JP2000517418A - 定量的関節炎状態のアッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ＣＯＭＰのＣ−末端分解産物であり、約１４−３３の分子量を有する新規および新規発見低分子量タンパク質フラグメント、および本新規ＣＯＭＰフラグメントおよび他の既知の分子量６７kDa−８０kDaおよび１５０kDa−２５OkDaのＣＯＭＰフラグメント、およびスロンボスポンディンフラグメントに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体(集合的に“ＡＤＰ”と呼ぶ）ならびに：(１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベート；(２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして(３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイを記載する。関節炎疾病の診断的測定としてのＡＤＰ対ＫＳの比率の測定のためのアッセイもまた記載する。
Description
【発明の詳細な説明】
定量的関節炎状態のアッセイ
発明の分野
本発明は、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(ＣＯＭＰ)の分解生産物で
ある新規低分子量タンパク質フラグメント、このフラグメントに独特な抗体およ
び関節炎状態の重症度の測定のためのこのような抗体の使用に関する。
発明の背景
軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(ＣＯＭＰ)は、軟骨の細胞外マトリッ
クスの一部である分子量４３５,０００の５量体である。約８７,０００の各モノ
マーは、軟骨細胞により合成され、分泌される。ＣＯＭＰは軟骨の湿重量の約１
％を構成すると考えられている。ＣＯＭＰはスロンボスポンディン遺伝子ファミ
リーのメンバーと構造が類似している。タイプ３反復およびＣ−末端領域が類似
している。スロンボスポンディンは、ＣＯＭＰと構造が類似しているが、細胞遊
走の調節および生育、増殖(血管平滑筋のような)および内皮細胞の生育阻害に対
する活性を有する(Newton et al.，（1994）Genomics 24:435-439)。
ＣＯＭＰの生理学的機能は知られていないが、その滑液および血清への存在が
骨関節症(Sharif et al.，（1995）34:306-310)および関節リウマチ(Fors1ind e
t al.，Brit．J．Rheumatology，（1992）31:593-598)と関連している。滑液お
よび血液の軟骨ターンオーバーの指標としてもまた提案されている(Saxneおよび
Heinegard，D．（1992）Br．J．Rheumatology 31:583-591)。更に、高レベルの
ＣＯＭＰを有する間接リウマチ患者の滑液は６５キロダルトンフラグメントおよ
び恐らく(還元条件下で)低分子量種の痕跡量を含む(SaxneおよびHeinegard，D．
（1992）Br．J．Rheumato1ogy 31:583-591)。近年の研究は、また、骨関節症お
よび関節リウマチの患者の軟骨および滑液が４３kDa、６７−９４kDa、１５０−
２００kDaの範囲のフラグメントも含むことを証明している(Dicesare P．E．et
al.，（1996）J．Orthopaedic Res．14:946-955)。
他の軟骨マトリックスタンパク質、軟骨マトリックス糖タンパク質(ＣＭＧＰ)
が骨関節症のイヌから発見されているが(FifeおよびBrandt（1989）J．Clin.
Invest．84:1432-1439)、軟骨破壊の結果であるということが示されていない。
米国特許第４,７７８,７６８号は、軟骨傷害とプロテオグリカンおよびフラグメ
ントの測定値の相関を記載している。プロテオグリカンのＧ１ドメインの放出は
、関節リウマチの重症度に伴って増加するが、同じ状況下でグリコサミノグリカ
ン−富領域(ＣＳ／ＫＳドメイン)が減少する(SaxenおよびHeinegard，（1993）A
rthritis Rheum．35:385-390)。この証明は、現在まで、タンパク質のフラグメ
ントが疾病の状態を予測できるかどうか、予期できていない。
アグレカンは軟骨に存在するプロテオグリカンである。このタンパク質はケラ
タンスルフェート(ＫＳ)側鎖を含む。関節炎において、アグレカン分解産物が患
者の滑液で見られる。滑液および血清中のアグレカン分解産物の測定の一つの方
法は、ケラタンスルフェート側鎖を認識する抗体を使用したＥＬＩＳＡによる定
量である(Thonar E J-MA et al,，（1995）Acta Orthop．Scand（S266）66:103-
106)。数カ所の研究室での実験は、関節炎患者の血清ＫＳの測定の有用性を確認
していない。
スロンボスポンティン(４５０kDa)は分子量１５０kDaの３つの同一のモノマー
から成る高分子量粘着性糖タンパク質である。これは軟骨中で発見され、関節軟
骨細胞により産生される(Mil1erおよびMcDevitt(1988)，Biocem．Biophys．Res.
