JPS5871461A - 標識抗原結合固定化モノクロ−ナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標識抗原を結合した新規な抗原結合固定化モ
ノクローナル抗体即ち標識抗原結合固定化モノクローナ
ル抗体及びこれを用いる免疫学的測定方法に関するもの
である。

試料中の抗原を測定するために、抗体を利用して行う免
疫学的測定方法は、そのすぐれた特異性の故に近年めざ
ましい進展をみた。殊に臨床検査の分野においては、血
液、尿、髄液、細胞その他の生体試料中の蛋白、ペプチ
ド、糖蛋白、ホルモン、各穐薬物の定量に幅広く取り入
れられている。

免疫学的測定方法における測定手技は極めて多現在まで
に開発された免疫学的測定方法の操作法、感に１対象抗
原については１日本公衆衛生協会編「免疫血清反応検査
」あるいは、日本免疫学金輪「免疫実験操作法」等に詳
しく記載されているが、それら従来の免疫学的定量的測
定方法の中で感度の点で最もすぐれている定量方法はラ
ジオイムノアッセイ法と酵素免疫法である。

これら両者の感度は、はぼ同程厩とみなしてよ＜　ｎｇ
〜ｐｇ／ｍｅの超微量測定が可能であり、このたメ、血
中インスリン、グルカゴン、Ｃ−ペプチドｆｘど（Ｄペ
プチドホルモン、α−フェトプロティン。

ＣＥＡ％ＩｇＥなどの蛋白質、コルチゾール、アルドス
テロン、ＡＣＴＨなどのホルモン、更にはフェニトイン
、バルピタールなどの薬物の定量などに広く第１」用さ
れる〇 又１両測定法は、標識抗原を用いる点、および実際の操
作法においても共通する点が多い。

即ち、ラジオイムノアッセイ法は標識物質としてラジオ
アイソトープが使用され、酵素免疫法では酵素が使用さ
れるが、測定の操作は共通であり。

大別して花抗反応法と面相法に分類される。

箱抗反応法は溶液中に一定量の標識抗原と試料を加え、
インキュベートして免疫反応させた後。

沈殿剤を加えて抗原抗体複合物を沈殿させ沈殿中の標識
抗原量を測定して試料中の抗原量を定量する。標識物質
がアイソトープである場合は放射能を測定する。又、標
識物質が酵素である場合は各々の酵素に対応する基質発
色液が用いられる。

同相法においては適当な担体に固定化した固定化抗体を
緩衝液にとり、試料を加えてインキュヘ−ト後洗浄し−
Ｃ標識抗体を加え、第２インキユベートを行い１反応液
を除いて洗浄後固相に結合した標識物質を測定すること
によって、試料中の抗原量を定量する。

これらの方法についての詳細は各種の放置に詳しく述べ
られている所であるが、これらの方法の難点は測定操作
法が長時間にわたりかつ遠心分離や洗浄などの操作が入
るため、全体的に測定操作が煩雑となることである。

例えば、現在実用化されている方法で最も新しい方法と
されている固相法サンドイツチ法による酵素免疫法の操
作の概略は順に以下の通りである。

＋１＋　ＩＩ定化抗体ビーズと試料をインキュベート。

（２）ビーズを取り出して生食液で３回以上くり返し洗
浄。

（８）標識抗体を加えて再インキュベート。

（４）ビーズを取り出して生食液で３回以上くり返し洗
浄。

（６）ビーズに基質発色液を加えて活性測定。

この様に操作法が煩雑でおるため１日常検査室において
実施するに当っては多大の人的、時間的労力が消費され
、その経済的損失は極めて大きいものがある。

更に近年臨床検査技術の進歩とともに臨床検査における
検体数が飛躍的に増加してきたため、日常検膏室におい
ては検査自動化による省力化に向けて努力を行った結果
、多くの検査項目が自動分析装置によって処理されるこ
とが可能となった。

しかしながら、ラジオイムノアッセイ法や酵素免疫法に
おいては操作法の煩雑さのため自動化とは程遠い状況に
あるのが現状である。

例外として特開昭４８−５４９１号に開示されている如
く、ホモジニアス酵素免疫法があるが。

この方法はある特定の薬物においてのみ有効であり、蛋
白、ペプチド、糖質はもとより、ハプテン抗原全般に有
効であるというわけではない。

本発明者らは、この様な現状に鑑み、操作法が簡便で自
動化の可能な超微量測定法の開発に鋭意研究努力した結
果、そのような目的を達成する新規な抗原結合固定化モ
ノクローナル抗体を見出だし、本発明を完成するに至っ
た。

