JPH07503373A - ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法本発明は、血中のヒルジンお よび合成トロンビン抑制因子を測定する方法および該方法を実施するための調製 物に関する。

ヒルジンは１ｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　（ヒル）の唾液腺から得ら れ、抗凝血剤であり、その効果はトロンビンとの化学的複合物の形成にあり、そ れによってその触媒作用が抑制される。

ヒルジンは、分子量が７ｋＤで６５個のアミノ酸を含むミニ蛋白である。その強 力なトロンビンに対する親和性（ｋ、値は１０−”ｍｏｌ／ｌ）およびその直接 作用機構のために、ヒルジンは極めて興味深い。過去においては、その臨床的利 用は極めて限られていた。なぜならば、ヒルジンは標準化された形態では容易に 入手できなかったからである。今日、ヒルジンは遺伝子工学によって製造するこ とができ、したがって、その臨床的利用が近い将来期待できる。

例えば、経口投与用医薬調製物は、欧州特許公開第４６８３２７号公報に開示さ れているが、当該調製物は組換え体ヒルジンを含む。

最近、ヒルジンは、集中的に薬理学的に研究されてきており、その薬理学的デー タが実験動物とヒトから得られた。ヒルジンは肝では代謝されず、むしろそのま まの形で腎から排除される。ヒルジンは約１から２時間の排除半減期を有し、体 の細胞外液腔に分布する。ヘパリンに似て、ヒルジンは経口的には吸収されない 。過去の研究で、ヒルジンは、はとんど全ての血栓症において活性で、したがっ て、内毒素ショック、実験的心筋梗塞および血栓崩壊後の再閉塞の防止の際です ら活性であることが示された。臨床薬理学的な研究では、免疫学的反応は検出さ れなかった。臨床研究で、ヒルジンは、抗凝血剤および抗血栓剤としてヘパリン より優れていることが証明された。

現在、多くの研究室が合成（特に小分子の）抑制因子の合成を世界的な規模で研 究している。合成トロンビン抑制因子はヒルジンと同じ態様で働く。ベンザミジ ン誘導体（例えばＮＡＰＡＰ（Ｎ、−（２−ナフチルスルホニル−グリシル）　 −Ｄ、Ｌ−アミジノフェニルアラニン−ピペリジン））およびいわゆるトリペプ チドに関する研究は、もっとも大きな前進を示した。

全ての合成トロンビン抑制因子は、現在前臨床研究の段階にある。これらの効果 は、ヒルジンのそれと質的に同じとみなすことができる。しかしながら、合成ト ロンビン抑制因子の代謝は、ヒルジンのそれと異なる。通常、トロンビン抑制因 子は、肝臓また血中で代謝される。そのような物質は、臨床試験のためにまもな く利用可能になると予想される。ヒルジンを越える利点は、該化合物は経口的に 投与できるという事実にある。

しかしながら、適切な治療または予防のためには、血中のヒルジン濃度および合 成トロンビン抑制因子濃度を、過少投与を避けまたは過剰投与による副作用を予 防するために継続的に決定できることが必要である。言い換えれば、治療薬監視 が利用できなければならない、今日まで、特に血中のヒルジンおよび合成トロン ビン抑制因子を、簡単な態様で実施できる測定方法は存在しない。

本発明は、特に血中のヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法を提供 するという課題にあるが、これは、病院２診療所および実験室で１例えば出血も しくは血栓症の危険性診断のための手術前検査に、また血栓症の畏れのある患者 の抗血液凝固の治療の監視のために、さらに種々の疾病、例えば重篤な感染症、 肝機能障害および悪性疾患のフォローアツプに簡単な態様で広範囲に利用できる 。

本発明の方法は容易に実施することができ、その間、病院や診療所に既に存在す る装置を使用することができると考えられる。さらに、該方法を実施するための 調製物は入手可能であろう。

本発明の要旨は、血中のヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子を測定する方法 であり、この方法では、プロトロンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロン ビンに分ｍ１ｌｌする化合物、その塩またはそれら化合物の混合物、並びに場合 によって緩衝液および／または他の慣用的な添加物が血液に加えられ、添加から 始まり凝固が開始するまでの経過時間が測定される。

