JPH06319586A - イン・ビボ糖化アルブミンに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
イン・ビボ糖化アルブミンに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH06319586A JPH06319586A JP6045471A JP4547194A JPH06319586A JP H06319586 A JPH06319586 A JP H06319586A JP 6045471 A JP6045471 A JP 6045471A JP 4547194 A JP4547194 A JP 4547194A JP H06319586 A JPH06319586 A JP H06319586A
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 in vivo糖化アルブミンに対するモノクロー
ナル抗体を提供すること。 【構成】 イムノアフィニティクロマトグラフィーによ
って血清から精製されたin vivo糖化アルブミンで免疫
化し、免疫化された動物の脾臓細胞を不死化し、次い
で、培養上清が糖化アルブミンに対する所定の抗体を含
有するこれら不死化細胞をクローン化することによって
得ることのできる、非糖化アルブミンと３０％未満反応
するin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体。 【効果】 in vivo糖化アルブミンに対するモノクロー
ナル抗体を得た。
ナル抗体を提供すること。 【構成】 イムノアフィニティクロマトグラフィーによ
って血清から精製されたin vivo糖化アルブミンで免疫
化し、免疫化された動物の脾臓細胞を不死化し、次い
で、培養上清が糖化アルブミンに対する所定の抗体を含
有するこれら不死化細胞をクローン化することによって
得ることのできる、非糖化アルブミンと３０％未満反応
するin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体。 【効果】 in vivo糖化アルブミンに対するモノクロー
ナル抗体を得た。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、in vivo糖化アルブミ
ン(glycated albumin)に対するモノクローナル抗体に関
する。さらに詳しくは、本発明は、非糖化アルブミン(n
on-glycatedalbumin)と３０％未満反応するin vivo糖化
アルブミンに対するモノクローナル抗体に関する。ま
た、本発明は、当該モノクローナル抗体の生産方法、in
vivo糖化アルブミンの精製方法、in vivo糖化アルブミ
ン特異的検出用の当該モノクローナル抗体、およびin v
ivo糖化アルブミンの免疫学的測定方法に関する。
ン(glycated albumin)に対するモノクローナル抗体に関
する。さらに詳しくは、本発明は、非糖化アルブミン(n
on-glycatedalbumin)と３０％未満反応するin vivo糖化
アルブミンに対するモノクローナル抗体に関する。ま
た、本発明は、当該モノクローナル抗体の生産方法、in
vivo糖化アルブミンの精製方法、in vivo糖化アルブミ
ン特異的検出用の当該モノクローナル抗体、およびin v
ivo糖化アルブミンの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルブミンは、分子量６６ｋＤを有する
血清タンパクであり、５８５アミノ酸から構成される。
該アルブミンは、６０リシン残基を含有しており、該リ
シン残基で、アルブミンは、糖化され得る。したがっ
て、アルブミンは、血流中を循環する他の血漿タンパク
と同様に非酵素的に糖化される。この非酵素的糖化は、
不可逆的に進行する遅い連続反応であり、主に血糖濃度
に依存する。したがって、血液由来のタンパクの糖化度
は、平均血糖値の測定のために重要な指標である。グリ
コヘモグロビンの測定は、ヘモグロビンの長い半減期に
よる血糖値の長期変化を記録するだけである。アルブミ
ンは、約１９日という実質的に短い生物学的半減期を有
しており、その結果、糖化アルブミンは、血糖値の中期
変化をモニターするための重要なパラメーターに相当す
る[イー・フッド(Ｅ.Ｈud)ら、クリニカ・シミカ・アク
タ(Ｃlin.Ｃhem.Ａcta)、１８５(１９８９)、１５７−
１６４]。
血清タンパクであり、５８５アミノ酸から構成される。
該アルブミンは、６０リシン残基を含有しており、該リ
シン残基で、アルブミンは、糖化され得る。したがっ
て、アルブミンは、血流中を循環する他の血漿タンパク
と同様に非酵素的に糖化される。この非酵素的糖化は、
不可逆的に進行する遅い連続反応であり、主に血糖濃度
に依存する。したがって、血液由来のタンパクの糖化度
は、平均血糖値の測定のために重要な指標である。グリ
コヘモグロビンの測定は、ヘモグロビンの長い半減期に
よる血糖値の長期変化を記録するだけである。アルブミ
ンは、約１９日という実質的に短い生物学的半減期を有
しており、その結果、糖化アルブミンは、血糖値の中期
変化をモニターするための重要なパラメーターに相当す
る[イー・フッド(Ｅ.Ｈud)ら、クリニカ・シミカ・アク
タ(Ｃlin.Ｃhem.Ａcta)、１８５(１９８９)、１５７−
１６４]。
【０００３】糖化アルブミンは、シマ(Ｓhima)ら［ケイ
・シマ(Ｋ.Ｓhima)ら、ディアベトロジカ(Ｄiabetologi
ca)３１(１９８８)、６２７−６３１およびケイ・ジャ
スカワ(Ｋ.Ｊasukawa)ら、ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィー(Ｊ.Ｃhromatography)５９７(１９９２)、２
７１]に従って、クロマトグラフィーによって単離し、
検出することができる。しかしながら、この方法は、診
断試験のために時間を消費し過ぎる。したがって、糖化
アルブミンに対する抗体が開発された。しかしながら、
これらの抗体は、他の(糖化もしくは非糖化)血清タンパ
クまたは非糖化アルブミンとの交差反応性を示し、この
交差反応性は、診断試験のためには高すぎる。アルブミ
ンのリシン５２５での糖化に対して特異的な抗体は、Ｅ
Ｐ−Ａ０ ２５７ ４２１に開示されている。したがっ
て、これらの抗体は、特定の糖化アルブミンを認識する
だけである。エム・コーエン(Ｍ.Ｃohen)らは、糖化ア
ルブミンに対する別のモノクローナル抗体(Ａ７１７)を
開発した[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ズ(Ｊ. of Ｉmmunol.Ｍeth.)１１７(１９８９)、１２１
−１２９]。この抗体は、in vitro糖化アルブミンおよ
び非糖化アルブミン間の区別を認めるが、in vivo糖化
アルブミンおよび非糖化アルブミン間の区別は認めな
い。この違いは、in vitro糖化アルブミンがin vivo糖
化アルブミンよりも強く糖化され、したがって、非糖化
アルブミンとは、さらに強く異なるという事実によって
説明することができる。ＷＯ ８８／００３４６に開示
されている糖化血漿タンパクに対するモノクローナル抗
体も、単に、in vitro糖化血漿タンパクおよび非糖化血
漿タンパク間の区別を認めるだけである。この場合、最
良の抗体(７４−Ｇ１１)でさえ、なお、(in vitro糖化
血漿タンパクとの反応性と比較して)非糖化血漿タンパ
クと約４０％の反応性を有する。
・シマ(Ｋ.Ｓhima)ら、ディアベトロジカ(Ｄiabetologi
ca)３１(１９８８)、６２７−６３１およびケイ・ジャ
スカワ(Ｋ.Ｊasukawa)ら、ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィー(Ｊ.Ｃhromatography)５９７(１９９２)、２
７１]に従って、クロマトグラフィーによって単離し、
検出することができる。しかしながら、この方法は、診
断試験のために時間を消費し過ぎる。したがって、糖化
アルブミンに対する抗体が開発された。しかしながら、
これらの抗体は、他の(糖化もしくは非糖化)血清タンパ
クまたは非糖化アルブミンとの交差反応性を示し、この
交差反応性は、診断試験のためには高すぎる。アルブミ
ンのリシン５２５での糖化に対して特異的な抗体は、Ｅ
Ｐ−Ａ０ ２５７ ４２１に開示されている。したがっ
て、これらの抗体は、特定の糖化アルブミンを認識する
だけである。エム・コーエン(Ｍ.Ｃohen)らは、糖化ア
