JPS62240616A

JPS62240616A - 血液凝固促進剤

Info

Publication number: JPS62240616A
Application number: JP61084456A
Authority: JP
Inventors: Hideo Anraku; 秀雄安楽
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-04-11
Publication date: 1987-10-21
Anticipated expiration: 2009-06-08
Also published as: JPH0643342B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は血液凝固因子活性化剤と加水分解酵素とを含有
する血液凝固促進剤に関する。

（従来の技術）検査技術の目覚ましい進歩とあいまって血清生化学検査
、血清免疫学検査、血球検査などの血液検査が広く普及
し、病気予防や早期診断に役立っている。血液検査の多
くは血清検査であり、その検査に要する血清は９通常、
血液検査用容器に採取した血液を凝固させた後、遠心分
離によって。

比重の異なる血餅（フィブリンと血球が混合したゲル様
塊状物）から分離し、ピペットを用いて。

あるいはデカンテーションにより採取している。

被験者から採取された血液が凝固するには比較的長時間
を必要とする０例えば、血液凝固時間が比較的短いとさ
れるガラス製検査容器を用いても血液が凝固するまでに
４０〜６０分を必要とし１合成樹脂製検査容器を用いる
と、実に４時間以上の放置時間が必要となる。そのため
、検査に必要な血清を迅速に確保できないという欠点を
有する。これは、特に緊急に検査を実施する必要のある
場合に問題となる。

血液を速やかに凝固させるため血液凝固促進剤が使用さ
れる。例えば、血液中の第Ｘｌｌ因子（接触因子）を活
性化する血液凝固促進剤が用いられる。第Ｘｌｌ因子は
血液凝固に係る蛋白質加水分解酵素前駆体の一種であり
、これが活性化することにより血液中の他の血液凝固因
子が連鎖的に活性化され血液凝固が始まる。第Ｘｌｌ因
子活性化剤としては、従来からガラス、カオリン、ベン
トナイト、シリカなどの無機微粒子やエラジン酸が知ら
れている。これらは血液の凝固機能検査のひとつである
活性化部分トロンボプラスチン時間の測定試薬の一成分
としても利用されている。しかし。

これらを血液凝固促進剤として用いても、その純度や組
成により血液凝固時間などにバラツキがある。さらに、
これらの血液凝固促進剤を用いて血液を凝固させると、
血清と血餅とが良好に分離しないため、遠心分離により
血清を採取したとき血餅成分が血清に混入する問題があ
る。

これらの問題を解決すべく２発明者は、血液凝固因子活
性化剤と蛋白質加水分解酵素とを含有する血液凝固促進
剤を提案している（特開昭６０−１７４９５２号公報）
。この血液凝固促進剤に含有される血液凝固因子活性化
剤は下記一般式で示され、かつ。

該式中の隣接するカルボニル基が実質的に同一平面上に
存在する環式有機化合物である：（ここで、Ａは環式化
合物の残基を示す）。

このような化合物としては例えば、没食子酸アルキルエ
ステル酸化物、エラジン酸酸化物などが挙げられる。蛋
白質加水分解酵素としては、トリプシン、トロンビン、
カテプシンＢなどの各種プロテアーゼが用いられる。上
記環式有機化合物（Ｉ）は血液凝固筒ＸＩＩ因子を非酵
素的に活性化する。

第Ｘｌｌ因子もまた。蛋白質加水分解酵素の一種であり
、この第Ｘｌｌ因子の働きで血液中の他の血液凝固因子
が連鎖的に活性化される。さらに、トリプシンなどの蛋
白質加水分解酵素の働きで血液中の血液凝固因子の分解
が促進されるため、血液が速やかに凝固する。血液凝固
に要する時間にも大　゛きなバラツキがなく、血清と血
餅との分離状態も良好である。

（発明が解決しようとする問題点）発明者は上記環式化合物をさらに検討し、優れた血液凝
固促進剤の開発を試みた。本発明の目的は、血液を短時
間で凝固させ、かつ血清と血餅との分離性の良好な血液
凝固促進剤を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明の血
液凝固促進剤は、血液凝固因子活性化剤および加水分解
酵素を含有する血液凝固促進剤であって、該血液凝固因
子活性化剤が、下記一般式で示され、かつ、該式中の隣
接するカルボニル基が実質的に同一平面上に存在する環
式有機化合物（Ｉ）を配位子とする金属錯体からなり、
該加水分解酵素がペプチド鎖においてＡｒｇと任意のア
ミノ酸残基との結合および／またはＬｙｓと任意のアミ
ノ酸残基との結合を加水分解しうる酵素であり、そのこ
とにより上記目的が達成される：（ここで、Ａは環式化
合物の残基を示す）。