Comm．153:708-714)。今日まで、関節炎患者の滑液中のスロンボスポンディンま
たはその分解産物の存在を記載した報告はない。
血清ＣＯＭＰの定量は関節リウマチおよび骨関節炎の予知値であり得る(MShar
if,Saxne T,Shepstone L,Kirwan JR,Elson CJ,Heinegard D,Dieppe PA;Br J Rhe
umatol 34:4，306-10，1995;Hansson B M，Carey D，Alini M,Ionescu M,Rosen
berg LC,Poole AR,Heinegard D,Saxne T,J C1in Invest 95:1071-7，1995)。し
かしながら、血清ＣＯＭＰを定量する先のアッセイは軟骨分解が関節炎患者で進
行しているか否かの測定は不可能である。
抗原性ＫＳはヒト骨関節炎の関節由来の滑液に増加した量で存在する(Shimozu
ru et al.，Orthop．Trans．20:419，1995)。このレベルおよびプロテオグリカ
ン異化作用の他のマーカーは、特に、関節軟骨質量の二次炎症性変かまたは損失
が存在する関節において、この疾病の前放射線医学段階の間最高であり、
経時的に減少する傾向にある(レビューのためにThonar E J-M A et al.，Sports
medicine & arthroscopy review:chondral injuries（編Andrish J．T）Raven P
ress，New York 1994:13-29参照)。これはデータの解釈を困難にする。しかしな
がら、この困難さは、更なるマーカーを測定し、この結果を一つのマーカー対他
のマーカーの比率として報告するにより回避できる(Thonar EJ-MA et al.,Acta
Orthop．Scand．（Suppl 266）66:103-106，1995)。興味深いことに、最近の報
告は、同じ患者の滑液における抗原性ＣＯＭＰ対抗原性ＫＳの比率が、軟骨巨大
分子ターンオーバーの変化の追跡に有用であり得ると請求している(Peterson et
al.，（1997)Ann．Rheum．Disease 56:64-67)。
その滑液および／または血清の存在が関節炎(骨関節炎または関節リウマチ)の
ような疾病状態と相関し得る新規タンパク質またはタンパク質のフラグメント(
分解産物)または異なるタンパク質またはフラグメントの比率の同定が、このよ
うな疾病の診断および処置に有用である。更に、このような新規タンパク質また
はタンパク質フラグメントの検出のための新規抗体および他の分子の開発は、関
節炎患者の診断および処置に慣用的に適用されるアッセイを容易に利用可能とす
る。関節炎の新規医薬開発のために、軟骨マトリックスにおける新規医薬の効果
の評価のためのアッセイおよび処置治療のための患者の選択手段が必要である。
本発明は、関節炎の進行と関連したＣＯＭＰタンパク質の新規低分子量フラグメ
ント、これらのフラグメントに結合する抗体および、これらのフラグメントおよ
び他の既知のＣＯＭＰフラグメントおよびスロンボスポンディン−１(“ＴＳＰ
−１”)のフラグメントの定量による関節炎疾病状態の重症度の測定のためのア
ッセイを見出した。我々のＣＯＭＰのカルボキシ末端への抗ペプチド抗体を使用
した実験において、予測できなかったことは、この分子のカルボキシル末端由来
の特異的分解産物またはこの分解産物対ＫＳの比率が診断的または予知的価値を
有するということであった。ＣＯＭＰのレベルがこのｃ−末端分解産物と異なり
、全分子より幾分異なっていることを反映することが示された。加えて、抗体は
他の既知のＣＯＭＰフラグメントを認識することが判明した。更に、この抗ペプ
チド抗体は、予期せずに、ウシスロンボスポンディンのＮ−末端２０kDaフラグ
メントおよび完全長ヒトＴＳＰ−１を認識した。ウシおよびヒトスロンボスポン
デ
ィンのＮ−末端配列が同一であるため、この抗体はヒトＴＳＰ−１のＮ−末端２
０kDaフラグメントを認識することが予測される。
本発明の要約
本発明は、ＣＯＭＰのＣ−末端分解産物である新規および新規発見低分子量タ
ンパク質フラグメントを記載する。本明細書で“LMW-COMP”と呼ぶ最初のグルー
プは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１４−３３の分子量を有する。好ましくは、LMW-CO
MPフラグメントは約３０、２０、１８、１６または１４キロダルトンの分子量を
有し、最も好ましくはLMW-COMPは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０キロダルトンの見
かけの分子量を有する低分子量分解産物の優勢種である。このＣＯＭＰフラグメ
ントは、関節炎疾病状態がより重症になるにつれ、増加した量で産生される。こ
れらの新規発見Ｃ−末端ＣＯＭＰフラグメントは、還元状態でのみ他のＣＯＭＰ
成分と分離され、従って、その分離は、ＣＯＭＰフラグメント(存在する場合)の
分離が、このような還元条件下で行われるアッセイに依存する。本発明の他の局
面は、この新規LMW-COMPに結合できるポリクローナルおよびモノクローナル抗体
である。このLMW-COMPは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体によって、ＣＯ
ＭＰの少なくともカルボキシ末端由来１７アミノ酸のアミノ酸ポリペプチドを認
識される。これらの抗体は、ウエスタン・ブロッティングで、約６７kDaから約
８０kDaおよび１５０kDaから２５０kDaの分子量を有する、ＣＯＭＰ Ｃ−末端
分解フラグメントの他のグループを検出し、ＴＳＰ−１のＮ−末端由来のスロン
ボスポンディンの２０kDaフラグメントである他の関節炎分解産物と交差反応も
する。LMW-COMPフラグメント、６７−８０kDaおよび２２０−２５０kDa ＣＯＭ
Ｐフラグメントおよびスロンボスポンディンフラグメントは、本明細書で集合的
に“関節炎分解産物”または“ＡＤＰ”と呼ぶ。従って、“関節炎分解産物”ま
たは“ＡＤＰ”なる用語の使用は、上記の３つ総てのフラグメントであると共に
、１個またはそれ以上の個々のフラグメントも意味し得る。これらのフラグメン
トを認識し、結合する抗体は、従って、“ＡＤＰ抗体”と呼ぶ。本発明のまた別
の局面は、種々の体液、好ましくは滑液および血清におけるＡＤＰのレベルの測
定のためのアッセイ法である。
本発明のアッセイの局面の好ましい態様は：
(１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベ
ート；
(２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして
(３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定
を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイである。
このアッセイの最も好ましい態様において、ＡＤＰはLMW-COMPフラグメントで
