JPH01312463A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は不均一系免疫学的測定法に関し、更に詳しくは
、不拘−系免疫反応後固相と液相を分離することなく容
易に試料溶液中の抗原又は抗体を測定する方法に関する
。

〔従来の技術およびその課題〕

血清や尿などの種々の試料中の成分を抗原−抗体反応の
特異性を利用し、免疫学的に分析する方法としては、抗
原−抗体複合体を直接、沈降物の量、濁度の変化などで
測定する一次元免疫拡散法、比濁法、比ろう法などの方
法とラジオアイソトープ、酵素、色素などの標識物質を
用いてその活性や濃度を測定することにより、抗原−抗
体複合体の量を測定ゴる放射免疫測定法（ＲＩＡ　）、
酵素免疫６（１］定法（ＥＩＡ　）、ケイ光免疫測定法
（ＦＩＡ　）などの方法がある。前者の方法に比べ後者
の方法は、感度、定量性などの面で優れていることから
、分析化学、特に臨床化学分析の分野においては、重要
な方法となつ−Ｃきでいる。これら標識物質を用いた免
疫学的測定法の中でも、ＲＩＡＶこついては、アイソト
ープの取り扱いや廃妻物などの間頭があることから、酵
素や色素など全標識物質として用いた免疫学的測定法し
こついての自動化が強く要望されている。

しかしながら、標識物質を用いた免疫学的測定法の自動
化、特に、感度、定量性に優れている不均一系の測定法
では、固相一液相分離（Ｂ／Ｆ分離）のためＶＣ洗浄操
作、遠心分離操作などが必要であり、この点が自動化を
困難にしている。従って、標識物質を用いた不均一系免
疫学的測定法については、これまで、専用機器による自
動化対応が行われてきているが、このためには、新たに
専用機器の設備化が必要であり、又、その使用効率も悪
いという問題が出てきている。

ところで、臨床化学分析の分野においでは、近年、一般
に生化学自動分析装置と呼ばれる自動分析装置が、急速
に普及し、生化学的分析法の自動化が進んできており、
この分野においては、汎用機器としで使用されている。

従って、免疫学的測定法においても専用機器を必要とせ
ず、すでに設備化され汎用されている生化学自動分析装
置を・用いて自動代金可能とするこきが熱望されている
１゜ そこで本発明者ら（・ま、−船足市販されている？リス
チレンボールやガラスボールなどの固相を用いた不均一
系免疫学的測定法の試薬を用いて液相部分を試料として
汎用機器で測定したところ、定量性、精度等が悪くその
ままでは使用不可能であった。

〔課題全解決するための手段〕

かかる現状において本発明者らは上記課題を解決すべく
検討してきたところ、固相一液相不均一系免疫学的測定
法においては通常免疫反応後、固相上の標識抗原又は標
識抗体を測定するものであるが、意外にも反応終了後固
相と液相全分離することなく液相中の標識抗原又は標識
流体全用１１定することにより前述のＶｊ的が達成さｆ
［ることを見い出し、本発明全完成した１゜ すなわち、本発明は試料溶液中の抗原又は抗体と、固相
に固定化Ｌ５た抗体又は抗原とを、これらの標識抗原又
は標識抗体の存在下に不均一系で反応させて試料溶液中
の抗原又は抗体を測定する不均一系免疫学的測定法ＶＣ
おいて、該反応終了後液相中の標識抗原又は標識抗体（
以下、単Ｋ「標識体」という）全測定することを特徴と
する試料溶液中の抗原又は抗体の測定法を提供するもの
である。

本発明方法に使用される固相としては、自体公知の物質
をそのまま使用でき、例えば？リスチレンなどのプラス
チックビーズ、ラテツクス粒子、アガロースデル、デキ
ストランゲル、？リアクリルアミドグル、セルロース粒
子、イオン交換樹脂、シリコン、ガラス、マイクロカプ
セル、金属コロイドなどがあげられ、さらに反応容器で
あるガラスやプラスチックのチューブやカップを固相と
して使用しても良い。父、固相上に抗原又は抗体を保持
する方法としても公知の物理的吸着あるいは化学的共有
結合のいずれを用いても良い。

本発明において使用しうる標識物質としては、本法が通
常の不均一系免疫学的測定法であることから、これらに
使用できる標識物質はすべて使用しつる。本法を旧人法
に適用することは、当然可能ではあるが、ラノオアイソ
トープの取り扱いや廃棄物の処理などの問題があること
から標識物質としては、より好、捷しくけ、非放射性の
物質がより好ましい。

適当な標識物質としては、酵素、発色性色素、Φレート
剤、全ケイ光色素、発光性物質などが挙げられるが、例
えば、酵素としては、ペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、カタラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが好
ましい。

本発明において用いることができる不均一系免疫学的測
定法としては、競合法の２抗体固相法、１抗体固相法、
サンドイツチ法等があげられる。

本発明の実施にあたっては、使用する標識体の量は、測
定対象抗原又は抗体のモル数、及びその測定範囲により
決定され、一般には測定対象抗原又は抗体のモル数が多
い場合には、標識体の量も多くシ、測定対象抗原又は抗
体のモル数が少ない場合には、標識体の量を少なくする
ことにより、より定量性を高くすることが可能となる。

