JP3397066B2 - 免疫学的測定方法を用いたアポ蛋白ｅフェノタイプの同定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法を用いたアポ蛋白ｅフェノタイプの同定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アポ蛋白Ｅフェノ
タイプの同定方法に関するものである。
タイプの同定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アポ蛋白Ｅは、１９７３年にＳｈｏｒｅ
によって同定された分子量３４０００の血清蛋白で、血
中の数種の脂質と結合してリポ蛋白を形勢し、主として
中性脂肪に富むリポ蛋白の運搬、代謝に寄与しているア
ポ蛋白の一つである。アポ蛋白Ｅは主にリポ蛋白受容体
への認識蛋白として機能しており、低比重リポ蛋白（以
下本明細書中では、ＬＤＬと記載する）受容体に対して
親和性を有することから、血漿脂質代謝において重要な
役割を担っている。
によって同定された分子量３４０００の血清蛋白で、血
中の数種の脂質と結合してリポ蛋白を形勢し、主として
中性脂肪に富むリポ蛋白の運搬、代謝に寄与しているア
ポ蛋白の一つである。アポ蛋白Ｅは主にリポ蛋白受容体
への認識蛋白として機能しており、低比重リポ蛋白（以
下本明細書中では、ＬＤＬと記載する）受容体に対して
親和性を有することから、血漿脂質代謝において重要な
役割を担っている。
【０００３】アポ蛋白Ｅには、その荷電の違いによっ
て、主としてアポ蛋白Ｅ２（以下、本明細書中ではＥ２
と記載する）、アポ蛋白Ｅ３（以下、本明細書中ではＥ
３と記載する）、アポ蛋白Ｅ４（以下、本明細書中では
Ｅ４と記載する）等のアイソタイプがある。これらのア
イソタイプは、それぞれε２、ε３、ε４と呼ばれる対
立遺伝子によって合成され、合成された蛋白をイソマー
と言う。このようにアポ蛋白Ｅは主として３種類の遺伝
子が対になって合成されるため、これらの対立遺伝子の
組み合わせによって発現されるアポ蛋白Ｅのイソマーに
は、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／
４及びＥ４／４の６種類のフェノタイプが存在する。す
なわち、Ｅ２／２、Ｅ３／３及びＥ４／４がホモタイ
プ、Ｅ２／３、Ｅ２／４及びＥ３／４がヘテロタイプで
ある。
て、主としてアポ蛋白Ｅ２（以下、本明細書中ではＥ２
と記載する）、アポ蛋白Ｅ３（以下、本明細書中ではＥ
３と記載する）、アポ蛋白Ｅ４（以下、本明細書中では
Ｅ４と記載する）等のアイソタイプがある。これらのア
イソタイプは、それぞれε２、ε３、ε４と呼ばれる対
立遺伝子によって合成され、合成された蛋白をイソマー
と言う。このようにアポ蛋白Ｅは主として３種類の遺伝
子が対になって合成されるため、これらの対立遺伝子の
組み合わせによって発現されるアポ蛋白Ｅのイソマーに
は、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／
４及びＥ４／４の６種類のフェノタイプが存在する。す
なわち、Ｅ２／２、Ｅ３／３及びＥ４／４がホモタイ
プ、Ｅ２／３、Ｅ２／４及びＥ３／４がヘテロタイプで
ある。
【０００４】Ｅ２、Ｅ３及びＥ４のアイソタイプは、１
１２番目のアミノ酸配列が、Ｅ２及びＥ３はシステイ
ン、Ｅ４はアルギニン、１５８番目のアミノ酸配列がＥ
２はシステイン、Ｅ３及びＥ４はアルギニンである点で
構造を異にし、野性型はＥ３である。各アイソタイプの
発現頻度は、Ｅ２が約５％、Ｅ３が約８５％、Ｅ４が約
１０％である。
１２番目のアミノ酸配列が、Ｅ２及びＥ３はシステイ
ン、Ｅ４はアルギニン、１５８番目のアミノ酸配列がＥ
２はシステイン、Ｅ３及びＥ４はアルギニンである点で
構造を異にし、野性型はＥ３である。各アイソタイプの
発現頻度は、Ｅ２が約５％、Ｅ３が約８５％、Ｅ４が約
１０％である。
【０００５】アポ蛋白ＥのアイソタイプのうちＥ２は、
ＬＤＬ受容体への親和性を有しないため、Ｅ２／２のホ
モタイプではＩＩＩ型高脂血症を示す確率が高いことが
知られている。
ＬＤＬ受容体への親和性を有しないため、Ｅ２／２のホ
モタイプではＩＩＩ型高脂血症を示す確率が高いことが
知られている。
【０００６】また、アポ蛋白ＥのアイソタイプのうちＥ
４は、近年になってアルツハイマー病との関連性が見い
だされ（Proc. Natl. Acad. Sci., 90, p1977-1981, (1
993)）、アルツハイマー病発症のハイリスクグループの
指標として研究が進められている。
４は、近年になってアルツハイマー病との関連性が見い
だされ（Proc. Natl. Acad. Sci., 90, p1977-1981, (1
993)）、アルツハイマー病発症のハイリスクグループの
指標として研究が進められている。
【０００７】このように、アポ蛋白Ｅのフェノタイプを
同定することは、医療の分野で多くの情報を与えること
になる。しかしながら、これらアポ蛋白Ｅのフェノタイ
プの同定には、等電点電気泳動法や遺伝子解析等の手法
