JPS61198062A - エリスロポイエチンの酵素免疫測定法 - Google Patents
エリスロポイエチンの酵素免疫測定法Info
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- JPS61198062A JPS61198062A JP3968785A JP3968785A JPS61198062A JP S61198062 A JPS61198062 A JP S61198062A JP 3968785 A JP3968785 A JP 3968785A JP 3968785 A JP3968785 A JP 3968785A JP S61198062 A JPS61198062 A JP S61198062A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はエリスロポイエチン（以下ＥＰＯと略分化をコ
ントロールしている分子量約４万のホルモンである。種
々の貧血症や赤血球冷遇症では、体液中ＥＰＯｉが増加
または減少していることが知られてＰす、体液中ＥＰＯ
量を正確に測定することはこれらの血液疾患の診断に極
めて重要であ従来、ＥＰＯの測定法としてはマウス、ラ
ット等の小動物を用いる。バイオアッセイ法（臨床検査
Ｖｏｌ 、２２．Ｎｏ、２．１９７８年〕、マウス骨随
細胞への棒Ｖｏｌ 、９７．Ｎｏ、２，１５８〜１６９
頁、１９８１年）、マウス胎児細胞を利用する方法（日
本血液学会Ｄ 、Ｖｏ Ｉ 、 ４４ 、ＮｏＪ３゜１
９８１年）などが知られている。これらの中ではバイオ
アッセイ法が最も信頼性が高いと言われているが、この
方法は検出感度が低く、測定に長い日数’に？し、多数
の動物を使用するためコストも高いという欠点ｔＷして
いる。さらには後述するラジオイムノアッセイと同じよ
うにアイソトープを使用する上での欠点も有している。
ントロールしている分子量約４万のホルモンである。種
々の貧血症や赤血球冷遇症では、体液中ＥＰＯｉが増加
または減少していることが知られてＰす、体液中ＥＰＯ
量を正確に測定することはこれらの血液疾患の診断に極
めて重要であ従来、ＥＰＯの測定法としてはマウス、ラ
ット等の小動物を用いる。バイオアッセイ法（臨床検査
Ｖｏｌ 、２２．Ｎｏ、２．１９７８年〕、マウス骨随
細胞への棒Ｖｏｌ 、９７．Ｎｏ、２，１５８〜１６９
頁、１９８１年）、マウス胎児細胞を利用する方法（日
本血液学会Ｄ 、Ｖｏ Ｉ 、 ４４ 、ＮｏＪ３゜１
９８１年）などが知られている。これらの中ではバイオ
アッセイ法が最も信頼性が高いと言われているが、この
方法は検出感度が低く、測定に長い日数’に？し、多数
の動物を使用するためコストも高いという欠点ｔＷして
いる。さらには後述するラジオイムノアッセイと同じよ
うにアイソトープを使用する上での欠点も有している。
また、ＥＰＯのラジオイムノアッセイについて１４ Ｊ
、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、Ｖｏｌ、９９．Ｎｏ、
５．６２４〜６８５頁、１９８２年、に記載されている
ように、検出感度は４曜υ／ ｗｔと高いが、アイソト
ープを使用するため、特別の設備２よび特殊技術者を要
すること、放射性廃棄物が出ることなどの問題があり、
どこでも手軽に実施できる方法ではない。
、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、Ｖｏｌ、９９．Ｎｏ、
５．６２４〜６８５頁、１９８２年、に記載されている
ように、検出感度は４曜υ／ ｗｔと高いが、アイソト
ープを使用するため、特別の設備２よび特殊技術者を要
すること、放射性廃棄物が出ることなどの問題があり、
どこでも手軽に実施できる方法ではない。
（発明が解決しようとする問題点ン
近年、体液中の微量物質の定量法としての酵素免疫測定
法の進展は目覚しいものがあるが、放射免疫測定法に比
べて検出感度が低いという理由によりその用途拡大が制
限されている。特にＥＰＯ〜 は正常血中濃度７％ １０〜２０ ”／ｍｌ （０−１
〜０．３Ｖｇ／ ）と極めで微量であるため公知の酵素
免疫測定法では検出が難しいと考えられていた。
法の進展は目覚しいものがあるが、放射免疫測定法に比
べて検出感度が低いという理由によりその用途拡大が制
限されている。特にＥＰＯ〜 は正常血中濃度７％ １０〜２０ ”／ｍｌ （０−１
〜０．３Ｖｇ／ ）と極めで微量であるため公知の酵素
免疫測定法では検出が難しいと考えられていた。
本発明者らは、このような現状に鑑み、通常の検査室で
実施でき、かつ極めて短時間に低コストで実施でき、検
出感度の極めて高いＥＰＯの測定法を鋭意研究し本発明
に到達した。
実施でき、かつ極めて短時間に低コストで実施でき、検
出感度の極めて高いＥＰＯの測定法を鋭意研究し本発明
に到達した。
（問題点を解決するための手段）
すなわち本発明はエリスロポイエチンと特異的に反応す