ルブミンに対する別のモノクローナル抗体(Ａ７１７)を
開発した[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ズ(Ｊ. of Ｉmmunol.Ｍeth.)１１７(１９８９)、１２１
−１２９]。この抗体は、in vitro糖化アルブミンおよ
び非糖化アルブミン間の区別を認めるが、in vivo糖化
アルブミンおよび非糖化アルブミン間の区別は認めな
い。この違いは、in vitro糖化アルブミンがin vivo糖
化アルブミンよりも強く糖化され、したがって、非糖化
アルブミンとは、さらに強く異なるという事実によって
説明することができる。ＷＯ ８８／００３４６に開示
されている糖化血漿タンパクに対するモノクローナル抗
体も、単に、in vitro糖化血漿タンパクおよび非糖化血
漿タンパク間の区別を認めるだけである。この場合、最
良の抗体(７４−Ｇ１１)でさえ、なお、(in vitro糖化
血漿タンパクとの反応性と比較して)非糖化血漿タンパ
クと約４０％の反応性を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、in vivo糖化アルブミンおよび非糖化アルブミ
ン間の区別を可能にする、糖化アルブミンに対するモノ
クローナル抗体を提供することである。
目的は、in vivo糖化アルブミンおよび非糖化アルブミ
ン間の区別を可能にする、糖化アルブミンに対するモノ
クローナル抗体を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、イムノアフィ
ニティクロマトグラフィーおよびボロナート(boronate)
クロマトグラフィーによって血清から精製したin vivo
糖化アルブミンで免疫化し、免疫化した動物の脾臓細胞
を不死化させ、培養上清が所望のin vivo糖化アルブミ
ンに対する抗体を含有するこれらの不死化細胞をクロー
ン化することによって得ることのできる、(in vivo糖化
アルブミンとの反応性と比較して)非糖化アルブミンと
３０％未満反応するin vivo糖化アルブミンに対するモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
ニティクロマトグラフィーおよびボロナート(boronate)
クロマトグラフィーによって血清から精製したin vivo
糖化アルブミンで免疫化し、免疫化した動物の脾臓細胞
を不死化させ、培養上清が所望のin vivo糖化アルブミ
ンに対する抗体を含有するこれらの不死化細胞をクロー
ン化することによって得ることのできる、(in vivo糖化
アルブミンとの反応性と比較して)非糖化アルブミンと
３０％未満反応するin vivo糖化アルブミンに対するモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
【０００６】驚くべきことに、本発明のモノクローナル
抗体は、反応性をin vitro糖化アルブミンほど強くは糖
化されないin vivo糖化アルブミンとの反応性と比較す
る場合でさえ、非糖化アルブミンとの反応性は低い(３
０％未満)。
抗体は、反応性をin vitro糖化アルブミンほど強くは糖
化されないin vivo糖化アルブミンとの反応性と比較す
る場合でさえ、非糖化アルブミンとの反応性は低い(３
０％未満)。
【０００７】in vivo糖化アルブミンは、血清から単離
される。好ましくは、高フルクトサミン含量を有する、
すなわち、４００〜５００μmol／リットルのフルクト
サミンを有する糖尿病血清を使用する。フルクトサミン
含量は、慣用の方法で、例えば、テスト・コンビネーシ
ョン・フルクトサミン(Ｔest Ｃombination Ｆructosam
ine)[ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍa
nnheim ＧmbＨ)、カタログ番号第１２９８１９４号]で
測定される。精製のために、まず、硫酸アンモニウムを
使用して、この血清からイムノグロブリンフラクション
を沈殿させ、塩化ナトリウムを含有するリン酸バッファ
ーに対して上清を透析させる。次いで、ヒト血清アルブ
ミンに対するポリクローナルイムノグロブリンＧフラク
ション上でアフィニティクロマトグラフィーに付して、
アルブミンを単離する。得られた全アルブミンフラクシ
ョンを酢酸アンモニウムバッファーに対して透析させ、
ボロナート上でクロマトグラフィーに付して、糖化アル
ブミンを分離する。このために、ボロナート基について
の全ての慣用の保持体を使用することができる；ボロナ
ートクロマトグラフィー用支持体として、フラクトゲル
(Ｆractogel) ＴＳＫ−ＡＦフェニルボロナートを使用
するのが好ましい。平衡化および洗浄バッファーとし
て、エタノールを含有する酢酸アンモニウムを使用する
のが好ましい。溶離は、ソルビトールを含有するトリス
(Ｔris)バッファーで行うのが好ましい。この方法で単
離した糖化アルブミンをリン酸バッファーに対して透析
させ、ＨＩＣ(疎水性相互作用クロマトグラフィー)に付
してさらに精製する。
される。好ましくは、高フルクトサミン含量を有する、
すなわち、４００〜５００μmol／リットルのフルクト
サミンを有する糖尿病血清を使用する。フルクトサミン
含量は、慣用の方法で、例えば、テスト・コンビネーシ
ョン・フルクトサミン(Ｔest Ｃombination Ｆructosam
ine)[ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍa
nnheim ＧmbＨ)、カタログ番号第１２９８１９４号]で
測定される。精製のために、まず、硫酸アンモニウムを
使用して、この血清からイムノグロブリンフラクション
を沈殿させ、塩化ナトリウムを含有するリン酸バッファ
ーに対して上清を透析させる。次いで、ヒト血清アルブ
ミンに対するポリクローナルイムノグロブリンＧフラク
ション上でアフィニティクロマトグラフィーに付して、
アルブミンを単離する。得られた全アルブミンフラクシ
ョンを酢酸アンモニウムバッファーに対して透析させ、
ボロナート上でクロマトグラフィーに付して、糖化アル
ブミンを分離する。このために、ボロナート基について
の全ての慣用の保持体を使用することができる；ボロナ
ートクロマトグラフィー用支持体として、フラクトゲル
(Ｆractogel) ＴＳＫ−ＡＦフェニルボロナートを使用
するのが好ましい。平衡化および洗浄バッファーとし
て、エタノールを含有する酢酸アンモニウムを使用する
のが好ましい。溶離は、ソルビトールを含有するトリス
(Ｔris)バッファーで行うのが好ましい。この方法で単
離した糖化アルブミンをリン酸バッファーに対して透析
させ、ＨＩＣ(疎水性相互作用クロマトグラフィー)に付
してさらに精製する。
【０００８】この方法で単離したin vivo糖化アルブミ
ンを免疫原として使用して、この目的のために一般に使
用される動物を免疫化する。マウスを使用するのが好ま
しい。
ンを免疫原として使用して、この目的のために一般に使
用される動物を免疫化する。マウスを使用するのが好ま
しい。
【０００９】免疫化した動物の脾臓細胞の不死化は、公
知の方法に従って、例えば、骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３−
Ａg８−６５３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０)のような骨
髄腫細胞との融合によって行われる。融合は、ガルフレ
(Ｇalfre)[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethod
s in Ｅnzymology)１７３、１９８１、３]によって開示
されている方法に従って行われるのが好ましい。
知の方法に従って、例えば、骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３−
Ａg８−６５３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０)のような骨
髄腫細胞との融合によって行われる。融合は、ガルフレ
(Ｇalfre)[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethod
s in Ｅnzymology)１７３、１９８１、３]によって開示
されている方法に従って行われるのが好ましい。
【００１０】該不死化細胞の培養上清を、慣用の方法に