本発明の要旨は、また上述の方法を実施するための調製物で、これは、プロトロ ンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロンビンに分割する化合物、その塩ま たはそれら化合物の混合物を、緩衝液および／または他の慣用的な添加物ととも に、またはそれら添加物無しで含むという特徴を有する。

本発明の方法は、単純な態様で実施でき、さらに、検査の結果は較正曲線を読み 取ることができるので、容易に得ることができるという顕著な利点を有する。こ の方法は、簡単に病院、診療所および実験室で大規模に実施でき、特定の訓練を 受けた職員を必要としない。

本発明の方法は、ヒルジンまたは合成（好ましくは小分子）のトロンビン抑制因 子を測定するために実施できる９合成トロンビン抑制因子の例は、上記全てのト リペプチドｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇの誘導体で、これは、硼酸誘導体、アルギニ ナール、クロロメチルケトン誘導体、アミノ酸で修飾された誘導体、ベンザミジ ン誘導体および所謂ヒロローグ（すなわち部分的ヒルジン類似配列）である、解 毒薬の成分はヒルジンに対するものと同じである。

本発明の科学的背景はヒルジンまたは合成トロンビン抑制因子とプロトロンビン 中間体くプロトロンビン−トロンビン変換の中間生成物の中間メイゾトロンビン 、またはメイゾトロンビンーデスーフラグメントー１　［Ｍｅｉｚｏｔｈｒｏｍ ｂｉｎ−ｄｅｓ−Ｆｒａｇ＋＋ｅｎｔ−１１）との相互作用にある。この変換は 、多工程反応を含み、この場合、非常に特異的な蛋白結合が、限定的な蛋白分解 反応工程によって分解される。凝固カスケードが活性化されている間、通常は、 蛋白分解活性を有する複合体が活性化された第■因子、Ｃａ＋＋、リン脂質およ び第Ｘ因子から生成され、これは、プロトロンビン−トロンビン変換を開始させ る。その結果は極めて少量の第■囚子中間体である力１゜プロトロンビンはこの プロトロンビン複合体で「固相様」類似の活性化を受けるからである。しかしな がら、凝固力（蛇毒の特定の分画（例えばエキス−カリナートウス［Ｅｃｈｉｓ −ｃａｒｉ−ｎａｔｕｓ］由来のもの）で開始する場合、［非定形的（ａｔｙｐ ｉｓｃｈｅ）」な中間体１例えばメイゾトロンビン、ＰＩＶＫＡメイゾトロンビ ンまたはメイゾトロンビンーデスーフラグメントー１がプロトロンビンから専ら 形成される。これらの中間体ｔよ。

ヒルジンまたは合成トロンビン抑制因子によって不活化されるが、ヘパリンでは 不活化されない。したがって、サンプル中に含まれるヒルジンによって不活化さ れるメイゾトロンビンまたはＰＩＶＫＡメイゾトロンビンが、蛇毒（例えばエキ ス蛇毒）によって血中でまたは血液成分中で生成される。凝固試験を設定するこ とができる。プロトロンビン中間体に対するヒルジンおよび合成トロンビン抑制 因子の親和性は極めて高い。例えば、メイゾトロンビンについては、それはに□ ＞　１０−１０−１Ｏ／ｌであり、その結果、遊離プロトロンビン中間体（例え ばメイゾトロンビン）は、ヒルジンまたは合成トロンビン抑制因子が完全に消費 されてしまうまで生成されなｔｌ。

このプロトロンビン中間体、例えばメイゾトロンビン４１、サンプル中に含まれ るフィブリノーゲンをフィブリンに変換することができる。このフィブリン生成 は、サンプルを凝固させることによって時間で表される。定量化は、血液サンプ ルのヒルジン濃度は、治療的血液濃度の範囲内では凝固時間を直線的に増加させ 、したがって迅速で無駄のない表示を可能にするということで実施される。