が用いられており、高度に熟練した技術を必要とし、解
析には長時間を要する。また、アポ蛋白Ｅは、そのフェ
ノタイプ以外にも、各イソマーの血中濃度の多少自体が
病態と関係する可能性についても問われているが、等電
点電気泳動法や遺伝子解析手法では、アポ蛋白Ｅの量や
濃度を測定することはできなかった。
同定することは、医療の分野で多くの情報を与えること
になる。しかしながら、これらアポ蛋白Ｅのフェノタイ
プの同定には、等電点電気泳動法や遺伝子解析等の手法
が用いられており、高度に熟練した技術を必要とし、解
析には長時間を要する。また、アポ蛋白Ｅは、そのフェ
ノタイプ以外にも、各イソマーの血中濃度の多少自体が
病態と関係する可能性についても問われているが、等電
点電気泳動法や遺伝子解析手法では、アポ蛋白Ｅの量や
濃度を測定することはできなかった。
【０００８】一方、１９９５年にはＥ４に特異的なモノ
クローナル抗体が開発され、ＥＬＩＳＡ法によるＥ４測
定の可能性が示唆された（Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 216, p467-472, (1995) ）が、この手法はそれぞ
れの検体をマイクロプレートに感作する方法であり、実
際に検体を多数測定することはできなかった。
クローナル抗体が開発され、ＥＬＩＳＡ法によるＥ４測
定の可能性が示唆された（Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 216, p467-472, (1995) ）が、この手法はそれぞ
れの検体をマイクロプレートに感作する方法であり、実
際に検体を多数測定することはできなかった。
【０００９】よって、アポ蛋白Ｅのフェノタイプ同定及
びイソマー測定に適用できるさらに簡便な手法が望まれ
ていた。
びイソマー測定に適用できるさらに簡便な手法が望まれ
ていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便迅速なアポ蛋白Ｅフェノタイプの同定方法を提
供することである。
は、簡便迅速なアポ蛋白Ｅフェノタイプの同定方法を提
供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、抗アポ蛋白Ｅ抗体と
アポ蛋白Ｅイソマー特異的抗体とを組み合わせた免疫測
定方法により、アポ蛋白Ｅフェノタイプの同定を行える
ことを見い出して、本発明を完成した。
題を解決すべく鋭意研究した結果、抗アポ蛋白Ｅ抗体と
アポ蛋白Ｅイソマー特異的抗体とを組み合わせた免疫測
定方法により、アポ蛋白Ｅフェノタイプの同定を行える
ことを見い出して、本発明を完成した。
【００１２】すなわち、本発明は、抗アポ蛋白Ｅ抗体を
固相化し、抗アポ蛋白Ｅ抗体又は抗アポ蛋白Ｅイソマー
特異的抗体を液相に用いるサンドイッチ測定による免疫
学的測定方法を用いてアポ蛋白Ｅ量及びアポ蛋白Ｅイソ
マー量をそれぞれ測定し、アポ蛋白Ｅ量とアポ蛋白Ｅイ
ソマー量の比を算出することを特徴とするアポ蛋白Ｅフ
ェノタイプの同定方法を提供する。
固相化し、抗アポ蛋白Ｅ抗体又は抗アポ蛋白Ｅイソマー
特異的抗体を液相に用いるサンドイッチ測定による免疫
学的測定方法を用いてアポ蛋白Ｅ量及びアポ蛋白Ｅイソ
マー量をそれぞれ測定し、アポ蛋白Ｅ量とアポ蛋白Ｅイ
ソマー量の比を算出することを特徴とするアポ蛋白Ｅフ
ェノタイプの同定方法を提供する。
【００１３】本発明の測定方法を用いれば、簡便な免疫
測定方法によって、アポ蛋白Ｅのフェノタイプの同定を
行うことができる。
測定方法によって、アポ蛋白Ｅのフェノタイプの同定を
行うことができる。
【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】本発明において、免疫学的測定方法は、サ
ンドイッチ法により行われ、サンドイッチ法であれば抗
原抗体反応を用いるいずれの測定方法でもよく、ラジオ
イムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光抗体
方等公知の手法を適宜用いることができるが、これらに
限定されるものではない。
ンドイッチ法により行われ、サンドイッチ法であれば抗
原抗体反応を用いるいずれの測定方法でもよく、ラジオ
イムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光抗体
方等公知の手法を適宜用いることができるが、これらに
限定されるものではない。
【００１６】本発明の免疫学的測定方法に用いる抗体
は、アポ蛋白Ｅを認識する抗体及び各アポ蛋白Ｅのイソ
マーを特異的に認識する抗体を挙げることができる。こ
れらの抗体の作製に関しては、抗アポ蛋白Ｅ抗体を作製
するには免疫原にアポ蛋白Ｅ又は各アイソタイプの共通
アミノ酸配列部分を、各イソマー特異的抗体を作製する
には免疫原にそれぞれのイソマーに特有のアミノ酸配列
部分を用いると良い。具体的には、Ｅ２は、アミノ酸番
号１５８番目のシステインが、Ｅ４はアミノ酸番号１１
２のアルギニンが特有の配列となるので、この部分を含
むペプチドを免疫原とすることが望ましい。Ｅ３はアミ
