JP3198111B2 - ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法 - Google Patents
ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法Info
- Publication number
- JP3198111B2 JP3198111B2 JP51370893A JP51370893A JP3198111B2 JP 3198111 B2 JP3198111 B2 JP 3198111B2 JP 51370893 A JP51370893 A JP 51370893A JP 51370893 A JP51370893 A JP 51370893A JP 3198111 B2 JP3198111 B2 JP 3198111B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hirudin
- blood
- meizothrombin
- prothrombin
- coagulation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/4609—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates from reptiles
- G01N2333/4613—Snake venom
- G01N2333/4633—Snake venom from Echis carinatus; Ecarin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、血中のヒルジンおよび合成トロンビン抑制
因子を測定する方法および該方法を実施するための調製
物に関する。
因子を測定する方法および該方法を実施するための調製
物に関する。
ヒルジンはHirudo medicinalis（ヒル）の唾液腺から
得られ、抗凝血剤であり、その効果はトロンビンとの化
学的複合物の形成にあり、それによってその触媒作用が
抑制される。ヒルジンは、分子量が7kDで65個のアミノ
酸を含むミニ蛋白である。その強力なトロンビンに対す
る親和性（k1値は10-12mol/）およびその直接作用機
構のために、ヒルジンは極めて興味深い。過去において
は、その臨床的利用は極めて限られていた。なぜなら
ば、ヒルジンは標準化された形態では容易に入手できな
かったからである。今日、ヒルジンは遺伝子工学によっ
て製造することができ、したがって、その臨床的利用が
近い将来期待できる。
得られ、抗凝血剤であり、その効果はトロンビンとの化
学的複合物の形成にあり、それによってその触媒作用が
抑制される。ヒルジンは、分子量が7kDで65個のアミノ
酸を含むミニ蛋白である。その強力なトロンビンに対す
る親和性（k1値は10-12mol/）およびその直接作用機
構のために、ヒルジンは極めて興味深い。過去において
は、その臨床的利用は極めて限られていた。なぜなら
ば、ヒルジンは標準化された形態では容易に入手できな
かったからである。今日、ヒルジンは遺伝子工学によっ
て製造することができ、したがって、その臨床的利用が
近い将来期待できる。
例えば、経口投与用医薬調製物は、欧州特許公開第46
8327号公報に開示されているが、当該調製物は組換え体
ヒルジンを含む。
8327号公報に開示されているが、当該調製物は組換え体
ヒルジンを含む。
最近、ヒルジンは、集中的に薬理学的に研究されてき
ており、その薬理学的データが実験動物とヒトから得ら
れた。ヒルジンは肝では代謝されず、むしろそのままの
形成で腎から排除される。ヒルジンは約１から２時間の
排除半減期を有し、体の細胞外液腔に分布する。ヘパリ
ンに似て、ヒルジンは経口的には吸収されない。過去の
研究では、ヒルジンは、ほとんど全ての血栓症において
活性で、したがって、内毒素ショック、実験的心筋梗塞
および血栓崩壊後の再閉塞の防止の際でする活性である
ことが示された。臨床薬理学的な研究では、免疫学的反
応は検出されなかった。臨床研究で、ヒルジンは、抗凝
血剤および抗血栓剤としてヘパリンより優れていること
が証明された。
ており、その薬理学的データが実験動物とヒトから得ら
れた。ヒルジンは肝では代謝されず、むしろそのままの
形成で腎から排除される。ヒルジンは約１から２時間の
排除半減期を有し、体の細胞外液腔に分布する。ヘパリ
ンに似て、ヒルジンは経口的には吸収されない。過去の
研究では、ヒルジンは、ほとんど全ての血栓症において
活性で、したがって、内毒素ショック、実験的心筋梗塞
および血栓崩壊後の再閉塞の防止の際でする活性である
ことが示された。臨床薬理学的な研究では、免疫学的反
応は検出されなかった。臨床研究で、ヒルジンは、抗凝
血剤および抗血栓剤としてヘパリンより優れていること
が証明された。
現在、多くの研究室が合成（特に小分子の）抑制因子
の合成を世界的な規模で研究している。合成トロンビン
抑制因子はヒルジンと同じ態様で働く。ベンザミジン誘
導体（例えばNAPAP（Ｎα−（２−ナフチルスルホニル
−グリシル）−D,L−アミジノフェニルアラニン−ピペ
リジン））およびいわゆるトリペプチドに関する研究
は、もっとも大きな前進を示した。全ての合成トロンビ
ン抑制因子は、現在前臨床研究の段階にある。これらの
効果は、ヒルジンのそれと質的に同じとみなすことがで
きる。しかしながら、合成トロンビン抑制因子の代謝
は、ヒルジンのそれと異なる。通常、トロンビン抑制因
子は、肝臓または血中で代謝される。そのような物質
は、臨床試験のためにまもなく利用可能になると予想さ
れる。ヒルジンを越える利点は、該化合物は経口的に投
与できるという事実にある。
の合成を世界的な規模で研究している。合成トロンビン
抑制因子はヒルジンと同じ態様で働く。ベンザミジン誘
導体（例えばNAPAP（Ｎα−（２−ナフチルスルホニル
−グリシル）−D,L−アミジノフェニルアラニン−ピペ
リジン））およびいわゆるトリペプチドに関する研究
は、もっとも大きな前進を示した。全ての合成トロンビ
ン抑制因子は、現在前臨床研究の段階にある。これらの
効果は、ヒルジンのそれと質的に同じとみなすことがで
きる。しかしながら、合成トロンビン抑制因子の代謝
は、ヒルジンのそれと異なる。通常、トロンビン抑制因
子は、肝臓または血中で代謝される。そのような物質
