FR2485740A1 - Procede permettant d'ameliorer la sensibilite d'un lysat d'amibocytes de limule (lal) vis-a-vis de l'endotoxine, reactif lal correspondant, et utilisation de ce reactif pour determiner la presence d'endotoxines - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE TRAITEMENT, DANS DES CONDITIONS DE TRAITEMENT DE LYSAT, D'UN LYSAT D'AMIBOCYTES DE LIMULE AYANT UNE SENSIBILITE DIMINUEE A L'ENDOTOXINE DU FAIT DE LA PRESENCE D'UN INHIBITEUR ENDOGENE DE LYSAT, PAR UNE QUANTITE D'UN AGENT D'AUGMENTATION DE LA SENSIBILITE DU LYSAT AYANT DES CARACTERISTIQUES D'AUGMENTATION DE LA SENSIBILITE DU LYSAT, SUFFISANTE POUR NEUTRALISER, AU MOINS PARTIELLEMENT, LEDIT INHIBITEUR DU LYSAT, EN AUGMENTANT AINSI LA SENSIBILITE DU LYSAT A L'ENDOTOXINE, LEDIT AGENT D'AUGMENTATION DE LA SENSIBILITE DU LYSAT ETANT UN SURFACTIF AMPHOTERE, UN SURFACTIF ANIONIQUE, UN SURFACTIF CATIONIQUE OU UN SURFACTIF NON IONIQUE. DETERMINATION DE LA PRESENCE D'ENDOTOXINES.

Description

PROCEDE PERMETTANT D'AMELIORER LA SENSIBILITE D'UN LYSAT

D'AMIBOCYTES DE LIMULE (LAL) VIS-A-VIS DE L'ENDOTOXINE,

REACTIF LAL CORRESPONDANT, ET UTILISATION DE CE REACTIF

POUR DETERMINER LA PRESENCE D'ENDOTOXINES.

Cette invention concerne un procédé permettant d'amé-

liorer la sensibilité d'un lysat d'amibocytes de limule (ci-

après appelé parfois LAL ou lysat) vis-à-visde l'endotoxine, ainsi qu'un réactif LAL amélioré et que l'utilisation de ce

réactif LAL.

Comme on le sait bien, l'essai LAL qui permet de détec-

ter les endotoxines est peut-être l'essai le plus pratique et le plus sensible pour déterminer les endotoxines. Les

méthodes d'essai commerciales font appel à un lysat d'ami-

bocytes de l'hémolymphe de limule obtenue à partir de 1l'es-

pèce de crabes appelés limules. Ce lysat est combiné avec des cations divalents appropriés, des tampons appropriés et d'autres ingrédients pour former un réactif LAL. Ce réactif

réagit ensuite avec l'endotoxine, pendant l'essai, en for-

mant un gel. Les fabricants de réactifs LAL éprouvent souvent des difficultés pour produire un lysat ayant la

sensibilité voulue pour détecter l'endotoxine. La sensibi-

lité d'une préparation à l'autre est également variable.

Ces problèmes sont attribués au moins en partie à la pré-

sence d'une substance inhibitrice de l'endotoxine, non défi-

nie et endogène, dans le lysat (ci-après appelée parfois "l'inhibiteur"). On ne sait pas grand chose de la nature de l'inhibiteur ou de son rôle in vivo chez le crabe limule. Des études par

électrophorèse indiquent que l'inhibiteur est une lipopro-

téine de haut poids moléculaire. Il peut fonctionner dans l'amibocyte en maîtrisant le mécanisme de défense de la coagulation. Il est également plausible que l'inhibiteur soit un composant de membrane libéré pendant la lyse des cellules. L'incertitude quant au rôle et quant à l'origine de l'inhibiteur est compliquée par le fait que le mécanisme

de l'inhibition est mal élucidé. L'inhibiteur bloque proba-

blement la réaction enzymatique d'une manière ou d'une autre,

soit par association avec l'enzyme elle-meme, soit par aaso-

ciation avec l'endotoxine, soit encore par association avec les deux. Comme certaines autres protéases de la sérine, on pense que l'enzyme qui favorise la coagulation forme un complexe avec le calcium et le glycérophospholipide. L'endo- toxine elle-même est lipoldale, par conséquent un inhibiteur à caractère lipoprotéinique serait tout à fait compatible

avec l'un ou l'autre composant.

Le fait que l'inhibiteur soit une lipoprotéine est prouvé par sa sensibilité au chloroforme. Comme décrit dans le brevet U.S. N 4.107.077, la sensibilité du LAL se trouve

sensiblement améliorée quant on traite le lysat par un sol-

vant organique tel que le chloroforme pour faire précipiter l'inhibiteur du lysat. On recueille ensuite la phase

aqueuse et on la traite pour préparer le réactif LAL.

Jusqu'à présent, le mode opératoire d'extraction par solvant susmentionné constituait le moyen le plus rapide pour améliorer la sensibilité du LAL. Malheureusement,cette

méthode présente plusieurs inconvénients. Comme il est ab-

solument nécessaire que l'absence d'endotoxines soit assurée tout au long de la production du lysat, un mode d'extraction

délicat et une centrifugation ultérieure augmentent les ris-

ques de perte de produit. Comme indiqué dans le brevet sus-

mentionné, le traitement par solvant réduit la stabilité du lysat, au point qu'il faut achever rapidement la production à basse température. De plus, le précipité séparé du lysat

par le traitement par solvant contient une quantité consi-

dérable de coagulogêne, la protéine de coagulation requise.

Le maintien d'une teneur suffisante en protéines est un impératif d'une bonne gélification pendant l'essai de l'endotoxine. Evidemment, dans ces dernières circonstances, la maîtrise de la sensibilité du réactif est difficile. Le chloroforme, qui est le solvant utilisé avec le plus de succès, est bien connu pour ses effets indésirables chez l'homme. La santé et la sécurité du personnel de production sont, par conséquent, un souci raisonnable. Il est évident qu'un procédé qui évite ces inconvénients et qui améliore pourtant la sensibilité dans la mesure voulue constituerait

un perfectionnement de la technique.

C'est par conséquent un objectif de la présente inven-

tion de procurer un procédé permettant d'améliorer de maniè-

re simple et rapide la sensibilité du LAL.

Conformément à cette invention, il est procuré un pro-

cédé pour traiter, dans des conditions de traitement du lysat, le LAL ayant une sensibilité diminuée vis-à-vis de

l'endotoxine, du fait de la présence d'un inhibiteur endo-

gène, par une quantité d'un agent d'augmentation de la sen-

sibilité du lysat suffisante pour neutraliser, au moins partiellement, l'inhibiteur du lysat, en augmentant ainsi

la sensibilité du LAL à l'endotoxine.