ノ酸番号１１２部分のペプチドを免疫原とするとＥ２
と、アミノ酸番号１５８部分のペプチドを免疫原とする
とＥ４と同じ特異性になってしまうので、Ｅ３の構造全
体を免疫原として用いるのが好ましい。尚、Ｅ３の測定
に当たっては、Ｅ３特異抗体を用いずに、抗アポ蛋白Ｅ
抗体、抗Ｅ２抗体及び抗Ｅ４抗体を用いて免疫学的測定
方法を行い、アポ蛋白Ｅ全量からＥ２及びＥ４量を差し
引いた結果を、Ｅ３量として用いることもできる。
は、アポ蛋白Ｅを認識する抗体及び各アポ蛋白Ｅのイソ
マーを特異的に認識する抗体を挙げることができる。こ
れらの抗体の作製に関しては、抗アポ蛋白Ｅ抗体を作製
するには免疫原にアポ蛋白Ｅ又は各アイソタイプの共通
アミノ酸配列部分を、各イソマー特異的抗体を作製する
には免疫原にそれぞれのイソマーに特有のアミノ酸配列
部分を用いると良い。具体的には、Ｅ２は、アミノ酸番
号１５８番目のシステインが、Ｅ４はアミノ酸番号１１
２のアルギニンが特有の配列となるので、この部分を含
むペプチドを免疫原とすることが望ましい。Ｅ３はアミ
ノ酸番号１１２部分のペプチドを免疫原とするとＥ２
と、アミノ酸番号１５８部分のペプチドを免疫原とする
とＥ４と同じ特異性になってしまうので、Ｅ３の構造全
体を免疫原として用いるのが好ましい。尚、Ｅ３の測定
に当たっては、Ｅ３特異抗体を用いずに、抗アポ蛋白Ｅ
抗体、抗Ｅ２抗体及び抗Ｅ４抗体を用いて免疫学的測定
方法を行い、アポ蛋白Ｅ全量からＥ２及びＥ４量を差し
引いた結果を、Ｅ３量として用いることもできる。
【００１７】尚、本願発明の抗体は、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体のどちらにも限定されるもので
はない。モノクローナル抗体を作製する場合は、ケーラ
ーとミルシュタイン（Nature 256 495 1975 ）、シェー
ラー（Nature 285 446 1980）等公知の手法を適宜用い
ることができる。またモノクローナル抗体の精製には、
塩折、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィー等の各種分析・精製手段を用いることがで
きる。
体、モノクローナル抗体のどちらにも限定されるもので
はない。モノクローナル抗体を作製する場合は、ケーラ
ーとミルシュタイン（Nature 256 495 1975 ）、シェー
ラー（Nature 285 446 1980）等公知の手法を適宜用い
ることができる。またモノクローナル抗体の精製には、
塩折、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィー等の各種分析・精製手段を用いることがで
きる。
【００１８】これらの抗体を用いてアポ蛋白Ｅフェノタ
イプの同定を行うには、検体中のアポ蛋白Ｅ量及び各ア
ポ蛋白Ｅイソマー量を測定し、アポ蛋白Ｅ量とアポ蛋白
Ｅイソマー量との比を算出する。アポ蛋白Ｅイソマー量
／アポ蛋白Ｅ量の値が、ほぼ１であればホモタイプ、ほ
ぼ０．５であればヘテロタイプ、ほぼ０であれば別のフ
ェノタイプである。
イプの同定を行うには、検体中のアポ蛋白Ｅ量及び各ア
ポ蛋白Ｅイソマー量を測定し、アポ蛋白Ｅ量とアポ蛋白
Ｅイソマー量との比を算出する。アポ蛋白Ｅイソマー量
／アポ蛋白Ｅ量の値が、ほぼ１であればホモタイプ、ほ
ぼ０．５であればヘテロタイプ、ほぼ０であれば別のフ
ェノタイプである。
【００１９】本発明の方法では、抗アポ蛋白Ｅ抗体を固
相化し、抗アポ蛋白Ｅ抗体又は抗アポ蛋白Ｅイソマー特
異的抗体を液相に用いるサンドイッチ測定により免疫測
定を行う。この場合、抗アポ蛋白Ｅ抗体を液相として用
いればアポ蛋白Ｅ量を、各イソマー特異的抗体を液相と
して用いればアポ蛋白Ｅの各イソマー量を、同一の測定
手法で行うことができる。
相化し、抗アポ蛋白Ｅ抗体又は抗アポ蛋白Ｅイソマー特
異的抗体を液相に用いるサンドイッチ測定により免疫測
定を行う。この場合、抗アポ蛋白Ｅ抗体を液相として用
いればアポ蛋白Ｅ量を、各イソマー特異的抗体を液相と
して用いればアポ蛋白Ｅの各イソマー量を、同一の測定
手法で行うことができる。
【００２０】アポ蛋白Ｅの同定及び測定を行うには、本
発明が特に有用である。
発明が特に有用である。
【００２１】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２２】実施例１ 抗ＡｐｏＥモノクロナール抗体
の作製 抗アポＥモノクロナール抗体を、血清由来の超低比重リ
ポ蛋白（以下、本明細書中ではＶＬＤＬと記載する）を
免疫原として、常法に従いＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し
作製した。すなわち、フロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したＶＬＤＬ２５〜１００μｇでＢＡＬＢ
／Ｃマウスに初回免疫を行い、２〜３週間後、フロイン
ト不完全アジュバントでエマルジョン化したＶＬＤＬ２
