JPS58216959A - 血漿中のx3因子を測定する方法 - Google Patents

血漿中のx3因子を測定する方法

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JPS58216959A
JPS58216959A JP57099284A JP9928482A JPS58216959A JP S58216959 A JPS58216959 A JP S58216959A JP 57099284 A JP57099284 A JP 57099284A JP 9928482 A JP9928482 A JP 9928482A JP S58216959 A JPS58216959 A JP S58216959A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血漿中の血液凝固■因子測定に関する。さらに
詳しくは活性化したXIIIa  の活性を螢光法によ
って測定する場合、反応した螢光物質と未反応の螢光物
質を分子篩を用いて分離し正確に反応した螢光物質の量
を測定する方法に関する。
XIII因子は血液凝固の最終段階で働く酵素であるが
、正確には血漿中のトロノビ/とCa++イオンとの作
用により活性のあるXI]Taとなって始めて酵素作用
が発現する非活性型のものである。したがってXITT
 aの活性の測定からX■■因子の量を測定することが
できる。
血液凝固機構におけるxrnaの作用はトロンビ/の作
用により生成したフィブリンにイソペプチド結合からな
る分子間架橋、すなわちクロスリ/りを形成するもので
、XI”ITaはトランスグルタミナーゼの作用を有し
ているといえる このようなことから臨床的意義も重要
で特に血管向凝固症候群(DICという)、腎疾患、外
科、産科領域ではその重要性が認められている。因に、
厚生省n r c調査研究班の報告でもこのことが裏付
けされた。したがって現在■因子の簡便かつ正確な測定
方法の開発が強く望まれている所以である。
従来Xlff因子の測定には種々の方法が考えられた。
例えば (1)  クロットテスト、これはフィブリンゲルの尿
素や酸に対する溶解性を調べるもので、簡便ではあるが
定量性に欠ける。
(2)  クロスリンク定量法、これはフィブリンゲル
中のクロスリンクリジンを定量するもので、多量の試料
を必要とする上定量性もよくない、。
(3)  ラジオアイソトープ法、これはカゼイ/への
140化合物のとりこみ量を測定するもので定量性もよ
く高感度であるが後述の欠点もある。
(4)  螢−t 法、これはカゼインへのダンシル力
ダベリ/のとりこみ量を測定するもので、定量性もよく
高感度であるが操作は煩雑である。
(5)抗原−抗体法、これは感度、定量性とも中程度で
あるが、xIII因子とXTII&の抗原性が犬臭く異
なるため、抗原活性と酵素活性は必ずしも一致しないと
いう問題がある。
以上さまざまな方法が提案されて来たが、これらの中で
感度、定量性ともに優れているのはラジオアイソトープ
法(RI法)および螢光法といわれている。しかしRI
法は放射能物質を取扱うために設備にかなりの投資が必
要であり操作も煩雑で小規模な実施は困難である。捷た
螢光法はRI法ような欠点はないがそれでもなお問題が
ある。すなわち螢光法はローランド等により1969年
、初めて報告された( J、 ClIn、 Inves
t 、 48 : 1054〜1064.1969)方
法で次の図式によりカゼイ/のγ−グルタミル基とダン
ジルカダベリンのξ−アミノ基がXTII &の作用で
結合しカゼインーダンンルカダベリノを生成する。
ローラン等はこの後カゼイン−ダンジルカダベリンを強
酸を用いて沈澱させ、さらに有機溶媒で何度も洗浄を繰
返し、未反応のダノシルカダベリ/を溶出分離した後、
尿素に界面活性剤を添加した水溶液に溶解しその螢光を
測定し、その結果から■hの活性を測定すると共にXI
II因子の量を測定した。この方法は優れた方法である