よって、例えば、ＥＬＩＳＡ試験法によって、in vivo
糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンとの反応性につ
いて試験する。この試験で培養上清がin vivo糖化アル
ブミンと正反応するが、非糖化アルブミンとは全く反応
しないか、または非常にわずかしか反応しないこれらの
細胞を、通常の方法で、例えば、フルオレセンス励起セ
ルソーターによって単離し、次いで、クローン化する。
よって、例えば、ＥＬＩＳＡ試験法によって、in vivo
糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンとの反応性につ
いて試験する。この試験で培養上清がin vivo糖化アル
ブミンと正反応するが、非糖化アルブミンとは全く反応
しないか、または非常にわずかしか反応しないこれらの
細胞を、通常の方法で、例えば、フルオレセンス励起セ
ルソーターによって単離し、次いで、クローン化する。
【００１１】本発明は、好ましくは、前記方法によって
得ることができる、非糖化アルブミンと２５％未満、よ
り好ましくは１０％未満、特に好ましくは１％未満反応
するin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体を提供するものである。細胞系「ＭＡＫ ２.２１.１
１」または「ＭＡＫ ２.６.２８」によって生産されるモノ
クローナル抗体と同等にin vivo糖化アルブミンに結合
することができるこれらのモノクローナル抗体が特に好
ましく、特にこれらの細胞系から得ることのできるモノ
クローナル抗体である。
得ることができる、非糖化アルブミンと２５％未満、よ
り好ましくは１０％未満、特に好ましくは１％未満反応
するin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体を提供するものである。細胞系「ＭＡＫ ２.２１.１
１」または「ＭＡＫ ２.６.２８」によって生産されるモノ
クローナル抗体と同等にin vivo糖化アルブミンに結合
することができるこれらのモノクローナル抗体が特に好
ましく、特にこれらの細胞系から得ることのできるモノ
クローナル抗体である。
【００１２】「同等に結合できる抗体」なる用語は、所定
の既知の抗体とのエピトープ重複が検出可能である抗体
を示すと解される。このエピトープ重複は、競合試験系
の補助によって容易に測定することができる。この目的
のために、例えば、エンザイムイムノアッセイを使用し
て、抗体が所定の抗原または特定のエピトープへの結合
について公知の抗体と競合する程度を試験する。このた
めに、適当な抗原を標識形態の既知モノクローナル抗体
および過剰の検討中の抗体と一緒にインキュベートす
る。次に、形成される複合物を固定化させ、液相から固
体を分離し、次いで、２つの相のうちの一方において結
合標識を検出することによって、検討中の抗体が所定の
抗体を結合から追い出すことができる程度を容易に測定
することができる。１０5倍過剰で少なくとも５０％の
置換がある場合、エピトープ重複が存在する。
の既知の抗体とのエピトープ重複が検出可能である抗体
を示すと解される。このエピトープ重複は、競合試験系
の補助によって容易に測定することができる。この目的
のために、例えば、エンザイムイムノアッセイを使用し
て、抗体が所定の抗原または特定のエピトープへの結合
について公知の抗体と競合する程度を試験する。このた
めに、適当な抗原を標識形態の既知モノクローナル抗体
および過剰の検討中の抗体と一緒にインキュベートす
る。次に、形成される複合物を固定化させ、液相から固
体を分離し、次いで、２つの相のうちの一方において結
合標識を検出することによって、検討中の抗体が所定の
抗体を結合から追い出すことができる程度を容易に測定
することができる。１０5倍過剰で少なくとも５０％の
置換がある場合、エピトープ重複が存在する。
【００１３】本発明は、さらに、細胞系「ＭＡＫ ２.２
１.１１およびＭＡＫ ２.６.２８」を提供するものであ
る。
１.１１およびＭＡＫ ２.６.２８」を提供するものであ
る。
【００１４】さらに本発明は、イムノアフィニティクロ
マトグラフィーおよびボロナートクロマトグラフィーに
よって血清から精製したin vivo糖化アルブミンで免疫
化し、免疫化した動物の脾臓細胞を不死化させ、培養上
清が所望の糖化アルブミンに対する抗体を含有するこら
れ不死化細胞をクローン化することを特徴とする、本発
明のin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体の生産方法を提供するものである。
マトグラフィーおよびボロナートクロマトグラフィーに
よって血清から精製したin vivo糖化アルブミンで免疫
化し、免疫化した動物の脾臓細胞を不死化させ、培養上
清が所望の糖化アルブミンに対する抗体を含有するこら
れ不死化細胞をクローン化することを特徴とする、本発
明のin vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗
体の生産方法を提供するものである。
【００１５】驚くべきことに、前記方法で単離されたin
vivo糖化アルブミンが、非糖化アルブミンとの交差反
応性が低いin vivo糖化アルブミンに対するモノクロー
ナル抗体を得るために特に好適な免疫原であることが判
明した。
vivo糖化アルブミンが、非糖化アルブミンとの交差反
応性が低いin vivo糖化アルブミンに対するモノクロー
ナル抗体を得るために特に好適な免疫原であることが判
明した。
【００１６】したがって、本発明は、さらに、アルブミ
ンをイムノアフィニティクロマトグラフィーによって血
清から精製し、in vivo糖化アルブミンをボロナートク
ロマトグラフィーによって分離することを特徴とするin
vivo糖化アルブミンの精製方法を提供するものであ
る。
ンをイムノアフィニティクロマトグラフィーによって血
清から精製し、in vivo糖化アルブミンをボロナートク
ロマトグラフィーによって分離することを特徴とするin
vivo糖化アルブミンの精製方法を提供するものであ
る。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体は、in vivo
糖化アルブミンおよび非糖化アルブミン間での免疫学的
区別ができる。したがって、本発明のモノクローナル抗
体は、血清試料中のin vivo糖化アルブミンの診断検査
に好適である。
糖化アルブミンおよび非糖化アルブミン間での免疫学的
区別ができる。したがって、本発明のモノクローナル抗
体は、血清試料中のin vivo糖化アルブミンの診断検査
に好適である。
【００１８】したがって、本発明は、さらに、in vivo
糖化アルブミンの特異的測定のための免疫学的試験方法
において使用するための本発明のモノクローナル抗体を
提供するものである。
糖化アルブミンの特異的測定のための免疫学的試験方法
において使用するための本発明のモノクローナル抗体を
提供するものである。
【００１９】この測定は、ＥＬＩＳＡ蛍光イムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ、蛍光−偏光イムノアッセ
イ、ＣＥＤＩＡまたはＥＭＩＴのような全ての従来のイ
ムノアッセイによって行うことができる。該試験は、こ
の方法で、競合イムノアッセイによるような均質試験と
して、および不均質試験として行うことができる。該試
験は、反応相手のうちの一方を固定化して行われるのが
好ましい。
イ、ラジオイムノアッセイ、蛍光−偏光イムノアッセ
イ、ＣＥＤＩＡまたはＥＭＩＴのような全ての従来のイ
ムノアッセイによって行うことができる。該試験は、こ
の方法で、競合イムノアッセイによるような均質試験と
して、および不均質試験として行うことができる。該試
験は、反応相手のうちの一方を固定化して行われるのが
好ましい。
【００２０】したがって、本発明は、分析試料を抗体と
インキュベートし、形成された複合物を結合反応の前ま
たは後に固定化させ、次いで、慣用の方法で抗原に対す
る抗体の結合を測定することを特徴とする、in vivo糖
化アルブミンの特異的検出に使用するための本発明のモ
ノクローナル抗体を提供するものでもある。
インキュベートし、形成された複合物を結合反応の前ま
たは後に固定化させ、次いで、慣用の方法で抗原に対す
る抗体の結合を測定することを特徴とする、in vivo糖
化アルブミンの特異的検出に使用するための本発明のモ
ノクローナル抗体を提供するものでもある。
