DE60012612T2

DE60012612T2 - Verdüner zur Kryokonservierung von Rindersperma

Info

Publication number: DE60012612T2
Application number: DE60012612T
Authority: DE
Inventors: Jean-Gerard Saint-Ramon; Serge Desherces; Gustavo Decuadro-Hansen
Original assignee: IMV Technologies SA
Current assignee: IMV Technologies SA
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: ATE272312T1; EP1051907A1; ES2225043T3; US6368786B1; FR2793495A1; CA2308892A1; FR2793495B1; EP1051907B1; DE60012612D1; DK1051907T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Verdünner zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen. Genauer ausgedrückt, die Erfindung betrifft ein wässriges Verdünnermedium, das keine Substanzen tierischer Herkunft enthält und das gebrauchsbereit über fange Zeiträume konserviert werden kann.
Verdünner zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen sind bekannt. Die FR-B-2 720 407 der Anmelderin beschreibt einen Verdünner, der Nährstoffe, Puffer und Mineralsalze sowie ein Schutzmittel, das aus Sojalecithin besteht, enthält. Außerdem ist aus Al-hanek et al. 1989, Zhirotnov'dni Nanki, 26(5): 80–83, bekannt, dass die Hinzufügung von Produkten tierischer Herkunft, die Vitamin A enthalten, insbesondere Eigelb, einen günstigen Einfluss auf die Qualitätsindices der Spermatozoen hat.
Der in dem vorgenannten Patent beschriebene Verdünner ist dazu bestimmt, den Rindersamen zu verdünnen und für eine spätere Verwendung zu gefrieren. Dies ist ein im wesentlichen "gesundes" Verfahren. Dieser Verdünner ist relativ befriedigend.
Er ist leicht herzustellen und ist sehr klar. Das Fehlen von Produkten tierischer Herkunft garantiert die Abwesenheit jeglichen Infektionsagens.
Dagegen wurde die Frage der biologischen Wirksamkeit des Produktes nicht aufgeworfen. Die Wirksamkeit in den vorher verwendeten Konzentrationsbereichen erlaubt es nicht, mit der Flexibilität zu arbeiten, die man in einem Besamungszentrum haben muss.
In der Tat möchte man derzeit die Samenproduktion optimieren, d.h. man möchte eine bedeutende Anzahl von Dosen mit einer minimalen Konzentration an Spermatozoen in einer Paillette produzieren.
Bei in vivo-Tests mit einer sehr geringen Konzentration an Spermatozoen in der Paillette war die Leistungsfähigkeit des Verdünners der FR-B-2 720 407 nicht hervorragend.
Der Artikel von L.G. Sanchez-Partidaet al., Reprod Fertil. Dev., 1997, 9, 689–96, beschreibt Verdünner für Schafbockspermatozoen auf der Basis von Tris, das variable Glycerinkonzentrationen enthält, denen man Taurin, Hypotaurin und Inosit aus Nebenhoden sowie Carnosin und Ascorbinsäure zugesetzt hatte.
Der Artikel von M. Ollero et al. in Cryobiologys 37, 1–2, 1998, beschreibt die Wirkung auf Schafbockspermatozoen, die einem Zyklus des Kühlens, Gefrierens, Auftauens, mehreren Verdünnern unterzogen wurden, unter denen das Fiser-Medium war, dem verschiedene Bestandteile, wie z.B. Lactalbumin und Rinderserumalbumin, Vitamin E, Dithiothritol, Stiersamenplasma, Glycinbetain, Prolin, Phosphatidylcholin und Cholesterin zugesetzt worden waren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verdünners zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen, der in vivo verbesserte Resultate liefert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines solchen Verdünners, der zu einem zufriedenstellenden Überleben der Spermatozoen bei niedriger Konzentration führt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Verdünner bereit, der die oben gestellten Aufgaben löst.
Der Verdünner zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens ein Phospholipid, Vitamin A, kombiniert mit einem Emulgator, mindestens ein Antioxidans und mindestens ein Polyol.
Das Vitamin ist mit einem Emulgator, z.B. Sorbitanmonooleat, das unter der Bezeichnung "Tween 80" im Handel ist, kombiniert.
Das Antioxidans kann eine Aminosäure sein, die Antioxidans-Eigenschaften hat, z.B. Taurin und Glycin.
Das Antioxidans kann auch ein Peptid-Antioxidans sein, z.B. reduziertes Glutathion.
Das erfindungsgemäße Verdünnungsmittel kann außerdem ein Sterol, insbesondere Cholesterin, enthalten.
Wenn ein Sterol im Verdünner vorliegt, so enthält dieser vorteilhafterweise Cyclodextrine, die es in wässrigem Medium solubilisieren.
Der Verdünner der vorliegenden Erfindung kann außerdem auch Salze und Kohlenhydrate enthalten.
Die Kohlenhydrate sind z.B. Glucose, Fructose, Lactose.
Die Salze sind insbesondere Puffer, z.B. Trimethylolmethylamin; dieser Puffer wird üblicherweise Tris-Puffer oder einfach Tris genannt.
Das Verdünnungsmittel der Erfindung enthält eine wirksame Dosis mindestens eines Polyols, das geeignet ist, die Kristallbildung zu inhibieren. Das Polyol wird vorteilhafterweise Glycerin sein.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verdünner führt man die folgenden Stufen durch:

