JPH03237358A - 初乳又は乳の試料の安定化方法およびこれに使用する安定化キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は免疫化学的検査を受ける初乳又は乳の試料を安
定する方法、ならびに初乳又は乳の試料を安定化するの
に使用する安定化キットに関するものである。

（背景技術） 獣医分野における診断では、種々の免疫に対する抗体の
力価を血清について測定するのが普通である。このため
の血清採取は獣医が行う必要がある。多くの場合に上述
の測定を初乳又は乳ついて行うことかできる。乳の試験
は特に牛の検査を大規模に行う場合に利点かある。これ
は次の理由による： （ｉ）獣医は試料採取の必要がないので、試料採取費、
従って免疫化学的検査の全費用か相当低下する： （ｉｉ）試料採取によるストレスが動物に全く又はほと
んど生じない； （ｉｉ）いくつかの場合に、血清の代りに初乳を使用す
ることによって測定感度が改善され：事実初乳は高濃度
の抗体を含有する。

しかし、検査に使用する初乳又は乳の試料を極めて注意
深く処理した場合にのみ初乳又は乳から信頼できる結果
が得られることが、実際に分っている。高すぎる温度で
貯蔵すると信頼できない結果が得られ；このような影響
が時には２４時間後に既に現れことは分っている。信頼
できる結果は試料を一２０℃において注意深く貯蔵した
場合にのみ得られる。上述の初乳および乳の感度に関し
て、検査を受ける試料を注意して制御条件下に採取し、
貯蔵し、輸送する必要がある。このような制御条件は、
オージェスキー（Ａｕ　ｊｅｓｚｋｙ）病に対して提案
されている豚における撲滅プログラムのような大規模な
野外試験では実現するのが困難であり、また試料を貯蔵
および輸送するのに余り適当でない基幹施設を有する区
域又は国々では実現するのか困難である。この結果、初
乳又は乳については抗体力価を測定する可能性が妨げら
れている。

本発明の目的は実際に結果の信頼性を損うことなく初乳
又は乳の免疫化学的検査を行うことを可能にすることに
ある。

本発明においては、免疫化学的検査を受ける初乳又は乳
の試料に、次の成分： （ａ）微生物学的防腐剤、 （ｂ）前記検査を受ける試料を５〜８好ましくは５．５
〜６．５のｐＨに保つ緩衝液、および（ｃ）　１種又は
２種以上の非イオン界面活性剤を含有する安定化剤組成
物を安定化に有効な量添加することにより、上述の目的
を達成する。成分（ａ）　、　（ｂ）および（ｃ）は実
施する免疫化学的検査を妨害しないように選定する必要
がある。これは、成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は単
独でもまた互に組み合わせても実施する試験の結果に影
響を与えることは許されないことを意味する。使用する
非イオン界面活性剤を選定する際には、商業的に入手で
きる広範囲の洗剤を使用することができる。

本発明においては、上述の安定化剤組成物を添加した場
合には、初乳又は乳の試料における抗体力価すなわち抗
体濃度が変化せず、上昇した温度（３７°Ｃ）において
長時間貯蔵した場合でも変化しないので、免疫化学的検
査は信頼できる結果を与えることができることを見い出
した。本発明の評価に当っては、さらに乳は極めて特殊
な体液であって、−船釣に使用される添加剤および特殊
に使用される安定化側組成物に対して高い要件を課する
ものであることを考慮する必要がある。

最適安定化のためには、少なくとも２種の非イオン界面
活性剤の混合物であって、そのうちの少なくとも１種の
界面活性剤のＨＬＢ値が１２〜１６であるものを使用す
るのが好ましい。