【００２１】分析試料からの糖化アルブミンに対する抗
体の結合の検出は、サンドイッチＥＬＩＳＡ試験で行わ
れるのが好ましい。このために、まず、マイクロタイタ
ープレートを血清アルブミンに対するポリクローナル抗
血清で被覆し、次いで、分析試料と一緒にインキュベー
トする。この方法で、糖化アルブミンおよび非糖化アル
ブミンを固定ポリクローナル抗血清に結合させる。次い
で、第１工程で固定化されたin vivo糖化アルブミンに
だけ結合する本発明のin vivo糖化アルブミンに対する
モノクローナル抗体と一緒にインキュベートする。次い
で、本発明の抗体を得た動物種由来のネズミＦｃγに対
する標識抗体によって、本発明の抗体の結合を検出す
る。別法としては、本発明の抗体は、直接標識化するこ
ともできる。標識化は、通常の方法で、例えば、酵素標
識、蛍光標識または化学発光標識によって行われる。
体の結合の検出は、サンドイッチＥＬＩＳＡ試験で行わ
れるのが好ましい。このために、まず、マイクロタイタ
ープレートを血清アルブミンに対するポリクローナル抗
血清で被覆し、次いで、分析試料と一緒にインキュベー
トする。この方法で、糖化アルブミンおよび非糖化アル
ブミンを固定ポリクローナル抗血清に結合させる。次い
で、第１工程で固定化されたin vivo糖化アルブミンに
だけ結合する本発明のin vivo糖化アルブミンに対する
モノクローナル抗体と一緒にインキュベートする。次い
で、本発明の抗体を得た動物種由来のネズミＦｃγに対
する標識抗体によって、本発明の抗体の結合を検出す
る。別法としては、本発明の抗体は、直接標識化するこ
ともできる。標識化は、通常の方法で、例えば、酵素標
識、蛍光標識または化学発光標識によって行われる。
【００２２】さらに、本発明は、少なくとも１つの本発
明のモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、
in vivo糖化アルブミンの免疫学的特異的測定方法を提
供するものである。この免疫学的方法は、特にサンドイ
ッチアッセイのような前記イムノアッセイ、競合試験ま
たは均質試験の全てに従って行うことができる。かかる
免疫学的方法では、分析試料を抗体と一緒にインキュベ
ートし、形成された複合物を結合反応の前または後に固
定化させ、次いで、抗原に対する抗体の結合を慣用の方
法で測定するのが好ましい。
明のモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、
in vivo糖化アルブミンの免疫学的特異的測定方法を提
供するものである。この免疫学的方法は、特にサンドイ
ッチアッセイのような前記イムノアッセイ、競合試験ま
たは均質試験の全てに従って行うことができる。かかる
免疫学的方法では、分析試料を抗体と一緒にインキュベ
ートし、形成された複合物を結合反応の前または後に固
定化させ、次いで、抗原に対する抗体の結合を慣用の方
法で測定するのが好ましい。
【００２３】本発明のin vivo糖化アルブミンに対する
モノクローナル抗体を生産する２つのハイブリドーマ細
胞系「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ ＡＣＣ ２０５２)」
および「ＭＡＫ ２.６.２８(ＤＳＭ ＡＣＣ ２０５３)」
は、１９９２年１０月２１日にドイツ連邦共和国デー−
３３ブラウンシュベイク、マチェロデルヴェーク１ベー
番の「ドイッチェ・ザームルンク・フュア・ゼールクル
トゥーレン・ウント・ミクロオルガニズメン・ゲゼルシ
ャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング」(Ｄeu
tsche Ｓammlung fuer Ｚellkulturen und Ｍikroorgan
ismen ＧmbＨ)に寄託された。
モノクローナル抗体を生産する２つのハイブリドーマ細
胞系「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ ＡＣＣ ２０５２)」
および「ＭＡＫ ２.６.２８(ＤＳＭ ＡＣＣ ２０５３)」
は、１９９２年１０月２１日にドイツ連邦共和国デー−
３３ブラウンシュベイク、マチェロデルヴェーク１ベー
番の「ドイッチェ・ザームルンク・フュア・ゼールクル
トゥーレン・ウント・ミクロオルガニズメン・ゲゼルシ
ャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング」(Ｄeu
tsche Ｓammlung fuer Ｚellkulturen und Ｍikroorgan
ismen ＧmbＨ)に寄託された。
【００２４】本発明を、以下の実施例によってさらに詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２５】
実施例１ ヒト血清からin vivo糖化アルブミンの単離
【００２６】１．硫酸アンモニウム沈殿 まず、最終濃度２.８５mol／リットルまで硫酸アンモニ
ウムを添加し、次いで、室温で１時間撹拌することによ
って、高フルクトサミン含量(４００〜５００μmol／リ
ットル)を有する糖尿病血清からイムノグロブリンフラ
クションを沈殿させる。沈殿物を１２０００×ｇで２０
分間遠心し、廃棄する。アルブミン含有上清をカリウム
バッファー(ｐＨ６.８)(５０mmol／リットル)／塩化ナ
トリウム(５０mmol／リットル)に対して透析する。次い
で、同一のバッファーを使用して蛋白濃度を１０mg／ml
に調節する。
ウムを添加し、次いで、室温で１時間撹拌することによ
って、高フルクトサミン含量(４００〜５００μmol／リ
ットル)を有する糖尿病血清からイムノグロブリンフラ
クションを沈殿させる。沈殿物を１２０００×ｇで２０
分間遠心し、廃棄する。アルブミン含有上清をカリウム
バッファー(ｐＨ６.８)(５０mmol／リットル)／塩化ナ
トリウム(５０mmol／リットル)に対して透析する。次い
で、同一のバッファーを使用して蛋白濃度を１０mg／ml
に調節する。
【００２７】２．イムノアフィニティクロマトグラフィ
ー ａ)免疫吸着剤の製造 製造者の指示に従って、ヒト血清アルブミンに対して特
異的であり、かつ、免疫吸着的に精製されたヒツジ由来
のポリクローナルイムノグロブリンＧフラクションをグ
ルタルジアルデヒド−活性アミノ−セフェロジル(Ｓeph
erosil)[シリケートを基剤とする支持体、ベーリンガー
・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンク
テル(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタログ番号第
６６５５２５号]に結合させる。得られた吸着剤は、吸
着剤１ml当たりヒト血清アルブミン約３mgの結合能を有
する。
ー ａ)免疫吸着剤の製造 製造者の指示に従って、ヒト血清アルブミンに対して特
異的であり、かつ、免疫吸着的に精製されたヒツジ由来
のポリクローナルイムノグロブリンＧフラクションをグ
ルタルジアルデヒド−活性アミノ−セフェロジル(Ｓeph
erosil)[シリケートを基剤とする支持体、ベーリンガー
・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンク
テル(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタログ番号第
６６５５２５号]に結合させる。得られた吸着剤は、吸
着剤１ml当たりヒト血清アルブミン約３mgの結合能を有
する。
【００２８】ｂ)免疫吸着 ２ａ)からの免疫吸着剤をリン酸カリウムバッファー(ｐ
Ｈ６.８)(５０mmol／リットル)／塩化ナトリウム(５０m
mol／リットル)で平衡化させる。次いで、１)からのア
ルブミンフラクションを室温で２時間以内に適用する。
次いで、非結合蛋白を５カラム容量のリン酸カリウムバ
ッファー(ｐＨ６.８)(２５０mmol／リットル)で洗浄す
る。
Ｈ６.８)(５０mmol／リットル)／塩化ナトリウム(５０m
mol／リットル)で平衡化させる。次いで、１)からのア
ルブミンフラクションを室温で２時間以内に適用する。
次いで、非結合蛋白を５カラム容量のリン酸カリウムバ
ッファー(ｐＨ６.８)(２５０mmol／リットル)で洗浄す
る。
【００２９】結合した全アルブミンを室温で２カラム容
量の０.１％ＨＣlで溶離し、次いで、酢酸アンモニウム
(ｐＨ８.５)(１mol／リットル)に対して透析する。
量の０.１％ＨＣlで溶離し、次いで、酢酸アンモニウム
(ｐＨ８.５)(１mol／リットル)に対して透析する。