は、臨床試験のためにまもなく利用可能になると予想さ
れる。ヒルジンを越える利点は、該化合物は経口的に投
与できるという事実にある。
しかしながら、適切な治療または予防のためには、血
中のヒルジン濃度および合成トロンビン抑制因子濃度
を、過少投与を避けまたは過剰投与による副作用を予防
するために継続的に決定できることが必要である。言い
換えれば、治療薬監視が利用できなければならない。今
日まで、特に血中のヒルジンおよび合成トロンビン抑制
因子を、簡単な態様で実施できる測定方法は存在しな
い。
中のヒルジン濃度および合成トロンビン抑制因子濃度
を、過少投与を避けまたは過剰投与による副作用を予防
するために継続的に決定できることが必要である。言い
換えれば、治療薬監視が利用できなければならない。今
日まで、特に血中のヒルジンおよび合成トロンビン抑制
因子を、簡単な態様で実施できる測定方法は存在しな
い。
本発明は、特に血中のヒルジンおよび合成トロンビン
抑制因子の測定方法を提供するという課題にあるが、こ
れは、病院、診療所および実験室で、例えば出血もしく
は血栓症の危険性診断のための手術前検査に、また血栓
症の畏れのある患者の抗血液凝固の治療の監視のため
に、さらに種々の疾病、例えば重篤な感染症、肝機能障
害および悪性疾患のフォローアップに簡単な態様で広範
囲に利用できる。
抑制因子の測定方法を提供するという課題にあるが、こ
れは、病院、診療所および実験室で、例えば出血もしく
は血栓症の危険性診断のための手術前検査に、また血栓
症の畏れのある患者の抗血液凝固の治療の監視のため
に、さらに種々の疾病、例えば重篤な感染症、肝機能障
害および悪性疾患のフォローアップに簡単な態様で広範
囲に利用できる。
本発明の方法は容易に実施することができ、その間、
病院や診療所に既に存在する装置を使用することができ
ると考えられる。さらに、該方法を実施するための調製
物は入手可能であろう。
病院や診療所に既に存在する装置を使用することができ
ると考えられる。さらに、該方法を実施するための調製
物は入手可能であろう。
本発明の要旨は、血中のヒルジンおよび合成トロンビ
ン抑制因子を測定する方法であり、この方法では、プロ
トロンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロンビン
に分割する化合物、その塩またはそれら化合物の混合
物、並びに場合によって緩衝液および／または他の慣用
的な添加物が血液に加えられ、添加から始まり凝固が開
始するまでの経過時間が測定されるが、当該方法によっ
て、メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビンまたは
メイゾトロンビン−デス−フラグメント−１がプロトロ
ンビン中間体として用いられる。
ン抑制因子を測定する方法であり、この方法では、プロ
トロンビン中間体、プロトロンビンをメイゾトロンビン
に分割する化合物、その塩またはそれら化合物の混合
物、並びに場合によって緩衝液および／または他の慣用
的な添加物が血液に加えられ、添加から始まり凝固が開
始するまでの経過時間が測定されるが、当該方法によっ
て、メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビンまたは
メイゾトロンビン−デス−フラグメント−１がプロトロ
ンビン中間体として用いられる。
本発明の要旨は、また上述の方法を実施するための調
製物で、これは、上記に定義されるプロトロンビン中間
体、プロトロンビンをメイゾトロンビンに分割する化合
物、その塩またはそれら化合物の混合物を、ヘパリン並
びに緩衝液および／または他の慣用的な添加物ととも
に、またはそれら添加物無しでん含むという特徴を有す
る。
製物で、これは、上記に定義されるプロトロンビン中間
体、プロトロンビンをメイゾトロンビンに分割する化合
物、その塩またはそれら化合物の混合物を、ヘパリン並
びに緩衝液および／または他の慣用的な添加物ととも
に、またはそれら添加物無しでん含むという特徴を有す
る。
本発明の方法は、単純な態様で実施でき、さらに、検
査の結果は較正曲線を読み取ることができるので、容易
に得ることができるという顕著な利点を有する。この方
法は、簡単に病院、診療所および実験室で大規模に実施
でき、特定の訓練を受けた職員を必要としない。
査の結果は較正曲線を読み取ることができるので、容易
に得ることができるという顕著な利点を有する。この方
法は、簡単に病院、診療所および実験室で大規模に実施
でき、特定の訓練を受けた職員を必要としない。
本発明の方法は、ヒルジンまたは合成（好ましくは小
分子）のトロンビン抑制因子を測定するために実施でき
る。合成トロンビン抑制因子の例は、上記全てのトリペ
プチドphe−pro−argの誘導体で、これは、硼酸誘導
体、アルギニナール、クロロメチルケトン誘導体、アミ
ノ酸で修飾された誘導体、ベンザミジン誘導体および所
謂ヒロローグ（すなわち部分的ヒルジン類似配列）であ
る。解毒薬の成分はヒルジンに対するものと同じであ
る。
分子）のトロンビン抑制因子を測定するために実施でき
る。合成トロンビン抑制因子の例は、上記全てのトリペ
プチドphe−pro−argの誘導体で、これは、硼酸誘導
体、アルギニナール、クロロメチルケトン誘導体、アミ
ノ酸で修飾された誘導体、ベンザミジン誘導体および所
謂ヒロローグ（すなわち部分的ヒルジン類似配列）であ
る。解毒薬の成分はヒルジンに対するものと同じであ
る。
本発明の科学的背景はヒルジンまたは合成トロンビン
抑制因子とプロトロンビン中間体（プロトロンビン−ト
ロンビン変換の中間生成物の中間メイゾトロンビン、ま
たはメイゾトロンビン−デス−フラグメント−１［Meiz
othrombin−des−Fragment−１］）との相互作用にあ
る。この変換は、多工程反応を含み、この場合、非常に
特異的な蛋白結合が、限定的な蛋白分解反応工程によっ
て分解される。凝固カスケードが活性化されている間、
通常は、蛋白分解活性を有する複合体が活性化された第
Ｖ因子、Ca++、リン脂質および第Ｘ因子から生成され、
これは、プロトロンビン−トロンビン変換を開始させ
る。その結果は極めて少量の第II因子中間体であるが、
プロトロンビンはこのプロトロンビン複合体で「固相
様」類似の活性化を受けるからである。しかしながら、
凝固が蛇毒の特定の分画（例えばエキス−カリナートゥ