る抗体を不溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持
体、エリスロポイエチンを含む被 ゛検液２よび
エリスロポイエチンと特異的に反応する抗体を酵素で標
識した標識物を反応せしめて、該抗体結合不溶性支持体
上に抗体−エリスロポイエチンー標識物複合体を形成さ
せた後、該抗体結合不溶性支持体上に結合した標識物の
ｉ−を測定するか、もしくは遊離の結合していない標識
物の量を測定することによシ、間接的にエリスロポイエ
チンを測定することを特徴とするエリスロポイエチンの
酵素免疫測定法である。
る抗体を不溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持
体、エリスロポイエチンを含む被 ゛検液２よび
エリスロポイエチンと特異的に反応する抗体を酵素で標
識した標識物を反応せしめて、該抗体結合不溶性支持体
上に抗体−エリスロポイエチンー標識物複合体を形成さ
せた後、該抗体結合不溶性支持体上に結合した標識物の
ｉ−を測定するか、もしくは遊離の結合していない標識
物の量を測定することによシ、間接的にエリスロポイエ
チンを測定することを特徴とするエリスロポイエチンの
酵素免疫測定法である。
具体的な一例としてはエリスロボイエデンと特、 異的
に反応する抗体を不溶性支持体に結合させた抗体結合不
溶性支持体Ｐよびエリスロポイエチンを含む被検液を反
応させて、エリスロポイエチンを該抗体結合不溶性支持
体に結合させた後、前記エリスロポイエチンと特異的に
反応する抗体を酵素で標識した標識物を反応させること
を特徴とするエリスロポイエチンの酵素免疫測定法があ
る。
に反応する抗体を不溶性支持体に結合させた抗体結合不
溶性支持体Ｐよびエリスロポイエチンを含む被検液を反
応させて、エリスロポイエチンを該抗体結合不溶性支持
体に結合させた後、前記エリスロポイエチンと特異的に
反応する抗体を酵素で標識した標識物を反応させること
を特徴とするエリスロポイエチンの酵素免疫測定法があ
る。
本発明に２いて使用するＥＰＯと特異的に反応する抗体
は、ＥＰＯを比較的多量に産生じている再生不良性貧血
患者などの尿より精製されたＥＰＯをヒト以外の哺乳動
物、たとえばウサギ、ヒツジなどに免疫して得られる。
は、ＥＰＯを比較的多量に産生じている再生不良性貧血
患者などの尿より精製されたＥＰＯをヒト以外の哺乳動
物、たとえばウサギ、ヒツジなどに免疫して得られる。
ＥＰＯの精製はアフィニティクロマトグラフ、ゲル濾過
など公知の精製手段を組合せて実施できるか、特異性の
高い抗体を得るには、ＥＰＯｉできるだけ純化してＰく
のが好適である。このようにして精製されたＥＰＯをウ
サギ、ヒツジなどの皮下に免疫して抗ＥＰ０血清を得る
。次に抗ＥＰＯ血性は硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースク
ロマトなどによシ精製し、ＥＰＯと特異的に反応する抗
体のガンマグロブリン分画（以下、抗ＢＰＯと略す）會
得る。また必要であれば抗ＥＰＯ血清よＪＥＰＯｋリガ
ンドするアフィニティクロマトグラフを行って抗ＥＰＯ
Ｉ得てもよい。
など公知の精製手段を組合せて実施できるか、特異性の
高い抗体を得るには、ＥＰＯｉできるだけ純化してＰく
のが好適である。このようにして精製されたＥＰＯをウ
サギ、ヒツジなどの皮下に免疫して抗ＥＰ０血清を得る
。次に抗ＥＰＯ血性は硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースク
ロマトなどによシ精製し、ＥＰＯと特異的に反応する抗
体のガンマグロブリン分画（以下、抗ＢＰＯと略す）會
得る。また必要であれば抗ＥＰＯ血清よＪＥＰＯｋリガ
ンドするアフィニティクロマトグラフを行って抗ＥＰＯ
Ｉ得てもよい。
また、ＥＰＯと特異的に反応する抗体は、細胞融合法に
よシ得られるモノクローナル抗体を用いてもよい。ＥＰ
Ｏに対するモノクローナル抗体の作製は、たとえば、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスに前記の精製されたＥＰＯｔｌ−免疫
して肺細胞を得、骨随腫細胞とポリエチレングリコール
により融合させ、ＨＡＴ培地によるクローニングをくシ
知すことにより実施される。このようにして得られたモ
ノクローナル抗体を用いると、より特異性の高いＥＰＯ
の測定が可能である。
よシ得られるモノクローナル抗体を用いてもよい。ＥＰ
Ｏに対するモノクローナル抗体の作製は、たとえば、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスに前記の精製されたＥＰＯｔｌ−免疫
して肺細胞を得、骨随腫細胞とポリエチレングリコール
により融合させ、ＨＡＴ培地によるクローニングをくシ
知すことにより実施される。このようにして得られたモ
ノクローナル抗体を用いると、より特異性の高いＥＰＯ
の測定が可能である。