５〜１００μｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確
認後、遊離のＶＬＤＬ２５〜１００μｇを静脈内に投与
し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞
を調製した。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し
ていたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を
１：２〜１：５の比率で混合し、ポリエチレングリコー
ル（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合
した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プ
レートに分注し３７℃二酸化炭素インキュベーターで培
養した。
の作製 抗アポＥモノクロナール抗体を、血清由来の超低比重リ
ポ蛋白（以下、本明細書中ではＶＬＤＬと記載する）を
免疫原として、常法に従いＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し
作製した。すなわち、フロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したＶＬＤＬ２５〜１００μｇでＢＡＬＢ
／Ｃマウスに初回免疫を行い、２〜３週間後、フロイン
ト不完全アジュバントでエマルジョン化したＶＬＤＬ２
５〜１００μｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確
認後、遊離のＶＬＤＬ２５〜１００μｇを静脈内に投与
し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞
を調製した。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し
ていたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を
１：２〜１：５の比率で混合し、ポリエチレングリコー
ル（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合
した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プ
レートに分注し３７℃二酸化炭素インキュベーターで培
養した。
【００２３】モノクローナル抗体のスクリーニングは固
相化ＥＬＩＳＡで行った。すなわち、リコンビナントＥ
３（和光純薬社製）を９６ウエルＥＬＩＳＡプレート
（ファルマシア社製）に１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ
／ウエル分注し、４℃一晩放置することにより吸着させ
る。ウエルを１％牛血清アルブミン（以下、本明細書中
ではＢＳＡと記載する）でブロッキングした後、洗浄緩
衝液として０．０５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝液
（以下本明細書中では、洗浄緩衝液と記載する）を用い
て３回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５
０μｌを加え、３７℃１時間反応させた。洗浄緩衝液で
３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
（ダコ社製）を加え、さらに３７℃１時間反応させた。
洗浄緩衝液で４回洗浄後、基質としてＡＢＴＳを用い発
色の見られるウエルを選択した。こうして得た抗アポ蛋
白Ｅ抗体２種をＬＺ１２、ＬＺ１８と命名した。ＬＺ１
２、ＬＺ１８は、ネイティブアポＥを用いたウエスタン
ブロッテングにおいて、ネイティブアポ蛋白Ｅに相当す
る分子量の位置にバンドを確認した。
相化ＥＬＩＳＡで行った。すなわち、リコンビナントＥ
３（和光純薬社製）を９６ウエルＥＬＩＳＡプレート
（ファルマシア社製）に１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ
／ウエル分注し、４℃一晩放置することにより吸着させ
る。ウエルを１％牛血清アルブミン（以下、本明細書中
ではＢＳＡと記載する）でブロッキングした後、洗浄緩
衝液として０．０５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝液
（以下本明細書中では、洗浄緩衝液と記載する）を用い
て３回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５
０μｌを加え、３７℃１時間反応させた。洗浄緩衝液で
３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
（ダコ社製）を加え、さらに３７℃１時間反応させた。
洗浄緩衝液で４回洗浄後、基質としてＡＢＴＳを用い発
色の見られるウエルを選択した。こうして得た抗アポ蛋