即ち１本発明は、標識抗原結合固定化モノクロ−ナル抗
体及び標識抗原結合固定化モノクローナル抗体を用いて
試料中の抗原を定量する免疫学的測定方法である。

即ち１本発明者らは、標識抗原を結合した新規な抗原結
合固定化抗体即ち標識抗原結合固定化抗体について鋭意
研究の結果、このうちモノクローナル抗体を固定化した
もの即ち標識抗原結合固定化モノクローナル抗体を用い
ると試料中の抗原を定量することができることを見出だ
し、本発明を完成するに至ったものである。

即ち１本発明者らは単クローン抗体を適当な担体に結合
させて調製した固定化抗体を過剰量の標識抗原と反応さ
せ、固定化標識抗原抗体複合物を得、その特性について
研究の結果次の様な事実を見出だした。

即ち、該複合物を試験管にとり、生食液で稀釈した抗原
を加えてインキュベートしておいた後に反応液を分析し
た所、加えた抗原の量に応じた量の標識抗原が反応液中
に離脱してきていることを発見した。

この点を更に詳細に説明するために、以下に実験例を挙
げて説明する。

実験ｌ６１ （１１固定化抗体の調製 アミノシラン化ガラスピーズを２５％グルタルアルデヒ
ド溶液に浸漬し、室温で４時間処理したのちに精製水で
洗浄しアルデヒド化ガラスピーズとする。単りローン抗
ヒトエｇＧ（ヒトエｇＧテ免疫したマウス奔騰とミエロ
ーマ細胞のハイプリドーマをマウスに移植し、貯留した
抗体含有腹水を硫安分画によって精製したヒトエｇＧ−
ＦｃＫ％異的な抗体）２５９の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩
衝生食液溶液にアルデヒド化ガラスピーズを浸漬して抗
体をガラスピーズに結合させ固定化抗体とする。

（２）　　標識抗原の調製 ペルオキシダーゼ１０１ＲｙをＱ、　３　Ｍ　ＮａＨＣ
０３’；ｆｄＫ溶解、１％フルオロジニトロベンゼンの
アルコール溶液０．２　ｍｌを加えて２〜１０℃で１時
間処理する。０．０６　Ｍ　Ｎａ工０４溶液２ｓｄを添
加して２〜１０℃、３０分間処理後０．０１Ｍ炭酸緩衝
液ｐ　Ｈｇ。

５に透析してアルデヒド化ベルオキンダーゼを調製する
。

上記アルデヒド化ペルオキシダーゼ溶液にヒトＩｇＧ　
１０　Ｗ／　０．５　ａｔ　（Ｄ溶液０．５　ｍｌ　ヲ
加、ｔ　テ２〜１０℃、３時間反応させた後ＮａＢＨ，
で還元処理し、ＩＱ　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝生食液に透
析してペルオキシダーゼ標識工ｇＧとする。

（８〕　　固定化標識抗原抗体ビーズの調製上記のベル
オキンダーゼ標識工ｇＧ溶液に固定化抗体ビーズを浸漬
して室温で１−間反応させたのち生食液で洗浄し固定化
標識抗原抗体ビーズ（以下ビーズ）とする。

（４）　　免疫反応 ｌＱｍＭリン２緩衝生食液ｐ　Ｈ７，Ｏ＋　　０．９　
ｍｌにヒトエｇＧ溶液０．１　ａｔ　、ビーズ１個を加
えて３７℃。

３０分間インキュベート後上清０．１　ｍｌをとり、ペ
ルオキシダーゼの活性を測定した。

活性測定には４−アミノアンチピリン、フェノール及び
Ｈ，０２を含む発色液を用い、５０５ｎｍで測定した。

実験４２ ｆｉ＋　　固定化標識抗原抗体ビーズの調製抗体として
抗ヒトエｇＧ（羊）を使用する以外は実験／Ｉ６１と全
く同様の方法で調製した。

（２）　　免疫反応 実験隘１と全く同条件で反応？行い以下の結果実験隘１
に示されている様に予め固定化抗体に又、未標識抗原無
添加の場合の非特異的離脱量は実験Ｎｏ、　２に示され
る多クローン抗体の場合の約５倍である。このことから
単クローン抗体の場合は抗体と標識抗原の結合は多クロ
ーン抗体の場合より弱く、一定条件の下では結合と解離
が一定の平衡状態にあり、新九に未標識抗原？加えると
解離の方向へ平衡が移動し標識抗原が離脱する。実験Ｎ
ａ２に示される様に多クローン抗体の場合ではこの様な
現象は認められず、抗体と抗原の結合が複数の結合部位
で結合しているため極めて強固で。