本発明では抗ＥＰＯ＝ｉ不溶性支持体に結合させて抗体
結合不溶性支持体を得る。不溶性支持体とホ０ してはポリスチレンチュアブ、ヤリスチレン球、シリコ
ン片、マイクロプレー、トなどが挙げらｎるが、特にポ
リスチレン球が好ましい。抗ＥＰＯ＝ｉこｎらの不溶性
支持体に結合させる方法は公知の化学的方法でも良いが
、物理的吸着法で十分である。すなわち、抗ＥＰＯｉ適
当な緩衝液に溶解し、前記不溶性支持体を加えて、θ℃
〜室温にて数時間〜−夜、好ましくＪｆｉ４℃〜２０℃
にて４時間〜１６時間放置した後、生食水で洗浄して抗
ＥＰＯ結合不溶性支持体を得る。この抗ＥＰＯ結合不溶
性支持体は牛血清アルブミン、アジ化ナトリウムなどの
安定化剤を加えて保存すれば少なくとも１年は安定であ
る。
結合不溶性支持体を得る。不溶性支持体とホ０ してはポリスチレンチュアブ、ヤリスチレン球、シリコ
ン片、マイクロプレー、トなどが挙げらｎるが、特にポ
リスチレン球が好ましい。抗ＥＰＯ＝ｉこｎらの不溶性
支持体に結合させる方法は公知の化学的方法でも良いが
、物理的吸着法で十分である。すなわち、抗ＥＰＯｉ適
当な緩衝液に溶解し、前記不溶性支持体を加えて、θ℃
〜室温にて数時間〜−夜、好ましくＪｆｉ４℃〜２０℃
にて４時間〜１６時間放置した後、生食水で洗浄して抗
ＥＰＯ結合不溶性支持体を得る。この抗ＥＰＯ結合不溶
性支持体は牛血清アルブミン、アジ化ナトリウムなどの
安定化剤を加えて保存すれば少なくとも１年は安定であ
る。
本発明ではまず抗ＥＰＯ結合不溶性支持体にＥＰＯを含
む被検液を反応させて、ＥＰＯｉ結合させる。反応はＯ
℃〜４０℃、好ましくは４℃〜２０℃にて、１時間〜−
夜、好ましくＶｉ２時間から５時間行う。ここでＥＰＯ
Ｉ含む被検液とは血清、血漿、尿など？示す。
む被検液を反応させて、ＥＰＯｉ結合させる。反応はＯ
℃〜４０℃、好ましくは４℃〜２０℃にて、１時間〜−
夜、好ましくＶｉ２時間から５時間行う。ここでＥＰＯ
Ｉ含む被検液とは血清、血漿、尿など？示す。
次に、ＥＰＯｉ結合させた抗ＥＰＯ結合不溶性支持体に
、抗ＥＰＯｉ酵素で標識した標識物（以下、単に標識物
と略す）を反応させ、不溶性支持体上に抗ＥＰＯ−ＥＰ
Ｏ−標識物なるサンドイッチ状複合体を形成させる。
、抗ＥＰＯｉ酵素で標識した標識物（以下、単に標識物
と略す）を反応させ、不溶性支持体上に抗ＥＰＯ−ＥＰ
Ｏ−標識物なるサンドイッチ状複合体を形成させる。
ここで、酵素としてはグルコースオキシダーゼ、ペルオ
キ・ンダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼなどが挙げらｎるか、本発明では後述する理
由によりグルコースオキシダーゼが好適である。またペ
ルオキシダーゼの場合は、抗ＥＰＯｉペプシン消化、還
元などの操作をして得られるＦ（ａｂ’）２．Ｆａｂ、
Ｆａｂ’ ７ラグメントの１種また＃：ｔ２種以上にペ
ルオキシダーゼを結合させた標識物音用いると、測定の
パックグランドが低くなり、検出感度が向上するので有
利である。
キ・ンダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼなどが挙げらｎるか、本発明では後述する理
由によりグルコースオキシダーゼが好適である。またペ
ルオキシダーゼの場合は、抗ＥＰＯｉペプシン消化、還
元などの操作をして得られるＦ（ａｂ’）２．Ｆａｂ、
Ｆａｂ’ ７ラグメントの１種また＃：ｔ２種以上にペ
ルオキシダーゼを結合させた標識物音用いると、測定の
パックグランドが低くなり、検出感度が向上するので有
利である。
グルコースオキシダーゼやペルオキシダーゼなどを抗Ｅ
ＰＯまたは抗ＥＰＯのＦ （ａ ｂ’ ） ２ ＋ Ｆ
ａ ｂ 、Ｆａ ｂ’フラグメントなどに標識する方法
は公知方法で実施できる。たとえは酵素の糖鎖を過ヨウ
素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に抗ＥＰＯなどの
アミノ基を結合させる方法、たとえば酵素にマレイミド
基金導入し、抗ＥＰＯのＦａｂ’に存在するチオール基
と結合させる方法などが挙げられる。
ＰＯまたは抗ＥＰＯのＦ （ａ ｂ’ ） ２ ＋ Ｆ
ａ ｂ 、Ｆａ ｂ’フラグメントなどに標識する方法
は公知方法で実施できる。たとえは酵素の糖鎖を過ヨウ
素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に抗ＥＰＯなどの
アミノ基を結合させる方法、たとえば酵素にマレイミド
基金導入し、抗ＥＰＯのＦａｂ’に存在するチオール基
と結合させる方法などが挙げられる。
本発明では得られたサンドイッチ状複合体中の標識に用
いた酵素の活性を測定する。この酵素の活性量は最初に
反応させたＥＰＯの量に比例するので被検液中のＥＰＯ
ｉ測定することができる。
いた酵素の活性を測定する。この酵素の活性量は最初に
反応させたＥＰＯの量に比例するので被検液中のＥＰＯ
ｉ測定することができる。