微生物学的防腐剤としては、重クロム酸塩、例えば、重
クロム酸ナトリウム、重クロム酸カリウム又は重クロム
酸アンモニウム、あるいは有機水銀化合物、例えば、エ
チルマーキュリチオサリチレートが好ましい。安定化側
組成物、従って緩衝液もａ厚な状態で添加して試料をで
きるだけ希釈しないようにするのが好ましい。このよう
な希釈は実施する試験の感度を低下する。本発明におい
ては、緩衝剤成分として弱無機酸およびその塩を併用す
ることにより、濃厚な緩衝液を得ることができることを
見い出した。

本発明においては、安定化剤組戊物の最後に示した成分
（ｃ）として最適なのは、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル、およびポリオキシエチレンとポリオ
キシプロピレンとから形成されポリオキシプロピレン含
有量の比較的大きいブロック共重合体からなる群、又は
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンとポリオキシプロピレンとから形成されポ
リオキシプロピレン含有量の比較的大きいブロック共重
合体、およびアルキルフェノールポリオキシエチレン化
合物からなる群から選定された少なくとも２種の非イオ
ン界面活性剤の混合物の水溶液であることを見い出した
。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、例
えば、ツイーン■、例えば、ツイーン８０およびツイー
ン８５という商品名で市販されている。ポリオキシエチ
レン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体はプルロ
ニック■という商品名で入手することができ、実施例で
使用するポリオキシプロピレン含有量の比較的大きい（
約９０％）共重合体プルロニックＰＥ３１．００である
。ノニデット■（Ｎｏｎｉｄｅｔ　；商品名）　Ｐ−４
０はアルキル基が８個の炭素原子を有し１個の分子当り
平均９個のエチレンオキシド分子が存在するアルキルフ
ェノールポリオキシエチレン化合物の例である。

使用者例えば牛の飼育者が安定化側組成物を添加したか
どうが、すなわち初乳又は乳の試料が安定化されたかど
うかを確かめることができるのは大きな利点である。こ
れは免疫化学的検査の実施者にとって一層重要なことで
ある。事実、試料が安定化されていることを容易に確か
めることができる場合には、検査結果の信頼性が初乳又
は乳の試料の経歴によって影響されていないことを確信
することができる。

本発明は特別な例において、初乳又は乳を着色させるこ
とができる指示薬を含有する安定化側組成物を使用する
。防腐剤として重クロム酸塩を使用する利点は、これを
添加した初乳又は乳の試料が黄色に着色することである
。本発明の極めて好ましい例においては、初乳又は乳の
試料に添加することができる安定化側組成物は濃厚緩衝
液中に溶解している重クロム酸塩を含有する。所望のｐ
Ｈ範囲および水に対する大きい溶解度に関して、約６．
４のｐＨを有するＨ２ＰＯ，−／ＨＰＯ，”−緩衝液が
最適である。安定化側組成物の第３成分、すなわち界面
活性剤は濃厚水溶液の形態で個別に添加するのが好まし
い。この成分を重クロム酸の緩衝剤溶液に溶解させた状
態で使用する場合には、比較的多量の水を溶媒として使
用して上述の諸成分のうちの１個の成分も分離しないよ
うにする必要がある。

この結果、初乳又は乳の試料は比較的大きく希釈され、
実施する免疫化学的検査の感度に有害な影響が現われる
。

本発明の特別な利点は、成分として防腐剤および緩衝剤
を含有する溶液と共に初乳又は乳の試料を着色する指示
薬を洗剤溶液（成分Ｃ）に添加することにより達成され
る。適当な指示薬の例はメチレンブルーであり、メチレ
ンブルーはオレンジ色に着色した重クロム酸塩溶液を使
用した場合に初乳又は乳の試料に緑色を付与する。試料
を安定化する際に洗剤溶液を忘れた場合には、試料は黄
色に着色する。防腐剤および緩衝液の溶液を忘れた場合
には、試料は青色に着色する。検査する初乳又は乳の試
料が緑色である場合のみが、安定化が完全に行われたこ
とを示す。

安定化剤組成物が有効である限界は極めて広い。

後述の実施例から明らかなように、初乳又は乳の試料の
顕著な安定化作用は、ｌ容量％の安定化剤組成物を添加
した場合に既に達成され、２又はＩＯ容量％の安定化剤
組成物を添り口した場合にも同じ結果か得られる。

