JPS6242059A - ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、ヒト上皮ｍ胞成長因子の測定法に関する。さ
らに詳細には、本発明は、精製されたｈ−ＥＧＦとこれ
を抗原として調製された抗ｈ−［Ｇト抗血清どを用い、
抗原抗体反応を利用する標識免疫測定法（以下「免疫測
定法」を［イムノアッセイ法」ということもある。）に
よるｈ−ＥＧＦの測定法に関するものである。

先行技術 ヒト上皮細胞成長因子（ｈｕｍａｎ　Ｅ　ｐｉｄｅｒｍ
ａｌＱｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　、以下ｈ−ＥＧＦと
いうことがある）は、１９７５年コーエコーＳ、Ｃｏｈ
ｃ口）らにより人尿中から単離された上皮組織の増殖角
化を促進するヒト由来の因子として紹介〔文献１〕され
たｂのであって、同年、グレゴリ−（１」。

Ｑ　ｒｅｇｏｒｙ）らによって人尿中から単離された青
酸分泌抑制作用をもつヒトウロガストロン（ｈｕｍａｎ
Ｕｒｏｇａｓｔｒｏｎｅ）として紹介〔文献２〕された
ポリペプチドと同一物質であり、分子ｒＩｉ約６０００
１５３コのアミノ酸より構成され、その分子中に３本の
ジスルフィド結合を右づるポリペプチド〔代謝、１７．
５１　（１９８０））であるということがわかっている
。

現在、ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆの生体内での特異的な生理的作
用は知られていないが、このＥＧＩ−に対するリセブタ
ーの構造が解明され〔文献３〕で以来、その生化学的研
究が進められている。従って、これら研究のために生体
内のｈ　−ＥＧＦ測定法を確立することは必須の要件で
ある。

ところで、今までのｈ　−ＥＧＦの測定−法としては、
３　Ｔ　３１１１胞の増殖能を利用したバイオアツヒイ
法〔文献４〕やＫＢｉｌｌ胞を用いたラジオリセブター
アッ廿イ法〔文献５〕等が行なわれてさ′だ。

しかしながら、これらの方法はいずれも検体処理能力に
限界があり、また、生物活性を指標としているのでｈ　
−［ＥＧＦの定ｍの信頼性に問題を右していた。

そこで、このような問題に対処すべく、ｈ　、−ＥＧＦ
をある物質（放射性同位元素、酵素等）で標識しておき
、この標識物とＦｌ　−Ｅ　Ｇ　Ｆに対する抗血清とを
組合せて、ｈ−ＥＧＩ−の邑を定量的に測定プるという
方法（イムノアッセイ法）が提案されている（例えば放
射性同位元素で標識したｈ−［ＥＧＦと、ｈ　−ｒＥ　
Ｇ　Ｆに対する抗血清とを組合せたラジオイムノアッセ
イ法（Ｒ［△法）は（文献６〕に紹介されている）。し
かしながら、このイムノアッセイ法に用いられている抗
ｈ−ＥＧＦ抗面清は、いずれも尿中より１Ｊ１ｉｌｌｌ
！された精製不十分なｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆを抗原として調
製されたものであるため、その時宜性には疑問があり、
従ってそのような抗血清を使用した測定法は定量信頼性
に問題性を有していると占わざるを１畔ない。また、イ
ムノアッセイ法の系においては、測定値を標準曲線と対
比して、標準に用いたホルモンの醋をもって測定値を表
現するのが、ふつうであるので、標準品としては高純度
に精製されたものが用いられるのが望ましいが、今まで
に高純度（特に、９９％程度以上）のｈ　−ＥＧＦが得
られたという報告もない。

１工立ｊＬｌ 要旨 本発明は上記問題点に解決づ゛ることを目的とし、ｌ！
１純度に精製されたｈ　−ＥＧｒ’標品およびこれを抗
原として精製された抗ｈ　−ＥＧＦ抗血清を用いるイム
ノアッセイ法を提供することにより上記目的を達成する
ムのである。

従って、本発明によるヒト上皮細胞成長因子の測定法は
、抗原抗体反応を利用した標識免疫測定法によってヒト
上皮細胞成長因子を測定する方法において精製されたヒ
ト上皮細胞成長因子およびこれを抗原として調整された
抗血清をそれぞれ抗原および抗体として使用することを
特徴とりるものである。

効　　果 このように本発明によるｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆの測定法は、
［記したような標識免疫測定法の範喘に入るものである
。従って、本発明のｔｌ−Ｅ　Ｇ　Ｆの測定法は、上記
問題点を解決覆るとともにＦ記のにつな利点を有するも
のである。

イ、　高感度の定量を行うことができる。

本発明は抗原抗体反応を利用げる免疫化学的測定法であ
る。従って被検液中に他の化合物〈例えばペプチドやホ
ルモン）が共存していても、本発明の方法によればｈ　
−ＥＧＦのみを定量することができる。そして、低濃度
の抗原と抗体間であっても抗原抗体反応が進行７′るの
で、高感度の定量が可能であることはいうまでしない。

口、　定量の信頼性が高い。

従来のｈ−［ＧＦの測定法は、尿中よりｊμ離された精
製不十分なｈ　−ＥＧＦおよびこれを抗原として調製さ
れた抗ｈ−ＥＧＦ抗血清をそれぞれ抗原および抗体とし
て用いているので、その定Ｍ　（ｌｌ’１に問題点があ
った。一方、本発明のｈ−ＥＧＦの測定法は、高純度（
特に実施例では９９％程度以上）に精製されたｈ−ＥＧ
Ｆ標品およびこれを抗原として調製された特異性の９い
抗ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ抗血清を用いているので、再現性も
良好であり、かつ測定値の変動係数し低いところから定
量の信頼性す、１いといえよう。

ハ、　抗体処理能力に優れている。

本発明は免疫化学的方法なので、他の測定方法のように
、測定するものを予めある程度分離する必要がなく、比
較的簡便な操作で目的を達成７ることかできる。従って
、自動化することも可能であり、一般に抗体処理能力ら
優れているといえよう。

発明の詳細な説明 本発明は、１力記のように抗原抗体反応を利用した免疫
化学的方法によるｈ　−ＥＧＦの測定法である。そして
、特に、標識免疫測定法であると言うことができる。

このような免疫測定法は、標識に用いる６のによって、
ＥＩＡ（［ｉｉ動物質酵素）、ＲＩＡ（標識物質は放射
性同位元素（ラジオアイソトープ）等と呼ばれている。

このような標識免疫測定法には、抗原を放射性同位元素
や酵素等のマーカーで標識したちのを用いる間接法と、
抗体を上記物質等で４！２識する直接法とがあるが、抗
血清を用いる場合は間接法で行うのが好ましい。なお、
抗血清より所望抗体を取得する手間を猷わなければ直接
法によって行って６よい。

イムノアッセイ法によってホルモン等の生体内微量成分
を測定する場合は、施行法の簡便さ、感度、精度の優秀
さ、低コストなどの押出からコンベテイテイブ７ツセイ
払〔成占「生化学実験講座−ホルモン−Ｊ、Ｐ１５７（
１９７７）、東京化学同人刊）を行うのがふつうである
。