本発明の血液凝固促進剤に含有される金属錯体（血液凝
固因子活性化剤）の配位子成分である上記（Ｉ）式で表
される化合物は、同素環式化合物であっても異部環式化
合物であってもよく、また。

単環式化合物であっても、多環式化合物であってもよい
。このような環式化合物としては、上記２個のカルボニ
ル炭素を含む環が６員環または５員環であることが好ま
しい。

同素環式化合物のうち好ましい６員環式化合物としては
下記一般式（ＩＩ　、）で示される０−キノン環を有す
る化合物が挙げられる：Ｒ５（ここで、　ＲＩ＋　Ｒｔ、　Ｒ３およびＲ４は、水素
。

炭化水素基、極性置換基または多環式化合物における残
基を示す）。

上記式において炭化水素基は特に限定されないが。

アルキル基、特に炭素数１〜１８のアルキル基が好まし
い。極性置換基も特に限定されない。例えば。

カルボキシル基、カルボン酸エステル基、水酸基。

アミノ酸、メルカプト基などがある。０−キノン環を有
する化合物としては、０−キノンをはじめ。

下記式（ＩＩ［）〜（■）で示される化合物が挙げられ
る：没食子酸アルキルエステル酸化物（ここで＋　Ｒ５はアルキル基を示す。）エラジン酸部
分酸化物ニラジン酸完全酸化物 ■・４−ジ（３・４−ジヒドロキシフェニル）２・３−
ジメチルブタン部分酸化物 ■す（ＶＩ）１・４−ジ（３・４−ジヒドロキシフェニル）２・３−
ジメチルブタン完全酸化物 υ （■）同素環式化合物のうち５員環式化合物の好ましい具体例
としては、下記式（■）で示される１・２・３−トリケ
トヒドロインデンが挙げられる。

異部環式化合物としては２例えば１次の一般式（ＩＸ）
で示される化合物が挙げられる。

（ここで、　Ｒｈは水素、炭化水素または多環式化合物
における残基を示し＋ＲｆｆおよびＲ−は水素、炭化水
素基、極性置換基または多環式化合物における残基を示
す。炭化水素基および極性置換基については（ｎ）式と
同様である。）（ＩＸ）式で示される化合物の好ましい具体例としては
１例えば２次式で表されるイサチンがある。

錯体を形成する金属は、０．０−配位性を有するアルカ
リ金属以外の金属である。特にＦｅ、　Ｃｏ。

Ｎｉ、　ＡＩなどを含む錯体が取り扱いが容易であるた
め好適である。本発明の血液凝固促進剤へ用し）られる
金属錯体は上記配位子となる化合物（Ｉ）＆こ上記金属
イオンを含む塩溶液を加えて得られる。

例えば、没食子酸プロピル酸化物の鉄錯体は、没食子酸
プロピル酸化物を含む溶液に塩化第二鉄溶液を混合する
ことにより得られる。このような金１’ｌｔＷ体には、
錯体内部の電気的中性を保つためＧこハロゲン根、硫酸
根、硝酸根、アンモニウム根の１種または２種以上を含
む配位子が含有されてし１でもよい。水が配位子として
含有されていてもよい。

本発明の血液凝固促進剤に含有される加水分解酵素はプ
ロテアーゼであり、ペプチド鎖においてＡｒｇと任意の
アミノ酸残基との結合およびＬｙｓと任意のアミノ酸残
基との結合を加水分解しうる酵素である。このようなプ
ロテアーゼとしては９例エバ、トリプシン、トロンビン
、ヘビ毒トロンビン様酵素などのセリンプロテアーゼ；
カテプシンＢ、フィシンなどのチオールプロテアーゼ；
キニナーゼ■などの金属プロテアーゼがある。特にセリ
ンプロテアーゼが好適に用いられる。これらプロテアー
ゼは、単独でも血液凝固促進作用を有するが、上記血液
凝固因子活性化剤（金属錯体）と併用することによって
血液凝固の活性化能が飛躍的に向上する。