白Ｅ抗体２種をＬＺ１２、ＬＺ１８と命名した。ＬＺ１
２、ＬＺ１８は、ネイティブアポＥを用いたウエスタン
ブロッテングにおいて、ネイティブアポ蛋白Ｅに相当す
る分子量の位置にバンドを確認した。
【００２４】実施例２ 抗Ｅ４モノクローナル抗体の作
製 抗Ｅ４モノクロナール抗体は、ＮＵＫＩＮＡらにより作
製されたモノクロナール抗体Ａｐ４１２−１−７を用い
た(Biochem. Biophys. Res. Commum. Vol.216,p467, (1
995) ）。モノクロナール抗体Ａｐ４１２−１−７の免
疫原としては、Ｅ４イソマー特異的な配列であるアミノ
酸番号１０６−１１６部分（Ala-Asp-Met-Glu-Asp-Val-
Arg-Gly-Arg-Leu-Val ）のＮ末にシステインを加えたペ
プチドを固相合成法（合成機）にて合成し、架橋剤とし
てマレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロサクシイミドを
用いて、Ｎ末のシステインとKeyhole limpet hemocya
nin （以下本明細書中では、ＫＬＨと記載する）とを結
合して作製した。結合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫
し、抗体価の上昇をみて細胞融合を行った。免疫、細胞
融合は実施例１と同様の方法で行った。スクリーニング
は、実施例１と同様の方法で、リコンビナントＥ４（和
光純薬社製）を固相化したＥＬＩＳＡを用いて行い、モ
ノクローナル抗体Ａｐ４１２−１−７を確立した。
製 抗Ｅ４モノクロナール抗体は、ＮＵＫＩＮＡらにより作
製されたモノクロナール抗体Ａｐ４１２−１−７を用い
た(Biochem. Biophys. Res. Commum. Vol.216,p467, (1
995) ）。モノクロナール抗体Ａｐ４１２−１−７の免
疫原としては、Ｅ４イソマー特異的な配列であるアミノ
酸番号１０６−１１６部分（Ala-Asp-Met-Glu-Asp-Val-
Arg-Gly-Arg-Leu-Val ）のＮ末にシステインを加えたペ
プチドを固相合成法（合成機）にて合成し、架橋剤とし
てマレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロサクシイミドを
用いて、Ｎ末のシステインとKeyhole limpet hemocya
nin （以下本明細書中では、ＫＬＨと記載する）とを結
合して作製した。結合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫
し、抗体価の上昇をみて細胞融合を行った。免疫、細胞
融合は実施例１と同様の方法で行った。スクリーニング
は、実施例１と同様の方法で、リコンビナントＥ４（和
光純薬社製）を固相化したＥＬＩＳＡを用いて行い、モ
ノクローナル抗体Ａｐ４１２−１−７を確立した。
【００２５】実施例３ モノクローナル抗体の特異性確
認 実施例１及び２で作製した抗体、並びに対照としてアポ
蛋白Ｅを認識しないモノクローナル抗体Ａ１ｃ１４２を
用いて、各抗体の反応特異性をリコンビナントＥ２、Ｅ
３、Ｅ４及びアポ蛋白Ｂ（和光純薬社製）を用いた固相
ＥＬＩＳＡで確認した。すなわち、リコンビナントＥ
２、Ｅ３、Ｅ４及びアポ蛋白Ｂ（和光純薬社製）を９６
ウエルＥＬＩＳＡプレート（ファルマシア社製）に１μ
ｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウエル分注し、４℃一晩放
置することにより吸着させた。ウエルを１％ＢＳＡでブ
ロッキングした後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、各モノク
ローナル抗体の培養上清５０μｌを加え、３７℃１時間
反応させた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マ
ウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、さらに
３７℃１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄後、基
質としてＡＢＴＳを用い発色を比較した。この結果を図
１に示した。モノクローナル抗体Ａｐ４１２−１−７
は、Ｅ４にのみ特異的に反応し、ＬＺ１２及びＬＺ１８
はリコンビナントＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てに、同程度の
反応性を示し、Ａ１ｃ１４２はいずれとも反応しなかっ
た。
認 実施例１及び２で作製した抗体、並びに対照としてアポ
蛋白Ｅを認識しないモノクローナル抗体Ａ１ｃ１４２を
用いて、各抗体の反応特異性をリコンビナントＥ２、Ｅ
３、Ｅ４及びアポ蛋白Ｂ（和光純薬社製）を用いた固相
ＥＬＩＳＡで確認した。すなわち、リコンビナントＥ
２、Ｅ３、Ｅ４及びアポ蛋白Ｂ（和光純薬社製）を９６
ウエルＥＬＩＳＡプレート（ファルマシア社製）に１μ
ｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウエル分注し、４℃一晩放
置することにより吸着させた。ウエルを１％ＢＳＡでブ
ロッキングした後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、各モノク
ローナル抗体の培養上清５０μｌを加え、３７℃１時間
反応させた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マ
ウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、さらに
３７℃１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄後、基
質としてＡＢＴＳを用い発色を比較した。この結果を図
１に示した。モノクローナル抗体Ａｐ４１２−１−７
は、Ｅ４にのみ特異的に反応し、ＬＺ１２及びＬＺ１８
はリコンビナントＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てに、同程度の
反応性を示し、Ａ１ｃ１４２はいずれとも反応しなかっ
た。
【００２６】実施例４ 血清を用いたアポ蛋白Ｅ及びＥ
４の濃度測定 ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（MAXISORB）にＬＺ１８
を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ／ウエル入れ、４℃
一夜放置し吸着させた。ウエルを１％ＢＳＡでブロッキ
ングした後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、反応緩衝液とし
て１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４（以下
本明細書中では、反応緩衝液と記載する）を４０μｌを
入れた。ツイーン２０を０．５％含むＰＢＳで血清を２
０倍希釈し、反応緩衝液の入ったウエルに４０μｌ加え
た。３７℃で１時間反応後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、
アルカリフォスファターゼ（以下本明細書中では、ＡＬ
Ｐと記載する）標識抗ＬＺ１２（総アポ蛋白Ｅ測定
用）、又はＡＬＰ標識Ａｐ４１２−１−７（Ｅ４測定
用）を７５μｌ入れ、３７℃で１時間反応させた。反応
終了後、洗浄緩衝液で４回洗浄し、基質としてｐＮＰＰ
を７５μｌ入れ室温３０分放置した後、４０５ｎｍの吸
光度を測定した。アポ蛋白Ｅ濃度測定済みのＥ４ホモ血
清をアポ蛋白Ｅ、及びＥ４測定のスタンダードとして用
い、検体の総アポ蛋白Ｅ、Ｅ４の濃度を算出した。結果
を図２及び表１に示す。
４の濃度測定 ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（MAXISORB）にＬＺ１８
を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ／ウエル入れ、４℃
一夜放置し吸着させた。ウエルを１％ＢＳＡでブロッキ
ングした後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、反応緩衝液とし
て１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４（以下
本明細書中では、反応緩衝液と記載する）を４０μｌを
入れた。ツイーン２０を０．５％含むＰＢＳで血清を２
０倍希釈し、反応緩衝液の入ったウエルに４０μｌ加え
た。３７℃で１時間反応後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、
アルカリフォスファターゼ（以下本明細書中では、ＡＬ
Ｐと記載する）標識抗ＬＺ１２（総アポ蛋白Ｅ測定
用）、又はＡＬＰ標識Ａｐ４１２−１−７（Ｅ４測定
用）を７５μｌ入れ、３７℃で１時間反応させた。反応
終了後、洗浄緩衝液で４回洗浄し、基質としてｐＮＰＰ
を７５μｌ入れ室温３０分放置した後、４０５ｎｍの吸
光度を測定した。アポ蛋白Ｅ濃度測定済みのＥ４ホモ血
清をアポ蛋白Ｅ、及びＥ４測定のスタンダードとして用
い、検体の総アポ蛋白Ｅ、Ｅ４の濃度を算出した。結果
を図２及び表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例５ Ｅ４フェノタイプの同定
実施例４で測定した総アポ蛋白Ｅ濃度、Ｅ４濃度の測定
値より、Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比を算出した。Ｅ４／総
アポ蛋白Ｅの比は理論的には、Ｅ４ホモは１、Ｅ４ヘテ
ロは０．５、Ｅ４を持たないものは０となる。算出した
Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比よりＥ４フェノタイプの同定を
行った結果を、表１に示す。Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比か