Il y a certains critères minimaux qui peuvent délimiter les caractéristiques d'augmentation de la sensibilité du LAL, c'est-à-dire que les agents d'augmentation de la sensibilité

du LAL qui sont utilisables dans le procédé selon l'inven-

tion doivent posséder (a) l'aptitude à accroître la sensibi-

lité du lysat jusqu'à une sensibilité appropriée, par exemple en la multipliant au moins par deux, (b) l'aptitude à résister à une dépyrogénation, c'est-à-dire à une élimination ou une destruction de l'endotoxine, par ultrafiltration ou par traitement acide à un pH inférieur à 5 ou par traitement

basique à un pH supérieur à 8, (c) l'aptitude à être stérili-

sés, par exemple par traitement à l'autoclave, par exemple à

une température égale ou supérieure à 121 C sous une pres-

sion de 1,05 kg/cm2 pendant 15 minutes, (d) l'aptitude à former des solutions aqueuses d'environ 2 % (poids/volume) à 25 C, (e) l'aptitude à fonctionner dans l'intervalle de

pH de 6,0 environ à 9 environ, (f) l'aptitude à être compa-

tibles avec des tampons et d'autres ingrédients utilisés dans le réactif LAL, et (g) l'aptitude à être compatibles

par rapport au LAL et à sa réaction avec les endotoxines.

Ces agents d'augmentation de la sensibilité comprennent

des surfactifs amphotères qui. possedent un groupement anio-

nique et un groupement cationique dans leur structure. Des exemples en sont les sulfobétaines représentées par la formule suivante (ci-après formule A) OR2

(R5-C-HN)n-R4 - N - R1 - S03-

R3 Y dans laquelle:

R est un radical alkylène ayant de 1 l environ 4 ato-

mes de carbone, Y est n'importe quel substituant approprié du point de vue chimique et non délétère, y compris (1 l'hydrogène, (2) un radical alkyle inférieur éventuellement substitué, contenant par exemple de 1 à 4 atomes de carbone, tel que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, ou le groupement hydroxy; R2 et R3 sont choisis tous deux parmi les radicaux alkyle inférieur éventuellement substitués contenant de 1 à 4 atomes de carbone, tels que par exemple les radicaux méthyle, éthyle, propyle, hydroxyéthyle, hydroxyméthyle, hydroxypropyle, etc., n = 0 ou 1, quand n = 0, R4 est un radical alkyle éventuellement substitué, contenant par exemple d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone, quand n = 1, R4 est un radical alkylène ayant d'environ 1 à environ 6 atomes de carbone, et

R5 est un radical alkyle éventuellement substitué, con-

tenant par exemple d'environ 8 à environ 18 atomes de car-

bone. I1 doit aller de soi que le terme "alkylène", dans le sens o il est utilisé ici, englobe aussi bien les radicaux polyméthylène que d'autres radicaux aliphatiques saturés divalents, et qu'il peut ainsi y avoir une ramification dans la liaison fournie par le radical alkylène. L'adjectif "inférieur" signifie un radical qui contient de 1 à 4 atomes

de carbone.

Les sulfobétaines que l'on emploie dans les composi-

tions selon la présente invention sont connues dans la tech-

nique et ont été décrites comme étant des surfactifs ampho-

lytes. La préparation de tels- composés est décrite, par exemple, par G.W. Fernley dans le JOURNAL OF AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY, Janvier 1978 (Vol. 55), pages 98-103, et par R. Ernst dans le brevet U.S. N 3.280.179, ce dernier

brevet étant incorporé ici à titre de référence.

Dans les sulfobétaines que l'on préfère comme surfactifs, R2 et R3 sont, dans la structure ci-dessus, des radicaux méthyle. Il est également préférable que R1 soit un radical propylène. Un type de surfactif sulfobétalne qui peut être employé possède la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 0 et R4 est un radical alkyle ayant d'environ 8 à 18 atomes de carbone, de préférence un radical alkyle à chaîne droite,

Pour ces surfactifs sulfobétalnes, une source commode du com-

posant R4 est un alcool gras de suif qui se compose d'un

mélange de composés ayant des longueurs de chaine différen-

tes, avec une composition type qui est d'environ 66 % de C18, 30 % de C16 et 4 % de C14 et autres. Une autre source commode est la fraction médiane d'alcools gras de coprah distillé, qui se compose elle aussi. d'un mélange de composés ayant des longueurs de chaîne différentes, une composition type comprenant environ 66 % de C12, 23 % de C14' 9 % de C16 et 2 % de C10o Des surfactifs sulfobétaines spécifiques répondant à la

structure ci-dessus dans laquelle n est égal à Q sont indi-

qués dans le brevet U.S. N 3.3539.521 qui est incorporé ici

à titre de référence. Un surfactif de ce type que l'on pré-

fère tout particulièrement est le N-tétradécyl-N,N'-

diméthyl-3-ammonio-1-propanesulfonate commercialisé par la

société Calbiochem-Behring Corporation sous la marque dépo-

sée "ZWITTERGENT" 3-14.

Un autre type de surfactif sulfobhétaine que l'on peut employer possède la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 1 et R4 est un radical alkylène ayant d'environ 1 à environ 6 atomes de carbone. Dans ces sulfobétaines dans lesquelles n est égal à 1, R5 est un radical alkyle ayant

d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone. Il. est préféra-

ble que R5 soit à chaîne droite, Comme déjà exposé, des sources commodes de radicaux alkyle ayant d'environ 10 à environ 18 atomes de carbone sont l'alcool gras de suif et

l'alcool gras de coprah.

Des surfactifs sulfobétaines spécifiques répondant à la

structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 1 sont indi-

qués dans le brevet U.S. No 3.280.179 déjà mentionné.

Les sulfobétaines que l'on préfère tout particulièrement comme surfactifs pour les composiLttons selon la présente

invention sont les 3-(N,N-diméthyl-N-acyleami:dopropyl-

ammoni.o)-2-hydroxypropane-1-sulfonates dans lesquels le radical acyle dérive d'un alcool gras de suif ou d'un alcool gras de coprah, l'alcool gras de coprah. ayant la préférence.

Il serait reconnu par l'homme du-métier que, dans la prépa-

ration normale de ces dérivés d'alcools gras de suif ou de coprah, il se formerait un mélange de sulfobétaînes avec

des longueurs variables de chaînes carbonées pour les radi-

caux acyle. Comme déjà exposé, ces alcools gras contiennent pour la majeure partie des longueurs de chaînes carbonées qui donneront des radicaux acyle ayant le nombre voulu d'atomes de carhone, c'est-à-dire d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone. Ainsi, ces mélanges obtenus à partir d'alcools gras de suif ou de coprah sont utilisables pour former le surfactif sulfobétaine dans les compositions selon la présente invention. Une substance de ce type que l'on préfère tout particulièrement utiliser dans la composition

selon la présente invention est la N-cocoamido-propyl-N,N-

diméthyl-N-2-hydroxypropylsulfobétaine, dont un exemple est la "LONZAINE CS", commercialisée par la société Lonza Inc., Fair Lawn, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique, et dont un autre exemple est le "VARION CAS" commercialisé par la société Sherex Chemical Company, Inc. D'autres surfactifs amphotères comprennent les acides aminocarboxyliques portant une longue chaîne alkylique sur l'atome d'azote, qui sont illustrés par la formule (ci-après Formule B):

R5 - N - R1 - COOM,

l il Y y les acides iminodicarboxyliques portant une longue chaîne alkylique sur l'atome d'azote qui sont illustrés par la formule (ci-après Formule C):

R5N(R 1-COOM)2

Y et les alkyl- ou amido-bétaines à longue chaîne sur l'atome d'azote qui sont illustrées par la formule (ci-après formule D)