ある。
所望により、体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルは、関節炎の診断
および／または処置中の異なる時間での体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ交代の
レベルと比較し得る。
本発明の更に別の局面は、関節炎の診断および／または処置のための、患者由
来の体液サンプル、好ましくは滑液および血清サンプル中の、関節炎分解産物対
ＫＳのレベルの比率の測定のための診断的アッセイを教示する。
図面の説明
図１は、ウサギ抗−Ｈ７４１抗体を使用した、異なる関節炎状態の患者の滑液
のウエスタンブロット分析を示す。レーン５：中度ＲＡ；レーン４：仮性通風；
レーン３：通風性関節炎；レーン２：仮性通風；レーン１、低分子量マーカー：
９７.４kDa、６６.３kDa、４５kDa、３１kDa、２１.５kDa。
図２はウサギ抗−Ｈ７４１抗体を使用した、異なる関節炎状態の患者の滑液の
ウエスタンブロット分析を示す。レーン１、乾癬性関節炎(患者＃１９)由来の滑
液の、５０倍モル過剰のペプチドＨ７４１存在下での免疫ブロッティング；レー
ン２、患者＃１９由来の滑液；レーン３、重症骨関節炎／関節リウマチ(サンプ
ル＃96020)；レーン４、中度ＲＡ；レーン５、中度ＲＡ；レーン６、低分子量マ
ーカー：９７.４kDa、６６.３kDa、４５kDa、３１kDa、２1.５kDaおよび１４.４
kDa。
図３ ヒトＣＯＭＰのモノマーサブユニットの模式図：ヒトＣＯＭＰはＮ−末
端ドメイン、鎖間結合領域、ＥＧＦおよびＴＳＰ様反復ドメインおよびＣ−末端
ドメインから成る。Ｃ−末端ＣＯＭＰへの合成ヘプタデカペプチドが抗体製造に
使用された。
図４ ウサギ抗−ヒトＣＯＭＰおよびＨ７４１におけるウサギ抗ペプチド抗体
による滑液で検出される免疫反応性フラグメントの比較：滑液５マイクロリット
ル／レーンを、還元条件下でSDS-PAGEゲルに使用し、ニトロセルロース膜に電気
泳動的にブロットし、個々のレーンを切片に切ったレーン２はＣＯＭＰに対する
ポリクローナル抗体を使用して分析し、レーン２は抗ペプチド抗体Ｈ７４１を使
用して分析し、そしてレーン４はウサギで発生させた非関連抗体を使用して分析
した。分子量マーカーの位置は左に示す。
図５ 抗体Ｈ７４１を使用したリウマチ(ＲＡ)および骨関節炎患者(ＯＡ)の滑
液のウエスタン分析：滑液５マイクロリットル／レーンを、還元(ａ)および非還
元(Ｂ)条件下で４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。ゲルをニトロセルロー
ス膜にブロットし、抗体７４１(２.５マイクログラム／ミリリットル)を使用し
て分析した。レーン１：軽度ＲＡ患者；レーン３：重症ＯＡ患者；レーン５：中
度ＲＡ患者；レーン７：重症ＯＡ患者。
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＯＭＰのＣ−末端分解産物である新規および新規発見低分子量タ
ンパク質フラグメントを記載する。タンパク質フラグメントは、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで１４から３３kDAの間の分子量を有するLMW-COMPフラグメントである。好ま
しくは、LMW-COMPフラグメントは約３０、２０、１８、１６または１４キロダル
トンの分子量を有し、最も好ましくはLMW-COMPは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０キ
ロダルトンの見かけの分子量を有する低分子量分解産物の優勢種である。このＣ
ＯＭＰフラグメントは、関節炎状態がより重症になるにつれ、増加した量で産生
される。これらの新規発見Ｃ−末端ＣＯＭＰフラグメントは、還元状態でのみ他
のＣＯＭＰ成分と分離され、従って、その分離は、ＣＯＭＰフラグメント(存在
する場合)の分離が、このような還元条件下で行われるアッセイに依存する。
他の態様で本発明は新規LMW-COMPへのポリクローナルおよびモノクローナル抗
体を記載する。これらの抗体はまた、約６７kDaから約８０kDaおよび１５０kDa
から２５０kDaの分子量を有する、ＣＯＭＰ Ｃ−末端分解フラグメントの他の
グループと交差反応し、ＴＳＰ−１のＮ−末端由来のＴＳＰ−１の２０kDaフラ
グメントである他の関節炎分解産物と交差反応もする。適当な体液は、関節炎患
者から得られる任意の体液を含む。適当な体液の例は、滑液、血液血清および尿
であり、滑液および血清が最も好ましい。滑液は最も高いレベルのＡＤＰを含む
可能性が高い。関節炎患者は、医師により診断されたか、関節炎に関連する症状
を有する者である。関節炎は骨関節炎および関節リウマチの両方を含む。ＡＤＰ
はまた外傷性関節または骨傷害の結果としての軟骨分解にも関連することが判明
している。これは、骨折、軟骨骨折、関節脱臼などを含む。
ＡＤＰは、ＣＯＭＰおよび他のＣ０ＭＰ分解産物から、既知の分離法を使用し
て単離および分離され得る。これらは、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動
および選択的沈殿を含む。１４−３３キロダルトンのフラグメントの分離法は還
元条件下で行うことが重要である。明らかに、LMW-COMPは少なくとも一つのジス
ルフィド結合をそれ自体にまたはＣＯＭＰの他の部分に有し、結合の還元はLMW-
COMPを遊離し、分離および検出され得る。還元条件は、典型的に還元剤を添加す
る体液の溶液に関与する。適当な還元剤は、ジスルフィド結合を還元する、当分
野で既知のものを含む。好ましい還元剤は、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、β−
メルカプトエタノール、システインおよびアスコルビン酸である。還元剤は、ジ
スルフィド結合の還元を促進するのに十分な濃度で使用し、少なくともジスルフ
ィト結合：還元剤の１：１の比率での濃度を可能にする。典型的に、０.１−１
００ｍＭの還元剤が十分であり、還元剤とのインキュベーションは約３０秒から
約３０分、約２５−４５℃の温度で行う。好ましくは、インキュベーションは約
５分、約３７℃で行う。体液の所望の分離の時間の還元剤への暴露の後、過剰の
還元剤を、ヨードアセトアミドまたはｎ−エチルマレイミドのような還元剤不活
化物質を使用して不活性化できる。この不活性化段階は、ＥＬＩＳＡアッセイを
検出または測定法として使用する場合、特に重要である。還元剤不活性化物質の
濃度は、先に体液に添加した還元剤の濃度より過剰であり、好ましくは約２倍以
上である。従って、体液中の還元剤の濃度が１ｍＭである場合、還元剤不活性化
物質の濃度は少なくとも２ｍＭである。所望により、体液は体液の粘性を減少さ
せる物質(粘性減少剤)で処理し得る。これは、体液が滑液であり、LMW-COMPの検
出がウエスタンブロッティングである場合、特に有用である。プロテアーゼ・フ
リー・ステレオマイセス・ヒアルロニダーゼが適当な粘性減少剤の一つであり、