【００３０】３．ボロナート・クロマトグラフィー フラクトゲル ＴＳＫ ＡＦ フェニルボロナート(Ｆract
ogel ＴＳＫ ＡＦ phenyl boronate)(メルク(Ｍerck))
上でクロマトグラフィーに付して、全アルブミンから糖
化アルブミンを分離する。クロマトグラフィー材は、５
％(ｖ／ｖ)エタノールを含有する酢酸アンモニウム(ｐ
Ｈ８.５)(１mol／リットル)で平衡化させる。
ogel ＴＳＫ ＡＦ phenyl boronate)(メルク(Ｍerck))
上でクロマトグラフィーに付して、全アルブミンから糖
化アルブミンを分離する。クロマトグラフィー材は、５
％(ｖ／ｖ)エタノールを含有する酢酸アンモニウム(ｐ
Ｈ８.５)(１mol／リットル)で平衡化させる。
【００３１】２ｂ)からの全アルブミンフラクションを
まずアミコンセル(Ａmicon cell)(ＹＭ１０膜)中でタン
パク１０mg／mlに濃縮し、エタノールを最終濃度５％
(ｖ／ｖ)まで添加し、得られた溶液を室温で２時間以内
にカラムに適用する。次いで、非結合タンパクを１時間
以内に４カラム容量の平衡バッファーで洗浄する。次い
で、結合した糖化アルブミンを室温で１時間以内に１〜
２カラム容量の溶離バッファー(トリス(１００mmol／リ
ットル)／ソルビトール(８００mmol／リットル)を含有
するＨＣl(ｐＨ８.５))で溶離し、次いで、リン酸カリ
ウムバッファー(ｐＨ７.９)(５０mmol／リットル)に対
して透析する。
まずアミコンセル(Ａmicon cell)(ＹＭ１０膜)中でタン
パク１０mg／mlに濃縮し、エタノールを最終濃度５％
(ｖ／ｖ)まで添加し、得られた溶液を室温で２時間以内
にカラムに適用する。次いで、非結合タンパクを１時間
以内に４カラム容量の平衡バッファーで洗浄する。次い
で、結合した糖化アルブミンを室温で１時間以内に１〜
２カラム容量の溶離バッファー(トリス(１００mmol／リ
ットル)／ソルビトール(８００mmol／リットル)を含有
するＨＣl(ｐＨ８.５))で溶離し、次いで、リン酸カリ
ウムバッファー(ｐＨ７.９)(５０mmol／リットル)に対
して透析する。
【００３２】４．ＨＩＣクロマトグラフィー フェニル−ＴＳＫ ５ ＰＷ カラム(１５０mm×２１.５m
m；トーソハース(Ｔosohaas)、カタログ番号第０７６５
６号)上でＨＰＬＣに付して、単離したin vivo糖化アル
ブミンを精製する。
m；トーソハース(Ｔosohaas)、カタログ番号第０７６５
６号)上でＨＰＬＣに付して、単離したin vivo糖化アル
ブミンを精製する。
【００３３】３からのボロナートカラムの溶出液をタン
パク約８mg／mlまで濃縮し、硫酸アンモニウムを最終濃
度１mol／リットルまで添加し、０.４５μmフィルター
上で濾過する。得られた溶液をＨＰＬＣの操作当たり最
大１ml注入する。
パク約８mg／mlまで濃縮し、硫酸アンモニウムを最終濃
度１mol／リットルまで添加し、０.４５μmフィルター
上で濾過する。得られた溶液をＨＰＬＣの操作当たり最
大１ml注入する。
【００３４】以下のバッファー勾配液を用いてＨＰＬＣ
を行う： ０〜 ２５分 Ａ １００％、Ｂ ０％ ２５〜 ３０分 Ｂ ４０％までの直線勾配液 ３０〜 ６０分 Ｂ １００％までの直線勾配液 ６０〜１３０分 Ｂ １００％ １３０〜１３５分 Ａ １００％、Ｂ ０％までの直線勾
配液
を行う： ０〜 ２５分 Ａ １００％、Ｂ ０％ ２５〜 ３０分 Ｂ ４０％までの直線勾配液 ３０〜 ６０分 Ｂ １００％までの直線勾配液 ６０〜１３０分 Ｂ １００％ １３０〜１３５分 Ａ １００％、Ｂ ０％までの直線勾
配液
【００３５】バッファーＡ：硫酸アンモニウム(１mol／
リットル)／リン酸カリウム(ｐＨ７.０)(５０mmol／リ
ットル) バッファーＢ：リン酸カリウムバッファー(ｐＨ７.０)
(５０mmol／リットル)
リットル)／リン酸カリウム(ｐＨ７.０)(５０mmol／リ
ットル) バッファーＢ：リン酸カリウムバッファー(ｐＨ７.０)
(５０mmol／リットル)
【００３６】室温で、流速５ml／分で分離を行う。
【００３７】溶出液をフラクションに回収し、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＨＡＳＴ Ｓystem Ｐ
harmacia)によると９９％を超える純度を有するこれら
のフラクションをプールする。次いで、これらのフラク
ションをリン酸カリウムバッファー(ｐＨ７.０)(１５mm
ol／リットル)／塩化ナトリウム(５０mmol／リットル)
に対して透析し、タンパク３〜５mg／mlに濃縮し、次い
で、−８０℃で貯蔵する。
リアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＨＡＳＴ Ｓystem Ｐ
harmacia)によると９９％を超える純度を有するこれら
のフラクションをプールする。次いで、これらのフラク
ションをリン酸カリウムバッファー(ｐＨ７.０)(１５mm
ol／リットル)／塩化ナトリウム(５０mmol／リットル)
に対して透析し、タンパク３〜５mg／mlに濃縮し、次い
で、−８０℃で貯蔵する。
【００３８】実施例２ in vivo糖化アルブミンに対するモノクローナル抗体の
生産
生産
【００３９】１．糖化アルブミンによるマウスの免疫化 １２週齢のＢalb／ｃマウスをフロイント完全アジュバ
ント(ＣＦＡ)中の糖化アルブミン(実施例１に従って単
離した)１００μgで腹腔内一次免疫化する。さらに、６
週間後、４週間毎に３回免疫化する。毎回、フロイント
不完全アジュバント(ＩＦＡ)中の糖化アルブミン１００
μgを腹腔内投与する。次いで、免疫化マウスの脾臓細
胞と骨髄腫細胞との融合の４日前および３日前に、さら
に２回、ＰＢＳ中の糖化アルブミン１００μgで静脈内
免疫化する。
ント(ＣＦＡ)中の糖化アルブミン(実施例１に従って単
離した)１００μgで腹腔内一次免疫化する。さらに、６
週間後、４週間毎に３回免疫化する。毎回、フロイント
不完全アジュバント(ＩＦＡ)中の糖化アルブミン１００
μgを腹腔内投与する。次いで、免疫化マウスの脾臓細
胞と骨髄腫細胞との融合の４日前および３日前に、さら
に２回、ＰＢＳ中の糖化アルブミン１００μgで静脈内
免疫化する。
【００４０】２．免疫化およびクローニング ガルフレ(Ｇalfre)、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー(Ｍethods in Ｅnzymology)７３、１９８１、３に従
って、前記１に従って免疫化されたマウスの脾臓細胞と
骨髄腫細胞とを融合させる。この方法では、免疫化マウ
スの脾臓細胞約１×１０8個を骨髄腫細胞(Ｐ３Ｘ６３−
Ａg８−６５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０)２×１０7個
と混合し、次いで、遠心する(３００×ｇおよび４℃で
１０分)。次いで、該細胞を無ウシ胎児血清(ＦＣＳ)Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄し、再度、５０mlのコ
ニカルチューブ中、４００×ｇで遠心する。上清をデカ
ントし、軽くたたいて細胞沈降物を徐々に弛ませ、これ
にＰＥＧ(分子量４０００、メルク(Ｍerck)、ダルムシ
ュタット)１mlを添加し、ピペッティングによって混合
する。１分後、３７℃で水浴中、ＦＣＳ不含ＲＰＭＩ
１６４０ ５mlを室温で４〜５分以内に滴下する。次い
で、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０ ５mlを約１分
以内に滴下し、混合し、培地(ＲＰＭＩ １６４０ ＋ １
０％ＦＣＳ)で５０mlまで充填し、次いで、４００×ｇ
および４℃で１０分間遠心する。沈降した細胞を１０％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地に取り、ヒポキサン
チン−アザセリン選択培地(１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ
１６４０中ヒポキサンチン(１００mmol／リットル)、ア
ザセリン(１μg／ml))中に接種する。該培地に成長因子
としてインターロイキン６(ベーリンガー・マンハイム
・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツ
ング(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタログ番号第