その検出原理を述べれば下記の通りである。まず、一定
量の被標識ｈ−ＥＧＦ　（ｈ　−ＥＧＦ”　）、被検液
および一定量の抗血清（Ａｂ　）を混合して、同一系内
でインキュベ−１〜Ｊる。すると、被検液中にｈ　−Ｅ
ＧＦが存在すれば、抗原抗体反応によってｔｌ−Ｅ　Ｇ
　「とＡｂとの結合体（ｈ−ＥＧＩ”−Ａｂ＞およびｈ
−ＥＧＦ＊とＡｂとの結合体（ｈ−ＥＧＦ”　−Ａｂ）
が現出し、この系内には上記結合体およびｈ　−［ＥＧ
Ｆ、ｈ　−ＥＧＦ”および未反応Ａｂが存在することに
なる（ここでＡｂと結合しでいるｈ　−Ｅ　Ｇ　ｆ”’
をｒＢＪ結合していていないｈ−ＥＧＦをｒＦＪとする
）。

ついでこの系内の８と「とを何らかの方法（後記）で分
離したのら、Ｂあるいは［の吊を放射活性または酵素活
性（Ｂ”または「２）等で測定Ｊる。以上の結果から、
Ｂ”、Ｂ’／Ｆ　　、Ｂ”／（Ｂ”＋Ｆ”）、Ｂ”／Ｂ
ｏ”　　　ｏ＊は］）−（Ｂ Ｅ　Ｇ　ｒ：が存在しないときの結合型の測定値を示す
）、［３ｏ”　／Ｂ”などの値を指標としておｔ）ば、
これらの値は、標準品としてはまたは被検液中に存在づ
るものとしてｈ−［ＥＧ「の最の関数となるわけである
から、あらかじめ既知ωのｈ−ＥＧＦを反応系に加える
ことにより標準曲線を作成しておけば、測定値を標準値
をｅｉ準曲線と照らし合せることによって被検液中のｈ
　−ＥＧＦ〜を知ることができる。

ｒｌ−Ｅ　Ｇ　Ｆおよび抗ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ抗血清本発
明において使用し得るｈ　−１：　Ｇ　Ｆ　３３よび抗
ｈ　−Ｅ　Ｇ　ｆ：は、高純度に精製されたｈ　−ＥＧ
Ｆおよびこれを抗原とすることによっ゛Ｃ調製された特
異性の高い抗Ｆｌ　−［Ｇ　Ｆ抗血清である。

このようなｈ−ＥＧＦの調製方法は種々あるが（尿より
の抽出、化学合成、遺伝子工学的手法等に°よる）、生
産効率の点からは遺伝子工学的手法により調製され、高
純度に精製されたｈ−ＥＧｒ−を用いるのが好ましい。

なお、本発明で「精製された」というのは［実質的に甲
−である」という息味であって、例えば純度９５％程１
１以上であって、本発明において抗原として用いられた
ｈ　−ＥＧＦのように純度が９９％程；復以上のもので
あるのがより好ましい。このような遺伝子工学的手法に
よりｔ＋　−ＩＥ　Ｇ　Ｆを調製する方法は種々提案〔
前記特開昭５７−１２２０９６号、同５８−２１６６９
７号、同５９−１３２８９２号各公報等〕されているが
、本発明者らが先に提案した方法〔特願昭６０−２２６
３０号の明細古参照〕に従って行うのが最も好ましい。

ｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆを効率よく調製づることがでさるうえ、
高Ｋｉ度（９９％以上）の精製標品を容易に得ることが
できるからである。

このような遺伝子工学的手法によるｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆの調
製法は、下記の工程よりなるものである。

Δ、　　（イ）シグナルペプチドをコードする遺伝子で
あってその遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白
質の構造遺伝子を結合させ得るものを含みかつ予定した
宿主細胞内で増殖可能なベクターに、所望外来性蛋白質
をコード覆る遺伝子を組込み、（ロ）この組換体によっ
てダラム陰性微生物を形質転換させ、（ハ）１！７られ
る形質転換された微生物を、微生物の増殖過程において
対数増殖期の後期から停止期ｌｙｒ期にかけて蛋白質合
成能の誘導がおこるに必要な量の無機燐を含有づる培地
での培養に付したのち、これを集め、（ニ）ついでこの
微生物をオスモティック・ショック法によって処理する
ことにより所望外来性蛋白質を含む両分を回収すること Ｂ、　回収された所望蛋白質を含む両分をイオン交換ク
ロマトグラフィーに付したのら、所望外来性蛋白質画分
を回収すること。

Ｃ３上記で回収された所望外来性蛋白質を含む両分をさ
らに？３速液体クロマトグラフィーに付したのち、所望
外来性蛋白質画分を回収すること。

この方法の詳細は、後記参考例および特願昭６０−２２
６３０号の明ｉ書を参照されたい。

また、−Ｆ記ｈ　−ＥＧＦを抗原とし工調製された抗ｈ
−ＥＧＦ：抗血清は、例えば下記のようにして調￥Ｊす
ることができる。

４なりも遺伝子２［学的手法により造成されかつ純度９
９％以上に精製されたｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆを生理食塩水に
溶解したのち、等是のフロイントの完全アジュバント（
Ｆ　ｒｃｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａ　ｄｊｕｖ
ａｎｔ）（文献７）を加えてエマルシコンを１りて、つ
いでこれを家兎（♀）に１週間間隔で数回感作したのち
採血し、常法に従って血球フィブリンを除く（本発明の
場合は一例として血清分離剤入りのチューブ〔市販品〕
で処理したのち、遠心を行っている。）ことによって抗
血清を調製づる（詳細は、後記実施例を参照されたい）
という方法である。

そして、このようにして調製された抗ｈ−ＥＧＦ抗血Ｉ
Ｉ′ｉの確認は、定性的沈降反応、ゲル内拡散反応ある
いはＲ１Δ法等ににり行うことができる。

本発明では一例としてゲル内拡散法〔底内［役にたつ免
疫実験法Ｊ　ｐ６４、（１９８４）講談社用〕およびＲ
１Ａ法〔底置「生化学実験講座−ホルモン−Ｊ　ｐｌ　
７３　（１９７７）、東京化学同人Ｉす）に従って特責
性のＴＩＩ認を行った（詳細は、本発明者らが昭和６０
年６月２１日付で提出した特願昭６０−１３５４６０号
の明細用を参照されたい）。

４！Ａ識免疫測定法 本発明によるｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆの測定法は、前記の通り
標識免疫測定法の範驕に属するものであり、特に放射性
同位元素で標識されたｈ　−ＥＧＦを用いたイムノアッ
セイ法はＲＩＡ法の第四に属し、酵素で標識きれたｈ　
−［ＥＧＦを用いたイムノアッセイ法はエンザイムイム
ノアッセイ法（ＥｒＡ法）の範馳に属するものである。

これら方法は既に公知であって、種々の成書や文献に従
って行うことができる。例えば、ＲＩＡ法は前記〔文献
３〕に従って行うことができ、ＥＲＡ法は成書「酵素免
疫測定法」石川榮治ら編、医学店院刊（１９８２）に従
って行うことができる。例えば、ＲＩＡ法に従ってｈ−
ＥＧＦを測定する場合は下記の通りである。

すなわら、まず、ｈ−ＥＧＦを　　ＩＴ：標識して　　
Ｉ　−ｈ　−Ｅ　Ｇ　ＦをＪｏる。ついで、抗ｈ−［Ｇ
「抗血清と被検液とを混合した系に上記１２５１−ｈ−
［ＥＧＦを添加したのち、４℃で一夜放ｉ！？覆る。こ
れにヤギ抗家兎抗血清加え、抗血清と結合したｈ−ＥＧ
Ｆ　（８）と結合していないｈ−ＥＧＦ　（Ｆ）とを分
１１１［ｉ（二抗体法、吸着法および濾紙クロマト電気
泳動法が再現性よく代表的な方法とし工用いられている
（前記「生化学実験講座参照））シたのら、沈殿物（１
３）の放射活性を測定する。そして、あらかじめ上記方
法において非標識ｈ−ＥＧＦの濃度を種々変えて、標準
曲線を作成しておき、この標準曲線に、測定値を照合す
ることにより被検液中の）＋−ＥＧＦａ１を知ることが
できる。