他は当分野で既知である。他の体液の所望の処理は、体液中のタンパク質の選択
的沈殿であり、ＣＯＭＰの低分子量フラグメントを増加させる。選択的沈殿は、
例えば、３０％硫酸アンモニウムまたは２０％ポリエチレングリコールを使用し
て行い得る。
LMW-COMPが、ＣＯＭＰおよび他のＣＯＭＰ分解産物から単離または分離されて
いてもまたはいなくても、LMW-COMPの測定、検出または定量は重要である。分離
を行う場合、検出は純度の程度の確認を可能にする。分離を行わない場合、検出
は、疾病の一つの徴候がLMW-COMPの産生である時の疾病の重症度の同定として測
定されるLMW-COMPの量を可能にする。これらの抗体は６７−８０kDaフラグメン
トおよび１５０−２５０kDaフラグメントおよびＴＳＰ−１のＮ−末端と交差反
応し、従って、“ＡＤＰ抗体”と呼ぶ。これは、先に記載のように、Ｃ−末端Ｃ
ＯＭＰおよびＮ−末端ＴＳＰ−１のアミノ酸配列が完全に異なるため、予期され
ないことである。それ自体既知である６７−８０キロダルトン−ＣＯＭＰフラグ
メントが非還元条件で優勢であり、完全長ＣＯＭＰフラグメントのＣ−末端を有
し、滑液および培養したヒト骨関節炎軟骨で見られる。これは、マトリックスメ
タロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)で消化したヒト軟骨を使用して、培地中の６７−８
０kDaフラグメントの定量により証明される。
このように産生した抗体は、例えば、両方とも当分野で既知のウエスタンブロ
ッティングまたはＥＬＩＳＡによるＡＤＰの検出に使用できる。還元剤への抗体
の感受性のため、ＡＤＰの遊離に使用した過剰の還元剤を、抗-LMW-COMP抗体に
体液をさらし、またはインキュベーションする前に、還元剤不活性化物質で不活
性化することが必要であり得る。更に、ＥＬＩＳＡによるＡＤＰの測定は、免疫
反応性の定量であり、測定する分子量ではないため、還元状態ではなく行うこと
ができる。ＥＬＩＳＡは、６７−８０kDaおよび１５０−２５０kDa ＣＯＭＰフ
ラグメントの形成の阻害をする医薬の効果の追跡に使用し得る。驚くべきことに
、６７−８０kDa ＣＯＭＰフラグメントがセリンメタロプロテイナーゼおよび
マトリックスメタロプロテイナーゼでの消化により産生されることが判明した。
従つて、このアッセイは、ＭＭＰおよび、インビトロおよびインビボ両方での他
の望ましくない酵素の阻害剤の効果の追跡の可能性がある。以下に記載するＥＬ
Ｉ
ＳＡアッセイは、ポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡと比較した場合、Ｃ
ＯＭＰ組成物の予測により感受性であり得る。加えて、このアッセイは性質およ
び疾病重症度に依存した軟骨分解の異なる機構の可能性を示す。
ＡＤＰへの抗体は種々の方法で得られる。単離LMW-COMPは試験動物で抗体を産
生するための免疫原として塩油できる。また、ＴＳＰ−１のＮ−末端２０kDaフ
ラグメントは免疫原として使用できる。抗体をマウスで産生した場合、モノクロ
ーナル抗体を既知の方法で製造できる。更に、キメラ抗体およびヒト化抗体もま
た当分野に従って製造できる。特記しない場合、動物内で産生したポリクローナ
ル抗体を使用できる。また、完全長LMW-COMPを免疫原として使用する代わりに、
Ｃ−末端ぺプチド配列のようなLMW-COMPの短いセグメントを、LMW-COMPの一部に
対応する配列を有する合成ペプチドとして使用できる。好ましい合成ペプチドは
、好ましくはＣＯＭＰのＣ−末端由来である。好ましい合成ペプチドは完全長Ｃ
ＯＭＰの特異的残基を含むペプチドＨ７４１、およびＨ６６９である。
Cys741-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Thr-His-Gln-Leu-Arg-Gln-Ala75 7
-COOH(H741)(配列番号：１)
Lys669-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Trp-Lys-Asp-Lys-Lys-Ser-Tyr683-CONH2(H669
)(配列番号：２)
得られる抗体は、それぞれ抗体Ｈ７４１および抗体Ｈ６６９と呼ばれ、それを
産生する細胞はそれぞれハイブリドーマＨ７４１およびＨ６６９と呼ばれる。
更に好ましい合成ペプチドは、ラットＣＯＭＰのＣ−末端領域およびウシＣＯ
ＭＰのＣ−末端領域である。
ラット-NH2-Cys737-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Arg-His-Arg-Leu-Ar
g-Arg-Ala755COOH(配列番号：３)(Hrat)、そして
ウシ-NH2-Cys-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Ala-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln
-AlaCOOH(配列番号：４)(Hbov)
得られる抗体は同様にそれぞれ抗体Hratおよび抗体Hbovと呼ばれ、それらを産
生する細胞はそれぞれハイブリドーマHratおよびHbovと呼ばれる。上記のペプチ
ドに対して産生した抗体は、ウエスタンブロッティングで全ＡＤＰフラグメント
を検出することに注目することは重要である。ＣＯＭＰを認識しない抗体は、こ
れらのＡＤＰフラグメントの検出ができなかった。これらの観察は、これらのタ
ンパク質、ＡＤＰフラグメントが、滑液中でＣＯＭＰの分解産物であることを示
す。更に、Ｃ−末端抗ペプチド抗体は、ＣＯＭＰに対するポリクローナル抗体で
のウエスタン分析で認識されなかったＡＤＰフラグメントを認識することが判明
した。
体液中のＡＤＰの量の測定の特に好ましい方法は、本発明のアッセイ局面であ
る。ＡＤＰのレベルの測定のこのようなアッセイは：
関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベート
；
(２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして
(３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定
を含む。
アッセイの好ましい態様において、ＡＤＰはLMW-COMPであり、体液は滑液また
は血清である。還元条件を使用した事象において、還元条件は、約１ｍＭで約５
分、３７℃のジチオスレイトールまたはメルカプトエタノールである。好ましい
抗ＡＤＰ抗体は、ペプチドＨ７４１で感作したウサギで産生させる。結合抗−LM
W-COMP抗体のレベルの好ましい測定法は、電気泳動に続くウエスタンブロッティ
ングである。ウエスタンブロッティングを測定法として使用する場合、体液サン
プルと抗−LMW-COMPとのインキュベーションを開始する前に、還元剤不活性化物
質で、過剰の還元剤を不活性化することが通常望ましい。
本発明は、また、本発明のアッセイ局面を行うためのキットも含む。このよう
なキットは、１個またはそれ以上のLMW-COMPと約１４から約３３キロダルトンお