１２７１ １７２号、１００Ｕ／ml)を添加する。
ー(Ｍethods in Ｅnzymology)７３、１９８１、３に従
って、前記１に従って免疫化されたマウスの脾臓細胞と
骨髄腫細胞とを融合させる。この方法では、免疫化マウ
スの脾臓細胞約１×１０8個を骨髄腫細胞(Ｐ３Ｘ６３−
Ａg８−６５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０)２×１０7個
と混合し、次いで、遠心する(３００×ｇおよび４℃で
１０分)。次いで、該細胞を無ウシ胎児血清(ＦＣＳ)Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄し、再度、５０mlのコ
ニカルチューブ中、４００×ｇで遠心する。上清をデカ
ントし、軽くたたいて細胞沈降物を徐々に弛ませ、これ
にＰＥＧ(分子量４０００、メルク(Ｍerck)、ダルムシ
ュタット)１mlを添加し、ピペッティングによって混合
する。１分後、３７℃で水浴中、ＦＣＳ不含ＲＰＭＩ
１６４０ ５mlを室温で４〜５分以内に滴下する。次い
で、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０ ５mlを約１分
以内に滴下し、混合し、培地(ＲＰＭＩ １６４０ ＋ １
０％ＦＣＳ)で５０mlまで充填し、次いで、４００×ｇ
および４℃で１０分間遠心する。沈降した細胞を１０％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地に取り、ヒポキサン
チン−アザセリン選択培地(１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ
１６４０中ヒポキサンチン(１００mmol／リットル)、ア
ザセリン(１μg／ml))中に接種する。該培地に成長因子
としてインターロイキン６(ベーリンガー・マンハイム
・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツ
ング(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタログ番号第
１２７１ １７２号、１００Ｕ／ml)を添加する。
【００４１】融合の約１週間後、すでに多くのコロニー
が肉眼で見られる。一次培養物の上清をＥＬＩＳＡで試
験する(実施例３を参照)。糖化アルブミンに対する抗体
を生産する一次培養物を、フルオレセンス励起セルソー
ターによるヌンク・カンパニー(Ｎunc company)からの
９６ウエルのマイクロタイタープレート中で単一細胞沈
着によってクローン化する。次いで、クローニングのた
めに、該培地にインターロイキン６(１００単位／ml)を
添加する。
が肉眼で見られる。一次培養物の上清をＥＬＩＳＡで試
験する(実施例３を参照)。糖化アルブミンに対する抗体
を生産する一次培養物を、フルオレセンス励起セルソー
ターによるヌンク・カンパニー(Ｎunc company)からの
９６ウエルのマイクロタイタープレート中で単一細胞沈
着によってクローン化する。次いで、クローニングのた
めに、該培地にインターロイキン６(１００単位／ml)を
添加する。
【００４２】実施例３ 得られたモノクローナル抗体の特異性の測定 ＥＬＩＳＡ試験で、得られた抗体の特異性を測定する。
このために、マイクロタイタープレートのウエル当たり
１００μlの、ヒト血清アルブミンに対するヒツジ由来
の免疫吸着的に精製されたポリクローナル抗血清の溶液
(被覆バッファー(＝炭酸ナトリウム(０.２mol／リット
ル)／炭酸水素ナトリウム(ｐＨ９.３−９.５)中１０μg
／ml)を、まず、室温で１時間、振盪しつつインキュベ
ートし、次いで、０.９％塩化ナトリウム／０.０５％ト
ゥイーン(Ｔween)２０で３回洗浄した。次いで、室温で
３０分間、ウエル当たり２００μlの０.５％クロテイン
Ｃ(ＰＢＳ中)で再被覆することによって非特異的結合部
位を遮断する。
このために、マイクロタイタープレートのウエル当たり
１００μlの、ヒト血清アルブミンに対するヒツジ由来
の免疫吸着的に精製されたポリクローナル抗血清の溶液
(被覆バッファー(＝炭酸ナトリウム(０.２mol／リット
ル)／炭酸水素ナトリウム(ｐＨ９.３−９.５)中１０μg
／ml)を、まず、室温で１時間、振盪しつつインキュベ
ートし、次いで、０.９％塩化ナトリウム／０.０５％ト
ゥイーン(Ｔween)２０で３回洗浄した。次いで、室温で
３０分間、ウエル当たり２００μlの０.５％クロテイン
Ｃ(ＰＢＳ中)で再被覆することによって非特異的結合部
位を遮断する。
【００４３】この方法で調製されたマイクロタイタープ
レートにおいて、ウエル当たり１００μlの糖化アルブ
ミンのＰＢＳ中溶液(１μg／ml、実施例１に従って単
離)を添加し、振盪しつつ、室温で１時間インキュベー
トする。
レートにおいて、ウエル当たり１００μlの糖化アルブ
ミンのＰＢＳ中溶液(１μg／ml、実施例１に従って単
離)を添加し、振盪しつつ、室温で１時間インキュベー
トする。
【００４４】並行して、同様の方法で、対照混合物を非
糖化アルブミンの溶液１００μlで処理する。過ヨウ素
酸ナトリウム(酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ５.５)
(３０mmol／リットル)中２.５mmol／リットル)で糖残基
を酸化切断し(０℃で４５分間)、セファロース(Ｓephar
ose) Ｇ−２５上で過剰の過ヨウ素酸塩を除去し、次い
で、酸化で得られた反応性アルデヒド基をセミカルバジ
ドと反応させる(３０mmol／リットル酢酸ナトリウム／
炭酸ナトリウム(ｐＨ７.５)、２５℃で１時間インキュ
ベーション、次いで、リン酸カリウム(１５mmol／リッ
トル)／塩酸ナトリウム(ｐＨ７.５)(５０mmol／リット
ル)に対して透析する)ことによって、ヒト血清アルブミ
ン(ベーリンガー・ヴェルケ(Ｂoehringer Ｗerke)、カ
タログ番号第ＯＲＨＡ ２０／２１号)から非糖化アルブ
ミンを得る。
糖化アルブミンの溶液１００μlで処理する。過ヨウ素
酸ナトリウム(酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ５.５)
(３０mmol／リットル)中２.５mmol／リットル)で糖残基
を酸化切断し(０℃で４５分間)、セファロース(Ｓephar
ose) Ｇ−２５上で過剰の過ヨウ素酸塩を除去し、次い
で、酸化で得られた反応性アルデヒド基をセミカルバジ
ドと反応させる(３０mmol／リットル酢酸ナトリウム／
炭酸ナトリウム(ｐＨ７.５)、２５℃で１時間インキュ
ベーション、次いで、リン酸カリウム(１５mmol／リッ
トル)／塩酸ナトリウム(ｐＨ７.５)(５０mmol／リット
ル)に対して透析する)ことによって、ヒト血清アルブミ
ン(ベーリンガー・ヴェルケ(Ｂoehringer Ｗerke)、カ
タログ番号第ＯＲＨＡ ２０／２１号)から非糖化アルブ
ミンを得る。
【００４５】０.９％塩化ナトリウム／０.０５％トゥイ
ーン２０で３回洗浄した後、ウエル当たり１００μl
の、実施例２からの細胞培養上清を添加し、振盪しつ
つ、室温で１時間インキュベートする。次に、再度３回
洗浄し、次いで、ウエル当たり１００μlの、マウスの
Ｆｃγに対するヒツジ由来のペルオキシダーゼ標識ポリ
クローナル抗血清(免疫吸着的に精製した、２０mＵ／m
l)の添加によって、結合抗体を検出する。このために、
これを振盪しつつ、室温で１時間インキュベートし、次
いで、３回洗浄し、ウエル当たり１００μlのＡＢＴＳR
の添加によって、試験反応を開始する。室温で３０分
後、Ｄynatech ＥＬＩＳＡ reader ＭＲ７００で４０５
／４９０nmで測定を行う。
ーン２０で３回洗浄した後、ウエル当たり１００μl
の、実施例２からの細胞培養上清を添加し、振盪しつ
つ、室温で１時間インキュベートする。次に、再度３回
洗浄し、次いで、ウエル当たり１００μlの、マウスの
Ｆｃγに対するヒツジ由来のペルオキシダーゼ標識ポリ
クローナル抗血清(免疫吸着的に精製した、２０mＵ／m
l)の添加によって、結合抗体を検出する。このために、
これを振盪しつつ、室温で１時間インキュベートし、次
いで、３回洗浄し、ウエル当たり１００μlのＡＢＴＳR
の添加によって、試験反応を開始する。室温で３０分
後、Ｄynatech ＥＬＩＳＡ reader ＭＲ７００で４０５
／４９０nmで測定を行う。
【００４６】結果を下記「表１」に示す。各々の場合、ア
ルブミン分析物なしのインキュベーションで得られたブ