また、ＥＩＡ法については種々のシステムがあって、反
応型式では抗原抗体反応の段階において、酵素標識抗原
と非標識抗原とを競合させるがさせないかによって競合
法と非競合法とに、また他の型式では抗原抗体反応の結
果抗原と抗体とが結合して生じた結合型の部分（ｂｏｕ
ｎｄ、Ｂ　）と結合していない遊離型の部分（ｔｒｅｅ
、　［）とを物理的に分離して測定する方法（８／Ｆ分
離法（ヘテロジニアス［ｌΔ）と、分離せずに測定する
方法（Ｂ／Ｆ非分離法（ホモジニアスＥｌΔ）とに大別
することができる（前記成用「酵素免疫測定法」医学書
院第２版（１９８２）参照）。

これらのうち、ｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆの測定法としては非競合
法でヘテロジニアスＥＩＡ法であるサンドイツチ法が使
用されて得る。そしてサンドイツチ法を行うに際しては
、酵素標識抗体を得るに当って単に抗血清をぞのまま酵
素と結合させたのでは抗体以外のタンパクにもＭｌが結
合して標識抗体としでは不適なので、予め使用抗体を少
なくとちγ−グロブリン程度にまで精製Ｊるか、これを
さらＦａｂ’　にするか、あるい（よ固定化抗原を用い
たアフイテイクロマトグラフィーで目的とする時宜抗体
のみを精製したのち酵素で標識するか、あるいは酵素標
識抗体を用いない場合は２種類の抗血清を用意、する必
要がある。

このようなサンドイツチ法の一実施態様を述べれば下記
の通りである。すなわち、まず抗ｈ−ＥＧＦ抗体を用意
し、これを１ｎ相に不溶化した系を用Ｑ　Ｔる。ついで
、この系に被検液を加えてインキュベートシ（ここで被
検液中にｈ−［ＥＧＩ”が存在ずれば上記不溶化抗体と
反応（抗原抗体反応）し、ｈ　−ＥＧＦは系に固定化さ
れる〕に洗浄してから、さらに酵素標識抗体を加えてイ
ンキュベートし、洗浄を行うくここでも抗原抗体反応が
起こるので、その植果抗原は二つの抗体に挟まれた形と
なる）。ついで、上記酵素の基質を加えたの１５インキ
ユベートを行って酵素活性を測定する。なお、ここでの
酵素活性は系に固定化された酵素で標識された抗体量に
よって決まり、この抗体と先に系に固定化されている抗
体によってｈ　−ＥＧＦは挟まれているので、酵素活性
を測定することは被検液中のｈ　−ＥＱＦｍを示すこと
にほかならない。そして、あらかじめ作成しておいた標
準曲線と測定値とを照合覆ることによって、ｈ　−Ｅ　
Ｇ　Ｆ量を算出することができる。なお、上記測定法の
詳細については前記文献および後記実施例を参照された
い。

実　　験　　例 本発明を用いた抗ｈ　−、−Ｅ　Ｇ　Ｆ抗血清を１冒る
にあたり、抗原として用いたｈ−ＥＧＦを以下のように
して［し、さらに精製することによって高純度（純度９
９％以上）の標品を（ワだ。

゛［稈へ：オスモティックー［清の調製（１）　形質転
換体の造成 下記の方法に従って、形質転換体［Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２
　　ＹＫ　　５３７（ＤＴＡ１５２２）を造成した。

ｐＴＡ１５２９（造成の詳細は特願昭５９−１５９７０
３丹の明細書参照）５μ７を、５μｍの緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス−塩Ｗ１緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）（ｐ
ｔ−Ｉｆ　５）、１０ｍＭＭ０ＣＩ　　、５０ｍＭ　　
ＮａＣ１）中で４単位の制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［（タカ
ラ）を用いて３７℃で１時間加水分解した。ついで、エ
タノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、３０μｍの反
応液（６７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ、（０日８．８
）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム〔以下 （ＮＨ）　　ＳＯ４）　、６．７ｍＭエチレンシアミン
四酢酸（以下ＥＤＴ△）　、０．６６ｍＭずつのｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）中で１単位のＴ４−
ＤＮＡポリメラーピを用いて、３７℃で１５分間処理し
た。ついで、エタノール沈殿によって得られた沈殿物を
５０μｍの反応液（６ｍＭ　　丁ｒｉｓ　−１ｉｃ　ｌ
　　（Ｄｔ１８．　Ｏ）、６ｍＭ　　ＭｏＣｌ　　、１
５０ｍＭ　　ＮａＧＩ）中で４単位の制限酵素５ａｌＩ
（タカラ〕を用いて３７℃で１時間加水分解した。反応
終了後、アガロースゲル電気泳動によって、３９００　
ｂｐのＤＮＡ断片（第１図中■）をｔｑだ。

プラスミドｐｔ３Ｒ３２２−ｈＵＧ　（＋）ＢＲ３２２
（Ｅ、ｃｏｌｉ　　　Ｋ１２　　０６００（ｐＢＲ３２
２）として寄託済み（微工研条寄第２３５号））をＥｃ
ｏＲＩおよび５ａｌｌ：で消化したものに人工的に合成
したｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ構造遺伝子をｆＥｃＯＲＩ　Ｉ３
よび３ａｌ■で消化した断片を組み込んだもの〕５μ３
を、５０．ｃｚｌの反応液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ｌ−
Ｉｃ　Ｉ　（ｐｌ−１７，５）　、５０ｍＭ　　ＮａＣ
Ｉ、５０ｍＭ　　ＭＯＣｌ　２　）中で４単位の制限酵
素ＥＣ０ＲＩ（タカラ〕を用いて３７℃で１時間加水分
解したのち、上記と同様にＴ４　　ＤＮΔポリメラーげ
処理を行い、さらに３ａｌ■処理を行ったのら、アガロ
ースゲル電気泳動によって１６０ｂｐのＤＮＡ断片（第
１図中■）を得た。

上記で調製した二つのＤＮＡ断片（第１図中■および■
）を、３０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　
　　（ＤＩ−１７，５）　　　、　　１０ｍＭＭ（ＪＣ
Ｉ２．１０ｍＭ　　Ｄｌ−Ｔ１０．５ｍＭＡＴＰ）中で
３００！ｉｉ位の丁４リガーピ（タカラ〕を用いて１４
℃で１６時間反応させた。反応終了後、これで犬膓菌に
１２　　ＹＫ５３７を形質転換（クシュナーの方法（文
献７））させて、目的のプラスミド（以下、ｐＴＡ１５
２２）（第１図中■）を含有づる形質転換株（［Ｅ、　
ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２ＹＫ５３７　（ｐＴ△１５２２）
）を（りた。

（２）　形質転換体の培養 上記形質転換された微生物Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ
５３７　（ｐＴＡｌ　５２２）を−、以下のようにして
培養した。単ａ胞純粋分離した［、ｃｏｌｉＫ１２　　
ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）−白金耳をクツ１−ル当
り］−リブトン１０９、酵母エキス５ｇ、ＮａＣＩ　５
ｇ、アンピシリン２０巧からなる培地１０Ｃ７１，：接
種し、５００Ｉｄ！容の坂１］コルベンで３７℃で一夜
振盪培養を行った。

