkyl mit 8 bis 18 C-Atomen, und
M Wasserstoff, Natrium, Kalium oder Ammonium bedeuten; - (II) anionische oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formeln
(E) (R₆)n₁ · (Y)Ar · (SO₃M)n₂(F) R₅OSO₃M,worin
R₅, Y und M die gleiche Bedeutung wie oben haben,
R₆ ein Alkyl mit 8 bis 24 C-Atomen,
n₁ eine ganze Zahl von 1 bis 3,
n₂ die Zahl 1 oder 2, und
Ar Phenyl oder Naphthyl bedeuten; - (III) kationische oberflächenaktiven Mitteln der Formel worin R₅, Y und Y′ die gleiche Bedeutung wie oben haben; und
- (IV) nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln der folgenden Formel
(H) R₅R₇R₈N → Oworin
R₅ die gleiche Bedeutung, wie oben hat,
R₇ und R₈ jeweils Methyl oder Äthyl sind, sowie den nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln aus der Gruppe, die aus den Kondensationsprodukten von 10 bis 20 Molen Äthylenoxid mit dem Monoester eines 6 C-Atome enthaltenden, sechswertigen Alkohols besteht, wobei die Estergruppe 10 bis 20 C-Atome enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Verstärkungsmittel der Formel (A) in einer Menge von 0,01 bis 0,05
(w/v) anwesend ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n die
Zahl 0, R₄ Tetradecyl, R₂ und R₃ jeweils Methyl und
Trimethylen
bedeuten.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n die
Zahl 1, R₄ Trimethylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und
bedeuten.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Verstärkungsmittel der Formel (D) in einer Menge von 0,01 bis 0,05
(w/v) anwesend ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß n die
Zahl 1, R₄ Propylen, R₂ und R₃ jeweils Methyl und
Methylen bedeuten.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß n die
Zahl 0, R₂ und R₃ jeweils Methyl und
Methylen bedeuten.
8. Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz zur Endotoxin-Bestimmung mit
verbesserter Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin, bestehend aus einer
gepufferten wäßrigen Dispersion von Limulusamoebocyten-Lysat,
gekennzeichnet durch ein dem Lysat zugesetztes, die Lysat-Empfindlichkeit
verstärkendes Mittel, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
- (I) amphotere oberflächenaktive Mittel der folgenden Formeln
worin
R₁ ein Alkylenrest mit 1 bis 4 C-Atomen,
Y und Y′ Wasserstoff, niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,
R₂ und R₃ niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl,
n die Zahl 0 oder 1,
R₄ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, wenn n=0, oder ein Alkylenrest mit 1 bis etwa 6 C-Atomen, wenn n=1,
R₅ ein Alkyl mit etwa 8 bis etwa 18 C-Atomen, und
M Wasserstoff, Natrium, Kalium oder Ammonium bedeuten; - (II) anionische oberflächenaktive Mittel der folgenden Formeln
(E) (R₆)n₁ · (Y)Ar · (SO₃M)n₂(F) R₅OSO₃M,worin
R₅, Y und M die gleiche Bedeutung wie oben haben,
R₆ ein Alkyl mit 8 bis 24 C-Atomen,
n₁ eine ganze Zahl von 1 bis 3,
n₂ die Zahl 1 oder 2, und
Ar Phenyl oder Naphthyl bedeuten; - (III) kationische oberflächenaktive Mittel der Formel
worin
R₅, Y und Y′ die gleiche Bedeutung wie oben haben; und - (IV) nicht-ionischen oberflächenaktive Mittel der folgenden Formel
(H) R₅R₇R₈N → Oworin
R₅ die gleiche Bedeutung, wie oben hat,
R₇ und R₈ jeweils Methyl oder Äthyl sind, sowie
die nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel aus der Gruppe, die aus den Kondensationsprodukten von 10 bis 30 Molen Äthylenoxid mit dem Monoester eines 6 C-Atome enthaltenden, sechswertigen Alkohols besteht, wobei die Estergruppe 10 bis 20 C-Atome enthält.