よび／または抗−ＡＤＰ抗体の溶液または混合物を含む。キットは、体液サンプ
ルをインキュベートするためのバイアルまたは容器、粘性減少剤、還元剤不活性
化物質およびまたは分離物質も更に含み得る。
免疫アッセイは、ＣＯＭＰのＣ−末端１７アミノ酸配列(配列番号：１)に対す
る抗体を使用して開発し、関節炎患者由来のヒト滑液における抗原性ＣＯＭＰを
定量した。疾病の異なる段階での関節炎患者由来の滑液のＣＯＭＰの抗原含量を
同じ滑液中のプロテオグリカン(ＫＳ ＥＬＩＳＡで測定)の含量と比較した場合
、
明白なＣＯＭＰ抗原含量／ＫＳ比率が各疾病群の患者から得られた。従って、こ
のＣＯＭＰに対するＣ−末端由来抗体を使用したＣＯＭＰ顔料の測定は、関節炎
患者の診断および追跡に有用である。
本発明の他の局面において、軟骨破壊の付加的マーカーの測定のためのアッセ
イを記載し、結果を一つのマーカー対他のものの比率として示す。このアッセイ
において、ＡＤＰを上記のように測定する。軟骨のプロテオグリカンに優勢に存
在するグリコサミノグリカンであるＫＳの量を次いでそれ自体既知の方法を使用
して測定する(Campion，G．V．et al.，ArthritisおよびRheum．34(10):1254-12
59(1991))。次いで、ＡＤＰ対ＫＳ値の比率の測定のためにＡＤＰ値をＫＳ値と
比較する。この比率は関節炎状態の段階の指標であり、軟骨保護的治療の一つの
目標はＡＤＰ／ＫＳの比率の増加の防止である。好ましい態様において、数個の
体液サンプルを、ＣＯＭＰおよびLMW-COMPのレベルおよびその中のＫＳに関して
アッセイし、各々の平均値を取る。平均値を次いでこれらのフラグメントと他の
ものの比率の測定に使用する。
本発明は、関節炎疾病の予知、診断および処置におけるＡＤＰの測定に有用で
ある。関節炎状態の重症度の測定として、本発明は医師の処置および関節炎の処
置における医薬の投与の最適化を可能にする。処置の前または初期のＡＤＰのレ
ベルと処置中または後のレベルの比較により、医師は処置の有効性の追跡および
医薬の投与の調節または他の処置が可能となる。本発明はまた経時的にＡＤＰの
レベルを追跡することによる関節炎状態の段階の診断にも使用できる。ＡＤＰレ
ベルの変化は、関節炎状態が悪化、快方または安定であるかを支持できる。この
情報は、計画および適用する処置の良好な経過もまた可能とし得る。
本発明のＡＤＰは、関節炎状態の診断の分子マーカーとして有用である。例え
ば、単離LMW-COMPフラグメントは、サンプル中のＣＯＭＰフラグメントの分散の
指標として電気泳動ゲルまたはゲル濾過カラムでサンプル中のＡＤＰと並行に動
き得る。この場合、サンプルは体液サンプルであり得、または細胞または組織培
養、特にＣＯＭＰを産生する細胞または組織培養（例えば、軟骨細胞など）由来
のものであり得る。
本明細書に引用の総ての文献は、引用して本明細書に包含させる。実施例
実施例は、本発明の具体的な実施態様を説明するために提供するものであって
、いかにしても本発明を限定するものと解釈されるものではない。
実施例１ ＣＯＭＰのＣ−末端領域由来の合成ペプチドに対する抗ペプチド抗体の製造
ヒトＣＯＭＰポリペプチド中のCys741-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu
-Thr-His-Gln-Leu-Arg-Gln-Ala757-ＣＯＯＨ(配列番号１)(Ｈ７４１)で始まる残
基に相当する配列を持つ合成ペプチドそれぞれを、Ｎ-末端システインを介して
カサガイ(Keyhole limpet)へモシアニンに結合させ、既に確立されている方法(B
riand et al.，（1985）J．Immunol．Methods 78:59-69)を用いてウサギ中で抗
体を調製した。セファロースーペプチドアフィニティーカラムを用いて抗体をア
フィニティー精製した。ヒトＣＯＭＰ Lys669-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Trp-Ly
s-Asp-Lys-Lys-Ser-Tyr683-ＣＯＮＨ２(配列番号２)(Ｈ６６９)の第２の合成ペ
プチドをグルタルアルデヒド法(Briand et al.，（1985）J．Immunol．Methods
78: 59-69)を介してＫＬＨに結合させ、ウサギ抗体を上記のとおり調製した。
モノクローナル抗体は、確立された方法(Kohler and Milstein，(1975）Natur
e 256:495-497;Yelton and Sharff（1981）Ann．Rev．Biochem．50:657-680)に
従い、Ｈ７４１1およびＨ６６９ペプチドを用いて調製する。得られた抗体はそ
れぞれ抗体Ｈ７４１および抗体Ｈ６６９と呼び、これらの抗体を産生する細胞は
それぞれハイブリドーマＨ７４１およびＨ６６９と呼ぶ。更に、キメラ抗体およ
びヒト化抗体も当業者なら作成できる。
実施例２ ＣＯＭＰの分解産物としてのＣＯＭＰの低分子量フラグメントの同定
ストレプトマイセス処理した滑液から取ったヒアルロニダーゼ１０μｌを、１
０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ試料緩衝液１０μｌと混合した。試料を４
分間煮沸し、１５μｌを１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動後、タンパ
ク質を電気泳動(１００ボルト、４℃で２時間)によりニトロセルロース膜上へ移
した。ニトロセルロース膜を１％酢酸中、０.２％ponesau Ｓレッド染料(Sigma
Chemical，St．Louis，Missouri)で染色して、タンパク質マーカーを可視化した
。マーカーを緑色ペンシルでマークし、ブロットをＰＢＳで十分に洗浄し、ＰＢ
Ｓ中２％ＢＳＡで４℃で１８時間ブロックした。実施例３に記載のように、ブロ
ットをウサギ抗体Ｈ７４１で展開させた。図１および図２は、みかけの分子量約
３０、２０、１８、１６および１４キロダルトンを持つ様々なＬＭＷ−ＣＯＭＰ
フラグメントが得られたことを示す。最も優勢な種は、分子量約２０キロダルト
ンを持つと思われる。
実施例３ ウェスタン・イムノブロッティングによる ＣＯＭＰフラグメントについてのヒト滑液の分析
ヒト滑液をＥＤＴＡ中に集め、血清を血漿から調製し、使用するまで凍結貯蔵
した。ウェスタン・ブロット分析用に、滑液を薬品イソプロパン中、５６℃で２
時間、１０mg/mlＰＭＳＦ(フェニルメタンスルホン酸)１μｌの存在下でヒアル
ロニダーゼ(Saxne and Heinegard，（1992）Br．J．Rheumatol．31: 583-591)処
理し、使用するまで凍結貯蔵した。ＥＬＩＳＡアッセイ用に、滑液または血清を
２mMヨードアヤトアミド(Aldrich Chem.)または２mMN−エチルマレイミド(Aldri
ch Chem.)で処理する。滑液または血清を３０％硫酸アンモニウムまたは２０％
ＰＥＧで選択的に沈殿させ、ＣＯＭＰの低分子量フラグメントを豊富化させ、次
いで、−２０℃で貯蔵した。