ら同定したアポ蛋白Ｅのフェノタイプは、等電点電気泳
動の結果と一致していた。
値より、Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比を算出した。Ｅ４／総
アポ蛋白Ｅの比は理論的には、Ｅ４ホモは１、Ｅ４ヘテ
ロは０．５、Ｅ４を持たないものは０となる。算出した
Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比よりＥ４フェノタイプの同定を
行った結果を、表１に示す。Ｅ４／総アポ蛋白Ｅの比か
ら同定したアポ蛋白Ｅのフェノタイプは、等電点電気泳
動の結果と一致していた。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、アポ蛋白Ｅのフェノタイ
プの同定方法を提供することができる。
プの同定方法を提供することができる。
【図１】抗アポ蛋白Ｅ抗体及び抗Ｅ４抗体の反応性を示
す図である。
す図である。
【図２】アポ蛋白Ｅ及びＥ４の標準曲線を示す図であ
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特表 平７−502418（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
Claims (4)
- 【請求項１】 抗アポ蛋白Ｅ抗体を固相化し、抗アポ蛋
白Ｅ抗体又は抗アポ蛋白Ｅイソマー特異的抗体を液相に
用いるサンドイッチ測定による免疫学的測定方法を用い
てアポ蛋白Ｅ量及びアポ蛋白Ｅイソマー量をそれぞれ測
定し、アポ蛋白Ｅ量とアポ蛋白Ｅイソマー量の比を算出
することを特徴とするアポ蛋白Ｅフェノタイプの同定方
法。 - 【請求項２】 前記アポ蛋白イソマー特異的抗体が抗ア
ポ蛋白Ｅ４抗体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記アポ蛋白イソマー特異的抗体が抗ア
ポ蛋白Ｅ２抗体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記アポ蛋白イソマー特異的抗体が抗ア
ポ蛋白Ｅ３抗体である請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674196A JP3397066B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫学的測定方法を用いたアポ蛋白ｅフェノタイプの同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674196A JP3397066B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫学的測定方法を用いたアポ蛋白ｅフェノタイプの同定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10197528A JPH10197528A (ja) | 1998-07-31 |
| JP3397066B2 true JP3397066B2 (ja) | 2003-04-14 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35674196A Expired - Fee Related JP3397066B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫学的測定方法を用いたアポ蛋白ｅフェノタイプの同定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3397066B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1434053B1 (en) * | 2001-10-04 | 2008-03-26 | Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. | Reagent for detecting risk factor for alzheimer's disease, detection kit therefor and method of detecting risk factor for alzheimer's disease using the same |
| EP3163303A1 (en) * | 2015-11-02 | 2017-05-03 | Biocross, S.L. | Methods for apolipoprotein detection |
-
1996
- 1996-12-27 JP JP35674196A patent/JP3397066B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10197528A (ja) | 1998-07-31 |
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