次に、この培養液全ｆｆ１（１００ｄ）をとり、リット
ル当りグルコース３０ｇ、トリプトン２０ｇ、酵母エキ
ス１０！７、Ｍｇ５０　・７１−１２０１．０ｇ、およ
びアンピシリン２０〜よりなる培地２０リツトルに接種
し、３０リツトル容のジｔ・−ファーメンタ−で培養し
た。■ｓ差Ｕ磨１よ３７℃、通気量は０　、５　ＶＶ＋
ｌ　　（１ｖｖｍは１　ｖｏｌｕｍｅ−ｖｏｌｕｍｅ−
ｍｉｎｕｔｅのことで、１分間あたり培養液１リッ１−
ルに対して１リツトルの空気が導入されることを意味づ
るものである。）　、Ｄ　ｌ−１は４　Ｎ　　Ｎ　ａ　
ＯＨ１３よび４ＮＨＣ＋で７．２に調整しておき、溶存
酸素（Ｄｏ）　１１１度はＤｏコン１〜［１−ル装置に
より農拌速瓜を変化ざぜ（４ＤＤＩＢ付近に保持した。

培養は、グルコースおよび無ｎ燐の定量、〈［菌数の測
定、ｈ−ＥＧＦの産生量の測定を経時的に行うことによ
り、ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆの産生量が最大となるまで行った
。

（３）　オスモティック上清の調製 まず、上記培養液（２０リツ１−ル）を連続遠心磯５Ｃ
Ｒ２０［３（日立）によって遠心（１４，６００ｇ＞し
て菌体く湿を量６７２．１ｇ）を１！７だ。ついで、こ
の菌体をオスモティック・ショック法に付ずため、反応
液１０リッ１−ルの高濃度ショ糖液（２０％シュークＯ
−ス、３０ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ　　　−トＩＣＩ　　
　（ｐ　ｌ」　８．　　０）　　　、　　１ｍＭＥＤＴ
△〕に懸濁させた。！潟で１０分間放置したのち、上記
と同様に遠心して国体を回収した。

ついで、この菌体を２にグの氷が入った４℃の水（８リ
ツトル）に懸濁させ、そして１０分間放置侵、上記と同
様の遠心操作を行い、上清を回収して、イオン交換クロ
マトグラフィーに付する試料（′Ａオスモィック上清）
とした。

■程Ｂ：イオン交換りロマトグラフィー上記オスモディ
ック上泊を−Ｆ記と同様の連続遠心操作に付して上清９
３４０ｄを得て、これを試料としてイオン交換クロマト
グラフィーを以下のようにして行った。

（１）　イオン交換カラムの：Ａ製 カラム（直径３．２１×長さ６０　ｃｔｎ　）に樹脂（
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰ［ＥＡＲＬ　　６５０Ｍ）を充填
し、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）
で平衡化した。

（２）　イオン交換カラムクロマトグラフィー上記試料
をイオン交換カラム（カラム温度４℃）に付ずことによ
りカラムにｈ−ＥＧＦを吸着させ、ついで２０ｍＭ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）２５００ｄでカラ
ムを洗浄した。吸着されたｈ−ＥＧＦの溶出は、２０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝１　（ｐＨ６，０）１５００＊
と２５０ｍＭ酢Ｆａ７ンモニウムＷｉ函液（ｐＨ６，０
）１５００ａｅとのリニアグラジェント（２Ｉ！速２ａ
ｉ！／分）で行った。そのときのイオン交換カラムクロ
マトグラムは、第２図に承り通りである。同図中Ｏは、
各両分の吸光度（２８０ｎｍ＞を示し、・は、各両分の
ラジオリセブターアッセイ（ＲＲＡ）法による活性の強
さ〔結合阻害率（％）として表示したｂの〕を示す。

ｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆ画分として、各両分の吸光度のピークと
ＲＲＡ法により測定された活性ピークとが重なっている
部分を二つ回収した。一つは分画数５１〜６０番目まで
の画分く第２図中ｈ−ＥＧＦ−工。以下、ｒｈ−ＥＧＦ
−ＩＪという）であり、伯の一つは分画数９７〜１０５
番目までの両分（第２図中ｈ−ＥＧＦ−ＩＩ。以下、ｒ
ｈ−ＥＧＦ−Ｉ［Ｊという）である。

ここで、ＲＲＡ法は以下のようにして行ったものである
。

−４なわち、ｈ−ＥＧＦの［ＲＡはヒト鼻咽喉上皮癌細
胞由来のＫＢ細胞（ＡＴＣＣＮＱＣＣＬｌ　７）を用い
、Ａ、キング（Ｋｉｎｇ〉らの方法〔文献８〕を参考に
して行った。すなわち、まず８００ｄのフラスコを使用
してＤＭＥ培地中でｔｔｉ層培前培養。

次ニ、Ｉａ地ヲ除＠、０．０５％のＥＤＴＡをａむリン
酸平衡化塩溶ｗｔ（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがして、
細胞懸濁液をＷ製した。その後、２０ｍＭヒーブス（１
−１ａｐｅｓ）　　（ｐＨ７、４＞を含むハンクス（Ｈ
ａｎｋｓ）平衡塩類溶液（１］［３Ｓ　Ｓ　）で２回Ｗ
Ｊ胞を洗浄した。細胞をパインディング・ツルージョン
（［３ｉｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　（Ｄ　Ｍ　
Ｅ培地・２０　ｒＴＩ　Ｍヒーブス（１−（Ｃｐｅｓ）
　　（ｐＨ７，４）　−０，３５ｇ／リットルＮａ　Ｈ
ＣＯ−１ｏｏμｙ・−ストレプトマイシン）に懸濁後、
細胞数を５１０して３０万〜４０万１０．２−バインデ
ィング・ツルージョンとなる様１［し、チューブに０．
２−ずつ分注した。種々の濃度のｈ−ＥＧＦおよび　　
Ｉ−ｍＥＧＦ　ｌ？ウスＥＧＦ）を含む試料液０．２−
をチューブに加えて、３７℃で１時間インキュベートし
た。ついで、細胞を氷冷したト１［３ＳＳで２回洗ｆｐ
後、ガンマ−カウンター（７０力ＡＲＣ３００（アロカ
株式会社）〕で細胞に結合している　　Ｉ−ｍ［ＧＦ’
の７１２　ＤＪ活性を計測した。これを結合阻害率（％
）に換口したものは第２図に示した通りである。

なお、ここで得られたｈ　−Ｅ　Ｇ　［−ＩＩは、ｈ−
［Ｇｒ−Ｉが上皮細胞成長因子を構成している５３個の
アミノ酸からなる（後記）のに対し、Ｃ末端から二つの
アミノ酸（ロイシンおＪ：びアルギニン）が欠落したも
のであった。

■程Ｃ：高液体体りロマトグラフィー 上記工稈ＢでＩ＋′？られた画分ｈ−ＥＧＦ−Ｉを上記
の操作に付すことにより、これらの両分を精製した。す
なわら、画分ｈ−［ＧＦ−Ｉを凍結乾燥したのら、これ
を１０％アレトニトリルＪ３よび２％酎耐を含有する溶
液６０ａｉ！に溶解した。ついでこの溶液を遠心し、上
清的６０１ｄを得て、これを高速液体クロマトグラフィ
ーに付した。ここで高速液体クロマトグラフィーの諸条
件は以Ｆの通りである。

高速液４体りロマ：〜グラフィ一二 ＩＩ　ＣＬ　８０３　Ｄシステム（東洋費達）カラム温
度：４５℃ 流　速二２ａｅ／分 溶離液および溶離条件： Ａ液（１０％アセトニトリル、２％Ｉ！＄１）Ｂ液（８
０％アセトニトリル、２％酢酸）溶離は、下表のような
Ａ液とＢ液濃度によるグラジェントで行っＩ；。