尿を集め、遠心し、使用するまで凍結貯蔵した。
ヒト滑液２０マイクロリットルを１０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ充填緩衝液(NOVEX，San Diego，CA)と１：１に混合した。試料を４分間煮
沸し、１４％または４−１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−Glyゲル(Novex,CA
)上に１レーン当り１５mlずつ入れた。これらの試料の別のセットも、非還元条
件での分析用に準備した。分子量マーカーは、未知の分子量の位置を特定するた
めに使用した。電気泳動後、試料を電気泳動によりニトロセルロース紙上に移し
た。この紙を、１０mＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ NaCl、pH７.５(ＰＢＳ)中
、４℃で１８時間、２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で処理した。
このニトロセルロース紙をＰＢＳ(１０mＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ Na
Ｃｌ、pH７.２)で濯いだ。アフィニティー精製抗体５ml（ストック溶液中で濃縮
した３.６mg/mlタンパク質)をＥＬＩＳＡ希釈緩衝液(２０mMトリス、０.１５Ｍ
NaCl、０.１％ツイーン-２０、０.１％チメルソル(thimersol)、０.１％ウシ血
清アルブミン)にて７mlに希釈し、この溶液をニトロセルロース膜上に塗った。
室温で１時間後、膜をアルブミンなしのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で４回(５分/洗浄
)洗浄した。次いで、この膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma Immunochem
icals，USA)にコンジュゲートしたウサギＩｇＧに対するモノクローナル抗体１m
gと共に、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液１ml中、室温で１時間インキュベーションした
。この膜をアルブミンなしのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で５回、リン酸緩衝塩水、ｐ
Ｈ７.５で２回洗浄した。次いで、結合抗体をＥＣＬまたはＥＣＦ基質(Amersham
Co.)を用いて検出した。分子動力学濃度計(Molecular Dynamics densitometer)
(Sunnyva1e，CA)を用いてフラグメントを定量した。次いで、同じニトロセルロ
ース膜をＴＭＢ(Promega，Madison，WI)基質を用いて可視化した。
実施例４ ＥＬＩＳＡアッセイによるＣＯＭＰ断片化の定量
幾つかのＥＬＩＳＡ技術を用いて、ＣＯＭＰタンパク質の断片化を測定する。１．競合ＥＬＩＳＡアッセイ
９６-ウェルマイクロタイタープレートをＰＢＳ中５０ng/mlの抗原(Ｎ−末端
システインを持たない合成ペプチドＨ７４1)０.１ml/ウェルで４℃で４８ないし
７２時間コーティングした。ウェルをＰＢＳ中2％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)
３００μｌ/ウェルで室温(ＲＴ)で１.５時間ブロックした。ウェルをＥＬＩＳＡ
洗浄緩衝液(０.１５ＭＮａＣｌ、０.１％ツイーン２０、０.１％チメルソル含有
２０mMトリス、ｐＨ７.５)で２回洗浄し、各ウェルに、アッセイ緩衝液(０.１％
ＢＳＡ含有ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液)で１：１０、１：２０または１：４０に希釈
した体液(滑液、血清または尿)５０μｌを加え、次いで、ウサギ抗ＣＯＭＰペプ
チド抗体５０μｌ/ウェルをアッセイ緩衝液中０.７μｇ/mlで加えた。体液中の
抗原物質の濃度を見積もるために、標準(既知濃度の抗原溶液)を用いて標準曲線
を作った。この標準は、アッセイ緩衝液中で、最終濃度１.５ｎＭ、4.６ｎＭ、
１１.５ｎＭ、３４ｎＭ、４６ｎＭ、 １１５ｎＭおよび４６３ｎＭになる
ように調製した。次いで、５０μｌ/ウェルを加え、次いで、ウサギ抗ＣＯＭＰ
ペプチド抗体５０μｌ/ウェルと混合することにより、二重にアッセイした。全
ての試料、標準および滑液試料をＲＴで２時間インキュベーションし、プレート
をＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液中、ストック溶
液で１：３０００に希釈して調製したアルカリホスファターゼコンジュゲート化
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Calbiochem，San Diego，CA)１００μｌ/ウェルを添加
した。ＲＴで１時間後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、結合抗
体をｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液(Sigma，St．Louis，MO)１００μ
ｌ/ウェルを添加し、光学密度(ＯＤ)を４０５nmで測定することにより検出した
。方程式ｙ＝(Ａ−Ｄ)/(１＋(ｘ/Ｃ)B)＋Ｄ、ここで、ｙ＝ＯＤ405nm.、ｘ＝ｎ
ＭＨ７４１の４−パラメーターロジスティック曲線を用いて、標準曲線を得た。
次いで、滑液中の抗原濃度を、マッキントッシュコンピューターにつなげたモレ
キュラー・デバイス・マイクロプレート・リーダーでのグラフを用いて外挿した
。
結果：
Ｈ７４１ ＣＯＭＰ抗原は、関節炎患者の幾つかの滑液で、うまく定量された
。下記の表１は、その事実を要約したものである。
表１
疾病型 重篤度 平均ＣＯＭＰフラグメント濃度
ｎＭＨ７４１
骨関節症(ＯＡ) 軽度 ３３５(ｎ＝２)
中度 １１３(ｎ＝６)
重度 １８９(ｎ＝８)
慢性関節リウマチ(ＲＡ) 軽度 ２３６(ｎ＝２)
中度 １２６(ｎ＝１１)
重度 ３１６(ｎ＝３)
このデータは、明らかに、このＥＬＩＳＡアッセイにより様々な病状進行段階
の患者におけるＣＯＭＰフラグメント間の量的相違が同定されることを示してい
る。２．サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ：
マイクロタイタープレートは、冷所中１８時間、ウサギ抗ペプチドＨ７４１抗
体１μｇ/ウェルでコーティングする。ウェルは、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ３００ml
で室温で２時間ブロックする。ヒト滑液または血清または尿を０.１％ＢＳＡ含
有ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス、０.１５ＭＮａＣｌ、０.１％ツイー
ン２０、０.１％チメルソル)で希釈したもの数種を調製する。その１００μｌを