ス［Echis−cari−natus］由来のもの）で開始する場
合、「非定形的（atypische）」な中間体、例えばメイ
ゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビンまたはメイゾト
ロンビン−デス−フラグメント−１がプロトロンビンか
ら専ら形成される。これらの中間体は、ヒルジンまたは
合成トロンビン抑制因子によって不活化されるが、ヘパ
リンでは不活化されない。したがって、サンプル中に含
まれるヒルジンによって不活化されるメイゾトロンビン
またはPIVKAメイゾトロンビンが、蛇毒（例えばエキス
蛇毒）によって血中でまたは血液成分中で生成される、
凝固試験を設定することができる。プロトロンビン中間
体に対するヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の親
和性は極めて高い。例えば、メイゾトロンビンについて
は、それはk1＞10-10mol/であり、その結果、遊離プ
ロトロンビン中間体（例えばメイゾトロンビン）は、ヒ
ルジンまたは合成トロンビン抑制因子が完全に消費され
てしまうまで生成されない。このプロトロンビン中間
体、例えばメイゾトロンビンは、サンプル中に含まれる
フィブリノーゲンをフィブリンに変換することができ
る。このフィブリン生成は、サンプルを凝固させること
によって時間で表される。定量化は、血液サンプルのヒ
ルジン濃度は、治療的血液濃度の範囲内では凝固時間を
直線的に増加させ、したがって迅速で無駄のない表示を
可能にするということで実施される。
抑制因子とプロトロンビン中間体（プロトロンビン−ト
ロンビン変換の中間生成物の中間メイゾトロンビン、ま
たはメイゾトロンビン−デス−フラグメント−１［Meiz
othrombin−des−Fragment−１］）との相互作用にあ
る。この変換は、多工程反応を含み、この場合、非常に
特異的な蛋白結合が、限定的な蛋白分解反応工程によっ
て分解される。凝固カスケードが活性化されている間、
通常は、蛋白分解活性を有する複合体が活性化された第
Ｖ因子、Ca++、リン脂質および第Ｘ因子から生成され、
これは、プロトロンビン−トロンビン変換を開始させ
る。その結果は極めて少量の第II因子中間体であるが、
プロトロンビンはこのプロトロンビン複合体で「固相
様」類似の活性化を受けるからである。しかしながら、
凝固が蛇毒の特定の分画（例えばエキス−カリナートゥ
ス［Echis−cari−natus］由来のもの）で開始する場
合、「非定形的（atypische）」な中間体、例えばメイ
ゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビンまたはメイゾト
ロンビン−デス−フラグメント−１がプロトロンビンか
ら専ら形成される。これらの中間体は、ヒルジンまたは
合成トロンビン抑制因子によって不活化されるが、ヘパ
リンでは不活化されない。したがって、サンプル中に含
まれるヒルジンによって不活化されるメイゾトロンビン
またはPIVKAメイゾトロンビンが、蛇毒（例えばエキス
蛇毒）によって血中でまたは血液成分中で生成される、
凝固試験を設定することができる。プロトロンビン中間
体に対するヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の親
和性は極めて高い。例えば、メイゾトロンビンについて
は、それはk1＞10-10mol/であり、その結果、遊離プ
ロトロンビン中間体（例えばメイゾトロンビン）は、ヒ
ルジンまたは合成トロンビン抑制因子が完全に消費され
てしまうまで生成されない。このプロトロンビン中間
体、例えばメイゾトロンビンは、サンプル中に含まれる
フィブリノーゲンをフィブリンに変換することができ
る。このフィブリン生成は、サンプルを凝固させること
によって時間で表される。定量化は、血液サンプルのヒ
ルジン濃度は、治療的血液濃度の範囲内では凝固時間を
直線的に増加させ、したがって迅速で無駄のない表示を
可能にするということで実施される。
本発明の方法では、該化合物を血液に添加してから凝
固が開始するまでの経過時間を測定する。凝固開始を測
定する多くの方法が知られている。もっとも頻繁には、
凝固塊が形成されたとき当該溶液からフィブリンの糸を
引っ張りだす白金のフックが、周期的に凝固バッチに挿
入される。この瞬間は続いて凝固終末点として記録され
る。この記録工程は、ストップウォッチによって手動
で、または該白金フックが電極としてデザインされてい
るときは接触を引き起こすことによって電気的に行われ
る。さらにまた、自動化された方法も存在する。
固が開始するまでの経過時間を測定する。凝固開始を測
定する多くの方法が知られている。もっとも頻繁には、
凝固塊が形成されたとき当該溶液からフィブリンの糸を
引っ張りだす白金のフックが、周期的に凝固バッチに挿
入される。この瞬間は続いて凝固終末点として記録され
る。この記録工程は、ストップウォッチによって手動
で、または該白金フックが電極としてデザインされてい
るときは接触を引き起こすことによって電気的に行われ
る。さらにまた、自動化された方法も存在する。
本発明の方法は、全ての凝固診断に関する測定原理、
特に自動化された方法に応用できる大きな利点を有す
る。色素形成トロンビン基質が適切な血漿サンプルに添
加されるとき、実験室用自動装置で測定を行うことがで
きる。
特に自動化された方法に応用できる大きな利点を有す
る。色素形成トロンビン基質が適切な血漿サンプルに添
加されるとき、実験室用自動装置で測定を行うことがで
きる。
本発明の方法は、簡単な態様で実施でき、ヒルジン濃
度を較正曲線で読み取ることを可能にする。本発明の方
法は、全血、血漿で実施できるが、また尿のような体
液、濃縮組織液または均質化後の細胞溶出液に一定量の
正常血漿を加えても実施できる。本発明の方法は、ヘパ
リンはこの方法を阻害しないので、血液がヘパリンを含
んでいてもよいという顕著な利点を有する。
度を較正曲線で読み取ることを可能にする。本発明の方
法は、全血、血漿で実施できるが、また尿のような体
液、濃縮組織液または均質化後の細胞溶出液に一定量の
正常血漿を加えても実施できる。本発明の方法は、ヘパ
リンはこの方法を阻害しないので、血液がヘパリンを含
んでいてもよいという顕著な利点を有する。
本発明にしたがえば、メイゾトロンビン、PIVKAプロ