が、未反応のダンジルカダベリンを含まないカゼイン−
ダンシル力ダベリ/の分離取得が必須要件であり、その
だめの分離操作に強酸、有機溶媒を使用することは実際
には好ましくなく、かつ有機溶媒での沈澱の洗浄は操作
が煩雑でともすれば包み込まれた未反応ダンジルカダベ
リンの完全な分離に手間がか\る等の欠点があり、日常
の臨床検査に適用することは困難であった。
本発明者等はこれらの欠点を改良するため種々研究した
結果、カゼイン−ダンジルカダベリンに比較し分子量が
非常に大へいことに着目し、分子篩を利用することによ
り両者を極めて簡単にしかも完全に分離し得ることを見
出し本発明を完成した。本発明に従って、血漿中の血液
凝固X■因子測定に当り、X■因子を活性化したXnI
&の活性を基質としてカゼインおよび螢光性を有するカ
ダベリン誘導体を用いて測定する方法において、カゼイ
/と反応したカダベリン誘導体と未反応の当該化合物と
を分離するのに分子篩を用いることを特徴とする血漿中
のX■因子を測定する方法が提供される。カゼインとダ
ンジルカダベリンの場合、カゼインは分子量約75,0
00〜375,000の混合蛋白であり、一方ダンシル
カダベリンは分子量335.5のナツタレノ項を有する
化合物である。したがって、カゼイ/−ダンジルカダベ
リンははツカゼインと同等の分子量のものと做すことが
できる。このように分子量の差の大きいときは分子篩の
効果は特に著しい。
本発明に使用するカダベリン誘導体はそれ自身螢光性の
ものであり、かつカゼインと結合しても螢光性を保持す
るものであれば特に制限はない。この中にはクマリン誘
導体たとえばフルオレセイン、あるいはナフタリ/、ア
/トラセノ誘導体たとえばタノンルカダベリンがあるが
、特にダンジルカダベリンが好適である。
本発明に用いる分子篩であるゲル濾過のカラム担体には
デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、球状
セルロース、ポリビニルアルコールなどが使用できる。
本発明の場合分離すべ傘物質の分子量の差が犬轡いのテ
カラム担体の網目は粗いものでよい。通常脱塩に使用す
るもので充分である。このような担体を使用すると最初
から担体内に存在する溶液量、いわゆるボイドボリウム
(votavolume  )の直後にカゼインーダ/
シルカダペリ/がカゼインと共に流出してくる。未反応
のダンジルカダベリンが流出するのはずつと後である。
この関係を第1図に示す。試験方法は実施例で用いたカ
ラムに検体としてカゼインとダンシルカダベリ/の混合
液1−を加え、次いで同じ〈実施例の緩衝液で展開する
。結果は第1図の通りで最初の3−でカゼインの95%
が流出するがダンジルカダベリンはこの間に殆ど流出せ
ず、3tnt以後に実質流出が始まることが明かである
。したがって最初のカゼインの流出時に測定できるダノ
シル力ダベリ/の螢光はカゼイン−ダンジルカダベリン
に由来するものでこの量からXTIIaの活性ひいては
■因子の量が測定でへる。血漿中にある蛋白質などの他
の高分子物質もこの領域で流出するが螢光の測定である
ので影響はない。
実施例 1、試薬 (1)緩衝液 0.05 mot/l)リスーHα溶液
(pH7,5) (2)トロンビン液 トロンピノを上記緩衝液に牛血清
アルブミン 0.05π添加した溶液 に溶解し1.0Ou/m/!溶 液とする。
(3)カゼイン液 カゼインを上記緩衝液に溶解し、0
.65%溶液と する。
(4)ダンシル力ダベリ/液ダンジルカダベリンを上記
緩衝液に溶解 し、2.0 mol/を溶液 とする。
(5)塩化カルシウム液 塩化カルシウムを上記緩衝液
に溶解し 130 m moj/ を溶液と する。
(6)反応停止液 12 m mol/l  マレイミ
ド水溶液。
2、操作 血漿20μtを採り(1)の緩衝液に10%の割合でダ
リセリンを添加した溶液0.1ml lに加え56℃、
4分間加温した後水冷する。次にダンジルカダベリン液
0.2−、カゼイン液0.1m/、塩化力ルンウム液0