酵素の活性測定はその酵素の基質となる物質を添加する
ことにより行われるが、たとえばグルコースオキシダー
ゼではグルコースであり、ペルオキシダーゼでは０−フ
ェニレジアミンと過酸化水素などが挙げられる。
ことにより行われるが、たとえばグルコースオキシダー
ゼではグルコースであり、ペルオキシダーゼでは０−フ
ェニレジアミンと過酸化水素などが挙げられる。
本発明方法は、酵素としてグルコースオキシダーゼなど
のように、基質に作用して過酸化水素を発生させる酸化
酵素を用いることにより、さらに好適に実施することが
できる。なぜなら、過酸化水素全発生する酸化酵素の作
用により反応液中に過酸化水素を十分蓄積せしめること
かでき、その結果検出感度を向上させることが可能とな
るからである。過酸化水素全発生する酸化酵素としては
グルコースオキシダーゼ以外にコレステロールオキシダ
ーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アミン酸オキシダー
ゼなどが挙げられるが、グルコースオキシダーゼがコス
ト、安定性などの点で有利である。
のように、基質に作用して過酸化水素を発生させる酸化
酵素を用いることにより、さらに好適に実施することが
できる。なぜなら、過酸化水素全発生する酸化酵素の作
用により反応液中に過酸化水素を十分蓄積せしめること
かでき、その結果検出感度を向上させることが可能とな
るからである。過酸化水素全発生する酸化酵素としては
グルコースオキシダーゼ以外にコレステロールオキシダ
ーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アミン酸オキシダー
ゼなどが挙げられるが、グルコースオキシダーゼがコス
ト、安定性などの点で有利である。
本発明方法は、前記過酸化水素？発生する酸化酵素の活
性測定を化学発光法を用いることにより、より好適に実
施することができる。なぜなら、化学発光法による過酸
化水素の検出感度は１０Ｊモルと極めて微量の酵素量で
も検出できるため、酵素量に対応するＥＰＯの検出感度
が高くなると考えらｎるからである。
性測定を化学発光法を用いることにより、より好適に実
施することができる。なぜなら、化学発光法による過酸
化水素の検出感度は１０Ｊモルと極めて微量の酵素量で
も検出できるため、酵素量に対応するＥＰＯの検出感度
が高くなると考えらｎるからである。
化学発光法による過酸化水素の測定法としては、ルミノ
ールまたはイソルミノールと生成した過酸化水素とをペ
ルオキシダーゼ存在下に発光させる方法、ヒス（２，４
，６−）リクロロフェニル）オキザレー） （ＴＣＰＯ
）と過酸化水素とｒ反応させ生成したジオキセタンジオ
ンを螢光色素存在下で発光させる方法、過酸化水素とフ
ルオレシンとをペルオキシダーゼ存在下で反応させ、生
成した螢光物質ヲビス（２，４，６−ドリクロロフエニ
ル）オキザレートで発光させる方法等が挙げられるが、
これらは−例であって本発明方法はこれらに限定される
ものではない。これらの中では後者の過酸化水素トフル
オレシンとをペルオキシダーゼ存在下で反応させ、生成
した螢光物質ＩＴＣＰＯで発光させる方法か過酸化水素
の検出感度が最も高くて有利である。こ１１．らの反応
により生じた発光量は、市販のルミネッセンスメーター
で測定する。
ールまたはイソルミノールと生成した過酸化水素とをペ
ルオキシダーゼ存在下に発光させる方法、ヒス（２，４
，６−）リクロロフェニル）オキザレー） （ＴＣＰＯ
）と過酸化水素とｒ反応させ生成したジオキセタンジオ
ンを螢光色素存在下で発光させる方法、過酸化水素とフ
ルオレシンとをペルオキシダーゼ存在下で反応させ、生
成した螢光物質ヲビス（２，４，６−ドリクロロフエニ
ル）オキザレートで発光させる方法等が挙げられるが、
これらは−例であって本発明方法はこれらに限定される
ものではない。これらの中では後者の過酸化水素トフル
オレシンとをペルオキシダーゼ存在下で反応させ、生成
した螢光物質ＩＴＣＰＯで発光させる方法か過酸化水素
の検出感度が最も高くて有利である。こ１１．らの反応
により生じた発光量は、市販のルミネッセンスメーター
で測定する。
以上のように、本発明方法は、抗ＥＰＯ不溶性支持体に
結合させ、ＥＰＯ＝ｉ含む被検液？反応させてＥＰＯ’
ｉ不溶性支持体に結合させ、抗ＥＰＯと酵素とを結合さ
せた標識物音反応させて、不溶性支持体上に生成した抗
ＥＰＯ−ＥＰＯ−標識物なるサンドインチ状複合体中の
標識物の量音測定することよりなるＥＰＯの酵素免疫測
定法であるが、さらには標識物としてグルコースオキシ
ダーゼのような酸化酵素を用いて酵素活性を化学発光法
により検出することよりなるＥＰＯＯ高感度高感度側免
疫測定法る。
結合させ、ＥＰＯ＝ｉ含む被検液？反応させてＥＰＯ’
ｉ不溶性支持体に結合させ、抗ＥＰＯと酵素とを結合さ
せた標識物音反応させて、不溶性支持体上に生成した抗
ＥＰＯ−ＥＰＯ−標識物なるサンドインチ状複合体中の
標識物の量音測定することよりなるＥＰＯの酵素免疫測