測定対象抗原又は抗体の量に対し、標識体を大過剰に用
いた場合には測定感度、精度が低下し、また少ない場合
には測定範囲が狭くなる。従って、例えば測定対象抗原
又は抗体と標識体が当量関係をもって反応する場合、標
識体のｆｉ′は測定対象抗原又は抗体に対しモル比で１
〜１．　ＯＯＯ倍程度で用いることが望ましい。

免疫反応終了後、液相中の標識体を測定するには、反応
混合物から固相を分離することなくそのまま、一般に使
用されている自動分析装置にかければよい。

本発明により測定できる抗原又は抗体は、通常不均一系
免疫学的測定系により測定されている公知物質、例えば
、「酵素免疫測定法」（石川ら編、医学書院、１９８７
年）記載の物質があげられるが、不均一系免疫学的測定
系が可能であればこれに限定されるものではない。

代表的な抗原の例を示せばβ２−ミクログロブリン（β
２ＩｌｔＩ）、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原（
（ＩＡ　）、フェリチン、ＩｇＥ、　　インシュリンな
どがあげられる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ β２−ミクログロブリン（β２ｍ　）の測定：（１）抗
ヒトβ２ｍ抗体結合、ｔｆリスチ［／ンビーズ腹水より
、硫安分画法及びＤＥＡｇセファセル（ファルマシア社
）を用いたイオン交換法により精製した抗ヒトβ２１’
ｌ＋−モ、ツクローナル抗体（抗ヒトβ２ｍ　−ＭｅＡ
ｂ　）　ｆ　０．０５　Ｍ塩化ナトリウムを含有するα
０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）に０．０２ｍｇ／ｍノ
どなるように溶解した抗体溶液５０ｍ１によく洗浄した
ぼリスチレンビーズ（φ０．２〜（１，３ｍｍ　）　２
０りを浸した。２〜１０°Ｃで一夜放置後、抗体溶液を
除去し、０．１％ラウン清アルブミン及び０．１５　Ｍ
塩化ナトリウムを含有する０、　０２５　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７２）（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳ　）に浸して２
〜４゛Ｃで一夜以上放置した。その後、ＰＢＳでよく洗
浄し、同緩衝液に浸して抗ヒトβ２ｍ抗体結合・軟すス
チレンビー・ズとした。

（１）酵素標識抗ヒトβｚｍ抗体 （りと同様Ｇ′こてｔざ製した認識する抗原決定基の異
なる精製抗ヒトβ２ｒｆｌ　　ＭｅＡｂ　５　ｍｇをα
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）　１ｙｄに溶解し、〔Ｌ
２５■のべｆ／ンを加えて３７℃で一夜静置加温した。

２Ｍ）リス塩酸緩衝Ｈ（ｐＨ８−０）　０．１ｄを加え
て反応を停止させた後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有
する０、　１　ｈｉミリン緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡
化した、ウロトロデルＡｃＡ（ＬＴＢ社）カラム（φ２
．　ＯＸ　６０　ｃｍ　）でデル濾過を行い、Ｆ（ａｈ
　）２２．５〜を得た。以下、石川らのマレイミド法（
５ｃａｕｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

８．５ｕｐｐ１．７：４３．１９７８　　）ンこ従いβ
−ガラクトシダーゼ標識抗β２ｍ　−ＭｅＡｂ　（Ｆ’
ａｂ　　）を得意。

膏　測定 ■　酵素標識抗体液 （１）で得たβ−がラクトシダーゼ標識抗ヒトβ２　ｒ
Ｉｌ−Ｍ　ｅ　Ａ　ｂ金、０．５％ＢＳ人−ＰＢＳを用
いて２８０　ｎｍにおける吸光度が、０．００２５０Ｄ
（ＢＳＡが入っていない酵素標識抗体のみの吸光度）と
なるように希釈した。

０　標準液 精製ヒトβ２ｍを、馬血清により５００　ｎｒ／ａｌ、
　　２５０　ｎｆ　／ｐｄ、　　１００　ｎｙ／ａｔ、
５０ｎｙ　／ＩＩｌ、　　２５　ｎｆ　／ｌｔ、　　１
２．５　ｎｔ　／ｍｌになるように希釈した。

Ｏ免疫反応試薬−反応溶液 自動分析装置用サンｆルカツデに抗ヒトβ２ｎｌ抗体結
合？リスチレンビーズ及び酵素標識抗体０．３　ｄ　′
ｆｔ加えて作成した。

０　測定装置 日立７０５０型を使用した。

（ト）　測定操作 ｅ）に標準品又は、検体を５０μを添加しよく攪拌した
。この免疫反応混液全室温しこて、１時間放置後、反応
容器全自動分析装置の検体専用ランクに並べた。自動分
析装置に基質として、１０　ｎ１Ｍ・０−ニトロフェニ
ルβ・−Ｄガラクトピラノシドを含む０．１　Ｍ　−Ｐ
ＢＳ　（ｐＨ７、０）を設置し、免疫反応混液を検体と
し、検体量２０μを基質量３５０μｔとを反応させ、４
１５　ｎｍにおける吸光度変化を測定した。