トロンビンまたはメイゾトロンビン−デス−フラグメン
ト−１が、例えばプロトロンビン中間体として用いられ
る。メイゾトロンビンは市販されており、スイスのペン
タファーム社（Pentapharm company）から入手できる。
しかし、メイゾトロンビン、PIVKA−プロトロンビンま
たは他のプロトロンビン中間体はインビトロで生成する
こともできる。
トロンビンまたはメイゾトロンビン−デス−フラグメン
ト−１が、例えばプロトロンビン中間体として用いられ
る。メイゾトロンビンは市販されており、スイスのペン
タファーム社（Pentapharm company）から入手できる。
しかし、メイゾトロンビン、PIVKA−プロトロンビンま
たは他のプロトロンビン中間体はインビトロで生成する
こともできる。
下記の図に示したように、凝固系の４つの因子（第II
因子（プロトロンビン）、第VII因子、第IX因子および
第Ｘ因子）は、それらはガンマ−カルボキシグルタミン
酸基を含むという特徴を有する。このグルタミン酸のガ
ンマ−カルボキシル化は、酵素系（これはビタミンＫを
補助因子として必要とする）の助けを借りて肝でなされ
る「アカルボキシ（acarboxy）因子」のリボソーム合成
後まで起こらない。
因子（プロトロンビン）、第VII因子、第IX因子および
第Ｘ因子）は、それらはガンマ−カルボキシグルタミン
酸基を含むという特徴を有する。このグルタミン酸のガ
ンマ−カルボキシル化は、酵素系（これはビタミンＫを
補助因子として必要とする）の助けを借りて肝でなされ
る「アカルボキシ（acarboxy）因子」のリボソーム合成
後まで起こらない。
ガンマ−カルボキシグルタミン酸基は、凝固作用に必
須である。それらは、カルシウムイオンに対する必要な
結合原子価を表す。ジクマロール型の間接抗凝固物質
（ビタミンＫ拮抗物質）による処理では、ポストリボソ
ームのガンマ−カルボキシル化は起こらず、血液は不完
全な凝固因子またはアカルボキシ因子を示す。なぜなら
ば、それらは、カルシウム−結合ガンマ−カルボキシ基
を欠くからである。これらの凝固因子はまたPIVKA因子
（PIVKA＝proteins induced by vitamin K antagonist
s、ビタミンＫ拮抗物質誘導蛋白）と呼ばれる。
須である。それらは、カルシウムイオンに対する必要な
結合原子価を表す。ジクマロール型の間接抗凝固物質
（ビタミンＫ拮抗物質）による処理では、ポストリボソ
ームのガンマ−カルボキシル化は起こらず、血液は不完
全な凝固因子またはアカルボキシ因子を示す。なぜなら
ば、それらは、カルシウム−結合ガンマ−カルボキシ基
を欠くからである。これらの凝固因子はまたPIVKA因子
（PIVKA＝proteins induced by vitamin K antagonist
s、ビタミンＫ拮抗物質誘導蛋白）と呼ばれる。
そのようなジクマロール型の抗凝固物質で処置された
患者の血漿にエカリンを加えると、PIVKAメイゾトロン
ビンは、プロトロンビンを有する正常な血漿サンプルの
場合のように制限的蛋白分解を介して、同じ態様でPIVK
Aプロトロンビンからのこの血漿中に産生される。
患者の血漿にエカリンを加えると、PIVKAメイゾトロン
ビンは、プロトロンビンを有する正常な血漿サンプルの
場合のように制限的蛋白分解を介して、同じ態様でPIVK
Aプロトロンビンからのこの血漿中に産生される。
このPIVKAメイゾトロンビンまたは他のPIVKA中間体
は、ヒルジンと結合する能力を保持していたが、これら
は、しかし凝固カスケードの他の因子（血小板、フィブ
リノーゲン、トロンボモジュリンなど）に対して全く、
または極めて低い効果しかもたない。本発明にしたがえ
ば、メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビン、それ
らの中間体およびPIVKAプロトロンビンからのPIVKA中間
体を用いることができる。それらは、ヒトまたは他の哺
乳類由来のものでよい。
は、ヒルジンと結合する能力を保持していたが、これら
は、しかし凝固カスケードの他の因子（血小板、フィブ
リノーゲン、トロンボモジュリンなど）に対して全く、
または極めて低い効果しかもたない。本発明にしたがえ
ば、メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビン、それ
らの中間体およびPIVKAプロトロンビンからのPIVKA中間
体を用いることができる。それらは、ヒトまたは他の哺
乳類由来のものでよい。
メイゾトロンビンを調製するために、例えば、固定エ
カリンを例えば２から4cm3のサイズ範囲のミニカラムに
充填することができる。エカリン固定物（ペンタファー
ム社（Pen−tapharm AG）バーゼル）は膨張状態で購入
することができ、塩化ナトリウム0.15M、酢酸ナトリウ
ム0.02M、プリオネックス（Prionex、登録商標）（洗浄
ブタ皮膚コラーゲンの蛋白安定化ポリペプチドフラクシ
ョンのペンタファーム社の商標）0.2％およびトリクロ
ロイソブタノール0.3％、（pH5.5）の水溶液に懸濁す
る。膨張エカリン固定化物１グラムは、クエン酸バリウ
ム溶出液からpH8.4、37℃で30分以内に500から700Uのア
ミド分解活性（1U＝123NIH単位）を生じる（tos−gly−
pro−arg−pNA（Chromozym（登録商標）TH）で測定）。
カリンを例えば２から4cm3のサイズ範囲のミニカラムに
充填することができる。エカリン固定物（ペンタファー
ム社（Pen−tapharm AG）バーゼル）は膨張状態で購入
することができ、塩化ナトリウム0.15M、酢酸ナトリウ
ム0.02M、プリオネックス（Prionex、登録商標）（洗浄
ブタ皮膚コラーゲンの蛋白安定化ポリペプチドフラクシ
ョンのペンタファーム社の商標）0.2％およびトリクロ
ロイソブタノール0.3％、（pH5.5）の水溶液に懸濁す
る。膨張エカリン固定化物１グラムは、クエン酸バリウ
ム溶出液からpH8.4、37℃で30分以内に500から700Uのア
ミド分解活性（1U＝123NIH単位）を生じる（tos−gly−
pro−arg−pNA（Chromozym（登録商標）TH）で測定）。
続いて精製プロトロンビンフラクションをこれらのカ
ラムに入れ、場合によってヘパリンで安定化した後、生
成メイゾトロンビンを続いて凍結乾燥する。この凍結乾