マイクロタイタープレートに加え、室温で１時間インキュベーションする。試料
をＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄(４回)する。ヒトＣＯＭＰまたはペプチドＨ６６
９に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、あるいは、アルカリホスファ
ターゼにコンジュゲートさせた６７−８０ｋＤａの単離ＣＯＭＰフラグメントに
対する抗体１００μｌを、１μｇ/ウェルでウェルに加え、室温で１時間インキ
ュベーションする。後に、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、結合抗
体を冒頭に記載したようにして定量する。分子量約２０ｋＤａの精製ＣＯＭＰ分
解産物を用いた標準曲線を、未知の内容物を定量するのに使用する。
ヒト滑液または血清は、既に公開されているＥＬＩＳA法(Saxne and Heinegar
d，（1992）Br．J．Rheumato1．31: 583-591)により非分解ＣＯＭＰ総量につい
て分析する。
実施例５ 関節炎疾患の患者におけるＣＯＭＰフラグメントの定量
この実施例では、滑液をＣＯＭＰフラグメント源として使用し、抗ペプチド抗
体Ｈ７４１を分析に用いた。上記実施例３および４に記載の方法は、血清中のＣ
ＯＭＰおよびそのフラグメントの分析、あるいは尿中のフラグメント(のみ)の分
析にも適用できる。
第１に、還元条件下での１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてウサギ抗ペ
プチドＨ７４１抗体でのウェスタン・ブロッティングの後、滑液ＣＯＭＰの断片
化パターンを測定した。試験片にもよるが、この抗体は、還元条件下でのみ、分
子量およそ３３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０ａＤａ、１８ｋＤａ、１６ｋＤａおよ
び１４.４ｋＤａと思われる数種のバンドを検出した。免疫反応性物質の量は、
濃度計により各バンドの容量を測定することにより定量した。９４キロダルトン
のタンパク質は、完全なＣＯＭＰである。表２に示したように、骨関節症の場合
、
疾病の重篤度が重くなればなるほど、フラグメント数は増える。慢性関節リウマ
チでは、２０キロダルトンのフラグメントが重度疾病の場合に増大した。このこ
とは、ＣＯＭＰ断片化の種類および程度は、関節炎プロセスの段階を示す。ＬＷ
Ｍ−ＣＯＭＰマーカーは、痛風性関節炎症状における骨関節症や慢性関節リウマ
チに限定されず、乾癬性関節炎はこれらのフラグメントを高レベルで示す。
表２ 第２に、抗原性ＣＯＭＰ総量を、各断片化免疫反応性ＣＯＭＰそれぞれの容量
内容物全てを加えることにより、定量した（上記実施例３および５参照）。ＣＯ
ＭＰ総量は、ＣＯＭＰＥＬＩＳＡにより定量した(Saxne and Heinegard，D.（19
92）Br．J．Rheumatology 31: 583-591)。
ＣＯＭＰ総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率を含む表から、軟骨破壊度を考察
できる。表３では、容量測定により測定した断片化ＣＯＭＰ総量を用いて、かか
る比率を作成した。
表３ 上記の結果に基づけば、疾病重篤度および疾病種(乾癬性関節炎)は、ＣＯＭＰ
総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率がより高く、またフラグメント数も多いよう
である。このことは、軟骨の細胞外マトリクスが著しく分解されたことを示唆す
る。よって、治療の目的となるのは、滑液(または血清／尿)中のＣＯＭＰフラグ
メント数を減らすこと、およびＣＯＭＰ総量に対する断片化ＣＯＭＰの比率を下
げることであろう。その他の滑液成分に対するＣＯＭＰフラグメントの比率もま
た、疾病プロセスを評価するための手段である。
実施例６ 関節炎症状、抗関節炎剤および軟骨保護剤の評価 １．慢性関節リウマチ
標準プロトコール(Pettipher et al（1988）Br．J．Pharmaco1．95:169-176)
によりウサギにて自己免疫関節炎を誘導する。滑液を疾病の進行に合わせていろ
いろな間隔で集める。ヒツジで産生したＣ−末端ＣＯＭＰに対する抗体を用いて
滑液をウェスタンメブロッティングまたはＥＬＩＳＡにより分析する。２．骨関節症
外科的施術(Columbo et al，（1983）Arthritis Rheum．26:875-86)によりウ
サギの膝に骨関節症を誘導する。滑液、血清および尿を疾病の進行に合わせてい
ろいろな間隔で集める。ＣＯＭＰフラグメントの分析は、実施例２および３に記
載のようにして行う。３．ＫＳ値に対するＬＭＷ−ＣＯＭＰ値の比率
実施例４.１に由来する滑液をＫＳについてアッセイした。平均ＫＳ値(μｇ/m
l)は、Campion GV et al.，Arthritis Rheum．34(10):1254-1259 1991の確立さ
れた方法を用いて測定し、実施例４.１の方法に従い得られた平均ＣＯＭＰフラ
グメント値は、平均ＫＳ値当りの平均ＣＯＭＰフラグメントの比率を測定するた
め、ＫＳ含量と比較した。下記表４に示したように、ＫＳ含量は、グループ間で
類似するようであるが、ＫＳに対するＣＯＭＰフラグメントの比率は、疾病が軽
度から中度、重度へと進行するにつれて、変化する。
表４
疾病種 重篤度 COMP LMW-COMP 平均KS COMP/KSの 平均LMW-
μｇ/ml μｇ/ml 比率 C0MPフラグメ
μｇ/ml ント/平均KS
値
骨関節症 軽度 86(n=2) 335(n=2) 23 3.74 14.89
（ＯＡ） 中度 54(n=6) 113(n=6) 27 2.00 4.26
重度 67(n=8) 189(n=8) 23 2.91 8.36
慢性関節 軽度 62(n=2) 236(n=2) 79 .78 2.99
リウマチ 中度 31(n=12) 126(n=11) 31 1.00 4.06
（ＲＡ） 重度 46(n=3) 316(n=3) 54 .85 5.85
全長ＣＯＭＰ/ＫＳ比率は、疾病状態に対して、ＬＭＷ−ＣＯＭＰ/ＫＳ比率よ
りも感度が低い。
実施例７ ヒトにおける抗関節炎剤および軟骨保護剤の評価
滑液は、骨関節症または慢性関節リウマチいずれかの患者から得た。滑液試料
２０μｌをヒアルロニダーゼで処理し、加熱し、次いで、非還元緩衝液または還
元緩衝液のいずれかで処理し、その後、実施例３に記載のようにＳＤＳゲルにか
けた。ＣＯＭＰおよび低分子量ＣＯＭＰフラグメントの存在について、実施例３
に記載の適切な抗体を用いて測定した。表５は、関節炎症状の処置は、その処置
がメトトレキセートまたはピロキシカムなどの強い抗関節炎化合物による場合、
より少ないＬＭＷ−ＣＯＭＰフラグメントを産生することを示す。
表５
関節炎症状の連続的処置は、診断中または処置前のＣＯＭＰフラグメントレベ
ルを測定するアッセイを実施し、それとＣＯＭＰフラグメントレベルとを、処置
進行中の様々な時点で比較することにより、監視し、測定した。こうして、在籍