9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
es zusätzlich die Kationen Na⁺, Mn⁺⁺ und Ca⁺⁺ in die Lysat-Empfindlichkeit
steigernden Mengen enthält.
10. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
es zusätzlich die Kationen Na⁺, Sr⁺⁺, Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ in die Lysat-
Empfindlichkeit steigernden Mengen enthält.
11. Reagenz nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das Lysat in einer Menge zum Nachweis von 0,007 bis 0,50 ng/ml
FDA-Bezugsendotoxin EC-2 anwesend ist.
12. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei
einem Verstärkungsmittel der Formel (A) n die Zahl 0, R₄ Tetradecyl,
R₂ und R₃ jeweils Methyl und
Trimethylen sind.
13. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei
einem Verstärkungsmittel der Formel (A) n die Zahl 1, R₄ Trimethylen,
R₂ und R₃ jeweils Methyl und
sind.
14. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei
einem Verstärkungsmittel nach Formel (D) n die Zahl 1, R₄ Propylen,
R₂ und R₃ jeweils Methyl und
Methylen sind.
15. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei
einem Verstärkungsmittel nach Formel (D) n die Zahl 0, R₂ und R₃
jeweils Methyl und
Methylen sind.
16. Reagenz nach einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet,
daß es lyophilisiert ist.
17. Verwendung des Limulusamoebocyten-Lysat-Reagenz nach einem
der Ansprüche 8 bis 16 für die Endotoxin-Bestimmung.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US16345680A | 1980-06-27 | 1980-06-27 | |
US06/254,233 US4322217A (en) | 1980-06-27 | 1981-04-14 | Process for preparing Limulus lysate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3125181A1 DE3125181A1 (de) | 1982-03-04 |
DE3125181C2 true DE3125181C2 (de) | 1991-09-05 |
Family
ID=26859656
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19813125181 Granted DE3125181A1 (de) | 1980-06-27 | 1981-06-26 | Verfahren zur herstellung von limulus-lysat |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4322217A (de) |
AU (1) | AU545395B2 (de) |
CH (1) | CH647871A5 (de) |
DE (1) | DE3125181A1 (de) |
FR (1) | FR2485740A1 (de) |
GB (1) | GB2080524B (de) |
IT (1) | IT1211070B (de) |
NL (1) | NL8103113A (de) |
SE (1) | SE447029B (de) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8827557D0 (en) * | 1988-11-25 | 1988-12-29 | Radiometer Corporate Dev Ltd | Process for handling horseshoe crab amoebocyte lysate |
US5002015A (en) * | 1988-12-09 | 1991-03-26 | Aerotrace Hydraulics, Inc. | Submerged treadmill system for exercising animals |
EP0426395B1 (de) * | 1989-10-30 | 1997-01-22 | Biowhittaker, Inc. | Kinetische Bestimmungsmethode für Endotoxin unter Verwendung von Limulus-Amoebocyten-Lysat und chromogenem Substrat |
JP2957251B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1999-10-04 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定法 |
EP0549102B1 (de) * | 1991-12-25 | 1996-07-03 | Maruha Corporation | Reagenzien und Verfahren zur Bestimmung von Beta-Glucanen |
JP2737514B2 (ja) * | 1992-01-24 | 1998-04-08 | 和光純薬工業株式会社 | エンドトキシン測定用試料の前処理方法 |
CA2112776C (en) * | 1993-01-21 | 2002-11-12 | Masakazu Tsuchiya | Process for inhibiting activity of endotoxin |
JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
JP3429036B2 (ja) * | 1993-09-30 | 2003-07-22 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの特異的測定剤 |
US5716834A (en) * | 1994-08-19 | 1998-02-10 | National University Of Singapore | Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme |
US5637474A (en) * | 1994-10-31 | 1997-06-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring amount of endotoxin or (1→3)-β-D-glucan by kinetic turbidimetric method |
US6270982B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-08-07 | Charles River Laboratories | Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins |
PT1409984E (pt) * | 2001-06-28 | 2009-10-29 | Lonza Walkersville Inc | Processos e reagentes para a detecção de endotoxinas |
US7828741B2 (en) * | 2002-12-20 | 2010-11-09 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Utilizing lipopolysaccharide in exhaled breath condensate to diagnose gram negative pneumonia |
AU2003300356A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-22 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Disposable hand-held device for collection of exhaled breath condensate |
WO2004073497A2 (en) * | 2003-02-14 | 2004-09-02 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Device and method for collection of exhaled alveolar breath condensate |
ATE452986T1 (de) | 2003-03-17 | 2010-01-15 | Charles River Lab Inc | Methoden und zusammensetzungen für den nachweis mikrobieller verunreinigungen |
US20050026239A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-02-03 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions |
US20050048655A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-03-03 | Novitsky Thomas J. | Kit for detecting endotoxin |
US7968280B2 (en) * | 2004-12-02 | 2011-06-28 | Charles River Laboratories, Inc. | Methods for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants |
ATE419526T1 (de) | 2005-01-13 | 2009-01-15 | Charles River Lab Inc | Verfahren zur klassifizierung von mikroben in einer biologischen probe |
WO2009137244A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-11-12 | Charles River Laboratories, Inc. | Cartridge and method for sample analysis |
EP2147981A1 (de) | 2008-07-25 | 2010-01-27 | Biotype AG | Kit und Verfahren zur Auswertung der Detektionseigenschaften bei Verstärkungsreaktionen |
JP5437660B2 (ja) | 2009-02-19 | 2014-03-12 | 興和株式会社 | コアギュロゲン原料及びその製造方法、それを用いた生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
MY155541A (en) * | 2010-10-29 | 2015-10-30 | Universiti Malaysia Terengganu | Process for the preparation of amoebocyte lysate from the haemolymph of the horseshoe crab |
CU24073B1 (es) | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem | COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS |
SG11201900767VA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Lonza Walkersville Inc | Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3280179A (en) * | 1961-03-16 | 1966-10-18 | Textilana Corp | Processes for producing acyclic surfactant sulfobetaines |
US3368978A (en) * | 1964-12-28 | 1968-02-13 | Monsanto Co | Builder compositions and detergent compositions using same |
US3539521A (en) * | 1965-05-03 | 1970-11-10 | Procter & Gamble | Detergent composition |
US3915805A (en) * | 1970-05-25 | 1975-10-28 | Univ Johns Hopkins | Quantitative detection of endotoxin in biological fluids |
US3954663A (en) * | 1972-12-18 | 1976-05-04 | Teikoku Horinine Mfg. Co. Ltd. | Process for the preparation of Limulina lysate |
US4096091A (en) * | 1974-07-17 | 1978-06-20 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor |
US3944391A (en) | 1974-12-27 | 1976-03-16 | Preventive Systems, Inc. | In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid |
US4107077A (en) * | 1975-07-14 | 1978-08-15 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Limulus lysate of improved sensitivity and preparing the same |
US4038029A (en) * | 1976-01-20 | 1977-07-26 | Worthington Biochemical Corporation | Limulus lysate turbidity test for pyrogens |
GB1522127A (en) | 1976-07-23 | 1978-08-23 | Mallinckrodt Inc | Limulus amebocyte lysate reagent compositions |
GB2019563B (en) | 1978-04-20 | 1982-07-28 | Harvard College | Assay of gram-negative bacteria |
DE2927103A1 (de) * | 1978-10-06 | 1980-04-17 | Baxter Travenol Lab | Optisches verfahren zur bestimmung von endotoxin |
US4273557A (en) * | 1980-03-31 | 1981-06-16 | Mallinckrodt, Inc. | Limulus lysate procedure for determining endotoxins |
-
1981