0 R

(R5 - - HN)n - R4 - R CO

R3 Y

formules dans lesquelles R1, R2, R3, R4, Y et n ont les mêmes définitions que dans la Formule A ci-dessus, M est un atome d'hydrogène ou d'un métal formateur de sel et Y' a l1 même définition que Y dans la Formule A. Y et Y' peuvent être identiques ou différents. Des exemples de détergents

amphotères spécifiques sont l'acide N-alkyl-bêta-amino-

propionique, l'acide N-alkyl-bêta-iminodipropionique, et la N-alkyl-N,Ndiméthyl glycine; le radical alkyle peut être, par exemple, celui qui dérive de l'alcool gras de coprah, de

l'alcool laurylique, de l'alcool myristylique (ou d'un mé-

lange d'alcools laurylique et myristylique', de l'alcool de

suif hydrogéné, de l'alcool cétylïque, de l'alcool stéaryli-

que, ou d'un mélange de ces mêmes alcools. Les acides aminopropionique et iminodipropionïque substitués sont souvent fournis sous la forme de sels de sodium ou d'autres sels, qui peuvent de même être utilisés dans la pratique de

l'invention. Des exemples spécifiques comprennent la coco-

bétaine vendue par la société Witco Chemical Corporation sous le nom "EMCOL CC 37-18"; la cocoamidopropyl bétaine vendue par la société Lonza Inc. et par la société Sherex Chemical Company sous les noms respectifs "LONZAINE CO" et "VARION CADG"; le N-coco-bêta-aminopropionate de sodium vendu par la société Henkel Corporation sous le nom "DERIPHAT 151" le Nlauryl-bêta-iminodipropionate disodique vendu par la société Henkel Corporation sous le nom "DERIPHAT 160", et le N-suif-bêtaiminodipropionate disodique vendu par la société

Henkel Corporation sous le nom "DERIPHAT 154".

Des exemples d'autres détergents amphotères sont les imidazolines grasses telles que celles que l'on obtient en faisant réagir un acide gras à. chatne longue (ayant par exemple de 10 à 20 atomes de carbone) avec la diéthylène triamine et les acides monohalocarfoxyliques ayant de 2 à 6

atomes de carbone, par exemple la 1-coco-5-hydroxyéthyl-5-

carboxyméthylimidazoline.

Des exemples spécifiques comprennent la coco-

imidazoline commercialisée sous le nom "AMPHOTERGE K-2" par la société Lonza Inc., la dicarboxy-$mldazoline caprique commercialisée sous le nom "AMPHOTERGE KJ2" par la société Lonza Inc., et la dicarboxy-imidazoline de coprah mélangée avec des surfactifs sulfatés, commercialIsée sous le nom

"AMPHOTERGE 2 WAS MOD" par la société Lonzq inc.

D'autres exemples d'agents d'augmentation de la sensi-

bilité comprennent les surfactifs synthétiques anîonliques,

1Q généralement décrits comme étant les composés qui contien-

nent des groupements hydrophile et lipophile dans leur structure moléculaire et qui s'ionisent dans un milieu aqueux en donnant des anions contenant et le groupement lipophile et le groupement hydrophile. Les alkyl aryl

sulfonates, les alcane sulfates et les alkyl phénols sulfa-

tés oxyéthylés sont des exemples illustratifs du type anio-

nique de composés tensio-actifs.

Les alkyl aryl sulfonates forment une catégorie d'agents tensio-actifs anioniques synthétiques qui sont représentés par la formule générale (ciaprès Formule E): (R6)nl.(Y)Ar.(SO3M)n2 dans laquelle R6 est un radical hydrocarboné à chaine droite ou ramifiée ayant d'environ 1 à environ 24 atomesde carbone, au moins l'un des radicaux R6 ayant au moins 8 atomes de carbone; n1 vaut de 1 à 3; n2 vaut 1 ou 2; Ar est un

radical phényle ou naphtyle, et Y et M ont les mêmes défini-

tions que dans la Formule B ci-dessus. R6 peut, par exemple, être un radical méthyle, éthyle, hexyle, octyle,

tétradécyle, iso-octyle, nonyle, décyle, dodécyle, octa-

décyle, etc...

Des composés illustratifs des alkyl aryl sulfonates

comprennent le dodécylbenzène sulfonate de sodium, le décyl-

benzène sulfonate de sodium, le méthyl dodécylbenzène sulfonate d'ammonium, le dodécylbenzène sulfonated'ammonium, l'octadécylbenzène sulfonate de sodium, le nonylhenzène sulfonate de sodium, le dodécylnaphtalène sulfonate de sodium, l'heptadécylbenzène sulfonate de sodium, l'eicosyl naphtalène sulfonate de potassium, l'undécylnaphtalène sulfonate d'éthylamine et le docos.ylnaphtalène sulfonate de sodium. Les alkyl sulfates forment une catégorie d'agents tensio-actifs anioniques synthétiques qui' sont représentés par la formule générale (ci-après Formule F):

R50SO3M

dans laquelle R5 et M ont les mêmes définitions que dans la

Formule B ci-dessus.

Des composés représentatifs de la catégorie des alkyl sulfates de surfactifs anioniques comprennent l'octadécyl sulfate de sodium, l'hexadécyl sulfate de sodium, le dodécyl sulfate de sodium, le nony-l sulfate de sodium, le décyl sulfate d'ammonium, le tétradécyl sulfate de potassium, l'octyl sulfate de diéthanolamine, l'octadécyl sulfate de

triéthanolamine et le nonyl sulfate d'ammoni.um.

Les alkylphénols oxyéthylés sulfatés forment une caté-

gorie d'agents tensio-actifs ani'oniques synthétiques qui sont représentés par la formule générale (ci-après Formule G): R5 A - [CH2CH20] z - CH2CH2 - OS02M dans laquelle A est un atome d'oxygène ou de soufre, un groupement carbonamide, thiocarbonamide, carboxylique ou ester thiocarboxylique, z est un nombre entier de 3 à 8r et

R5 et M ont les mêmes définitions que dans la Formule B ci-

dessus. Des composés représentatifs de la catégorie des alkyl

phénols oxyéthylés sulfatés des surfactifs anioniques com-

prennent le nonylphénoxy tétraéthylénoxy sulfate d'ammonium, le dodécylphénoxy triéthylèneoxy sulfate de sodium, le décylphénoxy tétraéthylène-oxy sulfate d'éthanolamine et

l'octylphénoxy triéthylène-oxy sulfate de potassium.

D'autres exemples d'agents d'augmentation de la sensi-

bilité du LAL comprennent des composés tensio-actifs non

ioniques qui peuvent grosso modo être décrits comme des com-

posés qui ne s'ionisent pas mais qui acquièrent des carac-

téristiques hydrophiles à partir d'une chaine latérale oxy-

génée telle que le radical polyoxyéthylène, et dont la partie lipophile de la molécule peut provenir d'acides, de phénols, d'alcools1 d'amides ou d'amines gras. On prépare habituellement ces composés en faisqnt réagir un oxyde d'alkylène tel que l'oxyde d'éthylène, l'oxyde de butylène, l'oxyde de propylène, etc., avec un acide gras, un alcool à chaine droite ou ramifiée contenant un ou plusieurs groupe- ments hydroxyle, un phénol, un thîo-pfiénol, un amide ou une amine, pour former des polyoxyalkylène glyco-éthers et

esters, des polyoxyalkylène alkylph-énols, des polyoxy-

alkylène thiophénols, des polyoxyalkylène amides, etc, Il est généralement préférable de faire réagir d'environ 3 à environ 30, ou mieux de 10 à 30, moles d'oxyde d'alkylène par mole de l'acide, de l'alcool, du phénol, du thiophénol,

de l'amide ou de l'amine gras.