燥物質をアンプルに充填し、その後、使用のためには適
切な溶媒で再調製することができる。
ラムに入れ、場合によってヘパリンで安定化した後、生
成メイゾトロンビンを続いて凍結乾燥する。この凍結乾
燥物質をアンプルに充填し、その後、使用のためには適
切な溶媒で再調製することができる。
メイゾトロンビン−デス−フラグメント−１を調製す
るためには、メイゾトロンビンの場合と同じ方法を用い
る。バッチ工程では、より長い反応時間（３から４時
間）を予定する必要がある。メイゾトロンビン−デス−
フラグメント−１は、メイゾトロンビンの活性化後の生
成物である。
るためには、メイゾトロンビンの場合と同じ方法を用い
る。バッチ工程では、より長い反応時間（３から４時
間）を予定する必要がある。メイゾトロンビン−デス−
フラグメント−１は、メイゾトロンビンの活性化後の生
成物である。
本発明にしたがえば、プロトロンビンをメイゾトロン
ビンに分割する化合物として蛇毒が用いられる。蛇毒の
例は、エカリン、並びにジスホリドゥス（Dispholidus
−）、ラブドフィス（Rhabdophis−）、ボトロプス（Bo
throps−）、ノテキス（Note−chis−）、オキシウラヌ
ス（Oxyuranus−）、およびラッセル（Ru−ssel−）ク
サリヘビ型の毒である。エカリンおよび固定エカリンの
ような蛇毒は市販されており、例えばスイスのペンタフ
ァーム社から入手できる。
ビンに分割する化合物として蛇毒が用いられる。蛇毒の
例は、エカリン、並びにジスホリドゥス（Dispholidus
−）、ラブドフィス（Rhabdophis−）、ボトロプス（Bo
throps−）、ノテキス（Note−chis−）、オキシウラヌ
ス（Oxyuranus−）、およびラッセル（Ru−ssel−）ク
サリヘビ型の毒である。エカリンおよび固定エカリンの
ような蛇毒は市販されており、例えばスイスのペンタフ
ァーム社から入手できる。
本発明にしたがえば、好ましいエカリン（エキス−カ
リナートゥス毒素の高度に精製されたフラクション）が
蛇毒として用いられる。エカリンはプロトロンビンのア
ルギニン232でペプチド結合を分断し、中間体メイゾト
ロンビンを生じる。正常には、付加反応は自触反応また
はトロンビン加速を介して生じる。ヒルジンが血中に存
在するときは、メイゾトロンビンとヒルジンは相互に作
用する。反対に、ヘパリンはメイゾトロンビンと反応で
きない。添付の図１はこれらの作用を示す。
リナートゥス毒素の高度に精製されたフラクション）が
蛇毒として用いられる。エカリンはプロトロンビンのア
ルギニン232でペプチド結合を分断し、中間体メイゾト
ロンビンを生じる。正常には、付加反応は自触反応また
はトロンビン加速を介して生じる。ヒルジンが血中に存
在するときは、メイゾトロンビンとヒルジンは相互に作
用する。反対に、ヘパリンはメイゾトロンビンと反応で
きない。添付の図１はこれらの作用を示す。
血中のヒルジン濃度の測定工程は、以下の通りであ
る。0.16mlの緩衝液、0.02mlの0.1M CaCl2溶液およびエ
カリン0.02ml（200EU/ml）を0.4mlのヘパリン血（20IE
ヘパリン/ml血液）に加える。凝固開始は、凝固時間の
機械的自動的測定によって求められる。較正曲線を座標
に表すために、ヒルジンを量を増しながら、凝固充填物
の緩衝液部分に加える。添付の図２から、0.1−２μｇ
ヒルジン／凝固バッチの濃度範囲では直線関係が存在す
ることが明らかである。したがって、血液サンプルのヒ
ルジン濃度の非常に速い解読が可能である。また別の利
点は、全血の使用にある。全測定時間はおよそ５分で、
これは患者の枕元での診断という観点から治療薬のモニ
タリングに最適である。
る。0.16mlの緩衝液、0.02mlの0.1M CaCl2溶液およびエ
カリン0.02ml（200EU/ml）を0.4mlのヘパリン血（20IE
ヘパリン/ml血液）に加える。凝固開始は、凝固時間の
機械的自動的測定によって求められる。較正曲線を座標
に表すために、ヒルジンを量を増しながら、凝固充填物
の緩衝液部分に加える。添付の図２から、0.1−２μｇ
ヒルジン／凝固バッチの濃度範囲では直線関係が存在す
ることが明らかである。したがって、血液サンプルのヒ
ルジン濃度の非常に速い解読が可能である。また別の利
点は、全血の使用にある。全測定時間はおよそ５分で、
これは患者の枕元での診断という観点から治療薬のモニ
タリングに最適である。
以下の実施例は本発明を詳述する。
以下の検査例では、凝固時間測定装置を用いたが、こ
の装置では、凝固開始は、サンプルの試験管が回転して
いる間の電場の撹乱によって凝固バッチ中の磁石で検出
される。したがって、全血がサンプルバッチとして用い
られる。「血液凝固時間測定器」ヘモクロン（Hemochro
n）（登録商標）モデル801（アメリカ合衆国ニュージャ
ージー州エジソンのInt.Technidyne Corp.社製）は、２
つの検査回路を有し、したがって、問題なく２組の測定
が可能である。
の装置では、凝固開始は、サンプルの試験管が回転して
いる間の電場の撹乱によって凝固バッチ中の磁石で検出
される。したがって、全血がサンプルバッチとして用い
られる。「血液凝固時間測定器」ヘモクロン（Hemochro
n）（登録商標）モデル801（アメリカ合衆国ニュージャ
ージー州エジソンのInt.Technidyne Corp.社製）は、２
つの検査回路を有し、したがって、問題なく２組の測定
が可能である。
実施例 P214モデルのヘモクロン試験管中で、以下のものを混
合し、 0.02ml CaCl2（0.1M） 0.02mlエカリン（200EU/ml NaCl） 0.16mlトリス−緩衝液（0.05M、37℃でpH7.4） 0.40ml被検血液 時間を開始させ、試験管を自動凝固装置に入れ、凝固開
始の時間を記録する。この工程は、較正曲線をプロット
する場合と同じであり、そこから適切な凝固時間でヒル
ジン濃度を読み取ることができる。そのようにして、特
定量のヒルジンと、被検血液のかわりに未処理血液を緩
衝液に加える。凝固時間は、ヒルジン濃度が増すにつれ
長くなる。
合し、 0.02ml CaCl2（0.1M） 0.02mlエカリン（200EU/ml NaCl） 0.16mlトリス−緩衝液（0.05M、37℃でpH7.4） 0.40ml被検血液 時間を開始させ、試験管を自動凝固装置に入れ、凝固開
始の時間を記録する。この工程は、較正曲線をプロット