検出波長：吸光度２８０　ｎｎｉ ぞのときのｈ−ＥＧｔ＝−１の溶出パターンは、第３図
に示す通りである。なお、同図中保存時間１７．２３分
が精製されたｈ−ＥＧＦ−Ｉのピークである。

以上の工程により精製されたｈ−ＥＧＦｆｆｌ、蛋白が
、比活性Ｊ３よび収率は、第１表に示１通りである。

第１表 ”　　　　ＲＲＡ法（ｆ４願昭５９−１５９７０３（７
）明細書に記載の方法）によって計算した。

ネ＊　　　色素結合法（１３１０−ＲＡＤプロディン・
アッヒイギットを用いて行う）により行った。

なＪ３、ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ−ｎ両分も同様の方法で精製
することができた。

純度の検定 精製したｈ−ＥＧＦの純度の検定は、常法であるポリア
クリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体クロマト
グラフィーで行った。これらの結果より、純度は９９％
以上であることがわかった。

ぞのとさの電気泳動の結果は第４図に、高速液体クロマ
トグラフィーの結果は第５図に示す通りであった。なＪ
３、第４図中（イ）は電気泳動のゲルを模写したもので
あり、矢印＜ｈ＞がｈ−ＥＧＦのバンドを示し、また（
［］）はデンシトメトリーである。

アミノ酸組成の分析 上記ｈ−ＥＧＦのアミノ酸組成の分析は、前記実施例で
得られた両分の一部をとり、この両分を公知の常法に従
って処理したのち、アミノ酸分析機（１１１Ｃ−８２５
ＡΔ（東洋凸達）〕で行った。

ｆＪられた結果は、第２表に示す通りであった。この結
果は１文献値と完全に一致したちのである。

第　　２　　表 ☆　シスチンとして定量した。

一次４ｆ４選および二次横１の決 一次構造の決定は、〔文献８〕に従って行った。

づ”なりも、気相プロテインシークエンサー（アプライ
ド・バイオシステムズ社）を用い、試料（ｈ−ＥＧＦ−
Ｉ　　６０μｇ（１０μｍｏｌ）を水（１００μｍ）に
溶かしたもの〕をエドマン分解することにより、アミノ
末端側から逐次アミノ酸残塁を７ニリノチアゾリノン誘
導体として遊離させ、ついでこれを７工ニルチオヒダン
トインｙｋ導体（Ｐ　Ｔ　ｌ−４アミノ酸）に変換した
。そして、このＰＴｌ−１アミノ酸を逆相の＾液体体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定した。ここま
での操作で半シスチンに相当づる６１［＆ｌ所を除いて
（シスチンを含むベブタイドをそのままシークエンサー
にかけると半シスチンのところはブランクになる：第６
図参照）Ｎ末端から５３番目まで固定した。

次に半シスチンを同定づるために、試料（上記）をブロ
モシアン処理後、還元カルボキシメチル化（ＣＭ化）し
て、二つの７ラグメント（ＣＭＩおよびＣＭＩＩ）を得
た〔前記生化学実験講座参照〕。

ついで、この二つの７ラグメントのアミノ酸配列を各々
ｌ−（Ｐ　Ｌ　Ｏで分析すると、半シスチンはすべてＳ
−力ルボキシメチルシステインとして検出された。以上
の結果は、第６図に示す通りである。

同図中、△ｓｎ、　３ｅｒ等は各々アスパラギン、レリ
ン等のアミノ酸を示１当該分野で通常用いられている略
記法である。略記されたアミノ酸配列上の１．５．１０
等の数字はｈ−ＥＧＦのＮ、を端からＣ末端までのアミ
ノ酸の配列番号を示１らのである。また、右向きの矢印
（７）は直接分析されたＰＴｌ−１アミノ酸を示し、も
う一つの矢印（−〃）はＣＭ化処理をした後のＰ　Ｔ　
Ｈアミノ酸の同定結果を示すものである。また、図中、
ＣＭＩおよびＣＭＩ［はブロモシアン処理後、ＣＭ化し
て得られた両分を承りものである。なお、同図中Ｃ末端
から６番目までまでの左面きの矢印（−〉は、カルボキ
シペプチダーゼＷ（ＣＰＷ）を用いて試料を加水分解し
、ＴＩ離したアミノ酸を経時的に分析した結果を示すも
のである（Ｃ末端分析＋ＣＰＷ１に対しｈ−ＥＧＦ２０
の割合で反応させ、経時的にアミノ酸分析をくり返して
、遊離したアミノ酸を同定するもの）。

以上より、ｈ−ＥＧＦの一次Ｍ４造は、第６図で示され
るものであると確認された。

次に二次構造は、下記の方法によって調べた。

まず、試料（ｈ−ＥＧＦｌ　７４μびを１００μｍのピ
リジン／アセテート緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解したも
の）をサー七ライシンで消化しく文献９）たのち、逆相
ＨＰ　Ｌ　Ｃで７ラグメントを分取した。ついで常法に
よりアミノ酸分析をした結果、シスチンを含むフラグメ
ントを三つ得た。ついで、これら各々のフラグメントを
過ギＭｌ化することによってＳ−８架橋を切断した。そ
して、逆相ＨＰＬＣによりシスディン酸を含むフラグメ
ントを分取し、それぞれについて常法によりアミノ酸分
析およびアミノ酸配列分析を行った（結果は第７図参照
）。その結果、Ｓ−８架橋の位置はＮ末端側から６番目
と２０番口（第７図中（■））、１４番口と３１？ｆｌ
目（第７図中（ｆｆ））、および３３番目と４２番口（
第７図中〔■〕）であることがわかった。以上の一次構
造および二次構造の同定結果は、１９７５年にグレゴリ
−が提唱〔文献２〕したｈ−ＥＧｒの構造と一致づるち
のである。

また同様にしてｈ−ＥＧＦ−Ｉｆについて調べたところ
、Ｃ末端側のアミノ酸が二つ欠旧している以外はｈ−Ｅ
ＧＦ−Ｉと同一であった。

抗血清の調製 上記の高純ｒ！１（純麿９９％以上）に精製されたｈ−
ＥＧＦを抗原として、以下の手順に従って抗血清を調製
した。

ｈ−ＥＧＦ　（０，２ＩＩＩ９＞を生理食塩水（０，５
ｄ）に溶解し、ついで等岱のフロイントの完全アジュバ
ントを加えてエマルシコンを作成した〔成用「生化学実
験講座　ホルモンＪ　ｐｌ　７５（１９７７）、東京化
学同人刊）。次に、この１マルジョン１−を家兎（♀）
の脇の下および背中の皮下に数個所に（約０．２ｄずつ
）分けて注射し、この操作を１週間間隔で計６回行った
のら、最少の感作から１週間優に耳静脈より採血した。

そしてこの血液をヘパラビットチューブ（血清分離剤入
りのｙ」−ブ：積水化学工業■）に入れて２０〜３０分
放ｌしたのら、遠心（３０００ｒｐｍ。

３０分間）して血球・フィブリンを除去して、目的とＪ
る抗血清を得た。

本発明の抗血清の特異性の確認は、以下のオフテロニー
法に従って抗血清と他の物質との交差反応を調べること
により行った。

ガラスシャーレに１．２％の精製寒天液（アジ化ナトリ
ウム（ＮａＮ３）を０６１％添加したもの）７ｍを入れ
て寒天をゲル化させたのち、ゲルに直径５ｍ程度の穴を
あＧ−Ｊた。このような穴を第８図に示されるように６
個（イ〜へ）あけ、中央の穴に抗血清を２０μｍを入れ
、まわりの穴に各々ｈ−ＥＧＦ、　２１−Ｌｅｕ−ｈ−
ＥＧＦ　（ｈ　−ＥＧＦの２１番目のアミノ酸がメチオ
ニンからロイシンに置換されたもの。造成の詳細につい
ては特開昭６０−２８９９４号公報参照）、ウロガスト
ロン、正常ウサギ血清および抗つサギＩａＧ抗血ｉ＃２
０μｍを各々添加したのち、低温室（４℃）で−夜イン
キュベートを行った。そのとき生じた沈降線を第８図に
示す。同図中Ａｂは本発明の抗血清溶液が入った穴を示
し、イ〜へは下記の溶液が入った穴を示す。