本発明の方法では、該化合物を血液に添加してから凝固が開始するまでの経過時 間を測定する。凝固開始を測定する多くの方法が知られている。もっとも頻繁に は、凝固塊が形成されたとき当該溶液からフィブリンの糸を引っ張りだす白金の フックが、周期的に凝固バッチに挿入される。この瞬間は続いて凝固終末点とし て記録される。この記録工程は、ストップウォッチによって手動で、または該白 金フックが電極としてデザインされているときは接触を引き起こすことによって 電気的に行われる。さらにまた、自動化された方法も存在する。

本発明の方法は、全ての凝固診断に関する測定原理、特に自動化された方法に応 用できる大きな利点を有する。色素形成トロンビン基質が適切な血漿サンプルに 添加されるとき。

実験室用自動装置で測定を行うことができる。

本発明の方法は、簡単な態様で実施でき、ヒルジン濃度を較正曲線で読み取るこ とを可能にする。本発明の方法は、全血、血漿で実施できるが、また尿のような 体液、濃縮組織液または均質化後の細胞溶出液に一定量の正常血漿を加えても実 施できる。本発明の方法は、ヘパリンはこの方法を阻害しないので、血液がヘパ リンを含んでいてもよいという顕著な利点を有する。

本発明にしたがえば、メイゾトロンビン、ＰＩＶＫＡプロトロンビンまたはメイ ゾトロンビンーデスーフラグメントー１が、例えばプロトロンビン中間体として 用いられる。メイシトロンビンは市販されており、スイスのペンタファーム社（ Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ　ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できる。しかし、メイゾトロ ンビン、ＰＩＶＫＡ−プロトロンビンまたは他のプロトロンビン中間体はインビ トロで生成することもできる。

下記の図に示したように、凝固系の４つの因子（第■因子（プロトロンビン）、 第■因子、第Ｘ因子および第Ｘ因子）は、それらはガンマ−カルボキシグルタミ ン酸基を含むという特徴を有する。このグルタミン酸のガンマ−カルボキシル化 は、酵素系（これはビタミンＫを補助因子として必要とする）の助けを借りて肝 でなされる「アカルボキシ（ａｃａｒｂｏｘｙ）因子」のリポソーム合成後まで 起こらない。

ガンマ−カルボキシグルタミン酸基は、凝固作用に必須である。それらは、カル シウムイオンに対する必要な結合原子価を表す。ジクマロール型の間接抗凝固物 質（ビタミンに拮抗物質）による処理では、ポストリポソームのガンマ−カルボ キシル化は起こらず、血液は不完全な凝固因子またはアカルボキシ因子を示す。

なぜならば、それらは、カルシウム−結合ガンマ−カルボキシ基を欠くからであ る。これらの凝固因子はまたＰＩＶＫＡ因子（ＰＩＶＫＡ＝Ｂｒｏｔｅｉｎｓ　 １ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙｖｉｔａ履ｉｎ　Ｋ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ、ビタミン に拮抗物質誘導蛋白）と呼ばれる。

そのようなジクマロール型の抗凝固物質で処置された患者の血漿にエカリンを加 えると、ＰＩＶＫＡメイゾトロンビンは、プロトロンビンを有する正常な血漿サ ンプルの場合のように制限的蛋白分解を介して、同じ態様でＰＩＶＫＡプロトロ ンビンからこの血漿中に産生される。

このＰＩＶＫＡメイゾトロンビンまたは他のＰＩＶＫＡ中間体は、ヒルジンと結 合する能力を保持していたが、これらは、しかし凝固カスケードの他の因子（血 小板、フィブリノーゲン、トロンボモジュリンなど）に対して全く、または極め て低い効果しかもたない０本発明にしたがえば、メイゾトロンビン、ＰＩＶＫＡ メイゾトロンビン、それらの中間体およびＰＩＶＫＡプロトロンビンがらのＰＩ ＶＫＡ中間体を用いることができる。それらは、ヒトまたは他の哺乳類由来のも のでよい。