定法であるが、さらには標識物としてグルコースオキシ
ダーゼのような酸化酵素を用いて酵素活性を化学発光法
により検出することよりなるＥＰＯＯ高感度高感度側免
疫測定法る。
ｎｇｌｍｌ ）と極めて倣量であるＥ Ｐ ＯｋＭ素免
役測定法により高感度に定量することかできる。
役測定法により高感度に定量することかできる。
（実施例）
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこγ
Ｌらの実施例により限定さｎるものでない。
Ｌらの実施例により限定さｎるものでない。
実施例１
ａ）抗ＥＰＯの調製
約２００Ｕ／ｗｉの粗ＥＰＯＩフロイントの完全アジュ
バントと共ＶＣ３羽のウサギの皮下に注射し、２週後に
再び同量全免疫し、５週後に８．００００／ ｔｖの部
分精製したＥＰＯにより追加免疫を行い、追加免ｒ後ａ
Ｍ目に抗ＥＰＯ血渭を採取した。この抗ＥＰＯ血清から
硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースにより精製し、抗ＥＰＯ
を得た。
バントと共ＶＣ３羽のウサギの皮下に注射し、２週後に
再び同量全免疫し、５週後に８．００００／ ｔｖの部
分精製したＥＰＯにより追加免疫を行い、追加免ｒ後ａ
Ｍ目に抗ＥＰＯ血渭を採取した。この抗ＥＰＯ血清から
硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースにより精製し、抗ＥＰＯ
を得た。
ｂ）抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球の調製ポリスチレン球
（直径６．４鵡）１００個にＱ、１ＩＶＩＮａＨＣＯａ
に溶解した抗ＥＰＯｉ２０ｍ添加し、４℃ＶＣ１６時間
放置後、生食水で洗浄して抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球
を得た。
（直径６．４鵡）１００個にＱ、１ＩＶＩＮａＨＣＯａ
に溶解した抗ＥＰＯｉ２０ｍ添加し、４℃ＶＣ１６時間
放置後、生食水で洗浄して抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球
を得た。
Ｃ）グルコースオキシダーゼ標識抗ＥＰＯの調規抗Ｅ
Ｐ Ｏ２０１Ｎにペプシン１ｑを加えて３７℃で一夜分
解後、セファデックスＧ−１５０にてゲル濾過し、抗Ｅ
ＰＯのＦ（ａｂ’）２フラグメントを得た。このＦ（ａ
ｂ’ ）２ Ｋ Ｏ，ＩＭ ２−メルカプトエチルアミ
ン０，２ｇ／ ｆ加え３７℃、９０分反応させ、セファ
デックスＧ−２５にてゲル濾過し、抗ＥＰＯのＦａｂ’
フラグメント６．７ηを得た。次にグルコースオキシダ
ーゼ（東洋紡製）５岬にＮ−ハイドロキシサクシイミジ
ル−Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレ
イミド１ｗ１（ジオキサンに溶解）を３〜４回に分けて
添加し、セファデックスＧ−２５によりゲル濾過を行っ
て、マレイミド化グルコースオキシダーゼを得た。この
ようにして得られたマレイミド化グルコースオキシダー
ゼと前肥抗ＥＰＯのＦａ ｂ’フラグメント５岬と紮４
℃、−夜反応させ、セファデックスＧ−２００にてゲル
１過し、活性画分を集めて、グルコースオキシダーゼ標
ｌｊ Ｅ Ｐ Ｏを得た。
Ｐ Ｏ２０１Ｎにペプシン１ｑを加えて３７℃で一夜分
解後、セファデックスＧ−１５０にてゲル濾過し、抗Ｅ
ＰＯのＦ（ａｂ’）２フラグメントを得た。このＦ（ａ
ｂ’ ）２ Ｋ Ｏ，ＩＭ ２−メルカプトエチルアミ
ン０，２ｇ／ ｆ加え３７℃、９０分反応させ、セファ
デックスＧ−２５にてゲル濾過し、抗ＥＰＯのＦａｂ’
フラグメント６．７ηを得た。次にグルコースオキシダ
ーゼ（東洋紡製）５岬にＮ−ハイドロキシサクシイミジ
ル−Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレ
イミド１ｗ１（ジオキサンに溶解）を３〜４回に分けて
添加し、セファデックスＧ−２５によりゲル濾過を行っ
て、マレイミド化グルコースオキシダーゼを得た。この
ようにして得られたマレイミド化グルコースオキシダー
ゼと前肥抗ＥＰＯのＦａ ｂ’フラグメント５岬と紮４
℃、−夜反応させ、セファデックスＧ−２００にてゲル
１過し、活性画分を集めて、グルコースオキシダーゼ標
ｌｊ Ｅ Ｐ Ｏを得た。
ｄ）発光試薬の調製
試薬Ａ・・・５■のフルオレシンに２５ｍＭリン酸緩衝
液２００−に溶解した。
液２００−に溶解した。
試薬Ｂ −１００ｍＭ過酸化水素６００＃Ｊ、５ｍ１Ｖ
ＩＴＣＰＯ液３１１１アセトニトリル２６ｇ１ｆ混合し
て調製した。本試薬は測定時アセトニ） ＩＪルで５倍
に希釈して用いた。試薬Ａ１試薬Ｂけ共に測定直前に調
製した。
ＩＴＣＰＯ液３１１１アセトニトリル２６ｇ１ｆ混合し
て調製した。本試薬は測定時アセトニ） ＩＪルで５倍
に希釈して用いた。試薬Ａ１試薬Ｂけ共に測定直前に調
製した。