（イ）　　ｈ−ＥＧＦ （ロ）　　ｈ−ＥＧ「−１１ （ｈ−ＥＧＦのＣ末端アミノ酸が二つ 欠如したもの） （Ａ）　　２ｌ−Ｌｅｕ−ＥＧＦ （ニ）　ウロガストロン （ホ）　正常ウサギ血清 （へ）　抗ウサギ（ａＧ抗血清 また、Ａｂの穴のまわりの実線は沈降線を示す。

従って本発明の抗ｈ−ＥＧＦ抗血清と、イ、口、ハおよ
び二との間にはっきりとだ沈降線が確認できたこと（第
８図）、および上記と同様の方法で中央に本発明の抗血
清を入れ、まわりの穴にマウス−ＥＧ、Ｆ　（ｍ−ＥＧ
Ｆ）　、セクレチン、インシュリン、ヒト性腺刺激ホル
モン等を入れてインキュベートを行ったときには沈降線
が生じなかったことから、本発明の抗血清はｈ−ＥＧＩ
”に対して特異性が高いことが確認された。

実施例　１ 上記で調製された抗ｈ　−Ｅ　Ｇ　ｒ：抗血清を用いて
本発明の方法のうちＲＩＡ法を行って、抗１ｌ−ＥＧＦ
抗血清と他のペプチドやホルモンとの交差反応性を調べ
た。

（１五凰且ｚｙ 上記で冑られたｈ−ＥＧＦをクロラミンＴ法〔文献１０
）に従ってヨード化した。すなわち、ｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆ　
　１μ３を０．５Ｍリン酸ｇ函液（ｐＩ−１７，５）　
１０μｍに溶解したのち、これにＮａ　　　Ｉ（米国Ｎ
ＥＮ社製二臼木アイソトープ協会を通じ購入）ＩｍＣｉ
を加えて撹拌した。ついで、これに３ｒＩ！ｇ／Ｉｄ！
のクロラミンＴ１０μ＋を加えて１分間室温で反応を行
ったのち、３　ＩＩｒｇ／ｍｅのメタ重亜１４Ｍナトリ
ウムで反応を停止した。

この溶液に２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を反応
液の１／１０容酎加え、セフ７デックスＧ−２５（ファ
ルマシア）（０，１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ＋）を
含む５０ｍＭリンｌ１１緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化
したもの〕を用いて、１２５Ｉで標識された抗原（１−
ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ　）を　Ｉｔこ　。

ラジオイムノアツヒイ（ＲＩＡ） 被検試料、抗ｈ−ＥＧＦ抗血清および　　１−ｈ−ＥＧ
Ｆを各々希釈用緩衝液（０，ＯＩＭリンＭ緩衝液、０．
１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，１％ピラチン、０．０１％Ｎ
ａＮ３＞で希釈し、これら各々１００μｍを混合したの
ち、４℃で一夜放置した。ついで、これに希釈用緩衝液
で２０倍に希釈したヤギの抗家兎１ｇＧ血清（第二抗体
）と１００倍に希釈した正常家兎血清各１００μｍとを
加え、４℃−夜装置したのち、遠心（３００ｒｐｍ３０
分）して沈殿を冑、この沈殿を洗浄したのち、（りられ
た沈殿の放射活性（Ｂ）をγ−オートウェルシンチレー
ションカウンター（アロカ社製）で測定した。一方、被
検試料を除き、抗ｈ−ＥＧＦ抗血ｈ１および１２５１−
　ｈ　−Ｅ　Ｇのみを用いて上記と同じ操作を行って、
放射活性（Ｂｏ＞を測定して、Ｂ／Ｂｏを計算した〔前
記［生化学実験講座−ホルモン−Ｊｐ１６２）。上記方
法を種々のｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ　１１度存在下で行って、
標準曲線（第９図）を得た。

そして、他のペプチドやホルモンとの交差反応性を調べ
るため、上記ＲＩＡ操作においてｈ−ＥＧＦの代りに種
々の濃度の他のペプチドないしホルモンを系に加えて第
９図のような標準曲線を作成した。種々のペプチドない
しホルモンのＢ／Ｂｏ＝５０％となる濃度を、ｈ−ＥＧ
Ｆで上記ＲＩＡ法を行ったときに算出された［３／Ｂｏ
＝５０％となる製電を１００％として、ｔｌ−ＥＧＦの
前記濃度に対する割合〔交差反応性（％）〕として示し
た（第３表）。

この結果より、本発明の抗血清は、１１−　Ｅ　Ｇ　Ｆ
　。

ｈ−ＥＧＦ−ｎおよび２ｌ−Ｌｅｕ−ｈ−ＥＧＦと１０
０％交差反応を示し、ｍ−ＥＧＦとは０．１％の交差反
応を示し、またそれ以外のペプチドないしホルモンとの
交差反応性は０．０１％以下であったので、特異性は非
常に高いものであることが示唆される。

第　　３　　表 実施例　２ ヒト生体内（而しよう、血清、尿等）のｈ−ＥＧＦの測
定を本発明の方法（特にＲＩＡ法により行った。そのと
きの測定結果および文献値を第４表に示ず。

第　　４　　表 ＊　成用「細胞成長因子−Ｑ　ｒｏｗｔｌ＋　Ｆａｃｔ
ｏｒｓ　−Ｊｐ２５９口本組織培養学会編、朝倉占店刊
実施例１〜２では本発明のｈ　−［ＥＧｒ−の測定法の
うちＲＩＡ法を行ったが、ＲＩＡ法では、用いる放射性
同位原木が不安定であるので長期間使用できないこと、
特別の施設、機器が必要であること、ｔＩｌ射性魔性廃
棄物理に配慮すべきこと、人体への影響があること等の
問題を抱えている。これらの問題点を右さず、簡便なイ
ムノアッセイ法の代表としてＥＲＡ法がある。以下【、
１、ＥＩＡ法に係る操作および本発明によるｈ−ＥＧＦ
の測定例を示ずものである。

参考例　３ 抗ｈ　−ＥＧＦウサギ抗体の製造 ｈ−ＥＧＦ２ｊＩ！Ｊ′４ｒ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｌ−１７，１）！Ｍに溶解した。ついでこれにあらかじ
めＯ，１ＭリンＭｔ１衝液（ｐｔ−１７，１）で洗浄し
ておいたホルミルセルロフ？イン（生化学工業）６ｙ（
９重）を加え、さらに水素化シアノボウ索す１〜リウム
（ＮａＣＮ８１１３　）５０ｑを加えたのも１２時間撹
拌を行った。反応終了後、ホルミルセルロファインを０
．１Ｍリン酸ｗＬ衝液（ｐＨ７，１）で洗浄し、ついで
、０．２Ｍトリス−塩酸Ｗ耐液（ｐｌ−１７，０）１０
ｍに懸濁させ、Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　ｆ１３）　２０巧を
加えたのも２５℃で４時間反応を行った。反応終了後、
ホルミルセルロファインを０．１Ｍリン酸！ＩＩ液（＋
１１７．１）で洗浄し、さらに（イ）０．５ＭＮａＣ１
含有０．０５ＭリンＭ！１衝液（ｐＨ７，４）、（ロ）
０．２Ｍグリシン−塩酸（１−１２，２５）および（ハ
）０．４ＭリンＭ緩衝液（ｐＨ８，０＞で順次洗浄した
のら、これをカラムに充填した（ｈ−Ｅ　Ｇ　Ｆ−セル
ロファイン、カラｌ入ｉ、ｏｘｉ。