- 1981-04-14 US US06/254,233 patent/US4322217A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-06-23 GB GB8119357A patent/GB2080524B/en not_active Expired
- 1981-06-26 NL NL8103113A patent/NL8103113A/nl not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 AU AU72321/81A patent/AU545395B2/en not_active Expired
- 1981-06-26 IT IT8122595A patent/IT1211070B/it active
- 1981-06-26 FR FR8112598A patent/FR2485740A1/fr active Granted
- 1981-06-26 CH CH4249/81A patent/CH647871A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 DE DE19813125181 patent/DE3125181A1/de active Granted
- 1981-06-26 SE SE8104016A patent/SE447029B/sv not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL192139C (de) | 1997-02-04 |
GB2080524A (en) | 1982-02-03 |
NL192139B (de) | 1996-10-01 |
SE8104016L (sv) | 1981-12-28 |
AU7232181A (en) | 1982-01-07 |
NL8103113A (nl) | 1982-01-18 |
FR2485740B1 (de) | 1985-05-24 |
FR2485740A1 (fr) | 1981-12-31 |
IT1211070B (it) | 1989-09-29 |
US4322217A (en) | 1982-03-30 |
IT8122595A0 (it) | 1981-06-26 |
AU545395B2 (en) | 1985-07-11 |
GB2080524B (en) | 1984-04-18 |
SE447029B (sv) | 1986-10-20 |
DE3125181A1 (de) | 1982-03-04 |
CH647871A5 (fr) | 1985-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3125181C2 (de) | ||
DE3112441C2 (de) | ||
DE69327775T2 (de) | Verfahren zur Vorbehandlung für Blutanalyse | |
DE2941584C2 (de) | ||
DE2933872A1 (de) | Mehrzweck-blutverduennungsmittel zur verwendung in elektronischen blutuntersuchungsgeraeten | |
DE2365629C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Limulina-Lysat oder dessen gefriergetrocknetem Pulver | |
DE2609039B2 (de) | Verfahren zum Herstellen von beständigem Natriumpercarbonat | |
EP0018353A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von nebenwirkungsfreien Plasmafraktionen | |
DE2530685C3 (de) | Limulus-Lysatlösung sowie eine Lösung zur Wiederaufbereitung von lyophUisiertem Limulus-Lysat | |
DE69833675T2 (de) | Faktor g reduzierte amebozyten-lysate zur nachweisung der bakteriellen endotoxinen | |
Schubert et al. | Interaction in solution of lysozyme with chondroitin sulfate and its parent Proteinpolysaccharide1 | |
DE3750344T2 (de) | Beschleuniger der Aktivität von Hydrolase. | |
CH620362A5 (de) | ||
DE3007579A1 (de) | Selektives medium zur isolierung von choleravibrionen | |
DE1617138A1 (de) | Hautschuetzende Wasch- und Reinigungsmittel | |
DE1906699A1 (de) | Neue Polymyxinderivate und Verfahren zu deren Herstellung | |
DE2729618A1 (de) | Reagens zur bestimmung von endotoxin und verfahren zu seiner herstellung | |
EP0461473B1 (de) | Verfahren und Mittel zur Beseitigung von Trübungen in biologischen Flüssigkeiten | |
DE2608733A1 (de) | Reagens zur bestimmung von fibrinogen, fibrinspaltprodukten und fibrinogenspaltprodukten im blut und verfahren zur herstellung desselben | |
JPS6364747B2 (de) | ||
DE69001110T2 (de) | Thrombolytische zusammensetzung enthaltender gewebetyp, plasminogenaktivatoren oder derivate davon. | |
US2132886A (en) | Method of preparing colloidal compounds of silver and mercury | |
DE69420311T2 (de) | Verfahren und Zusammensetzung zum Lysieren von Erythrozyten, Blutzusammensetzungen und Verfahren zur Leukozytanalyse | |
Booth | A water-soluble precursor of choline found in the kidney and other tissues | |
DE2450148B2 (de) | Verfahren zur Inhibierung der Wirkung von Pepsin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: WHITTAKER CORP., LOS ANGELES, CALIF., US |
|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification |
Ipc: G01N 33/579 |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: BIOWHITTAKER, INC. (N.D.GES.D.STAATES DELAWARE), W |
|
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: KOHLER, R., DIPL.-PHYS. SCHMID, B., DIPL.-ING. HOLZMUELLER, R., DIPL.-ING. DR.-ING. RUEDEL, D., DIPL.-ING. DIPL.-WIRTSCH.-ING., PAT.-ANWAELTE, 70565 STUTTGART |