標準品の測定値から検体のβ２ｍ濃度を読み取った。得
られた検量線を第１図に示す。

実施例２ α−フェトプロティン（ＡＦＰ　）の測定：（＋）　　
抗ヒトＡＦＰ抗体結合？リスチレンラテックス １．０μＩｎ（積水化学社）の１％ラテックス懸濁液（
０，０５Ｍグリシン緩衝液、　ｐＨ８，５）　５１１１
と０．５　ｍ９　／　ｗｌ抗ＡＦＰＭｃ　Ａ　ｂ　Ｉ　
ｇＧ画分５ｄとを混合したのち、室温で２時間静置した
。０．５％ＢＳＡを含む同緩衝液５ＩＥ／を加え、２〜
１０°Ｃ−夜装置したのち、遠心法により未感作のＩｇ
Ｇの洗浄、除去を行ったのち、α１５Ｍの塩化ナトリウ
ムを含むｏ、　０２５　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７２
）に再懸濁し４°Ｃ以下で、保存したっ （Ｉ）　　酵素標識抗体 酵素トしてペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）を用い、中
機ら（Ｊ、ＨＩｓｔｏｃｈｅｍ　ｃｙｌｏａｈａｍ、。

２２巻、１０８４頁、１９７４年）の方法にて以下のよ
うにして、製造した。

ペルオキシダーゼ（東洋紡＞４１１９を１−の水に溶解
し、Ｑ、　Ｉ　Ｍ−ＮａＩＯ４α２ｄを加え、室温で２
０分反応する。反応終了後１　ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液に浸透し、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液にてｐＨを
９〜９．５に調整した後、５嘘の抗ヒトＡＦＰＭｅＡｂ
　−Ｆａｂ−を添加し、室温で２時間反応した。

４　＃Ｉｌ？　／　ｗｌのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４αＩＮＪ！
を加え、４℃２時間放置後、ウロトロデルＡｅＡ　４４
　（ＬＫＢ　）を用いてゲル濾過を行い、２８０ｎｎｏ
及び４０５ｎｍの吸光度より酵素標識抗体のピークを集
め濃縮保存した。

（ＩＩ）　　測定 ■　酵素標識抗体液 （璽）で得たペルオキシダーゼ標識抗ヒトＡＦＰＭｃＡ
ｂを、０．１％ＢＳＡ　−ＰＢＳを用いて２８０　ｎｍ
における吸光度が、０．０００１２５０Ｄ（ＢＳＡが入
っていない酵素標識抗体のみの吸光度）となるように希
釈した。

（→　標準液 精製ヒトＡＦＰをヤギ血清により８００μｆ／ｗｔｌ、
　　４００　ｎｇ／ｍｌ、　　２００　ｒｇ／ｗｌ、　
１００μｇ／ｄ、５０μｇ／Ｒ１，２５ｎｇ　／ＷＬ！
、　１２．５　ｎｇ／ｄになるように希釈した。

θ　免疫反応試薬−反応溶液 自動分析装置用サンデルカツゾに抗ヒトＡＦＰ抗体結合
？リスチレンラテックス及び酵素標識抗体０．５　ｄを
加えて作成した。

Ｏ測定装置 日立７０５０型を使用した。

■　測定操作 θに標準品又は、検体を５０μを添加し、よく攪拌した
。この免疫反応混液を室温にて１時間放置後、反応容器
を自動分析装置の検体専用ラックに並べた。自動分析装
置に基質として、１０αＩＭ・０−フェニレンシアミン
及びα０１％過酸化水素を含む０．１　Ｍ　ＩＪン酸−
り　゛エン酸緩衝液（ｐＨ５，０）を設置し、免疫反応
混液を検体とし、検体量２０μｌ基質３５０μｔＶこて
反応し、４５０ｎｍにおける吸光度変化を測定し実施例
１と同様、標準品の測定値から検体のＡＦＰ濃度を読み
取った。得られた検量線を第２図に示す。

〔作用及び発明の効果〕

本発明によれば、これ″まで洗浄や遠心分離操作が必要
であり、自動化が困難であった不均一系免疫学的測定法
が特別な専用機器を用いることなく免疫反応後の反応液
を生化学自動分析装置に検体（試料）として用いること
により、簡単に自動化が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるβ２ｍの検量線を、第２図は
実施例２におけるＡＦＰの検量線を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料溶液中の抗原又は抗体と、固相に固定化した抗
   体又は抗原とを、これらの標識抗原又は標識抗体の存在
   下に不均一系で反応させて試料溶液中の抗原又は抗体を
   測定する不均一系免疫学的測定法において、該反応終了
   後液相中の標識抗原又は標識抗体を測定することを特徴
   とする試料溶液中の抗原又は抗体の測定法。 ２、標識抗原又は識標抗体の添加量が、試料溶液中の抗
   原又は抗体に対しモル比で１〜１，０００倍である請求
   項１記載の測定法。