α）。ついで、前記抗血清（参考例２）５ｄを０．１５
ＭＮａＣｌ含右０．ＯＩ含有ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
で希釈したものを上記カラムに付した。そして、このカ
ラムを０．１５ＭＮａＣｌ含右０．ＯＩ含有ンＷ！ｉ緩
衝液（ｐｌ−１７，２＞で洗浄したのら、０．２Ｍグリ
シン−１２！酸Ｍ衝液を加えることにより所望画分の溶
出を行って、ｈ−［ＧＦと強い親和性をもつ特異抗体（
抗ｈ−ＥＧＦウサギ抗体）　（蛋白量９．０■）を得た
。

膨月上ＪＬＩ−鮭進 ポリスチレンチューブ（直径１．０ａｍ、ｌさ１０ｃＩ
１１ファルコン社）に上記抗体２０μｇ／Ｉｌｌおよび
０．０１ＭＮａＣｌ含右０．ＯＩ含有ン酸Ｍ函液（ｐＨ
８，０）１００μ！を加えて７．５℃で一夜インキュベ
ートションを行った。ついで、０．５％［３ＳＡ含０．
０５Ｍリン酸緩動液（ｐ　ｆ−１７，０）で洗浄後、０
．５％ＢＳＡと０．１５ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ１１７．２）を加えることによっ−Ｃ１
特７シ抗体をチューブに固定化した。なお、このチュー
ブは用いる前まで冷所保存した。

実施例　３ 本発明の方法によりｈ　−ＥＥ　Ｇ　Ｆの測定を以下の
ようにして行った。

１、　抗ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆウサギ抗体（Ｆａｂ’　　）
（７）β−ガラクトシダーぜ（β−ｇａｌ）による標識
、前記特異抗体（参考例３）５Ｉ１ｇにＯ，ｌＲｇのペ
プシンを加え、３０℃で一夜反応を行ったのら、これを
セルロファインＧＣ−７００（カラム直径１．０α、長
ざ５０　ｔ：ｘ　）のクロマトグラフィーに供して、抗
体画分（Ｆ　（ａｂ’　）２　）を得た。この両分をβ
−メルカプ１−アミンで還元後、セフ１デックス”Ｇ−
２５（カラム直径１．０ａ、長さ５０　ｔｓ　）のクロ
マトグラフィーを行った。１ｒ１られた両分にＮ、Ｎ’
−０−フェニレンジマレイミド（０−ＰＤＭ）飽和溶液
２　ｔｄｌ　全添加し、３０℃で３０分反応を行ったの
ち、この混合物をセファデックス０Ｇ−２５（カラム直
径１．０１、長さ５０　ｃｔａ　）のクロマトグラフィ
ーに供して、マレイミド化Ｆａｂ’を得た。

このマレイミド化ｒ’ａｂ’　にβ−ｇａｌ溶液＜５１
！ｇ／ｄ＞５０μｍを添加し、５℃で一夜反応を行った
のち、セファ０−ス６Ｂのクロマトグラフィーニ供し、
０．１％ＮａＮ　　、１Ｔｌ１ＭＭ（ＪＣ１２および　
　０．１５ＭＮａＣ１含右０．０１Ｍリン酸Ｗｉ函液（
ｐＨ７，２＞を用いて酵素活性ならびに抗体活性を右づ
る両分を分取して、β−ｇａｌと抗ｈ　−ＥＧＦ抗体（
Ｆａｂ’　）との結合物（酵素標識抗体）を得た。なＪ
３、この結合物の分子間は約６５万であって、抗体（Ｆ
ａｂ’　）と酵素との［ル比は約２であった。

２、　　ｈ−ＥＧＦの定量 上記で用意した特異抗体を固定化したチューブに被検液
（５０μｍ）を加えて、３７℃で２峙間反応を行った。

これを洗浄後、上記酵ん標識抗体を加えてさらに３７℃
ぐ２時間反応を行い、反応終了後、再び洗浄を行った。

この溶液に０．３ｍＭメブルウンベリフＩロールβ−ガ
ラク１−シト５０μｍを加えて３０℃で２０分反応後、
０．　１Ｎ　Ｎ　ａ　ＯＨ−グリシン（ｐＨ１０，３＞
？Ｗ液２．５ｄを加えた。そして、この溶液のＥＸ３６
０ｎｍ、ＥＭ４５０ｎｍにおＧｔ　６　ｍ　光４４１’
ｌｆ　ヲ螢光分光光度計で測定した。なお、ｆｉｌ’Ｉ
Ｎ品として、１０−１Ｍ４−メチルウンベリフェロンを
１００として相対的螢光強電を測定した。また、ここで
は非標識ｈ　−ＥＧＦの′ａ度を種々変えてあらかじめ
標岸曲線（第１０図）を作成しておき、この曲線と測定
値とを照合することによって被検液中のｈ−ＥＧＦを定
かした。ここで行った定量法において、その変動係数は
５％以下であった。

実施例　４ 実施例３と同様の方法でｈ　−ＥＧＦの測定を行った。

なお、そのときに使用した酵素標識抗体は以下のように
して調製したｂのである。前記特異抗体（参考例３）１
．５１Ｒｇを０．０５ｍＭリン酸緩衝液（Ｄｔ−１７，
０＞１ａｅに溶解し、ＭＢＳ　（ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロセシサクシイミドエステル（ピアス社
））０．３ｊ？９を含むテトラヒドロフラン２００μｍ
を加えて３０℃で３０分間反応を行ったのら、これをセ
ファデックスｏＧ−２５に付してＭＢＳアシル化ＩＱＧ
画分を得た。そして、以下実施例３と同様にして酵素標
識抗体を得、同様にｈ−ＥＧＦの定量を行った。

そのときに作成した標準画ｖ２Ｇま、第１１図に示す通
りである。なお、測定値の変動係数は、いずれも５％以
下であった。

引用外国文献 １）　プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７２、１３１７　（１
９７５） ２）　ネイチｔｙ−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、２５７．３
２５３）　ネイチｔｙ−（Ｎａｔｕｒｅ　）、３１１．
４１４４）　ブ［］シーディンゲス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ（ｐｒｏｃＪｌ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、　ＬＪ３△）、７４、　　
３９１８〜３９２１　　（１９７７）５）　ジＶ−ナル
・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　
ｉｏｌ、ｃｈａｍ、）　２５７．６）　ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・エンドクリノロシイ・アンド・メタボ
リズム（Ｊ。

Ｃｌ１ｎｉｃ、Ｅｎｄｏｃｌｉ、　　Ｍｅｔａｂ、　　
）　４５．７）　エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃｌ
ｉｎｏｌｏｇｙ）、９０．１２６１　（１９７２） ８）　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ーＬｌ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈａｍ、）　２５６．９）
　ジャーナル・Δブ・パイＡケミストリー（Ｊ、３ｉｏ
ｃｌ＋ａｍ、　＞　７４．　６９７１０）　ネイチｔ　
−＜Ｎａｔｕｒｅ　）　、１９４．関２微生　のｉ−Ｄ
’　　　Ｊ３よび一″２−ｉｑ本発明において開示され
た微生物の菌学的性質Ｊ３よび受託番号は下記の通りで
ある。