する場合と同じであり、そこから適切な凝固時間でヒル
ジン濃度を読み取ることができる。そのようにして、特
定量のヒルジンと、被検血液のかわりに未処理血液を緩
衝液に加える。凝固時間は、ヒルジン濃度が増すにつれ
長くなる。
以下の値は二度の測定によって４人の患者について求
められた。
められた。
患者Ｄについてはヒルジンの投与量不足または消費が
存在することが明白である。患者ＣおよびＡについて
は、ヒルジンの血液濃度は治療範囲内にあり、患者Ｂに
ついては毒性範囲にある。
存在することが明白である。患者ＣおよびＡについて
は、ヒルジンの血液濃度は治療範囲内にあり、患者Ｂに
ついては毒性範囲にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホフマン，ユッタ ドイツ連邦共和国ディー―99099・エル フルト，ヘルマン―ブリル―シュトラー セ・５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66 G01N 33/86
Claims (6)
- 【請求項１】血中または血液成分中のヒルジンまたは合
成トロンビン抑制因子の測定方法で、該方法において、
以下の物質（ｉ）および（ii）： （ｉ）メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビン、メ
イゾトロンビン−デス−フラグメント−１、プロトロン
ビンをメイゾトロンビンに分割する化合物、その塩また
はこれら化合物の混合物、並びに （ii）緩衝液および／または他の慣用的な添加物 が該血液または血液成分に加えられ、さらに該添加から
開始して凝固の開始までの経過時間が測定される測定方
法。 - 【請求項２】該血液または血液成分がヘパリンを含む、
請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記物質（ｉ）として、メイゾトロンビ
ン、PIVKAメイゾトロンビン、メイゾトロンビン−デス
−フラグメント−１、又は蛇毒が用いられる、請求の範
囲第１項または第２項に記載の方法。 - 【請求項４】エカリン（Ecarin）が蛇毒として用いられ
る、請求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】メイゾトロンビン、PIVKAメイゾトロンビ
ン、メイゾトロンビン−デス−フラグメント−１、蛇
毒、その塩またはこれら化合物の混合物からなる群より
選択される物質を、 ヘパリン並びに緩衝液および／または他の慣用的な添加
物とともに含む請求の範囲第１項から第４項の１つに記
載の当該方法を実施するための調製物。 - 【請求項６】蛇毒としてエカリンを含む、請求の範囲第
５項に記載の調製物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4203980.0 | 1992-02-11 | ||
| DE4203980A DE4203980A1 (de) | 1992-02-11 | 1992-02-11 | Verfahren zur bestimmung von hirudin und synthetischen thrombininhibitoren |
| PCT/EP1993/000161 WO1993016390A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-01-25 | Verfahren zur bestimmung von hirudin und synthetischen trhombininhibitoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07503373A JPH07503373A (ja) | 1995-04-13 |
| JP3198111B2 true JP3198111B2 (ja) | 2001-08-13 |
Family
ID=6451420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51370893A Expired - Lifetime JP3198111B2 (ja) | 1992-02-11 | 1993-01-25 | ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5547850A (ja) |
| EP (1) | EP0626070B1 (ja) |
| JP (1) | JP3198111B2 (ja) |
| AT (1) | ATE136367T1 (ja) |
| DE (2) | DE4203980A1 (ja) |
| DK (1) | DK0626070T3 (ja) |
| ES (1) | ES2087715T3 (ja) |
| WO (1) | WO1993016390A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4203965A1 (de) * | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
| DE19755682A1 (de) * | 1997-12-15 | 1999-06-17 | Knoll Ag | Verfahren zur Ermittlung eines Dosierungschemas für Thrombininhibitoren |
| DE19904674A1 (de) | 1999-02-04 | 2000-08-31 | Haemosys Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Thrombininhibitoren |