Sont représentatifs de ces surfactifs non ioniques les produits obtenus à partir de la réaction d'un oxyde d'alkylène avec un alcool aliphatique ayant de 8 à 18 atomes

de carbone, par exemple l'alcool octylique, nonylique, décy-

lique, octadécylique, dodécylique, tétradécylique, etc.; avec un monoester d'alcool hexahydrique, dont le groupement ester contient de 10 à 20 atomes de carbone, par exemple le monolaurate de sorbitanne, le mono- oléate de sorbitanne ou le monopalmitate de sorbitanne; avec un alkyi phénol dont le radical alkyle contient entre 4 et 20 atomes de carbone, par exemple le radical butyle, dibutyle, amyle, octyle, dodécyle, tétradécyle, etc.; ou avec une alkylamine dont le

radical alkyle contient entre 1 et 8 atomes de carbone.

Des composés représentatifs des surfactifs nonioniques

synthétiques comprennent les produits obtenus par condensa-

tion de l'oxyde d'éthylène ou de l'oxyde de propylène avec l'un des produits suivants: propylène glycol, éthylène diamine, diéthylène glycol, dodécyl phénol, nonyl phénol, alcool tétradécylique, N-octadécyl diéthanolamide, N-dodécyl mono-éthanolamide, mono-oléate de polyoxyéthylène (20) sorbitanne vendu sous le nom "TWEEN 80", et monolaurate de

polyoxyéthylène (20) sorbîtanne vendu sous le nom "TWEEN 20".

D'autres surfactifs non ioniques comprennent des oxydes

d'anines tertiaires à longue chaîne correspondant à la formu-

le générale suivante (ci-après Formule H):

R5R7R8N -O,

dans laquelle R5 a la même définition que dans la Formule A ci-dessus, et R7 et R8 sont chacun un radical méthyle ou

éthyle. La flèche présente dans la formule est une repré-

sentati'on conventionnelle d'une liaison semi-polaire. Des exemples d'oxydes d'amines convenant pour la présente invention comprennent l'oxyde de diméthyldodécylamine, l'oxyde de diméthyloctylamine, l'oxyde de diméthyldécylamine, l'oxyde de diméthyltridécylamine, l'oxyde de diméthylhexadécylamine, Des agents tensio-actifs cationiques peuvent également être utilisés comme agents d'augmentation de la sensibilité du LAL. Ces agents sont les composés tensio-actifs qui

contiennent un groupement hydrophobe organique et un groupe-

ment solubilisant cationique. Des groupes solubilisants

cationiques types sont les groupements amineet quaternaires.

De tels agents tensio-actifs cationiques sont représentés par la formule générale suivante (ci-après Formule I):

[R N / N\CHI2

yI II ___l l L y^No Ys dans laquelle R5, Y et Y' ont les mêmes définitions que dans la Formule C ci-dessus. Un exemple en est le produit "QUATERNARY O" commercialisé par la société Ciba-Geigy

Corporation.

D'autres exemples de surfactifs cationiques synthéti-

ques appropriés comprennent les diamines telles que celles qui répondent à la formule (ci-après Formule J):

R9NHC2H4N 2

dans laquelle R9 est un radical alkyle d'environ 12 à 22 atomes de carbone, par exemple la N-2-aminoéthyl stéaryl amine et la N-2-aminoéthyl myristyl amine; des amines à liaison amide telles que celles qui répondent à la formule (ci-après Formule K):

R5CONHC2H4NH3

telles que le N-2-amino éthylstéaryl amide et le N-amino éthyl myristyl amide; des composés d'ammonium

quaternaire dans lesquels. typiquement, l'un des groupe-

ments qui est lié à l'atome d'azote est un radical alkyle qui contient de 1 à 3 atomes de carbone, y compris de tels radicaux alkyle de 1 à 3 atomes de carbone qui portent des substituants inertes, par exemple des radicaux phényle, et sur lesquels il y a un anion tel qu'un atome d'halogène, un groupement acétate ou méthylsulfate, etc. Des composés

d'ammonium quaternaire types sont le chlorure d'éthyl-

diméthyl-stéaryl ammonium, le chlorure de benzyl-diméthyl-

stéaryl ammonium, le chlorure de benzyl-diméthyl-stéaryl ammonium, le chlorure de triméthyl stéaryl ammonium, le bromure de triméthyl cétyl ammonium, le chlorure de

diméthyléthyl dilauryl ammonium-, le chlorure de diméthyl-

propyl-myristyl ammonium, et les méthosulfates et acétates

correspondants.

Un autre surfact.f cationique convenable est représen-

té par la formule (ci-après Formule L): (CH2CH20) aHi

R5 - N

(CI2CH20) aH dans laquelle R5 a la même définition que dans la Formule A ci-dessus et chaque a est un nombre entîer de 1 à 15. Un exemple est la polyéthylène glycol amine de suif hydrogéné dans laquelle R5 représente le radical suif et a+a a une valeur moyenne de 5. Elle est commercialisée par la société Ciba-Geigy Corporation sous l'appellation commerciale

"BINA COBA 3001".

Ainsi qu'on l'a déjà mentionné, l'agent d'augmentation de la sensibilité du lysat est utilisé en quantité propre

à augmenter la sensibilité, c'est-à-dire en quantité suffi-

sante pour neutraliser, au moins partiellement, l'inhibi-

teur endogène de l'endotoxine dans le lysat. Généralement, il s'agit d'une quantité d'environ 0,001 à 1,Q % (poids/ volume), et, de préférence, d'environ 0,01% à environ 0,05%

(poids/volume) par rapport au volume total du lysat. Fré-

quemment, des quantités excédant la quantité propre à aug-

menter la sensibilité compromettent l'aptitude du LAL à réagir avec l'endotoxine pendant l'esji, Le LAL peut être préparé par des modes opératoires connus dans la technique, par exemple par le mode opératoire décrit dans le Brevet britannique NQ 1.522.127, qui est incorporé ici à titre de référence. Par exemple, on recueille l'hémolymphe de spécimens

sains de Limulus polyphemus dans une solution saline d'anti-

coagulant, comme décrit généralement par Levin et Bang --

"Clottable Protein in Limulus: Its localizationand Kinetics

of its Coagulation by Endotoxin", Thromb. Diath. Haemorrh.

19: 186-197 (1968). On recueille les amibocytes et on les lave avec la solution saline d'anticoagulant, l'amibocyte

étant séparé de l'anticoagulant par centrifugation.

On met les amibocytes séparés en suspension dans de l'eau et on complète la rupture osmotique des cellules par agitation mécanique. On sépare les débris cellulaires du lysat par centrifugation, et on rassemble les fractions du

lysat et on les conserve à 0 - 4 C.