単クローン抗体の場合の様な結合、解離の平衡関係は成
立しない。

本発明は、例えば、次のようにして容易に実施すること
ができる。

即ち、目的とする抗原に対する単クローン抗体を固相に
固定化し、別に抗原？検出可能な標識物質と結合させて
標識抗原？調製し、上記固定化抗体と標識抗原？抗原抗
体反応により結合して固定化標識抗原抗体全調製し、標
識抗原結合固定化モノクローナル抗体？得ることができ
るから、これ金柑いて試料中の抗原？定量するためには
、例えば次のようにする。

即ち、上記固定化標識抗原抗体と一定量の試料ｒインキ
ュベートし、上清溶液部の標識抗原量全測定することに
より、試料中の抗原量ケ定量する。

又、例えば、目的とする抗原に対する単りローン抗体？
カラス、合成高分子、多糖質等の固相に固定化した固定
化抗体にラジオアイソトープ、酵素、螢光体等で標識し
た抗原？抗原抗体反応により結合させて調製した試薬に
試料を添加してインキュベートし、上清に遊離する標識
抗原量を測定することによって試料中の抗原量を定量す
る。

本発明に使用される固定化の担体としては、例えば、文
献；千畑一部、他藩「アフィニティークロマトクラフィ
ー」に述べられているような担体が利用される。即ち蛋
白質との共有結合が充分に行なわ名、る様に修飾された
ガラス、ポリアクリルアミド；ポリスチレン、セファデ
ックス等の高分子１合体、アカロース、寒天、でんぷん
等の多糖体ゲル等が有効に利用される。

単クローン抗体は例えば抗体産生・・イブリ゛ドーマを
マウス腹膣内に１０５〜１０６個移植し２０〜３０日後
に貯留し次腹水？採取することによって得られる。抗体
含有腹水はそのままでも使用可能であるが、アルブミン
等の蛋白質？除去して抗体活性？高めて使用する方が有
利である。

標識化合物としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、カラクトシアーゼ等の酵素、■１
２ｅｃ１〜のラジオアイソトープ、フルオレツセイン等
の螢光性物質が利用出来るが、ラジオアイソトープは放
射性廃棄物の問題や特殊な設備、取扱い上安全衛生の点
で特別な配慮がいる等ラジオイムノアッセイ法につきま
とう種々の問題点があり、又螢光性物質の場合は螢光々
度計が日常の検査室ではまだ余り普及していないことか
ら実用上は種々の制約があること倉考えると、現状では
酵素金標識化合物として選び通常の比色計で測定出来る
ような発色系ケ選ぶことが望ましい。

して次の二つの工程から成っている。

第一は、固定化標識抗原抗体と試料中の抗原との免疫反
応の工程であり、第二は上清に離脱した標識抗原の測定
の工程である。

本発明の免疫学的方法によれば、従来の方法に比べ測定
操作が格段に簡略化さね測定に要する労力、時間も飛躍
的に節約されるが、更に特筆すべきことは自動分析装置
に使用される合成高分子製のサンプルカップを利用し、
サンプルカップの内面に抗体を固定化して固定化標識抗
原抗体？調製しておき、サンプルカップに試料を分注し
てインキュベート後自動分析装置により測定すれば従来
法では不可能であった超微量測定の自動化が可能となる
。

以下に実施例（調製例及び使用例）？示し、本発明を更
に詳細に説明する。

調製例１゜ シラン化ガラスピーズ（直径６．５ｍｍ）ｋ２５％クル
タルアルデヒド溶液に室温、４時間の浸漬したのち゛精
製水で洗浄してアルデヒド化ガラスピーズとする。モノ
クローナル抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃの０．１Ｍリン酸緩衝液
溶液６　ａｔにアルデヒド化カラスビーズ３０個を２〜
１０°Ｃ１５時間浸漬する。生理食塩液でよく洗浄して
モノクローナル抗体ビーズとする。

調製例２ ポリスチレンボール（直径５．０＋＋＋ｍ）ｋモノクロ
ーナル抗ヒ）　ＩｇＧ−Ｆｃの０．１　Ｍリン酸緩衝液
溶液６　ｄに２〜１０°Ｃで浸漬し時々撮盪しながら一
夜放置する。

生理食塩液でよく洗浄してモノクローナル抗体ポリスチ
レンボールとする。

調製例　３ ペルオキシダーゼ１０　ｍ９　ｋ　０．３　Ｍ　Ｎａ　
ＨＣＯ３緩衝液２　ｍｌ　ＶＣ溶解した溶液に１％フル
オロジニトロベンゼンのアルコール溶液０．２−に加え
て２〜１０℃、１時間反応０．０６　Ｍ　ＮａＩＯ４溶
液２　ｍｅ　ｆ加え２〜１０℃、３０分間反応した後０
．１６　Ｍグリセリン０．２　ｍｌで２〜１０°Ｃ１１
時間処理して過剰のＮａＩＯ４を還元除去して炭酸緩衝
液に４８時間透析しアルデヒド化ペルオキシダーゼを得
る。アルデヒド化ペルオキシダーゼ溶液にヒトＩｇＧの
１０ｑ１０．５肩ｌ溶液を０．５肩ｌ加え２〜１０’Ｃ
，３時間攪拌して反応させた後、１０７ｎｇＮａＢＨ４
に加えてアルデヒド残基と還元処理、１０　ｍ　Ｍ　’
）ン酸緩衝液に透析してペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇ
Ｇ溶液る。