a) Herstellung einer Dispersion mindestens eines Phospholipids in Form von Partikeln in mindestens einem Polyol bei ausreichender Temperatur;
b) Rühren der Dispersion der Stufe a) derart, dass die Phospholipidpartikel mikronisiert werden,
c) Ruhenlassen der in Stufe b) erhaltenen Dispersion für eine Zeitdauer von mindestens etwa 12 Stunden derart, dass eine Stabilität der erhaltenen Emulsion erzielt wird, d.h. ohne Phasentrennung, was zu einer Präparation führt, die die Präparation der Stufe c) genannt wird,
d) Herstellung einer wässrigen Phase, die mindestens eine Aminosäure mit Antioxidans-Eigenschaften, mindestens ein Peptid-Antioxidans und Vitamin A umfasst, was zu einer Phase führt, die als wässrige Phase der Stufe d) bezeichnet wird,
e) Vereinigung der Präparation der Stufe c) und der wässrigen Phase der Stufe d), was zu einer Präparation führt, die als Präparation der Stufe e) bezeichnet wird,
f) Sterilisation der Präparation der Stufe e).

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Sterilisation der Stufe f) durch ionisierende Strahlung in einer Spanne der Strahlungsdosis von etwa 5 bis etwa 20 Kgy, vorzugsweise von etwa 15 bis etwa 20 Kgy, durchgeführt.
Unter den Techniken zum Erhalt der Dispersion der Stufe a) kann man mechanische Dispergiervorrichtungen oder Emulgiervorrichtungen, die unter Druck arbeiten, verwenden.
Um in Stufe c) eine stabile Emulsion zu erhalten, ist es notwendig, die Dispersion für mindestens 12 Stunden ruhen zu lassen.
Vorzugsweise wird der Verdünner der Erfindung mit einer reduzierten Wassermenge formuliert, und vor Verwendung verdünnt man mit sterilem Wasser.
Zum Zeitpunkt seiner Verwendung enthält der Verdünner vorteilhafterweise ein Antibiotikum. Wenn das Antibiotikum dem Verdünner während seiner Herstellung zugesetzt wird, kann es während der Sterilisationsstufe seine Wirksamkeit verlieren.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Antibiotikum extratemporär zum Zeitpunkt der Verwendung zugesetzt.
Bei dieser Durchführungsform ist der Verdünner ohne Antibiotikum vorzugsweise in einem mit einem Stöpsel verschlossenen Behälter enthalten. Das Antibiotikum ist z.B. in Pulverform in dem Stöpsel enthalten und wird in den Verdünner freigesetzt, indem Druck auf den Stöpsel ausgeübt wird.
Das Antibiotikum ist z.B. Gentamycin in Form des Sulfats.
Typischerweise wird der erfindungsgemäße Verdünner die folgenden Phospholipide in den unten angegebenen Gewichtsverhältnismengen enthalten: "Lecithin 100" mit den angegebenen Gewichtsverhältnismengen der folgenden Phospholipide:

– Phosphatidylcholin 20 bis 24%
– Phosphatidylethanolamin 18 bis 22%
– Phosphatidylinositol 12 bis 15%.

"Lecithin 130" mit den angegebenen Gewichtsverhältnismengen der folgenden Phospholipide:

– Phosphatidylethanolamin 14 bis 20 %
– Phosphatidylinositol 7 bis 13 %
– Phosphatidylcholin 30 bis 35 %.

Das Lecithin 130 ist tatsächlich ein Lecithin, das mit Phosphatidylcholin angereichert ist.
Es muss betont werden, dass der erfindungsgemäße Verdünner ausschließlich zu Kryokonservierung von Rinderspermatozoen bestimmt ist, er ist nicht zur Kryokonservierung von Spermatozoen anderer Tierarten oder des Menschen bestimmt.
I) Es wurde ein Verdünner vorgeschlagen, der für die Erfindung nicht typisch ist und pro 100 ml Wasser umfasst:
Beispiel 1
Nach dem oben beschriebenen Arbeitsmodus formuliert man einen Verdünner, der die folgende Zusammensetzung hat:
Die obenstehende Formulierung wird hergestellt, um 100 ml konzentrierten Verdünner zu erhalten, wobei dieser vor Verwendung auf 500 ml verdünnt wird.
Beispiel 2: Vergleichsassays in vitro: Anomalien und Test auf osmotische Widerstandsfähigkeit
In diesem Beispiel wird der Verdünner von Beispiel 1 mit dem Verdünner des Standes der Technik, der in EP-A-0 685 556 beschrieben ist, verglichen, und zwar bezüglich der Anomalien und der osmotischen Widerstandsfähigkeit in vitro.