Pour former le réactif LAL, on tamponne généralement les fractions de LAL susmentionnées dans un intervalle de pH convenable, par exemple de 5,5 à 8,5, de préférence de 6,5

à 7,5, au moyen d'un tampon approprié, par exemple le tris-

(hydroxyméthyl)aminométhane, le maléate de tris(hydroxy-

méthyl)aminométhane, l'acide 1,4-pipérazinediéthanesulfoni-

que, l'acide morpholinopropanesulfonique, l'acide N-2-

hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique, 'la triéthanol-

amine, l'imidazole et le tris(hydroxyméthyl)imidazole, On peut ensuite répartir le réactif LAL entre des fioles à sérum, contenant par exemple 1, 2 ou 5,2 ml de solution,puis le lyophiliser. Normalement, après la lyophilisation, on ferme hermétiquement les fioles et on les réfrigère (1 à C). Normalement, conformément à cette invention, on traite le LAL en ajoutant l'agent d'augmentatton de la sensibilité du lysat au LAL après que le LAL a été séparé des débris cellulaires d'amibocytes. Habituellement, on l'ajoute pendant ou au moment de la préparation du réactif LAL, par

exemple en même temps que le tampon et les autres ingré-

dients.

On augmente encore la sensi blité. du réactif LAL vis-

à-vis de l'endotoxine en ajoutant de faibles concentrations de cations divalents et monovalents. Les ions calcium et manganèse sont les ionsdivalents préférés, mais on peut faire appel à d'autres ions alcalinoterreux tels que les

ions magnésium et strontium, ou à d'autres ions divalents.

Les ions magnésium et strontium sont également des ions

divalents préférés. Les ions sodiumh sont les ions mono-

valents préférés, mais on peut faire appel à d'autres ions monovalents, notamment les ions de métaux alcalins tels que

les ions lithium. Les chlorures (CaC12, NaCl, etc.) cons-

tituent des sources commodes de ces ions ajoutés, mais on peut utiliser d'autres sels. On ajoute de préférence ces électrolytes en quantités propres à augmenter la sensibilité

vis-à-vis de l'endotoxine, par exemple pour le cation diva-

lent (Ca+2 par exemple), la concentration sera comprise

entre 0,0001 et 0,4 mole/litre, et pour le cation mono-

valent (Na par exemple), la concentration sera comprise

entre 0,01 et 0,4 mole/litre.

Le réactif LAL peut également contenir des adjuvants classiques tels que les stabilisateurs, y compris le lactose. Ces adjuvants, lorsqu'ils sont utilisés, sont ajoutés en petites quantités suffisantes pour conférer les qualités souhaitées, mais sans compromettre les propriétés

voulues des réactifs LAL.

Toutes les opérations précédentes sont menées dans des conditions de traitement du lysat, c'est-à-dire telles que le produit final soit stérile et dépourvu d'endotoxines. Les méthodes qui permettent d'assurer l'absence d'endotoxines

sont connues dans la pratique. Par exemple, on peut débar-

* rasser des endotoxines les additifs minéraux (CaCl2, NaCl, etc.) en chauffant les sels secs à 250 C pendant au moins minutes. Les additifs organiques, en raison de leurs points de fusion, par exemple, doivent d'ordinaire être dissous, être rendus acides (pH < 5) ou alcalins (pH > 9) , et la solution doit être traitée en autoclave à 1210C pendant 3a à 60 minutes ou davantage pour détruire les

endotoxines éventuellement présentes.

Ainsi qu'on l'a déja mentionné, un autre aspect de

l'invention concerne un réactif LAL contenant comme ingré-

dient essentiel une dispersion aqueuse de LAL, un agent

d'augmentation de la sensibilité du LAL comme décrit précé-

demment, en quantité propre à augmenter la sensibilité du lysat, et un tampon approprié, déjà décrit, en quantité suffisante. Facultativement, on peut ajouter des cations monovalents et divalents décrits ci-dessus, en quantités propres à augmenter la sensiBilité du lysat, pour augmenter

encore la sensibilité du lysat envers l'endotoxine.

Normalement, le lysat contenu dans le réactif selon l'invention est présent en quantité permettant de déterminer

la présence d'endotoxines, par exemple en quantité suffi-

sante pour permettre la détermination de la présence

d'endotoxines dans un essai ultérieur au LAL pour la pré-

sence d'endotoxines, et généralement il s'agit d'une quanti-

té qui permettra de détecter d'environ Q,0Q7 à environ 0,5 ng/ml, de préférence d'environ 0,007 à environ 0,050 ng/ml d'endotoxines de référence EC-2 de la FDA (Food and Drug

Administration). On peut lyophiliser le réactif LAL sus-

mentionné, ce qui est préférable.

Conformément à cette invention, on peut utiliser le réactif LAL pour déterminer la présence d'endotoxines dans des conditions propres à une telle détermination, selon le mode opératoire habituel, tel que décrit par exemple dans le brevet britannique N 1.522.127, ainst que dans les

Exemples ci-après.

Les exemples suivants illustrent l'invention; toutes les parties sont données en poids/Volume, sauf indication contraire.

PREPARATION DU LYSAT DE LIMULE

On a préparé le lysat de limule par modification d'un mode opératoire décrit à l'origine par Levin et Bang (Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186 (1969). On a pêché des crabes limules, Limulus polyphemus, dans l'Océan Atlantique au voisinage de la ville de Beaufort (Caroline du Nord). On

a prélevé l'hèmolymphe (500 ml environ) par ponction cardia-

que à l'aide d'une aiguille de calibre 16, et on l'a re-

cueillie dans une bouteille de centrifugation en verre de

un litre exempte d'endotoxines, qui contenait 500 ml de N-

éthylmaléimide à Qf125 % dans une solution sline à 3 % dépourvue d'endotoxi'nes réchauffée à 429C. On a réchauffé la bouteille de centrifugation contenant la solution d'hémolymphe et d'anticoagulant à 42 pendant 8 minutes, puis on l'a centrifugée à 150 g pendant 10 minutes, On a

fait décanter le plasma surnageant et on a remis en suspen-

sion la boulette d'amfbocytes dans la solution d'anticoagu-

lant. On a à nouveau mis les cellules sous forme de boulette par centrifugation comme précédemment. On a remis les cellules tassées en suspension dans une solution saline à

0,9 %, dépourvue de substances pyrogènes, et on les a trans-

férées dans un tube de centrifugation en matière plastique de 50 ml dépyrogéné. On a à nouveau centrifugé les cellules

lavées à 150 g. Apres avoir fait décanter la solution sali-

ne, on a rompu les amibocytes tassés en leur ajoutant de l'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, à raison de 7 ml d'eau pour 3 ml de cellules tassées. Apres

mélange dans un dispositif tourbillon pendant 10 à 15 secon-

des, on a conservé les cellules lysées pendant 24 heures à 1 - 5 C. On a fait sédimenter les débris cellulaires par centrifugation à 1500 g pendant 15 minutes environ, On a fait décanter le lysat et on l'a conservé à 0 41C, On

a jeté les débris cellulaires.