ランク値を括弧内に示す。
ルブミン分析物なしのインキュベーションで得られたブ
ランク値を括弧内に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】実施例４ 試料中の糖化アルブミンの量の測定 実施例３と同様のＥＬＩＳＡ試験法で、試料中の糖化ア
ルブミンの量を測定する。
ルブミンの量を測定する。
【００４９】実施例３の記載に従って調製したマイクロ
タイタープレートの各ウエルに測定されるべき試料１０
０μlを添加し、振盪しつつ、室温で１時間インキュベ
ートする。
タイタープレートの各ウエルに測定されるべき試料１０
０μlを添加し、振盪しつつ、室温で１時間インキュベ
ートする。
【００５０】０.９％塩化ナトリウム／０.０５％トゥイ
ーン２０で３回洗浄した後、ウエル当たり１００μl
の、糖化アルブミン(１または５μg／ml)に対する抗体
を添加し、室温で１時間インキュベートする。次に、再
度、３回洗浄し、次いで、ウエル当たり１００μlの、
マウスのＦｃγに対するヒツジ由来のペルオキシダーゼ
標識ポリクローナル抗血清(免疫吸着的に精製した、２
０mＵ／ml)を添加することによって、結合抗体を検出す
る。このために、これを振盪しつつ、室温で１時間イン
キュベートし、次いで、再度、３回洗浄し、ウエル当た
り１００μlのＡＢＴＳRを添加することによって、試験
反応を開始する。室温で３０分後、Ｄynatech ＥＬＩＳ
Ａ reader ＭＲ７００中で４０５／４９０nmで測定を行
う。分析試料中の糖化アルブミンの量は、既知量の糖化
アルブミンを添加した場合に得られる吸光度と比較する
ことによって決定することができる。
ーン２０で３回洗浄した後、ウエル当たり１００μl
の、糖化アルブミン(１または５μg／ml)に対する抗体
を添加し、室温で１時間インキュベートする。次に、再
度、３回洗浄し、次いで、ウエル当たり１００μlの、
マウスのＦｃγに対するヒツジ由来のペルオキシダーゼ
標識ポリクローナル抗血清(免疫吸着的に精製した、２
０mＵ／ml)を添加することによって、結合抗体を検出す
る。このために、これを振盪しつつ、室温で１時間イン
キュベートし、次いで、再度、３回洗浄し、ウエル当た
り１００μlのＡＢＴＳRを添加することによって、試験
反応を開始する。室温で３０分後、Ｄynatech ＥＬＩＳ
Ａ reader ＭＲ７００中で４０５／４９０nmで測定を行
う。分析試料中の糖化アルブミンの量は、既知量の糖化
アルブミンを添加した場合に得られる吸光度と比較する
ことによって決定することができる。
【００５１】実施例５ 糖化アルブミンに対する抗体のエピトープ重複の測定 競合エンザイムイムノアッセイを行って、抗体の、モノ
クローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ ＡＣＣ
２０５２)」とのエピトープ重複を検出する。このため
に、まず、製造者の指示に従って、Ｄ−ビオチニル−ε
−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannh
eim)、カタログ番号第１００８９６０号)で、実施例１
に従って単離した糖化アルブミンをビオチニル化する。
ＰＢＳ １００μl中、このビオチニル化抗体３００ngを
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート(Ｅ
Ｐ−Ａ ０ ３４４ ５７８に従って製造した)に、室温で
１時間インキュベートすることによって結合させる。Ｐ
ＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で４回洗浄した後、ペ
ルオキシダーゼ(最終濃度２５０mＵ／ml)で標識化した
モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」と一緒に、
および評価されるべき抗体と一緒に同時にインキュベー
トする。ＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で再度４回
洗浄した後、室温で３０分間、過ホウ酸ナトリウム含有
バッファー中で、酵素基質溶液ＡＢＴＳR(ベーリンガー・マンハイム
・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍannheim
ＧmbＨ)、カタログ番号第６８７２５１号および第６８
７３５９号)と一緒にインキュベートし、次いで、結合
ＰＯＤ標識モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」
の量の指標として、４０５nmでの吸光度を測定する。こ
の値を、モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」単
独とのインキュベーションで得られた吸光度と比較す
る。少なくとも５０％の競合がモノクローナル抗体「Ｍ
ＡＫ ２.２１.１１」酵素コンジュゲート(２５０mＵ／m
l)と比較して１０5倍過剰までの評価されるべき抗体を
検出することができる場合、エピトープ重複は存在す
る。
クローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ ＡＣＣ
２０５２)」とのエピトープ重複を検出する。このため
に、まず、製造者の指示に従って、Ｄ−ビオチニル−ε
−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannh
eim)、カタログ番号第１００８９６０号)で、実施例１
に従って単離した糖化アルブミンをビオチニル化する。
ＰＢＳ １００μl中、このビオチニル化抗体３００ngを
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート(Ｅ
Ｐ−Ａ ０ ３４４ ５７８に従って製造した)に、室温で
１時間インキュベートすることによって結合させる。Ｐ
ＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で４回洗浄した後、ペ
ルオキシダーゼ(最終濃度２５０mＵ／ml)で標識化した
モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」と一緒に、
および評価されるべき抗体と一緒に同時にインキュベー
トする。ＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で再度４回
洗浄した後、室温で３０分間、過ホウ酸ナトリウム含有
バッファー中で、酵素基質溶液ＡＢＴＳR(ベーリンガー・マンハイム
・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍannheim
ＧmbＨ)、カタログ番号第６８７２５１号および第６８
７３５９号)と一緒にインキュベートし、次いで、結合
ＰＯＤ標識モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」
の量の指標として、４０５nmでの吸光度を測定する。こ
の値を、モノクローナル抗体「ＭＡＫ ２.２１.１１」単
独とのインキュベーションで得られた吸光度と比較す
る。少なくとも５０％の競合がモノクローナル抗体「Ｍ
ＡＫ ２.２１.１１」酵素コンジュゲート(２５０mＵ／m
l)と比較して１０5倍過剰までの評価されるべき抗体を
検出することができる場合、エピトープ重複は存在す
る。
【００５２】
【発明の効果】本発明によると、非糖化アルブミンと３
０％未満反応するin vivo糖化アルブミンに対するモノ
クローナル抗体を得ることができ、このモノクローナル
抗体によって、in vivo糖化アルブミンおよび非糖化ア
ルブミン間の区別を可能にすることができる。
０％未満反応するin vivo糖化アルブミンに対するモノ
クローナル抗体を得ることができ、このモノクローナル
抗体によって、in vivo糖化アルブミンおよび非糖化ア
ルブミン間の区別を可能にすることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ライナー・シュリプフェンバッヒャー ドイツ連邦共和国デー−67098バート・デ ュルクハイム、シェンケンベールシュトラ ーセ９番 (72)発明者 クラウス・ハレルマイヤー ドイツ連邦共和国デー−80339ミュンヘン、 バルトシュトラーセ31番 (72)発明者 ウルリッヒ・エシッヒ ドイツ連邦共和国デー−82152プラネッヒ、 ヨーゼフ−フォン−ヒルシュ−シュトラー セ51番 (72)発明者 クリスタ・ヒュブナー・パライツ ドイツ連邦共和国デー−82327トゥートツ ィング、マリーンシュトラーセ11番
