JPH0643342B2 - 血液凝固促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は血液凝固因子活性化剤と加水分解酵素とを含有
する血液凝固促進剤に関する。

（従来の技術） 検査技術の目覚ましい進歩とあいまって血清生化学検
査，血清免疫学検査，血球検査などの血液検査が広く普
及し，病気予防や早期診断に役立っている。血液検査の
多くは血清検査であり，その検査に要する血清は，通
常，血液検査用容器に採取した血液を凝固させた後，遠
心分離によって，比重の異なる血餅（フィブリンと血球
が混合したゲル様塊状物）から分離し，ピペットを用い
て，あるいはデカンテーションにより採取している。

被験者から採取された血液が凝固するには比較的長時間
を必要とする。例えば，血液凝固時間が比較的短いとさ
れるガラス製検査容器を用いても血液が凝固するまでに
40〜60分を必要とし，合成樹脂製検査容器を用いると，
実に４時間以上の放置時間が必要となる。そのため，検
査に必要な血清を迅速に確保できないという欠点を有す
る。これは，特に緊急に検査を実施する必要のある場合
に問題となる。

血液を速やかに凝固させるため血液凝固促進剤が使用さ
れる。例えば，血液中の第XII因子（接触因子）を活性
化する血液凝固促進剤が用いられる。第XII因子は血液
凝固に係る蛋白質加水分解酵素前駆体の一種であり，こ
れが活性化することにより血液中の他の血液凝固因子が
連鎖的に活性化され血液凝固が始まる。第XII因子活性
化剤としては，従来からガラス，カオリン，ベントナイ
ト，シリカなどの無機微粒子やエラジン酸が知られてい
る。これらは血液の凝固機能検査のひとつである活性化
部分トロンボプラスチン時間の測定試薬の一成分として
も利用されている。しかし，これらを血液凝固促進剤と
して用いても，その純度や組成により血液凝固時間など
にバラツキがある。さらに，これらの血液凝固促進剤を
用いて血液を凝固させると，血清と血餅とが良好に分離
しないため，遠心分離により血清を採取したとき血餅成
分が血清に混入する問題がある。

これらの問題を解決すべく，発明者は，血液凝固因子活
性化剤と蛋白質加水分解酵素とを含有する血液凝固促進
剤を提案している（特開昭60-174952号公報）。この血
液凝固促進剤に含有される血液凝固因子活性化剤は下記
一般式で示され，かつ，該式中の隣接するカルボニル基
が実質的に同一平面上に存在する環式有機化合物であ
る： （ここで，Ａは環式化合物の残基を示す）。

このような化合物としては例えば，没食子酸アルキルエ
ステル酸化物，エラジン酸酸化物などが挙げられる。蛋
白質加水分解酵素としては，トリプシン，トロンビン，
カテプシンＢなどの各種プロテアーゼが用いられる。上
記環式有機化合物(I)は血液凝固第XII因子を非酵素的に
活性化する。第XII因子もまた，蛋白質加水分解酵素の
一種であり，この第XII因子の働きで血液中の他の血液
凝固因子が連鎖的に活性化される。さらに，トリプシン
などの蛋白質加水分解酵素の働きで血液中の血液凝固因
子の分解が促進されるため、血液が速やかに凝固する。
血液凝固に要する時間にも大きなバツラキがなく，血清
と血餅との分離状態も良好である。

（発明が解決しようとする問題点） 発明者は上記環式化合物をさらに検討し、優れた血液凝
固促進剤の開発を試みた。本発明の目的は，血液を短時
間で凝固させ，かつ血清と血餅との分離性の良好な血液
凝固促進剤を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用） 本発明の血液凝固促進剤は，金属錯体からなる血液凝固
因子活性化剤および加水分解酵素を含有する血液凝固促
進剤であって、前記金属体が，隣接するカルボニル基が
実質的に同一平面上に存在する一般式(I)で示される環
式有機化合物を配位子とし，前記加水分解酵素が，ペプ
チド鎖においてArgと任意のアミノ酸残基との結合およ
び／またはLysと任意のアミノ酸残基との結合を加水分
解しうる酵素であり，そのことにより上記目的が達成さ
れる。： （ここで，Ａは環式化合物の残基を示す）。