Nach der in EP-A-0 685 556 beschriebenen Vorgehensweise formuliert man einen Verdünner des Standes der Technik, der die folgende Zusammensetzung hat:

Trimethylol-methylamin	3,4 g bis 4,2 g
Trinatriumcitrat-Dihydrat	13,7 g bis 16,75 g
Kaliumchlorid	0,55 g bis 0,67 g
Fructose	1,65 g bis 2,0 g
Glucose	0,68 g bis 0,84 g
Lactose	0,41 g bis 0,50 h
Calciumlactat	0,09 g bis 0,11 g
Glycin	5,15 g bis 6,25 g
Glycerin	64 ml bis 78 ml
Sojalecithin	6,75 bis 8,25 g

Zur Verwendung wird dieser mit 750 ml bis 900 ml Wasser als Vehikel verdünnt.
Die folgende Tabelle I gibt Vergleichsresultate für den Verdünner des Standes der Technik, VERDÜNNER A, und den Verdünner von Beispiel 1, VERDÜNNER I, bei verschiedenen Stieren: NIZAGOI, NOMEL, NORRIS, NOVAK, OCARINA und OKAVANGO, an. Tabelle I

H: OST = Test auf osmotische Widerstandsfähigkeit
Spz: = Spermatozoen

Tabelle I zeigt die Überlegenheit des Verdünners von Beispiel 1 gegenüber dem Verdünner des Standes der Technik an, denn für 7·10⁶ Spermatozoen pro Dosis erhält man einen Prozentsatz der osmotischen Widerstandskraft in vitro, die für den Verdünner für Beispiel 1 in vitro stark überlegen ist.
Obgleich die Erfindung für besondere Ausführungsformen beschrieben wurde, wird man verstehen, dass sie alle Ausführungsvarianten im Rahmen der Ansprüche umfasst.

Claims

Verdünner zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen, umfassend mindestens ein Phospholipid, Vitamin A, kombiniert mit einem Emulgator, mindestens ein Antioxidans und mindestens ein Polyol, wobei der Verdünner keine Substanzen tierischen Ursprungs enthält.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antioxidans eine Aminosäure, die Antioxidans-Eigenschaften hat, ist.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antioxidans ein Peptid-Antioxidans ist.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure mit Antioxidans-Eigenschaften Taurin ist.
Verdünner nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid-Antioxidans reduziertes Glutation ist.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem ein Sterol enthält.
Verdünner nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Sterol Cholesterol ist.
Verdünner nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem Cyclodextrine enthält, um das Sterol zu solubilisieren.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyol Glycerin ist.
Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem Salze und Kohlenhydrate enthält.
Verfahren zur Herstellung des Verdünners nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Stufen durchführt: a) Herstellung einer Dispersion mindestens eines Phospholipids in Form von Partikeln in mindestens einem Polyol bei ausreichender Temperatur, b) Rühren der Dispersion der Stufe a) derart, dass die Phospholipidpartikel mikronisiert werden, c) Ruhenlassen der in Stufe b) erhaltenen Dispersion für eine Zeitdauer von mindestens etwa 12 Stunden derart, dass eine Stabilität der erhaltenen Emulsion erzielt wird, d.h. ohne Phasentrennung, was zu einer Präparation führt, die Präparation der Stufe c) genannt wird, d) Herstellung einer wässrigen Phase, die mindestens eine Aminosäure mit Antioxidans-Eigenschaften, mindestens ein Peptid-Antioxidans und Vitamin A umfasst, was zu einer Phase führt, die als wässrige Phase der Stufe d) bezeichnet wird, e) Vereinigung der Präparation der Stufe c) und der wässrigen Phase der Stufe d), was zu einer Präparation führt, die als Präparation der Stufe e) bezeichnet wird, f) Sterilisation der Präparation der Stufe e).
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisation der Stufe f) durch ionisierende Strahlung in einer Spanne der Bestrahlungsdosis von etwa 5 bis etwa 20 Kgy durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Spanne der Bestrahlungsdosis von etwa 15 bis etwa 20 Kgy reicht.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Präparation der Stufe d) ein Sterol zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Präparation der Stufe d) Kohlenhydrate zugesetzt werden.
Verwendung eines Verdünners nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kryokonservierung von Rinderspermatozoen.