.05m/、トo7ビ/液0.05m/+17)順に添
加し37℃、1o分間反応させる。
直に(6)の反応停止液0.1 m7!を加え反応を停
止させる。この溶液をカラムの上部に加える。全部の液
が浸透したら(1)の緩衝液を2.5 ml!加える。
カラムの下部からの流出液が3dとなったところで、こ
の3mlの流出液を通常の方法で螢光強度を測定し、そ
の値からXTTIaの活性およびX■内因子債を算出す
る。励起波長は355nm、測定波長は525 nmで
ある。なお使用したカラムは直径1.6譚の円筒型で、
担体はポリビニルアルコール粒子 (東洋ソーダ製品、トヨパール)(W−40Coars
+e ) 1−を使用した。
実施例により種々の検体について試験した結果を第2図
に示す。この図から明かに定量性が認められた。また再
現性は螢光強度の相対比を測定した結果、100.10
4.105 。
99.105,105,101,103.98と2.6
%の良好なCVを示した。ただし正常者の平均を100
とした。
以上述べた通り、本発明の方法は感度の高い反応系を用
い操作を簡単にし、かつ正確な値を得ることができる極
めて有用な方法で通常の臨床検査に適用できるものであ
る。
【図面の簡単な説明】
第1図はカラムを用いてカゼインとダ/ンル力ダペリン
の混合液を緩衝液で展開するときの流出パターンを示す
。 第2図は種々の検体を用いて測定したXnI因子の量と
螢光強度の関係を示すグラフである。 第1図 (11) 手続補正書 昭和57年 8月 2日 特許庁長官  若 杉 和 夫   殿1 事件の表示 特顕昭57−99284号 2 発明の名称 血漿中の■因子を測定する方法 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 株式会社ヤ ト ロ ン 4代理人 住所 東京都港区虎ノ門二丁目8番1号虎ノ門電気ビル
明細書の特許請求の範囲及び 発明の詳細な説明の欄 6、 補正の内容 fil  特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 (2)明細書第4頁14〜15行の「ダンジルカダベリ
ンのξ−アミノ基が」火「ダンジルカダベリンのε−r
ミノ基が」に、同頁17行目の「ローラン等は」を「ロ
ーランド等は」にそれぞれ訂正丁711゜ +31 11’11M5[1,5〜16行の「カゼイン
−ダンジルカダベリン」の後に「がダンジルカダベリン
」馨挿入する。 (4)同第9頁14〜15行の「10%の割合でダリセ
リンを添加JYrlO%の割合でグリセリン?添加」に
訂正する。 特許請求の範囲: 1)血漿中の血液凝固■因子側?に当り、■因子を活性
化したXIIIaの活性な基質としてカゼインおよび螢
光性を有するカダベリン誘導体を用いて測定する方法に
おいて、カゼインと反応したカダベリン誘導体と未反応
の当該化合物とを分離するのに分子篩?用いることを特
徴とする血漿中の■因子?測定する方法。 2)カタヘリン、JJ体がダンジルカダベリンテある特
許請求の範囲第1項記載の方法。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)血漿中の血液凝固■因子測定に当り、■因子を活性
    化したXIIIaの活性を基質としてカゼインおよび螢
    光性を有するカダベリン誘導体を用いて測定する方法に
    おいて、カゼインと反応したカダベリン誘導体と未応応
    の当該化合物とを分離するのに分子篩を用いることを特
    徴とする血漿中のXTII因子を測定する方法。 2)カダベリン誘導体がダンシルカダペリ/である特許
    請求の範囲第1項記載の方法。
JP57099284A 1982-06-11 1982-06-11 血漿中のx3因子を測定する方法 Expired JPS6035119B2 (ja)

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