ｅ）ＥＰＯの測定
ポリスチレンチューブ（１２Ｘ７５Ｍ ）にｂ）で調製
した抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球１ヶ、ＥＰＯｉ含む試
料５０μ！、０．０１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液２００μｌ
を添加して３７℃で１時間反応させ、生食水で洗浄した
。
した抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球１ヶ、ＥＰＯｉ含む試
料５０μ！、０．０１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液２００μｌ
を添加して３７℃で１時間反応させ、生食水で洗浄した
。
次にＣ）で得たグルコースオキシダーゼ標識抗ＥＰＯを
０．５チ牛血清アルブミン加リン酸緩衝液で５００倍に
希釈して２５ＯＮ添加し、３７℃で１時間反応させ、生
食水で洗浄した。次に０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２
チグルコース溶液ヲ２５０μ！添加して３７℃で１時間
反応させた。
０．５チ牛血清アルブミン加リン酸緩衝液で５００倍に
希釈して２５ＯＮ添加し、３７℃で１時間反応させ、生
食水で洗浄した。次に０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２
チグルコース溶液ヲ２５０μ！添加して３７℃で１時間
反応させた。
次に、この反応液１００μ−を別の試験管に採り７．５
単位／１１のペルオキシダーゼ溶液ｔ １００μ１１ｄ
）で得た試薬Ａ全２００μｄ添加して２５℃で１時間反
応させた。次に、この反応液３００μｌｋルミフオトメ
ーターＴ Ｄ ４０００（ラボサイエンス社製）の測定
用バイアルに採り、ｄ）で得た試薬Ｂ ｒ ５００μ！
注入し、発光量を測定した。別にＥＰＯａ原醍知の標準
液を用いて前記と同様に操作して標準曲線を作成し、そ
の標準曲線より試料中のＥＰＯ５度を求めた。
単位／１１のペルオキシダーゼ溶液ｔ １００μ１１ｄ
）で得た試薬Ａ全２００μｄ添加して２５℃で１時間反
応させた。次に、この反応液３００μｌｋルミフオトメ
ーターＴ Ｄ ４０００（ラボサイエンス社製）の測定
用バイアルに採り、ｄ）で得た試薬Ｂ ｒ ５００μ！
注入し、発光量を測定した。別にＥＰＯａ原醍知の標準
液を用いて前記と同様に操作して標準曲線を作成し、そ
の標準曲線より試料中のＥＰＯ５度を求めた。
第１図にその標準曲線を示す。第１図から求められるＥ
ＰＯの検出感度は１−５ｍＵ／ ｍｌであった。
ＰＯの検出感度は１−５ｍＵ／ ｍｌであった。
実施例２
抗Ｅ）’０結合ポリスチレン球、グルコースオキシダー
ゼ標識抗ＥＰＯの調製は実施例Ｉと同様にして行った。
ゼ標識抗ＥＰＯの調製は実施例Ｉと同様にして行った。
ポリスチレンチューブ（１２Ｘ７５ｆｉ ）に実施例１
゜ｂ）で調製した抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球１ヶ、Ｅ
ＰＯを含む試料５０μ１１帆旧Ｍ ＩＪン酸緩衝液２０
０μｌを添加して３７℃で１時間反応させ、生食水で洗
浄した。次に実施例１．Ｃ）で得たグルコースオキシダ
ーゼ標識抗Ｅ Ｐ Ｏｉ ０．５ ％牛血清アルブミン
加リン酸緩衝液で５００倍に希釈して２５０μＩ添加狐
８７℃で１ｔＥ４間反応させ、生食水で洗浄した。次に
０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２％グルコース溶液ヲ２
５０μｅ添加して３７℃で１時間反応させた。
゜ｂ）で調製した抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球１ヶ、Ｅ
ＰＯを含む試料５０μ１１帆旧Ｍ ＩＪン酸緩衝液２０
０μｌを添加して３７℃で１時間反応させ、生食水で洗
浄した。次に実施例１．Ｃ）で得たグルコースオキシダ
ーゼ標識抗Ｅ Ｐ Ｏｉ ０．５ ％牛血清アルブミン
加リン酸緩衝液で５００倍に希釈して２５０μＩ添加狐
８７℃で１ｔＥ４間反応させ、生食水で洗浄した。次に
０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２％グルコース溶液ヲ２
５０μｅ添加して３７℃で１時間反応させた。
次に、この反応液１００μｌｒ別の試験管に採り、０．
０２％８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸溶液１
００１１．５ｍＭＴＣＰ０−酢酸エチル溶液２（ｌｏｐ
ｄを添加しすばやく混合した。生成する発光量をルミフ
ォトメーターＴＤ４０００ （ラボサイエンス社製）で
測定した。この方法により、１０ｍＵ／璽ｌのＥＰＯの
検出が可能であった。
０２％８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸溶液１