PREPARATION DE SOLUTIONS ETALONS D'ENDOTOXINES

On a prépare, dans de l'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, des solutions étalons du Lot EC-2 de

l'endotoxine étalon de référence de la FDA. La reconstitu-

tion d'l gg d'endotoxine fournie dans une fiole avec 10 ml d'eau a donné une concentration initiale de 0,1 pg/ml. On a secoué la fiole sur un disposif de secouage à va-et-vient pendant une heure. On a préparé des dilutions en série pour obtenir les concentrations d'endotoxines suivantes: ng/ml, 1 ng/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,25 pg/ml, 15,6 pg/ml et 7,8 pg/ml. Une fois préparées, on a conservé les solutions d'endotoxines pendant 48 heures puis on les a jetées. D'autres étalons d'endotoxines utilisés étaient des solutions du Lot NQ 1 d'endotoxines de référence FDA provenant de Klebsiella penumoniae, du lot 071857 d'endotoxines Escherichia coli

(Difco), et une reformulation du Lot EC-2 de référence pré-

paré dans le laboratoire de la demanderesse. Les solutions étalons d'endotoxines préparées à partier du Lot 071857 d'endotoxines d'E. colï avaient les concentrations suivantes; 6,25; 12,5; 50; 75; 100; 150 et 200 pg/ml.

METHODE D'ESSAI 'DU LYSAT

On a préparé des dilutions de lysat de 25 à 70 % dans un tampon 0,1 M à pH 7,0 qui était habituellement le "tris", c'est-à-dire le tris(hydroxyméthyl) aminométhane. D'autres tampons utilisés comprenaient l'imidazole, le tris-imidazole,

la triéthanolamine, le tris-maléate, l'acide N-2-hydroxy-

éthylpipérazine-N-2-éthanesulfonique (HEPES), l'acide 1,4-

pipérazinediéthanesulfonique (PIPES) et l'acide morpholino-

propanesulfonique (MOPS).

Pour déterminer la sensibilité du lysat, on a combiné 0,1 ml de chacune des dilutions d'endotoxine avec 0,1 ml de lysat dans des tubes en verre à bouchon fileté de 10 x 75 mm, dépyrogénés, et on les a fait incuber pendant une heure à 37 C. On a déterminé les résultats en retournant doucement chaque tube de 180 . Un caillot qui restait intact après

ce retournement indiquait un essai positif à l'endotoxine.

PREPARATION ET DEPYROGENATION DE SOLUTIONS DE SURFACTIFS

On a préparé des stocks de solutions d'agents d'augmnen-

tation de la sensibilité du LAL, à. des concentrations attei-

gnant jusqu'à 10 % d'ingrédients actifs en solution aqueuse (poids/volume) . Le plus souvent, la concentration préparée était de 1 % (poids/volume). Bien que le mode opératoire

variait quant à la quantité d'un agent à l'autre, on dis-

solvait une quantité suffisante de substance dans 5Q ml de solution aqueuse pour obtenir la concentration voulue après dilution à 100 ml. La solution contenait également 7,5 ml de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0, 05M (c'est-à-dire le produit "TRIZMA BASE", Sigma Chemical Company), et 1 ml de soude 2N pour donner un pH final supérieur ou égal à 11. On conservait l'agent contenu dans la solution alcaline

pendant 12 heures ou plus à 0 - 4QC pour assurer une dépyro-

génation complète. Après avoir ajusté la solution à pH 8 environ, on la traitait en autoclave à une température égale ou supérieure à 121 C sous 1,05 kg/cm2 pendant 15 minutes ou

plus. On ajustait finalement le pHI à 7,0 0,5. On calcu-

lait la concentration de l'agent et on ajustait la dilution

de façon à obtenir la concentration finale voulue. On dé-

pyrogénait les agents labiles sous l'effet des bases fortes en les traitant par un acide et en substituant respective- ment à la soude et au produit "TRIZMA BASE" de l'acide

chlorhydrique et le tampon "tris".

ADDITION D'AGENTS AU LYSAT

On a ajouté au lysat, pendant la dilution avec le tam-

pon, des solutions d'agents préparées comme décrit ci-

dessus. La quantité ajoutée variait avec l'agent utilisé, mais l'intervalle de concentration de tous les agents

essayés était de 0,001 à 1,0 % (poids/volume) de concentra-

tion finale dans la solution de lysat. L'ordre d'addition des composants ne modifiait pas la sensibilité résultante

du lysat.

EXEMPLE I

On a dépyrogéné, comme décrit ci-dessus, l'agent d'aug-

mentation de la sensibilité du LAL, le "ZWITTERGENT" 3-14,

le N,N-diméthyl-3-ammonïo-1-propanesulfonatef une sulfo-

bétaine vendue par Calbiochem-Behring Corporation, et on l'a dilué à une concentration finale de 1 % (poids/volume). On a préparé un lot de lysat 9CZC sous la forme d'une dilution à 50 % avec un tampon de tris-maléate 0, 1 M à pH 7,0. On a

procédé à l'addition de l'agent d'augmentation de sensibili-

té de façon à obtenir une concentration finale dans le lysat

de 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075 et 0,10 % (poids/volume).

Un échantillon témoin contenait de l'eau dépourvue de subs-

tances pyrogènes à la place du surfactif. On a conservé les dilutions de lysat pendant une nuit à 0 - 4 C et on les

a essayées le lendemain avec une série de dilutions d'endo-

toxines EC spécialement formulées (désignées par les ini-

tiales "EC"). Les résultats (Tableau I) indiquent à la fois l'intervalle de concentration effectif de l'agent d'augmentation de sensibilité et l'augmentation totale de la sensibilité du lysat vïs-à-vis de l'endotoxine, par

rapport au lysat témoin.

TABLEAU-

Agent d'augmentation Sensibilité*

Echantillon de sensibilité (%)-. du lvsat -

Témoin LAL plus agent d'augmentation de sensibilité 0,005 0,01 0,02 0,05 0,075 0,1Q

1.000,0

O,0o 31,2

10. 00, 0

10.000p0

10.000,Q

* Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine

(en pg/ml) qui donne unessai de coagulation positif.

EXEMPLE II

On a préparé des solutions. étalons d'endotoxine pour l'endotoxine E. coli 071857, l'endotoxine. EC-2 de référence FDA, et le lot No 1 de référence FDA de K. pneumonîiae. On a dilué le lysat avec du tampon "tris" O,1M à pH 7,0 et on

lui a ajouté la solution de l'agent d'augmentation de sensi-

bilité, le "ZWITTERGENT" 3-14, de façon -à obtenir une dilu-

tion de lysat de 30 % contenant 0,02 % de "ZWITTERGENT" 3-14 (poids/volume). On a remplacé l'agent par de l'eau dans l'échantillon témoin. On a procédé à l'essai du lysat avec

chaque série de dilutions d'endotoxine.

TABLEAU II

Sensibilité Endotoxine Echantillon du lysat E. coli 071857 Témoin 75,0 Agent d'augmentation de la sensîhilité du LAL 25,0 EC-2 de Référence Témoin 500,0 FDA Agent d'augmentation de la sensibilité du LAL 62,5 K. pneumonia de Témoin 1.Q00,Q FDA Agent d'augmentation de la sensibilité du LAL 125,0 * Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine

(en pg/ml) qui donne un essai de coagulation positif.