また、本発明は、初乳又は乳の試料の免疫化学的検査を
行うための試験キットと共に供給することかできる安定
化キットに関するものである。前記試験キットは試験に
必要な物質および所要に応して補助手段を具える。普通
、このような安定化キットは、免疫化学的検査のために
採取した初乳又は乳の試料を安定化するための規定、す
なわち試料の採取後にできるたけすみやかに上述の安定
化剤組成物を添加することにより安定化する必要がある
ことを含む使用指示手段を具える。豚におけるオージェ
スキー病ウィルスに対する抗体を測定するための試験キ
ットは本出願人にる未公開のオランダ国特許出願第８９
０１８９１号に記載されている。牛における牛のルーコ
ース（Ｉｅｕｃｏｓｅ）ウィルスに対する抗体の測定に
使用する試験キッキも知られている。このような試験キ
ットは、豚および牛のそれぞれからの初乳又は乳の試料
が上述の安定化剤組成物を含有している場合には、前記
試料の免疫化学的検査に有利に使用することができる。

（実施例） 次に本発明を実施例について説明する。

実施例１ 免疫化学的検査のための豚の初乳の安定化次の安定化剤
組成物を使用した： ｌ客演Ａ　：　Ｋ２Ｃｒ２０ｔ　　１０重量％；２、５
Ｍｔ（２ＰＱ＋−／ＨＰＯ＋”−緩衝液、ｐＨ＝６．４
（所望のｐＨになるまで２．５ＭＮａ８２Ｐ０４溶液を
２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で滴定することにより得
た）。

一溶液Ｂ：ツイーン８０　　１重量％；ノニデットＰ−
４０１重量％； プルロニックＰＥ３１００１重量％； メチレンブルー　　０．０５重量％。

分娩直後の４匹の雌豚から初乳を採集した。この初乳を
直ちに低温で凍結し、実験開始まで一２００Ｃで貯蔵し
た。実験開始前に各試料を分割した。

安定化剤組戊物を一部の試料には２％濃度で添加し、他
の部分の試料は処理しなかった。安定化した初乳および
未処理の初乳をそれぞれ２８℃および３７°Ｃで温度し
た。これらの試料のオージェスキーｇｌ抗体力価を０日
日、７回目および３５日目にスバキシン（Ｓｕｖａｘｙ
ｎ■、商品名）ｇｉエライサ法（ＥＬＩＳＡ）によって
測定した。

実験結果を次の表Ａに光学密度（％）で示した。

ネガティブコントロールは試験キットに添付された使用
指示手段に従って１００％に設定した。

表Δ 異なる温度で貯蔵した後の豚の安定化初乳又は未安定化
初乳におけるオージェスキー病ウィルスの糖蛋白質■に
対する抗体力価の測定結果（注）＊実施せず 上述の結果から、安定化試料は３７℃でさえも３５日間
、免疫化学的検査に対する有用性に関してその品質の劣
化を起こすことなく、貯蔵することかできることが明ら
かである。また、添加した安定化剤組成物が試験結果に
悪影響を及ぼさないことも明らかである。これに対し、
未処理初乳は２８°Ｃで貯蔵した場合には１週間以内で
既に免疫化学的検査に使用できなかった。これは試料（
試料１，２および３）が不当に陽性（光学密度＜　３ｓ
％　）と評価されたからである。