| US7422905B2 (en) | 2004-02-27 | 2008-09-09 | Medtronic, Inc. | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| US7439069B2 (en) | 2004-02-27 | 2008-10-21 | Nippoldt Douglas D | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| US7399637B2 (en) | 2004-04-19 | 2008-07-15 | Medtronic, Inc. | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| EP1745145A4 (en) * | 2004-05-11 | 2008-03-26 | Heptest Lab Inc | COMPOSITIONS, KIT AND METHOD IN ONE STEP FOR MONITORING COMPOUNDS HAVING XA AND / OR ANTIFACTOR IIA ANTIFACTOR ACTIVITIES |
| GB2433592A (en) * | 2005-12-23 | 2007-06-27 | Pentapharm Ag | Assay for thrombin inhibitors |
| WO2016019145A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Haemonetics Corporation | Detection and classification of an anticoagulant using a clotting assay |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2757992A1 (de) * | 1977-12-24 | 1979-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur prothrombin-bestimmung |
| US4496653A (en) * | 1980-10-09 | 1985-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of antithrombin-BM |
| DE3038163A1 (de) * | 1980-10-09 | 1982-05-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Thrombininhibitor, seine herstellung und verwendung |
| DE3330699A1 (de) * | 1983-08-25 | 1985-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma |
| NL8902406A (nl) * | 1989-09-27 | 1991-04-16 | Hendrik Coenraad Hemker Prof D | Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit. |
| EP0442843B1 (de) * | 1990-02-14 | 1998-09-09 | Pentapharm A.G. | Inhibitoren zur antikoagulierenden Vorbehandung von Blutproben |
| ES2073908T3 (es) * | 1990-11-05 | 1995-08-16 | Baxter Diagnostics Inc | Metodo para determinar la concentracion de anticoagulante. |
-
1992
- 1992-02-11 DE DE4203980A patent/DE4203980A1/de not_active Ceased
-
1993
- 1993-01-25 WO PCT/EP1993/000161 patent/WO1993016390A1/de active IP Right Grant
- 1993-01-25 JP JP51370893A patent/JP3198111B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-25 ES ES93903232T patent/ES2087715T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-25 AT AT93903232T patent/ATE136367T1/de active
- 1993-01-25 EP EP93903232A patent/EP0626070B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-25 US US08/284,453 patent/US5547850A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-25 DE DE59302119T patent/DE59302119D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-01-25 DK DK93903232.2T patent/DK0626070T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE136367T1 (de) | 1996-04-15 |
| EP0626070B1 (de) | 1996-04-03 |
| WO1993016390A1 (de) | 1993-08-19 |
| EP0626070A1 (de) | 1994-11-30 |
| US5547850A (en) | 1996-08-20 |
| DE4203980A1 (de) | 1993-08-12 |
| DE59302119D1 (de) | 1996-05-09 |
| JPH07503373A (ja) | 1995-04-13 |
| ES2087715T3 (es) | 1996-07-16 |
| DK0626070T3 (da) | 1996-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nowak et al. | Quantitative determination of hirudin in blood and body fluids | |
| Seegers et al. | Relationship of “new” vitamin K-dependent protein C and “old” autoprothrombin II-A | |