メイゾトロンビンを調製するために、例えば、固定工ヵリンを例えば２から４　 ｃｍ３のサイズ範囲のミ二カラムに充填することができる。エカリン固定物（ペ ンタファーム社（Ｐｅｎ−ｔａｐｈａｒｍ　ＡＧ）　ハーゼル）は膨張状態で購 入することができ、塩化ナトリウム０．１５Ｍ、酢酸ナトリウム０．０２Ｍ、ブ リオネックス（Ｐｒｉｏｎｅｘ、登録商標）（洗浄ブタ皮膚コラーゲンの蛋白安 定化ポリペプチドフラクションのペンタファーム社の商標）０．２％およびトリ クロロイソブタノール０．３％、（ｐＨ５，５）の水溶液に懸濁する。膨張工ヵ リン固定化物１グラムは、クエン酸バリウム溶出液がらｐＨ８，４，３７℃で３ ０分以内に５００がら７００Ｕのアミド分解活性（ＩＵ＝１２３ＮＩＨ単位）を 生じる（　ｔｏｓ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ（登 録商標）　ＴＨ）で測定）。

続いて精製プロトロンビンフラクションをこれらのカラムに入れ、場合によって ヘパリンで安定化した後、生成メイゾトロンビンを続いて凍結乾燥する。この凍 結乾燥物質をアンプルに充填し、その後、使用のためには適切な溶媒で再調製す ることができる。

メイゾトロンビンーデスーフラグメントー１を調製するためには、メイゾトロン ビンの場合と同じ方法を用いる。バッチ工程では、より長い反応時間（３から４ 時間）を予定する必要がある。メイゾトロンビンーデスーフラグメントー１は、 メイゾトロンビンの活性化後の生成物である。

本発明にしたがえば、プロトロンビンをメイゾトロンビンに分割する化合物とし て蛇毒が用いられる。蛇毒の例は、エカリン、並びにジスホリドウス（Ｄｉｓｐ ｈｏｌｉｄｕｓ−）、ラブドフイス（Ｒｈａｂｄｏｐｈｉｓ−）、ボトロプス（ Ｂｏｔｈｒｏｐｓ−）、ノテキス（Ｎｏｔｅ−ｃｈｉｓ−）、オキシウラヌス（ Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ−）　、およびラッセル（Ｒｕ−ｓｓｅｌ−）クサリヘビ型 の毒である。エカリンおよび固定エカリンのような蛇毒は市販されており、例え ばスイスのペンタファーム社から入手できる。

本発明にしたがえば、好ましくはエカリン（エキス−カリナートウス毒素の高度 に精製されたフラクション）が蛇毒として用いられる。エカリンはプロトロンビ ンのアルギニン２３２でペプチド結合を分断し、中間体メイゾトロンビンを生じ る。正常には、付加反応は自勉反応またはトロンビン加速を介して生じる。ヒル ジンが血中に存在するときは、メイゾトロンピンとヒルジンは相互に作用する。

反対に、ヘパリンはメイゾトロンピンと反応できない。添付の図１はこれらの作 用を示す。

血中のヒルジン濃度の測定工程は、以下の通りである。０゜１６＋ｓｌの緩衝液 、０．０２ｓ＋ｌのＯ、ＬＭ　Ｃａ　ＣＬ溶液およびエカリン０．０２鳳１（２ ００ＥＵ／■１）を０．４ｍｌのヘパリン血（２０ＩＥヘパリン／ｌｌ血液）に 加える。凝固開始は、凝固時間の機械的自動的測定によってめられる。較正曲線 を座標に表すために、ヒルジンを量を増しながら、凝固充填物の緩衝液部分に加 える。添付の図２から、Ｏ，ｌ−２μｇヒルジン／凝固バッチの濃度範囲では直 線関係が存在することが明らかである。したがって、血液サンプルのヒルジン濃 度の非常に速い解読が可能である。また別の利点は、全血の使用にある。全測定 時間はおよそ５分で、これは患者の枕元での診断という観点から治療薬のモニタ リングに最適である。