本発明の血液凝固促進剤は、上記金属錯体と上記加水分
解酵素とを主成分とし、金属錯体１００重量部に対し、
酵素が０．０１〜１００を置部（Ｉ０′〜１０８単位）
の割合で含有される。酵素が過少であっても金属錯体が
含有されていれば血液凝固促進作用は得られるが、酵素
を上記割合で配合した場合に比べると、その効果がはる
かに小さい。過剰であっても含有量に比例した効果は得
られない。血液凝固促進剤中には１重量％以下の割合で
抗線溶剤などの助剤が含有されていてもよい。本発明の
血液凝固促進剤は、血液１　ｒａｌあたりＩ　Ｘｌ０−
１０〜１ｘｌｏ−’ｇの割合で使用される。過少である
と血液凝固促進効果が得られない。過剰であっても使用
量に比例した効果は得られない。

血液凝固に用いる血液検査用容器はガラス製であっても
樹脂製であってもよい、血液を凝固させるには１例えば
容器中に採取した血液に血液凝固促進剤を加えてもよく
、血液凝固促進剤をあらかじめ容器内部に付与しておい
てもよい。血液凝固促進剤は２例えば粉末状のまま利用
してもよいが好ましくは、あらかじめ適当な溶媒に溶解
もしくは分散させておく。血液凝固促進剤を粉末状で。

あるいは高濃度の溶液として利用する場合に、血液の一
部が高濃度の金属錯体と接触して血液中の蛋白成分が変
質するおそれのあるときには、上記血液凝固促進剤を比
表面積の大きい担体に担持させることが推奨される。

このような方法に利用される担体としては、血液検査に
を害な影響を与えず、大きい比表面積を有するものであ
れば、特に限定されない。例えば。

不織布、織布、樹脂ビーズなどが好適に用いられる。こ
のような担体に上記血液凝固促進剤を担持させるには２
例えば、その溶液や分散液を担体に塗布したり、溶液や
分散液中に担体を浸漬して含浸させた後、乾燥させる。

アラビアゴムなどの適宜の助剤を含む血液凝固促進剤の
水分散液を調製し、これを急速凍結乾燥して血液凝固促
進剤担持粒子状物を得ることもできる。

本発明の血液凝固促進剤が、血液と接触すると。

含有される血液凝固因子活性化剤（金属錯体）が血液凝
固第Ｘｌｌ因子を活性化する。第ＸＩＩ因子は既述のよ
うに、蛋白質加水分解酵素前駆体の一種であり、これが
活性化することにより血液中の他の血液凝固因子が連鎖
的に活性化されて血液凝固が開始する。血液凝固促進剤
にはさらにセリンプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵
素が存在するため、血液中の血液凝固因子の加水分解が
促進される。血液凝固促進剤に含有される血液凝固因子
活性化剤がこの蛋白質加水分解酵素の活性化を促進する
ことも考えられる。その結果、短時間で血液が凝固する
。血液凝固に要する時間は、金属錯体の種類や量、容器
の材質２周囲の温度などにより異なるが２合成樹脂製容
器を用いた場合には通常３〜７分である。

本発明の血液凝固促進剤に含有される血液凝固因子活性
化剤は、金属錯体であるため３発明者が先に開発した血
液凝固促進剤に含有される環式有機化合物（Ｉ）に比べ
て、・さらに熱安定性に優れる。上記環式有機化合物を
含む血液凝固促進剤を利用したときには、この環式有機
化合物が血液中の金属成分と錯体を形成し血清成分に変
化を与えるおそれがあるが１本発明の血液凝固促進剤は
血液中の金属成分と反応することがないため、正確な検
査値が得られる。　本発明の血液凝固促進剤を用いると
血餅成分が充分に収縮するため血清と血餅との分離性に
優れる。そのため、血清の採取時に血餅成分が混入する
おそれもな（、血清を高収率で採取することができる。

（実施例）以下に本発明を実施例につき説明する。

尖施皿土ユ血液凝固因子活性化剤（金属錯体）としてエラジン酸酸
化物（９頁（ｖ）で示される化合物）の鉄錯体、そして
加水分解酵素としてトリプシンを含有する血液凝固促進
剤の生理食塩水溶液を調製した。それぞれの溶液中にお
ける濃度は０．５重量％および０．０５重量％である。

市販のポリエチレンプレーンスピッツに入所鮮血３　ｍ
ｌを採取し、これに上記血液凝固促進剤溶液３０μｌを
加えた。室温で静置し、血液が流動性を失うまでに要し
た時間を測定し、これを血液凝固時間とした。次に、血
液凝固後３０００回転／分で５分間遠心分離を行い。