実施例１と同様な実験において、実施例１に記載した安
定化剤組成物（Ｓｌ）と、これからノニデッ１−　Ｐ−
４０を除いた安定化剤組成物（Ｓ２）とを比較した。

初乳試料中の最終洗剤濃度は０゜０５％、最終に２Ｃｒ
ｚ（ｈ　ａ度ハ０．２％、最終Ｈ，ＰＯ４−／ＨＰＯ４
”−緩衝剤濃度は０．０５Ｍであった。

試料を３７℃で４８時間貯蔵した後に得た実験結果（光
学密度％）を表Ｂに示した。

表Ｂ 豚の初乳におけるオージェスキーｇｌに対する抗体力価
の測定結果 表Ｂに示すように、これらの安定化剤組成物には互に有
意な差が認められなかった。なお、三成分組成物、すな
わちノニデットＰ−４０を含有する安定化剤組成物が好
ましがった。これは、三成分組成物の場合に最も均一な
結果が得られることが分ったからである。

実施例３ 実施例１と同様な実験において、実施例１に記載した安
定化剤組成物を、濃度を変えて１０％、２％および１％
の濃度で添加した。

試料を３７℃で７日間貯蔵した後に得た実験結果（光学
密度％）を表Ｃに示す。

艮旦 豚の初乳におけるオージェスキーｇｌ抗体力価に及ぼす
種々の安定化剤組成物の濃度の影響表Ｃに示すように、
安定化剤組成物は使用したすべての濃度、すなわち１０
％、２％および１％の濃度において初乳試料の良好な安
定化を遠戚した。

実施例４ ２個所の養豚場において、通常の管理の一部として分娩
後の各雌豚から初乳を採集した。試料を２個の部分に分
割し、一方の部分を一２０°Ｃで貯蔵し、凍結状態で実
験室に輸送した。他方の部分は実施例１に記載した安定
化剤組成物で安定化した。

初乳に安定化剤組成物（約２％）を添加した後に、試料
を約４°Ｃで貯蔵した。実験室への試料の輸送中に輸送
時間および貯蔵温度には特別な注意を払わなかった。実
験室において、未処理凍結試料および安定化試料の両方
について、スパキシンｇＩエライサ法によってオージェ
スキーｇＩ抗体力価を測定した。この比較試験の結果を
表りに示す。

（ω車実施せず 表旦 実際的条件下に採集し安定化処理した豚の初乳と、未処
理凛結試料とのオージェスキーｇｌ力価の測定結果の比
較 表りから分るように、試料を安定化することにより、試
料を通常の実際的条件下に貯蔵および輸送することかで
きる。その後安定化試料は一２０’Ｃで注意深く貯蔵し
た未処理試料と同様に免疫化学的検査に有用であった。

これは、安定化試料を使用して行った試験の結果が信頼
できるものであって、個々の動物のオージェスキーｇＩ
の状態に関し誤差か入ってこないことを意味する。

実施例５ この実験に使用した混合牛乳の試料は試験開始まで一２
０℃で貯蔵した。試験前に各試料を分割した。牛乳の一
方の部分に安定化側組成物（２％）添加し、他方の部分
は未処理のままとした。実施例１に記載した安定化側組
成物を使用した。安定化牛乳および未処理牛乳をそれぞ
れ４℃および３７０Ｃて製置した。これらの試料につい
て牛の口ｆコースウィルス（Ｂ　［、Ｖ　）−乳エライ
ザ法を使用してＢＬＶ抗体力価を下表に示す経過日数で
測定した。

実験結果（光学密度％）を表Ｅに示す。

衣旦 異なる温度で貯蔵した後の安定化牛乳および未安定化牛
乳におけるＢＬＶ　ｐ２４に対する抗体力価の測定結果 表Ｅに示す結果から、安定化牛乳は未処理牛乳とは異な
り、可成りの期間貯蔵した後でもなお免疫化学的検査に
有用であることが分る。これは０日すなわち試験開始日
の結果と比較して検査結果に変化が認められなかったか
らである。

実施例６ 免疫化学的検査のための初乳の安定化処理：野外試験 試験Ｉ：オージェスキー陰性の飼育雌豚の群について、
すべての雌豚から分娩直後に初乳試料を採取した。１８
１匹の雌豚からの初乳試料を実施例１に記載した安定化
側組成物（Ｓｌ）によって安定化し、スバキシンｇＩ試
験によってｇＩ抗体について試験した。いずれの試料も
陽性でなく、５個の試料ははっきりせず、１７６個の試
料は陰性であった。はっきりしない試料は初乳を脱脂し
た後に再試験した。得られた脱脂初乳は陰性であった。