本発明の血液凝固促進剤に含有される金属錯体（血液凝
固因子活性化剤）の配位子成分である上記（Ｉ）式で表
される化合物は，同素環式化合物であっても異節環式化
合物であってもよく，また，単環式化合物であっても、
多環式化合物であってもよい。このような環式化合物と
しては、上記２個のカルボニル炭素を含む環が６員環ま
たは５員環であることが好ましい。

同素環式化合物のうち好ましい６員環式化合物としては
下記一般式(II)で示されるｏ−キノン環を有する化合物
が挙げられる： （ここで、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３およびＲ_４は，水素，炭化
水素基，極性置換基または多環式化合物における残基を
示す）。

上記式において炭化水素基は特に限定されないが，アル
キル基，特に炭素数１〜18のアルキル基が好ましい。極
性置換基も特に限定されない。例えば，カルボキシル
基，カルボン酸エステル基，水酸基，アミノ酸，メルカ
プト基などがある。ｏ−キノン環を有する化合物として
は，ｏ−キノンをはじめ，下記式(III)〜(XII)で示され
る化合物が挙げられる： 没食子酸アルキルエステル酸化物 （ここで，Ｒ_５はアルキル基を示す。） エラジン酸部分酸化物 エラジン酸完全酸化物 １・４−ジ（３・４−ジヒドロキシフェニル） ２．３−ジメチルブタン部分酸化物 １・４−ジ（３・４−ジヒドロキシフェニル） ２・３−ジメチルブタン完全酸化物 同素環式化合物のうち５員環式化合物の好ましい具体例
としては，下記式(VIII)で示される１・２・３−トリケ
トヒドロインデンが挙げられる。

異節環式化合物としては，例えば，次の一般式(IX)で示
される化合物が挙げられる。

（ここで，Ｒ_６は水素，炭化水素または多環式化合物に
おける残基を示し，Ｒ_７およびＲ_８は水素，炭化水素
基，極性置換基または多環式化合物における残基を示
す。炭化水素基および極性置換基については(II)式と同
様である。） (IX)式で示される化合物の好ましい具体例としては，例
えば，次式で表されるイサチンがある。

錯体を形成する金属は，ｏ，ｏ−配位性を有するアルカ
リ金属以外の金属である。特にFe,Co,Ni,Alなどを含む
錯体が取り扱いが容易であるため好適である。本発明の
血液凝固促進剤に用いられる金属錯体は上記配位子とな
る化合物（Ｉ）に上記金属イオンを含む塩溶液を加えて
得られる。例えば，没食子酸プロピル酸化物の鉄錯体
は，没食子酸プロピル酸化物を含む溶液に塩化第二鉄溶
液を混合することにより得られる。このような金属錯体
には，錯体内部の電気的中性を保つためにハロゲン根，
硫酸根，硝酸根，アンモニウム根の１種または２種以上
を含む配位子が含有されていてもよい。水が配位子とし
て含有されていてもよい。

本発明の血液凝固促進剤に含有される加水分解酵素はプ
ロテアーゼであり，ペプチド鎖においてArgと任意のア
ミノ酸残基との結合およびLysと任意のアミノ酸残基と
の結合を加水分解しうる酵素である。このようなプロテ
アーゼとしては，例えば，トリプシン，トロンビン，ヘ
ビ毒トロンビン様酵素などのセリンプロテアーゼ；カテ
プシンＢ，フィシンなどのチオールプロテアーゼ；キニ
ナーゼＩなどの金属プロテアーゼがある。特にセリンプ
ロテアーゼが好適に用いられる。これらプロテアーゼ
は，単独でも血液凝固促進作用を有するが，上記血液凝
固因子活性化剤（金属錯体）と併用することによって血
液凝固の活性化能が飛躍的に向上する。