Claims (14)
- 【請求項１】 イムノアフィニティクロマトグラフィー
およびボロナートクロマトグラフィーによって血清から
精製したin vivo糖化アルブミンで免疫化し、免疫化し
た動物の脾臓細胞を不死化させ、次いで、培養上清が所
望の糖化アルブミンに対する抗体を含有するこれら不死
化細胞をクローン化することによって得ることのでき
る、非糖化アルブミンと３０％未満反応するin vivo糖
化アルブミンに対するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 非糖化アルブミンと２５％未満反応する
請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 非糖化アルブミンと１０％未満反応する
請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 非糖化アルブミンと１％未満反応する請
求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 細胞系「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ Ａ
ＣＣ ２０５２)」または「ＭＡＫ ２.６.２８(ＤＳＭ Ａ
ＣＣ ２０５３)」によって生産されるモノクローナル抗
体と同等に糖化アルブミンに結合することができる請求
項１〜４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 細胞系「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＭＳ Ａ
ＣＣ ２０５２)」または「ＭＡＫ ２.６.２８(ＤＳＭ Ａ
ＣＣ ２０５３)」から得ることのできる請求項１〜５の
いずれか１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 細胞系「ＭＡＫ ２.２１.１１(ＤＳＭ Ａ
ＣＣ ２０５２)」。 - 【請求項８】 細胞系「ＭＡＫ ２.６.２８(ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ ２０５３)」。 - 【請求項９】 イムノアフィニティクロマトグラフィー
およびボロナートクロマトグラフィーによって血清から
精製したin vivo糖化アルブミンで免疫化し、免疫化し
た動物の脾臓細胞を不死化させ、培養上清が所望の糖化
アルブミンに対する抗体を含有するこれら不死化細胞を
クローン化することを特徴とする請求項１〜６のいずれ
か１項記載のモノクローナル抗体の生産方法。 - 【請求項１０】 イムノアフィニティクロマトグラフィ
ーによってアルブミンを血清から精製し、ボロナートク
ロマトグラフィーによってin vivo糖化アルブミンを分
離することを特徴とするin vivo糖化アルブミンの精製
方法。 - 【請求項１１】 in vivo糖化アルブミンの特異的測定
のための免疫学的検出方法において使用するための、請
求項１〜６のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１２】 分析試料を抗体と一緒にインキュベー
トし、形成された複合物を結合反応の前または後に固定
化させ、次いで、慣用の方法で抗原に対する抗体の結合
を測定することを特徴とするin vivo糖化アルブミンの
特異的検出に使用するための、請求項１〜６のいずれか
１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 請求項１〜６のいずれか１項記載の少
なくとも１つのモノクローナル抗体を使用することを特
徴とする、in vivo糖化アルブミンの免疫学的特異的測
定方法。 - 【請求項１４】 分析試料を抗体と一緒にインキュベー
トし、形成された複合物を結合反応の前または後に固定
化させ、抗原に対する抗体の結合を慣用の方法で測定す
る、請求項１３記載の免疫学的特異的測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4308532-6 | 1993-03-17 | ||
| DE19934308532 DE4308532A1 (de) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | Monoklonale Antikörper gegen in vivo glykiertes Albumin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319586A true JPH06319586A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=6483059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6045471A Pending JPH06319586A (ja) | 1993-03-17 | 1994-03-16 | イン・ビボ糖化アルブミンに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0657470A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06319586A (ja) |
| DE (1) | DE4308532A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19749277C2 (de) * | 1997-11-07 | 2000-05-25 | Univ Leipzig | Peptid der Sequenz NH¶2¶-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH und seine Verwendung |
| GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| EP3726215A4 (en) | 2017-12-12 | 2022-01-19 | DxGen Corp. | SILICA NANOPARTICLES FOR DIAGNOSIS BY BIOMARKERS AND PROCESS FOR THEIR PRODUCTION |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4797473A (en) * | 1986-06-25 | 1989-01-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically-glycated proteins |
| ES2046187T3 (es) * | 1986-08-22 | 1994-02-01 | Miles Inc | Anticuerpos para uso en la determinacion de la glucoalbumina humana. |
| US5223392A (en) * | 1988-01-25 | 1993-06-29 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies against glycated albumin, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore |
-
1993
- 1993-03-17 DE DE19934308532 patent/DE4308532A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-03-10 EP EP94103647A patent/EP0657470A3/de not_active Withdrawn
- 1994-03-16 JP JP6045471A patent/JPH06319586A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4308532A1 (de) | 1994-09-22 |
| EP0657470A2 (de) | 1995-06-14 |
| EP0657470A3 (de) | 1997-12-10 |
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