試験結果を下記の図式に示した。

試験■：いくつかの養豚場において、分娩後に雌豚から
初乳試料を採取した。実施例１に記載した安定化側組成
物（Ｓｌ）によって試料を安定化し、スバキシンｇＩ試
験によって試験した。２６１個のうち９８個の試料は陽
性で、１４６個の試料は陰性で、１７個の試料ははっき
りしなかった。陽性の豚およびはっきりしなかった豚の
脱脂初乳および乳液の両者について抗ｇＩ抗体を測定し
た。豚の９８個の陽性初乳試料のうち７５個が乳液にお
いて陽性反応を示し、２３個が乳液において陰性反応を
示した。後者は脱脂初乳において低い力価（＞　１／１
６）を示した。はっきりしない反応を示す豚のすべての
試料は乳液おいて陰性であり、１７個のうち８個の試料
は脱脂初乳においてはっきりしない結果を示した。これ
らの結果を下記の図式に示した。

結論：　上述の試験から、使用した安定化剤組成物は初
乳における偽陽性反応を無くなすと結論することができ
る。あいまいな試料は初乳を脱脂した後に再び試験する
必要がある。初乳におけるｇｆ抗体の測定は乳液におけ
る測定と少なくとも同程度の感度を示した。

図式 ２種の野外試験の結果を示す図式 鵡■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫化学的検査を受ける初乳又は乳の試料を安定化
   するに当り、 次の成分： （ａ）微生物学的防腐剤、 （ｂ）前記検査を受ける試料を５〜８のｐＨに保つ緩衝
   液、および （ｃ）１種又は２種以上の非イオン界面活性剤を含有し
   、成分（ａ），（ｂ）および（ｃ）は実施する免疫化学
   的検査を妨害しないように選定されている安定化剤組成
   物を安定化に有効な量添加することを特徴とする初乳又
   は乳の試料の安定化方法。 ２、成分（ｃ）は少なくとも２種の非イオン界面活性剤
   の混合物からなり、そのうちの少なくとも１種の界面活
   性剤のＨＬＢ値は１２〜１６であることを特徴とする請
   求項１記載の方法。 ３、次の成分： （ａ）重クロム酸塩および有機水銀化合物からなる群か
   ら選定された微生物学的防腐剤、（ｂ）弱無機酸および
   その塩を含有する濃厚緩衝液、および （ｃ）少なくとも２種の非イオン界面活性剤の混合物で
   あって、そのうちの少なくとも１種の界面活性剤のＨＬ
   Ｂ値が１２〜１６である非イオン界面活性剤を含有する
   安定化剤組成物を使用すること を特徴とする請求項２記載の方法。 ４、成分（ｃ）はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
   エステル、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロ
   ピレンとから形成されポリオキシプロピレン含有量の比
   較的大きいブロック共重合体からなる群、又はポリオキ
   シエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチ
   レンとポリオキシプロピレンとから形成されポリオキシ
   プロピレン含有量の比較的大きいブロック共重合体、お
   よびアルキルフェノールポリオキシエチレン化合物から
   なる群から選定された少なくとも２種の非イオン界面活
   性剤の混合物の水溶液からなることを特徴とする請求項
   １〜３のいずれか一つの項に記載の方法。 ５、次の成分： （ａ）防腐剤である重クロム酸塩、 （ｂ）ｐＨ約６．４の濃厚なＨ＿２ＰＯ＿４＾−／ＨＰ
   Ｏ＿４＾２＾−緩衝液、および （ｃ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、
   およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとか
   ら形成されポリオキシプロピレン含有量の比較的大きい
   ブロック共重合体からなる群、又はポリオキシエチレン
   ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンとポリ
   オキシプロピレンとから形成されポリオキシプロピレン
   含有量の比較的大きいブロック共重合体、およびアルキ
   ルフェーノルポリオキシエチレン化合物からなる群から
   選定された少なくとも２種の非イオン界面活性剤の混合
   物の水溶液 を含有し、成分（ａ）は成分（ｂ）のなかに加えられて
   いる安定化剤組成物を使用することを特徴とする請求項
   ４記載の方法。 ６、成分（ｃ）が、さらに、成分（ａ）と成分（ｂ）と
   からなる溶液と共に試料を着色させる指示薬を含有する
   ことを特徴とする請求項５記載の方法。 ７、免疫化学的検査を受ける初乳又は乳の試料を安定化
   するのに使用する安定化キットにおいて、 前記キットが次の成分： （ａ）微生物学的防腐剤、 （ｂ）前記検査を受ける試料を５〜８のｐＨに保つこと
   ができる緩衝液、および （ｃ）１種又は２種以上の非イオン界面活性剤を含有す
   る安定化剤組成物を具え、 前記キットは、さらに、免疫化学的検査の ために採取した初乳又は乳の試料を、試料の採取後にで
   きるだけすみやかに前記安定化剤組成物を添加すること
   により安定化する必要があることを規定している使用指
   示手段を具えることができる ことを特徴とする初乳又は乳の試料を安定化するのに使
   用する安定化キット。 ８、成分（ｃ）は少なくとも２種の界面活性剤の混合物
   からなり、そのうちの少なくとも１種の界面活性剤のＨ
   ＬＢ値は１２〜１６であることを特徴とする請求項７記
   載のキット。 ９、次の成分： （ａ）重クロム酸塩および有機水銀化合物からなる群か
   ら選定された微生物学的防腐剤、（ｂ）弱無機酸および
   その塩を含有する濃厚緩衝液、および （ｃ）少なくとも２種の非イオン界面活性剤の混合物で
   あって、そのうちの少なくとも１種の界面活性剤のＨＬ
   Ｂ値が１２〜１６である非イオン界面活性剤 を含有する安定化剤組成物を具える請求項８記載のキッ
   ト。 １０、成分（ｃ）はポリオキシエチレンソルビタン脂肪
   酸エステル、およびポリオキシエチレンとポリオキシプ
   ロピレンとから形成されポリオキシプロピレン含有量の
   比較的大きいブロック共重合体からなる群、又はポリオ
   キシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエ
   チレンとポリオキシプロピレンとから形成されポリオキ
   シプロピレン含有量の比較的大きいブロック共重合体、
   およびアルキルフェノールポリオキシエチレン化合物か
   らなる群から選定された少なくとも２種の非イオン界面
   活性剤の混合物の水溶液からなることを特徴とする請求
   項７〜９のいずれか一つの項に記載のキット。 １１、次の成分： （ａ）防腐剤である重クロム酸塩、 （ｂ）ｐＨ約６．４の濃厚Ｈ＿２ＰＯ＿４＾−／ＨＰＯ
   ＿４＾２−緩衝液、および （ｃ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、
   およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとか
   ら形成されポリオキシプロピレン含有量の比較的大きい
   ブロック共重合体からなる群、又はポリオキシエチレン
   ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンとポリ
   オキシプロピレンとから形成されポリオキシプロピレン
   含有量の比較的大きいブロック共重合体、およびアルキ
   ルフェノールポリオキシエチレン化合物からなる群から
   選定された少なくとも２種の非イオン界面活性剤の混合
   物の水溶液 を含有し、成分（ａ）は成分（ｂ）のなかに加えられて
   いる安定化剤組成物を含有することを特徴とする請求項
   １０記載のキット。 １２、成分（ｃ）が、さらに、成分（ａ）と成分（ｂ）
   とからなる溶液と共に試料を着色させる指示薬を含有す
   る請求項１１記載のキット。