本発明の血液凝固促進剤は，上記金属錯体と上記加水分
解酵素とを主成分とし，金属錯体100重量部に対し，酵
素が0.01〜100重量部（10¹〜10⁸単位）の割合で含有さ
れる。酵素が過少であっても金属錯体が含有されていれ
ば血液凝固促進作用は得られるが，酵素を上記割合で配
合した場合に比べると，その効果がはるかに小さい。過
剰であっても含有量に比例した効果は得られない。血液
凝固促進剤中には１重量％以下の割合で抗線溶剤などの
助剤が含有されていてもよい。本発明の血液凝固促進剤
は，血液１mlあたり１×10^-10〜１×10^-1ｇの割合で使
用される。過少であると血液凝固促進効果が得られな
い。過剰であっても使用量に比例した効果は得られな
い。

血液凝固に用いる血液検査容器はガラス製であっても樹
脂製であってもよい。血液を凝固させるには，例えば容
器中に採取した血液に血液凝固促進剤を加えてもよく，
血液凝固促進剤をあらかじめ容器内部に付与しておいて
もよい。血液凝固促進剤は，例えば粉末状のまま利用し
てもよいが好ましくは，あらかじめ適当な溶媒に溶解も
しくは分散させておく。血液凝固促進剤を粉末状で，あ
るいは高濃度の溶液として利用する場合に，血液の一部
が高濃度の金属錯体と接触して血液中の蛋白成分が変質
するおそれのあるときには，上記血液凝固促進剤を比表
面積の大きい担体に担持させることが推奨される。

このような方法に利用される担体としては，血液検査に
有害な影響を与えず，大きい比表面積を有するものであ
れば，特に限定されない。例えば，不織布，織布，樹脂
ビーズなどが好適に用いられる。このような担体に上記
血液凝固促進剤を担持させるには，例えば，その溶液や
分散液を担体に塗布したり，溶液や分散液中に担体を浸
漬して含浸させた後，乾燥させる。アラビアゴムなどの
適宜に助剤を含む血液凝固促進剤の水分散液を調製し，
これを急速凍結乾燥して血液凝固促進剤担持粒子状物を
得ることもできる。

本発明の血液凝固促進剤が，血液と接触すると，含有さ
れる血液凝固因子活性化剤（金属錯体）が血液凝固第XI
I因子を活性化する。第XII因子は既述のように，蛋白質
加水分解酵素前駆体の一種であり，これが活性化するこ
とにより血液中の他の血液凝固因子が連鎖的に活性化さ
れて血液凝固が開始する。血液凝固促進剤にはさらにセ
リンプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素が存在する
ため，血液中の血液凝固因子の加水分解が促進される。
血液凝固促進剤に含有される血液凝固因子活性化剤がこ
の蛋白質加水分解酵素の活性化を促進することも考えら
れる。その結果，短時間で血液が凝固する。血液凝固に
要する時間は，金属錯体の種類や量，容器の材質，周囲
の温度などにより異なるが，合成樹脂製容器を用いた場
合には通常３〜７分である。

本発明の血液凝固促進剤に含有される血液凝固因子活性
化剤は，金属錯体であるため，発明者が先に開発した血
液凝固促進剤に含有される環式有機化合物（Ｉ）に比べ
て，さらに熱安定性に優れる。上記環式有機化合物を含
む血液凝固促進剤を利用したときには，この環式有機化
合物が血液中の金属成分と錯体を形成し血清成分に変化
を与えるおそれがあるが，本発明の血液凝固促進剤は血
液中の金属成分と反応することがないため，正確な検査
値が得られる。本発明の血液凝固促進剤を用いると血餅
成分が充分に収縮するため血清と血餅との分離性に優れ
る。そのため，血清の採取時に血餅成分が混入するおそ
れもなく，血清を高収率で採取することができる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１−１ 血液凝固因子活性化剤（金属錯体）としてエラジン酸酸
化物（９頁(V)で示される化合物）の鉄錯体，そして加
水分解酵素としてトリプシンを含有する血液凝固促進剤
の生理食塩水溶液を調製した。それぞれの溶液中におけ
る濃度は0.5重量％および0.05重量％である。市販のポ
リエチレンプレーンスピッツに入新鮮血３ｍｌを採取
し，これに上記血液凝固促進剤溶液30μｌを加えた。室
温で静置し，血液が流動性を失うまでに要した時間を測
定し，これを血液凝固時間とした。次に，血液凝固後30
00回転／分で５分間遠心分離を行い，血清の分離状態を
観察した。その結果を表１に示す。実施例１−２〜４−
３の結果もあわせて表１に示す。