血清の分離状態を観察した。その結果を表１に示す。実
施例１−２〜４−３の結果もあわせて表１に示す。

ス１」ＬＬ」加水分解酵素としてトロンビンを用い、該酵素が５００
単位／１Ｖ１１となるように血液凝固促進剤の生理食塩
水溶液を調製したこと以外は実施例１と同様である。

！嵐班土」加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素を用い、該酵
素が０．００５重量％となるように血液凝固促進剤の生
理食塩水溶液を調製したこと以外は実施例１と同様であ
る。

去施勇１」金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例Ｌｌと同様である。

去旌桝主」金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例１−２と同様である。

去１劃［Ｌ」金属錯体として１・２・３−トリケトヒドロインデン鉄
錯体を用いたこと以外は実施例１−３と同様である。

スｍ金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−１と同様である。

ス１側［Ｌ」金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−２と同様である。

去ｆｌ金属錯体として没食子酸ｎ−プロピル酸化物の鉄錯体を
用いたこと以外は実施例１−３と同様である。

ス［金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−１と同様である。

尖侮炭↓」金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−２と同様である。

尖旌舅↓」金属錯体としてイサチン鉄錯体を用いたこと以外は実施
例１−３と同様である。

夫施皿１」金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のコバ用Ｈｅ体を用いたこと以外は実施例
１−１と同様である。その結果を表２に示す。実施例５
−２〜７−３の結果もあわせて表２に示す。

ス１副（【４金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のコバルトｆｉｔ体を用いたこと以外は実
施例１−２と同様である。

尖侮桝ｌ」金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のコバルト３７７体を用いたこと以外は実
施例１−３と同様である。

去旌勇ｌユ金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例
１−１と同様である。

尖旌炎工」金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）弐で示さ
れる化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例
１−２と同様である。

実施例６−３金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のニッケル錯体を用いたこと以外は実施例
１−３と同様である。

夫嵐炭エユ金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実
施例１−１と同様である。

去旌■工」金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実
施例１−２と同様である。

尖旌炭１」金属錯体としてエラジン酸酸化物（９頁（Ｖ）式で示さ
れる化合物）のアルミニウム錯体を用いたこと以外は実
施例１−３と同様である。

上較開土血液凝固促進剤としてニラジン耐酸化物鉄錯体（９頁（
Ｖ）式で示される化合物）を単独で用いたこと以外は実
施例１−１と同様である。その結果を表３に示す。比較
例２〜７の結果もあわせて表３に示す。

此１旧」１血液凝固促進剤として１・２・３−トリケトヒドロイン
デン鉄錯体を単独で用いたこと以外は実施例２−１と同
様である。

几較史主血液凝固促進剤としてトリプシンを単独で用いたこと以
外は実施例１−１と同様である。

ル較±↓ 血液凝固促進剤としてトロンビンを単独で用いたこと以
外は実施例１−２と同様である。

ル較拠盈血液凝固促進剤として蛇毒トロンビン様酵素を単独で用
いたこと以外は実施例１−３と同様である。

ル較開工血液凝固促進剤を添加しながったこと以外は実施例１−
１と同様である。

止較拠１血液凝固促進剤を添加せず、がっ、ガラススビッツを用
いたこと以外は実施例１−１と同様である。

（以下余白）（発明の効果）本発明によれば、このように、血液を短時間のうちに凝
固させる血液凝固促進剤が得られる。この血液凝固促進
剤は血清成分を変化させることがないため、血清を用い
た各種検査値が常時正確かつ安定に得られうる。血清と
血餅との分離性にも優れるため、血餅成分が血清に混入
することがないのみならず、血清成分収量も高い、血液
凝固促進剤に含有される金属錯体はそれ自体、比較的熱
に安定であるため長期保存にも適する。このような血液
凝固促進剤は、血清を用いる臨床検査用に。

あるいは各種生化学試験用に好適に利用されうる。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、血液凝固因子活性化剤および加水分解酵素を含有す
る血液凝固促進剤であって、該血液凝固因子活性化剤が、下記一般式で示され、かつ
、該式中の隣接するカルボニル基が実質的に同一平面上
に存在する環式有機化合物（ I ）を配位子とする金属
錯体からなり、該加水分解酵素がペプチド鎖においてＡｒｇと任意のア
ミノ酸残基との結合および／またはＬｙｓと任意のアミ
ノ酸残基との結合を加水分解しうる酵素である、血液凝固促進剤： ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、前記加水分解酵素がセリンプロテアーゼ、チオール
プロテアーゼおよび金属プロテアーゼのうちの少なくと
も一種である特許請求の範囲第１項に記載の血液凝固促
進剤。