００１１．５ｍＭＴＣＰ０−酢酸エチル溶液２（ｌｏｐ
ｄを添加しすばやく混合した。生成する発光量をルミフ
ォトメーターＴＤ４０００ （ラボサイエンス社製）で
測定した。この方法により、１０ｍＵ／璽ｌのＥＰＯの
検出が可能であった。
実施例３
ａ）抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球の調ｖは実施例１．と
同様にして行った。
同様にして行った。
ｂ）ペルオキシダーゼ標識抗Ｅｐｏの９Ｌ製ペルオキシ
ダーゼ（東洋紡製）６ｍ９１／ｎＮ−／−イドロキシサ
クンイミジルーＮ−（４−カルボキンシクロヘキシルメ
チル）マレイミド４．８１ｑ（Ｎ、ＩＶ−ジメチルホル
ムアミドに溶解）を添加し、３０℃４０分間反応させた
。この反応液をセファデックスＧ−２５によりゲル濾過
し、マレイミド化ペルオキシダーゼを得た。このように
して得られたマレイミド化ペルオキシダーゼと実、流側
１． Ｃ）で得られた抗ＥＰＯのＦａｂ’フラグメント
５．２岬と全４℃にて一夜反応させ、ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４にてゲル濾過し、活性画分金集めて、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ＥＰＯを得た。
ダーゼ（東洋紡製）６ｍ９１／ｎＮ−／−イドロキシサ
クンイミジルーＮ−（４−カルボキンシクロヘキシルメ
チル）マレイミド４．８１ｑ（Ｎ、ＩＶ−ジメチルホル
ムアミドに溶解）を添加し、３０℃４０分間反応させた
。この反応液をセファデックスＧ−２５によりゲル濾過
し、マレイミド化ペルオキシダーゼを得た。このように
して得られたマレイミド化ペルオキシダーゼと実、流側
１． Ｃ）で得られた抗ＥＰＯのＦａｂ’フラグメント
５．２岬と全４℃にて一夜反応させ、ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４にてゲル濾過し、活性画分金集めて、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ＥＰＯを得た。
ｃ）ＥＰＯの測定
ポリスチレンチューブ（１２Ｘ７５ｓｍ ）に実施例！
。
。
ｂ）で調製した抗ＥＰＯ結合ポリスチレン球１ヶ、ＥＰ
Ｏを含む試料５０μｇ、 ０．０１Ｍリン酸緩衝液２０
０μＩｆ添加して３７℃で１４５間反応させ、生食水で
洗浄した。次に前記ペルオキシダーゼ標識Ｅ Ｐ Ｏｉ
０．５ ％牛血清アルブミン加リン酸緩衝液で１００
０倍に希釈して２５０μ！添加し、３７℃で１時間反応
させ生食水で洗浄した。次に０−フェニレンジアミン３
■／ ｇ／ 、 Ｈ２Ｏ。０．０２％に含むクエン酸緩
衝液を５００４７１添加し、室温、暗所で１時間反応さ
せた。
Ｏを含む試料５０μｇ、 ０．０１Ｍリン酸緩衝液２０
０μＩｆ添加して３７℃で１４５間反応させ、生食水で
洗浄した。次に前記ペルオキシダーゼ標識Ｅ Ｐ Ｏｉ
０．５ ％牛血清アルブミン加リン酸緩衝液で１００
０倍に希釈して２５０μ！添加し、３７℃で１時間反応
させ生食水で洗浄した。次に０−フェニレンジアミン３
■／ ｇ／ 、 Ｈ２Ｏ。０．０２％に含むクエン酸緩
衝液を５００４７１添加し、室温、暗所で１時間反応さ
せた。
この反応液の４９２ｎｍに２ける吸光度を測定した。
この方法により２５ｍＱ ／ ｗｌのＥＰＯの検出か可
能であった。
能であった。
第１図は、グルコースオ、キシダーゼ標識抗ＥＰＯを用
いた化学発光法によるＥＰＯの標準曲線を示す。
いた化学発光法によるＥＰＯの標準曲線を示す。
Claims (2)
- （１）エリスロポイエチンと特異的に反応する抗体を不
溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持体、エリス
ロポイエチンを含む被検液およびエリスロポイエチンと
特異的に反応する抗体を酵素で標識した標識物を反応せ
しめて、該抗体結合不溶性支持体上に抗体−エリスロポ
イエチン−標識物複合体を形成させた後、該抗体結合不
溶性支持体上に結合した標識物の量を測定するか、もし
くは遊離の結合していない標識物の量を測定することに
より、間接的にエリスロポイエチンを測定することを特
徴とするエリスロポイエチンの酵素免疫測定法。 - （２）エリスロポイエチンと特異的に反応する抗体を不
溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持体、よびエ
リスロポイエチンを含む被検液を反応させて、エリスロ
ポイエチンを該抗体結合不溶性支持体に結合させた後、
前記エリスロポイエチンと特異的に反応する抗体を酵素
で標識した標識物を反応させることを特徴とする特許請