EXEMPLE 11-:1

On a étudié vingt-deux agents d'augmentation de la

sensibilité du LAL dlsponibles dans le commerce pour détermi-

ner leurs effets sur la sensi-Sblité du lysat à l'endotoxine.

On a préparé des solutions de chacun et on les a ajoutées au Lot 9FI de lysat à des concentrations finales échelonnées entre 0,001 et 0,20 % (poids/Volume). On a ensuite essayé

des échantillons de lysat avec l'endotoxine EC de FDA refor-

mulée (EC). Dans le Tableau III, les agents sont énumérés dans l'ordre d'efficacité décroissante. La concentration la

plus efficace essayée dans le lysat, ainsf que la sensibi-

lité correspondante du lysat, sont indiquées. La sensibi-

lité du lysat témoin (dilution de 50 %) ne contenant aucun

agent est également indiquée.

TABLEAU III

Marque ou appellation commerciale Zwittergent 3-14 Varion CADG Lonzaine CO Lonzaine CS Varion CAS Emcol CC38-17 Deriphat 151 Bina Coba 300] Barlox 12 Quaternary 0 Polystep B-5 Tween 80 Amphoterge K-2 Lodyne S-100 Deriphat 154 Polystep A-15 Amphoterge KJ-2 Deriphat 160 Polystep A-17 Amphoterge WAS Dianol RSX Tween 20 Lysat témoin Source Calbiochem-Behring Sherex Chemical Company, Inc. Lonza Inc. Lonza Inc. Sherex Chemical Company, Inc. Witco Chemical Corporation Henkel Inc. USA Ciba-Geigy Corporation Lonza Inc. Ciba-Geigy Corporation Stepan Chemical Company ICI Americas Inc. Lonza Inc. Ciba-Geigy Corporation Henkel Inc. USA Stepan Chemical Company Lonza Inc. Henkel Inc. USA Stepan Chemical Company, Lonza Inc. Quaker Chemical CorporatiOn ICI Americas Inc. Surfactif Amphotère Amphotère Amphotère Amphotère Amphotère Amphotère Amphotère b1 Cationique Non ioni-que Cationi'que Anîonique Non ionique Amphotere Amphotère Amphotère b) Anionique Amphotere Amphiotère b) Anionique Amphotere Anioni'que Non ibnique Concentration efficace (%) 0,02 0,02 0, 02 0,02 0,02 0,02 0,01 0,0] 0,]Q 0,002 0,001 0,20 Q,02 0,02 0,002 0,002 0, 001 0,02

0,001 '

0,001 0,02 0,002 a Sensibilité du lysat ,6 ,6 ]5,6 ,6 31,2 31,2 3],2 31,2 31,2 31,2 31,2 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 ,0 250,0 250,0

- 125,0

a) Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine (en pg/ml)

coagulation positif.

qui donne un essai de b) A pH 7, c'est la forme anionique qui prédomine. Nr CO u" oo -'I c, -Pl o> Mu w

EXEMPLE IV

Pour vérifier si la sensibilité accrue observée dans le lysat traité par l'agent d'augmentation de la sensibilité se conservait pendant la lyophilisation, on a préparé une dilution de 30 % de lysat dans du tampon "tris" 0,05M, avec et sans du "ZWITTERGENT" 3-14 à 0,02 % (concentration finale dans le lysat). On a introduit 1,2 ml de solution de lysat dans des fioles à sérum ayant chacune une capacité de 10 ml. On a congelé des échantillons à -35QC et on les a lyophilisés sous un vide de 50 p avec un temps de séchage de 32 heures environ. On a fermé hermétiquement les

fioles avec des bouchons en caoutchouc fendus et des bou-

chons métalliques. On a reconstltuté le lysat lyophilisé avec 1,2 ml d'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, puis on l'a essayé avec le lot EC-2 d'endotoxine de référence FDA. Le lysat témoin dépourvu d'agent d'augmentation de sensibilité avait une sensibilité de 62,5 pg/ml. En présence de l'agent d'augmentation de sensibilité, la sensibilité du lysat se trouvait multipliée

par deux et égale à 31,2 pg/ml.

EXEMPLE V

On a préparé un lot ODH correspondant à la récolte d'une journée de lysat de limule, vieux d'une semaine, sous la forme d'une dilution à 40 % dans un tampon de maléate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,05 M, à pH 7,0, contenant aux concentrations finales du CaCl2 0,06 M et du MnCl2

0,01M, ainsi que du "ZWITTERGENT" 3-14 à 0,03 %. On a intro-

duit des fractions de 1,2 ml de cette solution dans des fioles de 8 ml et on les a congelées à -45 C puis on les a lyophilisées sous un vide de 50 u avec un temps de séchage de 28 heures environ. On a fermé hermétiquement les fioles avec des bouchons en caoutchouc fendus et on les a fermées

avec des bouchons filetés en matière plastique. On a re-

constitué le lysat lyophilisé avec 1,2 ml d'eau pour injec-

tion dépourvue de substances pyrogènes, et on l'a essayé

avec le lot EC-2 d'endotoxine de référence FDA. La sensibi-

lité du lysat lyophilisé traité par l'agent d'augmentation de sensibilité était de 62 pg/ml. Une dilution témoin à % de LAL sans agent d'augmentation de sensibilité, essayée avant lyophilisation, Avait une sensibilité de 1 ng/ml,

EXEMPLE VI

On a combiné des récoltes d'une journée de lysat de limule ayant une sensïbîlilté égale ou supérieure à 500 pg/ml d'endotoxine 1CF d'E. coli, et on les a préparées sous la forme d'une dilution à 40 % dans un tampon de maléate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,025M à pH.7,0, contenant aux concentrations finales du MgC12 0,02M, du SrC12 0,01M, du CaC12 0,01M ainsi que 0,025 % de "ZWITTERGENT" 3-14. On a introduit cette solution, en fractions de 1,2 ml et de ,2 ml, dans des fioles de 10 ml, et on l'a congelée à -50 C. On a lyophilisé les échantillons sous un vide de 10.0 p

avec un temps de séchage de 72 heures environ. On a recons-

titué le produit lyophilisé avec 1,2 ml ou 5,2 ml d'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, suivant le volume de départ de lysat. Quand on a essayé avec de

l'endotoxine 1CF de E. co-li après lyophilisation, on a cons-

taté que la sensibilité du lysat lyophillsé traité par l'agent d'augmentation de sensibilité, pour les deux tailles d'échantillon, était de 25 pg/mal, contre une sensibilité

témoin de 500 pg/ml.

Claims (14)

-REVENDICATIONS

1. Procédé de traitement, dans des conditions de traitement de lysat,d'un lysat d'amibocytes de limule ayant

une sensibilité diminuée à l'endotoxine-du fait de la pré-

sence d'un inhibiteur endogène de lysat, par une quantité d'un agent d'augmentation de la sensibilité du lysat ayant des caractéristiques d'augmentation de la sensibilité du lysat, suffisante pour neutraliser, au moins partiellement,

ledit inhibiteur du lysat, en augmentant ainsi la sensibi-

lité du lysat à l'endotoxine, ledit agent d'augmentation de la sensibilité du lysat étant choisi dans le groupe comprenant: (I) les surfactifs amphotères ayant les formules suivantes;

(A) O R2

il I (R5-C-HN)n-R4- Rl SO319 R3 y (B).