受託年月日 （１）昭和５６年６月９日 （２）昭ｆ！１１５８年４月３０日 （３）昭和５６年６月９日 （４）１Ｍ＋和５９年１１月１４日 ′、Ｆ、　　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所の受託番号 １玉五見Ｉ （１）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００この菌は、
ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸
ｙＡ属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サプレ
ッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与づる
ヌクレアーＵをコードづるｒｅｃＢＣ遺伝子に欠陥を右
づるらのである。栄養要求性としては、トレオニンとロ
イシンをその最小培地上での増殖に必要とする。また、
分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

なお、木菌に関する文献は以下の通りである。

（イ）シエネテイツクス（Ｑ　ｅｎｅｔ　ｉｃｓ　）、
３９．４．４０（１９５４） （ロ）　　ネイチｖ　−（Ｎａｔｕｒｃ　）　、２１７
．（２）　　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　　Ｋ　１　２Ｃ６００
（ｐＹＫ２８３＞ この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を右する他、「因子を含まず
、サブレツナ−遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに
関与するヌクレアーゼをコード１′るｒｅｃＢＧ遺伝子
に欠陥を有づるものである。栄ｆｉｆｆ求竹としては、
トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要
とする。ｐｈｏ　Ａ遺伝子のプロモーター−オペレータ
ー領域ｐ、ＡＣＹ０１７７由来の複製開始領域および１
）　Ｂ　Ｒ３２２の旧ａ遺伝子から描成されたプラスミ
ドｐＹＫ２８３を含み、アンピシリンに対して耐性をポ
リ。また、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属づるも
のである。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除けば、こ
の菌株の菌学的性質はぞの親株１：、Ｃ０ＩｉＫ１２Ｃ
６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、　ｃｏｌｉＫｌ　２Ｃ６００（ｐＢＲ３
２２） この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｅ因子を合まず
、サブレツリー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに
関与づるヌクレアーぜをコードするｒｅｃＢｃＪ１！伝
子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては、ト
レオニンと１コイシンをその最小培地上での増殖に必要
とする。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む
。なお、プラスミドｐＢＲ３３２に対してはジーン（Ｇ
ｅｎｅ　）、２．９５　（１９７７）、大腸菌に１２Ｃ
６００に関しては上記ネイチャー（Ｎａｔｕｒｃ　）を
参照覆ることができる。ｐＢＲ３２２山来の形！１を除
（）ば、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２Ｃ６００（ｐＢＲ
３２２）の菌学的性質は親株のそれと同じである。

（４）　　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｋｌ　２　　ＹＫ５３
７大賜菌に１２　　ＹＫ　　５３７は、公知様であると
ころの大腸菌に１２株〔マイクロバイオロジカル・レビ
ューズ（Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｃｖ
ｉｃｗｓ）、４４．１〜５６　（１９８０））の誘導体
大腸菌に１２　１”ｌ　　１（ジーン（Ｇ　ｅｎｃ）、
２．９５（１９７７）バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジクス・アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｃｍ、　［３１ｏｐ
ｌ＋ｙｓ。

△Ｃｔａ、、５５５．２４３　（１９８１））をさらに
改変したｂのであり、下記の性質を示し、他の性質につ
いてはに１２　　ＲＲｌのそれと異なるところのない菌
株である。

（ｒｅｃ　　Ａ　１　、Ｐｈｏ　　Ａ８、ｐｒｏ　　）

【図面の簡単な説明】

第１図は、グラスミ１０丁Δ１５２２３Δ成のフローチ
ャートである。 第２図は、イオン交換力ラムクロマトグラフイーのクロ
マトグラムＪ３よびＲＲＡ法の結果を示すグラフである
。 第３図は、高速液体クロマトグラフィーのりＯマドグラ
ムを模写した図である。 第４図はポリアクリルアミドゲル・ディスク電気法ｌｈ
の結果を承りものであって、第４図（イ）は電気原初の
ゲルを模写した説明図であり、第４図（ロ）はデンジメ
トリーの図である。 第５図は、分析用高速液体クロマトグラフィーのクロマ
トグラムを模写した図である。 第６図は、ｈＥＧＦの一次構造を決定したときのアミノ
酸配列の決定手順および決定されたアミノ酸配列を示ず
説明図である。 第７図は、ｈ−ＥＧＦの二次構造を決定したときのＳ−
８結合の位置およびその付近のアミノ酸配列を示す説明
図である。 第８図は、抗ｈ−ＥＧＦ抗血清の特異性をオフテロニー
法によって調べたときのゲルを模写した図である。 第９図は、抗ｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆ抗血清を用いてＲ１Δ払
を行ったとぎに得られた標準曲線である。 第１０．１１図は、いずれも、抗ｈ　−ＥＧＦ抗血清お
よび酵素標識抗体を用いて［ＥＩＡ法を行ったときに得
られた標準曲線である。 莞３図 ［Ｉ］　　　　　　　　　　［Ｉ［］　　　　　　　Ｃ
ＤＩ］范７図 児８図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原抗体反応を利用した標識免疫測定法によってヒ
   ト上皮細胞成長因子（以下、ｈ−ＥＧＦという）を測定
   する方法において精製されたヒト上皮細胞成長因子およ
   びこれを抗原として調整された抗血清をそれぞれ抗原お
   よび抗体として使用することを特徴とするヒト上皮細胞
   成長因子の測定法。 ２、抗原抗体反応を利用した標識免疫測定法が下記の工
   程（イ）〜（ハ）よりなる、特許請求の範囲１項記載の
   測定法。 （イ）被検液、被標識ｈ−ＥＧＦおよび抗ｈ−ＥＱＦ抗
   血清のインキュベーションを同一系内で行なうこと。 （ロ）被標識ｈ−ＥＧＦと抗ｈ−ＥＱＦ抗血清の結合体
   （Ｂ）と、遊離している被標識ｈ−ＥＧＦ（Ｆ）とを分
   離すること。 （ハ）上記の工程で分離したＢおよびＦのいずれか一方
   の被標識ｈ−ＥＧＦ量を測定すること。 ３、被標識ｈ−ＥＧＦが放射性同位元素で標識されたｈ
   −ＥＧＦである特許請求の範囲第２項に記載の測定法。 ４、被標識ｈ−ＥＱＦが酵素で標識されたｈ−ＥＧＦで
   ある特許請求の範囲第２項に記載の測定法。 ５、抗原抗体反応を利用した標識免疫測定法が下記の工
   程（ニ）〜（ヘ）よりなる、特許請求の範囲第１項記載
   の測定法。 （ニ）抗ｈ−ＥＧＦ抗体を固相化した系を用意し、この
   系に被検液を加えてインキュベーションを行なうこと。 （ホ）上記の系を洗浄後、この系に被標識抗ｈ−ＥＧＦ
   抗体を加えてインキュベーションを行なうこと。 （ヘ）上記の系を洗浄後、この系に固定された被標識抗
   ｈ−ＥＧＦ抗体量を測定すること。 ６、被標識抗ｈ−ＥＧＦ抗体が、放射性同位元素で標識
   されたものである、特許請求の範囲第５項に記載の測定
   法。 ７、被標識抗ｈ−ＥＧＦ抗体が酵素で標識されたもので
   ある、特許請求の範囲第５項に記載の測定法。 ８、ｈ−ＥＧＦが遺伝子工学的手法によって調製され、
   これを精製することによって得られたものである、特許
   請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の測定法。