求範囲第１項記載のエリスロポイエチンの酵素免疫測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3968785A JPS61198062A (ja) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | エリスロポイエチンの酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3968785A JPS61198062A (ja) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | エリスロポイエチンの酵素免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61198062A true JPS61198062A (ja) | 1986-09-02 |
Family
ID=12559973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3968785A Pending JPS61198062A (ja) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | エリスロポイエチンの酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61198062A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01312463A (ja) * | 1988-06-10 | 1989-12-18 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| US7560238B2 (en) | 2000-05-30 | 2009-07-14 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Immunological latex turbidimetry method and reagent therefor |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS566161A (en) * | 1979-06-28 | 1981-01-22 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Erythropoietin sensitized latex |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS5779455A (en) * | 1980-09-12 | 1982-05-18 | Ra Jiyora Kiyansaa Research Fu | Measurement of antigen in liquid state |
| JPS59133462A (ja) * | 1983-01-21 | 1984-07-31 | Rikagaku Kenkyusho | エリスロポイエチンの定量法 |
-
1985
- 1985-02-28 JP JP3968785A patent/JPS61198062A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS566161A (en) * | 1979-06-28 | 1981-01-22 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Erythropoietin sensitized latex |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS5779455A (en) * | 1980-09-12 | 1982-05-18 | Ra Jiyora Kiyansaa Research Fu | Measurement of antigen in liquid state |
| JPS59133462A (ja) * | 1983-01-21 | 1984-07-31 | Rikagaku Kenkyusho | エリスロポイエチンの定量法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01312463A (ja) * | 1988-06-10 | 1989-12-18 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| US7560238B2 (en) | 2000-05-30 | 2009-07-14 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Immunological latex turbidimetry method and reagent therefor |
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