実施例１−２ 加水分解酵素としてトロンビンを用い，該酵素が500単
位／ｍｌとなるように血液凝固促進剤の生理食塩水溶液
を調製したこと以外は実施例１と同様である。

実施例１−３ 加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素を用い、該酵
素が0.005重量％となるように血液凝固促進剤の生理食
塩水溶液を調製したこと以外は実施例１と同様である。

実施例２−１ 金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例１−１と同様である。

実施例２−２ 金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例１−２と同様である。

実施例２−３ 金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例１−３と同様である。

実施例３−１ 金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−１と同様である。

実施例３−２ 金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−２と同様である。

実施例３−３ 金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−３と同様である。

実施例４−１ 金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−１と同様である。

実施例４−２ 金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−２と同様である。

実施例４−３ 金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−３と同様である。

実施例５−１ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物の）コバルト錯体を用いたこと以外は実施例１
−１と同様である。その結果を表２に示す。実施例５−
２〜７−３の結果もあわせて表２に示す。

実施例５−２ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のコバルト錯体を用いたこと以外は実施例１
−２と同様である。

実施例５−３ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のコバルト錯体を用いたこと以外は実施例１
−３と同様である。

実施例６−１ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例１
−１と同様である。

実施例６−２ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例１
−２と同様である。

実施例６−３ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例１
−３と同様である。

実施例７−１ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実施
例１−１と同様である。

実施例７−２ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実施
例１−２と同様である。

実施例７−３ 金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁(V)式で示され
る化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実施
例１−３と同様である。

比較例１ 血液凝固促進剤としてエラジン酸酸化物鉄錯体（９頁
(V)式で示される化合物）を単独で用いたこと以外は実
施例１−１と同様である。その結果を表３に示す。比較
例２〜７の結果もあわせて表３に示す。

比較例２ 血液凝固促進剤として１・２・３−トリケトヒドロイン
デン鉄錯体を単独で用いたこと以外は実施例２−１と同
様である。

比較例３ 血液凝固促進剤としてトリプシンを単独で用いたこと以
外は実施例１−１と同様である。

比較例４ 血液凝固促進剤としてトロンビンを単独で用いたこと以
外は実施例１−２と同様である。

比較例５ 血液凝固促進剤として蛇毒トロンビン様酵素を単独で用
いたこと以外は実施例１−３と同様である。

比較例６ 血液凝固促進剤を添加しなかったこと以外は実施例１−
１と同様である。

比較例７ 血液凝固促進剤を添加せず，かつ，ガラススピッツを用
いたこと以外は実施例１−１と同様である。

（発明の効果） 本発明によれば，このように，血液を短時間のうちに凝
固させる血液凝固促進剤が得られる。この血液凝固促進
剤は血清成分を変化させることがないため，血清を用い
た各種検査値が常時正確かつ安定に得られうる。血清と
血餅との分離性にも優れるため，血餅成分が血清に混入
することがないのみならず，血清成分収量も高い。血液
凝固促進剤に含有される金属錯体はそれ自体，比較的熱
に安定であるため長期保存にも適する。このような血液
凝固促進剤は，血清を用いる臨床検査用に，あるいは各
種生化学試験用に好適に利用さえうる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】金属錯体からなる血液凝固因子活性化剤お
   よび加水分解酵素を含有する血液凝固促進剤であって， 前記金属錯体が，隣接するカルボニル基が実質的に同一
   平面上に存在する一般式（Ｉ）で示される環式有機化合
   物を配位子とし， 前記加水分解酵素が，ペプチド鎖においてArgと任意の
   アミノ酸残基との結合および／またはLysと任意のアミ
   ノ酸残基との結合を加水分解しうる酵素である， 血液凝固促進剤： （ここで，Ａは環式化合物の残基を示す）。