以下の実施例は本発明を詳述する。

以下の検査例では、凝固時間測定装置を用いたが、この装置では、凝固開始は、 サンプルの試験管が回転している間の電場の撹乱によって凝固バッチ中の磁石で 検出される。したがって、全血がサンプルバッチとして用いられる。「血液凝固 時間測定器Ｊヘモクロン（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ）　（登録商標）モデル８０１（ アメリカ合衆国ニューシャーシー州エジランのＩｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ　Ｃｏｒｐ、社製）は、２つの検査回路を有し、したがっ て、問題なく２組の測定が可能である。

実施例 Ｐ２１４モデルのへモクロン試験管中で、以下のものを混合し、 ０．０２ｍ１　Ｃａ　Ｃ１，（０，ＩＭ）０．０２ｍ１エカリン（２００ＥＵ／ ＋ｌ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　）０．１６ｍ１　トリス−緩衝液（０，０５Ｍ、３７℃で ｐＨ１，４）０．４０＋ｍｌ被検血液 時間を開始させ、試験管を自動凝固装置に入れ、凝固開始の時間を記録する。こ の工程は、較正曲線をプロットする場合と同じであり、そこから適切な凝固時間 でヒルジン濃度を読み取ることができる。そのようにして、特定量のヒルジンと 、被検血液のかわりに未処理血液を緩衝液に加える。凝固時間は、ヒルジン濃度 が増すにつれ長くなる。

以下の値は二度の測定によって４人の患者についてめられた。

ＩＩＲｌｍ　ヒルジン／ＩＩバッチ　ヒルジン／ｍ１１（秒）　（μｇ）　（μ ｇ） 患者Ａ　（７０；６３）＋６６．５　０．５　１．２５患者Ｂ　（７９；８６） φ８２．５　０．９　２．２５患者Ｃ（４６；５０）＋４８．ｏ　Ｏ，１０，２ ５患者Ｄ　（４４；４８）φ４６．０　０゜ｏ　ｏ、ｏ。

患者りについてはヒルジンの投与量不足または消費が存在することが明白である 。患者ＣおよびＡについては、ヒルジンの血液濃度は治療範囲内にあり、患者Ｂ については毒性範囲にある。

エカリン誘導プロトロンビン活性化の模式図図１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．血中または血液成分中のヒルジン及び合成トロンビン抑制因子の測定方法で あって、該方法において、プロトロンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロ ンビンに分割する化合物、その塩またはこれら化合物の混合物、並びに場合によ って緩衝液および／または他の慣用的な添加物が該血液または血液成分に加えら れ、さらに該添加から開始して凝固の開始までの経過時間が測定される、血中ま たは血液成分中のヒルジン及び合成トロンビン抑制因子の測定方法。
2. ２．該血液または血液成分がヘパリンを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．プロトロンビン中間体として、メイゾトロンビン、ＰＩＶＫＡメイゾトロン ビンまたはメイゾトロンビン−デスーフラグメント−１（Ｍｅｉｚｏｔｈｒｏｍ ｂｉｎ−ｄｅｓ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ−１）が用いられ、さらに、蛇毒がプロトロ ンビンをメイゾトロンビンに分割する化合物として用いられる、請求の範囲第１ 項または第２項に記載の方法。
4. ４．エカリン（Ｅｃａｒｉｎ）が蛇毒として用いられる、請求の範囲第１項、第 ２項または第３項に記載の方法。
5. ５．プロトロンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロンビンに分割する化合 物、その塩またはこれら化合物の混合物を含み、それとともに緩衝液および／ま たは他の慣用的な添加物を含み、または含まない、請求の範囲第１項から第４項 の１つに記載の当該方法を実施するための調製物。
6. ６．プロトロンビン中間体として、メイゾトロンビン、ＰＩＶＫＡメイゾトロン ビンまたはメイゾトロンビン−デスーフラグメントー１を含み、プロトロンビン をメイゾトロンビンに分割する化合物として蛇毒を含む、請求の範囲第５項に記 載の調製物。
7. ７．蛇毒としてエカリンを含む、請求の範囲第６項に記載の調製物。