| JP5037331B2 (ja) | 出血性障害の処置のための第ｉｘａ因子 | |
| Celander et al. | The biochemistry and physiology of urokinase | |
| Seegers et al. | Purification and some properties of autoprothrombin C | |
| JP2000023696A (ja) | 血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテア―ゼ | |
| Saito et al. | Partial purification of plasma thromboplastin antecedent (factor XI) and its activation by trypsin | |
| EP1853926A2 (en) | Procoagulants based on metal-chelating lipids | |
| JP3198111B2 (ja) | ヒルジンおよび合成トロンビン抑制因子の測定方法 | |
| JPH0476629B2 (ja) | ||
| Thompson et al. | Removal of heparin and protamine from plasma | |
| Lundblad et al. | The activation of Stuart factor (factor X) by activated antihemophilic factor (activated factor VIII) | |
| Dubber et al. | In vitro and in vivo studies with Trasylol, an anticoagulant and a fibrinolytic inhibitor | |
| JPS5991899A (ja) | 診断用活性化部分トロンボプラスチン試薬 | |
| Abiko et al. | Plasminogen-plasmin system: VII. Potentiation of antifibrinolytic action of a synthetic inhibitor, tranexamic acid, by α2-macroglobulin antiplasmin | |
| WO1986005814A1 (en) | A solubilizable, fibrin based composition and its use, in determinations of fibrinolysis parameters | |
| Robbins | The human plasma fibrinolytic system: regulation and control | |
| Collen | Natural inhibitors of fibrinolysis | |
| Sakuragawa et al. | Significance of a prothrombin assay method using Echis carinatus venom for diagnostic information in disseminated intravascular coagulation syndrome | |
| Sandberg et al. | Studies of inhibition of the plasmin-plasminogen fibrinolytic enzyme system in patients with myocardial infarction∗ | |
| Geratz | Inhibition of coagulation and fibrinolysis by aromatic amidino compounds | |
| CA2137342A1 (en) | Test for quantitative thrombin time | |
| Astrup et al. | The fibrinolytic system in human blood, as exemplified in a case of agammaglobulinemia and a case of macroglobulinemia | |
| Haddeland et al. | Stimulating effect of tissue-type plasminogen activator—A new and sensitive indicator of denatured fibrinogen | |
| Donaldson | Activation of partially purified plasminogen in the presence of ϵ-aminocaproic acid: A technique for preparing plasmin free of extrinsic activators |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080608 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090608 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090608 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100608 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110608 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120608 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120608 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130608 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130608 Year of fee payment: 12 |