調製例　４ 調製例１で得たモノクローナル抗体ビーズ１５個？調製
例３で得たペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ溶液４　ｍ
ｌに浸漬して室温で１時間反応させた後、１０ｍＭリン
酸緩衝生食液で洗浄しペルオキシダーゼ標識ＩＦ！Ｇ結
合モノクローナル抗体ビーズ（以下、標識抗原抗体ビー
ズ）を得る。

調製例　５ 調製例２で得たモノクローナル抗体ポリスチレンボー々
１５個を調製例３で得たペルオキシダーゼ標識ヒ）　Ｉ
ｇＧ溶液４１Ｉ／に浸漬して、室温で１時間反応させた
後、ｌＱｍＭ＋Ｊン酸緩衝生食液で洗浄し、ペルオキシ
ダーゼ標識工ｇＧ結合モノクローナル抗体ポリスチレン
ボール（以下、標識抗原抗体ボール）を得る。

使用例　１゜ ｌＱｍＭリン酸緩衝生食液ｐＨ７，０，１，０ｄに各種
濃度のヒトＩｇＧ溶液１００　を加え、さらに調製例４
で得た標識抗原抗体ビーズ１個を添加して３７℃、２時
間振盪インキュベート後反応液５００μｅを別の試験管
に採取し、０４％パラクロールフェノール、００３％４
−アミノアンチピリン。

０００６％過酸化水素を含むＱ、　ｌ　Ｍ　）　！Ｊス
緩衝液ｐ　Ｉ＋　７．３を加えて３７℃、６０分間イン
キュベート後後　０−Ｄ５０５　を測定した結果１図１
の結果を得た。

使用例　２ １９ｍＭリン酸緩衝液１）Ｈ７，０（１１％ゼラチン含
有）　１．０　ｍｌに各種濃にのヒトエｇａ溶液１００
Ｎ３を加え、さらに調製例５で得た標識抗原抗体ボール
１個を添加して３７℃、２時間、゛インキュベート後１
反応液５００１Ｌｅを別の試験管に採取し、以下使用例
１と同様に操作して図２の結果を得た。

使用例　３゜ ０１Ｍトリス緩衝液ｐ、Ｈ７，０（２％ポリエチレング
リコール６０００含有）　１．０　ｍｌに各種濃度のヒ
トＩビＧ溶液１００）Ｊを加えさらに調製例４で得た標
識抗原抗体ビーズ１個を添加して、３７℃、２時間イン
キュベート後１反応液５００超を別の試験管に採取し、
以下使用例１と同様に操作して。

図３の結果を得た。

【図面の簡単な説明】

図面側」ち図１２図２及び図３は、各々使用例１使用例
２及び使用例３において得られた結果を表わす。 図面において、横軸は工ｇＧ！Ｉ＆（μｇ／ｄ）を表わ
し縦軸は０１Ｄ５ｏ５を表わす。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 釦　ｌ 団　２ ｂ　　　　Ｊｌ）Ｄ　　　Ｗｏｏ　　　７ｏｏ　　　４
０ｏ　　　ｒρＤｏ　　　　／６６　　　ｓｈｏ　　　
ｊｏｏ　　　４１６　　　夕０６手続補正書（方式） 昭和５７年　３　月　２Ｓ　日 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１７０２８９号 ２、発明の名称 標識抗原結合固定化モノクローナル抗体及びこれをｈ＋
いる免疫学的ｍｌ＋定方決 方法補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　　置　０３−２７０−８５７
重５、　補正の対象 明細を。 ６、　補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし）。 別紙のとおり。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （］）標識抗原結合同定化モノクローナル抗体。 （２）酵素で標識された特許請求の範囲第１項に記載の
   標識抗原結合固定化モノクローナル抗体。 （３）標識抗原結合同定化モノクローナル抗体を用いて
   試料中の抗原を定量する免疫学的測定方法。 〔４）酵素で標識されプζ標職抗原結合固定化モノクロ
   ーナル抗体を用いて試料中の抗原を定量する特ｒ！ｆ請
   求の範囲第３項に記載の免疫学的測定方法。 （５）標識抗原結合同定化モノクローナル抗体と一定量
   の試料をインキュベートし、上清に遊離する標識抗原を
   定量する特許請求の範囲第３項又は第４項に記載の免疫
   学的測定方法。