R5-N-R1-COOM

il1 Y Y' (C) R5N(RfCOOM)2 Y

(D) O R2

(R5-C-HN)n-R4-- -R1-CO0 l I R3 Y dans lesquelles: R1 est un radical alkylène ayant de 1 à 4 atomes de carbone; Y et Y' sont chacun (1) un atome d'hydrogène, (2) un radical alkyle inférieur ou (3) un radical hydroxy-alkyle inférieur; R2 et R3 sont chacun (1) un radical alkyle inférieur ou (2) un radical hydroxy-alkyle inférieur; nest égal à 0 ou 1, et quand nest égal à O, R4 est un radical alkyle contenant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone, et lorsque n est égal à 1-, R4 est un radical alkylène ayant d'environ 1 à environ 6 atomes de carbone; R5 est un radical alkyle contenant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone; et M est un atome d'hydrogène, de sodium ou de potassium ou un radical ammonium quaternaire;

(II) les surfactifs anioniques ayant les formules sui-

vantes: (E) (R6)nl. (Y)Ar.(SO3M) n2

(F) R50SO3M

dans lesquelles: -

R5, Y et M ont les mêmes définitions que ci-dessus; R6 est un radical alkyle de 8 à 24 atomes de carbone; n1 est un nombre entier de 1 à 3; n2 est égal à 1 ou 2; et Ar est un radical phényle ou naphtyle; (III) les surfactifs cationiques ayant la formule suivante: (G) r N \+

R5 -C 1H

N/CH2 y yI dans laquelle R5, Yet Y' ont les mêmes définitions que cidessus; et (IV) les surfactifs non ioniques ayant la formule suivante;

(H) R5R7R8N- -0

dans laquelle: -

R5 a la même définition que ci-dessus; R7 et R8 sont chacun un radical méthyle ou éthyle; ainsi que les surfactifs non ioniques choisis dans le groupe comprenant les produits de condensation d'environ 10 à 30 moles d'oxyde d'éthylène avec le mono-esterd'un alcool hexahydrique contenant 6 atomes de carbone, le groupement

ester contenant de 10 à 20 atomes de carbone.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensibilité est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères représentés par la formule (A) de la revendication 1.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, n est égal à 0 ou 1, R4 est un radica:l tétradécyle.et R1-Y forme un radical triméthylène lorsque n est égal à 0, et R4 est un radical

triméthylène et R1-Y est -CH2-CHOH-CH2 lorsque n est égal à 1.

4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensibilité est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères représentés par la

formule (D) de la revendication 1.

5. Procédé selon. la revendication 4, dans lequel n est égal à 1, R4 est un radical propylène, R2 et R sont

chacun un radical méthyle, et R forme un radical méthylène.

y

6. Procédé selon la revendication 4, dans lequel nest égal à 0, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle et

R forme un radical méthylène.

Y

7. Réactif de lysat d'amyBocytes de limule permettant de déterminer la présence d'endotoxines, comprenant une dispersion aqueuse tamponnée d'un lysat d'amybocytes de

limule en quantité propre à déterminer la présence d'endo-

toxines, ayant une sensibilité améliorée à l'endotoxine, et une quantité suffisante d'un agent d'augmentation de

sensibilité du lysat ayant des caractéristiques d'augmenta-

tion de la sensibilité du lysat, ledit agent d'augmentation

de sensibilité du lysat étant choisi dans le groupe compre-

nant: (I) les surfactifs amphotères ayant les formules suivantes:

(A) O R2

il __-

(R5-C-HN) n-R4-N-R1-SO30

R3 Y

(B)

R5-N-R1-COOM

I I Y Y'

<(C)R5N(R1 COOM)2

Y

(D) 0 R2

i (Rs--HN)n-R4- 1 --CO0

(R5-C-HN

I

R3 y dans lesquelles: R1 est un radical alkylène ayant de 1 à 4 atomes de carbone; Y et Y' sont chacun (1) un atome d'hydrogène, (2) un radical alkyle inférieur ou (3) un radical hydroxy-alkyle inférieur; R2 et R3 sont chacun (1) un radical alkyle inférieur ou (2) un radical hydroxy- alkyle inférieur; n est égal à 0 ou 1, et lorsque n est égal à Or R4 est un radical alkyle contenant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone, et lorsque n est égal à 1, R4 est un radical alkylène ayant de 1 à environ 6 atomes de carbone;

R5 est un radical alkyle contenant d'environ 8 à envi-

ron 18 atomes de carbone; et M est un atome d'hdrogène, de sodium ou de potassium ou un radical ammonunim-quaternaire;

(II) les surfactifs anloniques ayant les formules suivan-

tes: (E) (R6) (Y) Ar. (SO3M)n2

(F) R50SO3M

dans lesquelles: R5, Y et M ont les mêmes définitions que ci-dessus; R6 est un radical alkyle de 8 à 24 atomes de carbone; n1 est un nombre entier de 1 à 3; n2 est égal à 1 ou 2; et Ar est un radical phényle ou naphtyle; (III) les surfactifs cationiques ayant la formule suivante: i5

(G) N C

R5- C y J

dans laquelle R5, Yet Y' ont les mêmes définitions que ci-

dessus; et (IV) les surfactifs non ioniques ayant la formule suivante:

(H) RRRN-

() 5 7 8

dans laquelle: R5 a la même définition que ci-dessus R7 et R8 sont chacun un radical méthyle ou éthyle;

ainsi que les surfactifs non ioniques choisis dans le grou-

pe comprenant les produits de la condensation d'environ 10 à 30 moles d'oxyde d'éthylène avec le mono-ester d'un alcool hexahydrique contenant 6 atomes de carbone, le

groupement ester contenant de 10 à 20 atomes de carbone.

8. Réactif selon la revendication 7, dans lequel il y a en outre les cations Na, Mn et Ca++ en quantités

propres à augmenter la sensibilité'du lysat.

9. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient en outre les cations Na+, Sr Ca++et ++ Mg, en quantités propres à augmenter la sensibilité du lysat.

10. Réactif selon la revendication 9, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensiblilté est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères- représentés par la

formule A de la revendication 10.

11. Réactif selon la revendication 10, caractérisé en cqe ce que R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, n est égal à 0 ou 1, R4 est un radical tétradécyle et R1-Y forme un radical triméthylène lorsque n est égal à 0, et R4 est un radical triméthylène et R1-Y est -CH2-CHOH-CH2 lorsque n

est égal à 1.

12. Réactif selon la revendication 4, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensibilité est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères représentés par la

formule D de la revendication 10.

13. Réactif selon la revendication 12, dans lequel n est égal à 1, R4 est un radical propylène, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, et R1 forme un radical X méthylène.

14. Réactif selon la revendication 12, dans lequel n est égal à 0, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle

et R forme un radical méthylène.

y Dans une méthode permettant de déterminer la présence d'endotoxines dans des conditions propres à une

telle détermination, dans laquelle on fait réagir l'endo-

toxine avec un réactif qui est un lysat d'amibocytes de limule, le perfectionnement qui consiste à utiliser le réactif formé par un lysat d'amibocytes- de limule selon la revendication 7