内科医および臨床医は、抗関節剤の投与を調整して、関節炎症状の処置および軽
減を最適化できる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ
，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． (１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベ ート； (２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして (３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定 を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイ。 ２．体液サンプルが血清および滑液からなる群から選択される、請求項１記載 のアッセイ。 ３．滑液を更に粘性減少剤で処理する、請求項２記載のアッセイ。 ４．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbovお よびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体であ る、請求項２記載のアッセイ。 ５．抗−ＡＤＰ抗体が抗体Ｈ７４１である、請求項４記載のアッセイ。 ６．体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定法がＥＬＩＳＡであ る、請求項２記載のアッセイ。 ７． (１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元または非還元条件下でのインキュベ ート； (２)体液サンプルと、抗体Ｈ７４１および抗体Hrat、抗体Hbovおよび抗体Ｈ６６ ９からなる群から選択される抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして (３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルのＥＬＩＳＡによる測定 を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイ。 ８． (１)関節炎患者から得た体液サンプルの還元条件下でのインキュベート； (２)体液サンプルと抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして (３)体液サンプル中の結合抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定 を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイ。 ９．体液サンプルが血清および滑液からなる群から選択される、請求項８記載 のアッセイ。 １０．滑液を更に粘性減少剤で処理する、請求項９記載のアッセイ。 １１．還元条件がジチオスレイトールおよびメルカプトエタノールからなる群 から選択される還元剤の溶液である、請求項９記載のアッセイ。 １２．還元剤がジチオスレイトールの溶液である、請求項１１記載のアッセイ 。 １３．還元条件が０.１−１００ｍＭの濃度のジチオスレイトールの溶液であ る、請求項１２記載のアッセイ。 １４．還元条件が０.１ｍＭの濃度のジチオスレイトールの溶液、約３０秒か ら約３０分、約２５−４５℃である、請求項１２記載のアッセイ。 １５．還元条件が０.１ｍＭの濃度のジチオスレイトールの溶液、約５分、約 ３７℃である、請求項１４記載のアッセイ。 １６．体液を更にLMW-COMPを分離するための分離法に付す、請求項１１記載の アッセイ。 １７．分離法がＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動である、請求項１６記載のアッセイ 。 １８．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項９記載のアッセイ。 １９．抗−ＡＤＰ抗体が抗体Ｈ７４１である、請求項１８記載のアッセイ。 ２０．体液サンプル中の抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定法がウエスタンブロッ ティングまたはＥＬＩＳＡである、請求項９記載の方法。 ２１．体液を工程(３)の前に還元剤不活性化物質にさらす、請求項２０記載の アッセイ。 ２２．体液サンプル中の抗−ＡＤＰ抗体のレベルの測定法がウエスタンブロッ ティングである、請求項２１記載の方法。 ２３． (１)関節炎患者から得た体液サンプルの、０.１−１００ｍＭの濃度のジチオス レイトールの溶液、約３０秒から約３０分、約２５℃−４５℃である還元条件下 でのインキュベート； (２)体液サンプルと、抗体Ｈ７４１および抗体Hrat、抗体Hbovおよび抗体Ｈ６６ ９からなる群から選択される抗−ＡＤＰ抗体とのインキュベート；そして (３)ウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡによる体液サンプル中の結合抗 −ＡＤＰ抗体のレベルの測定（ウエスタンブロッティングは電気泳動後に行う） を含むＡＤＰのレベルの測定のためのアッセイ。 ２４．体液を工程(２)の前に還元剤不活性化物質にさらす、請求項２３記載の アッセイ。 ２５．１４,０００ダルトンから３３,０００ダルトンの分子量を有し、抗−Ａ ＤＰ抗体により認識されるタンパク質を含む、単離LMW-C0MPタンパク質。 ２６．LMW-COMP抗体がヒトＣOＭＰのＣ−末端へプタデカペプチドに対する抗 体である、請求項２５記載の単離LMW-COMPタンパク質。 ２７．タンパク質がＰＡＧＥで約２０,０００の分子量を有する、請求項２５ 記載のLMW-COMPタンパク質。 ２８．抗−ＡＤＰ抗体が抗体Ｈ７４１および抗体Hrat、抗体Hbovおよび抗体Ｈ ６６９からなる群から選択される、請求項２５記載の単離LMW-COMPタンパク質。 ２９．抗−ＡＤＰ抗体が抗体Ｈ７４１および抗体Hrat、抗体Hbovおよび抗体Ｈ ６６９からなる群から選択される、請求項２８記載の単離LMW-COMPタンパク質。 ３０．約２０,０００の見かけの分子量を有するLMW-COMPに結合する。抗体。 ３１．抗体Ｈ７４１および抗体Hrat、抗体Hbovおよび抗体Ｈ６６９からなる群 から選択される、請求項３０記載の抗体。 ３２．抗体がモノクローナル抗体である、請求項３１記載の抗体。 ３３．分子量約１４から約３３キロダルトンのLMW-COMPの溶液を含む、体液サ ンプル中のLMW-COMPのレベルの測定用キット。 ３４．抗−ＡＤＰ抗体を更に含む、請求項３３記載のキット。 ３５． (１)請求項１に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のLMW-COMP分解産物の レベルの測定； (２)体液サンプル中のＫＳのレベルの測定；そして (3)LMW-COMP対ＫＳの比率の測定 を含む、LMW-COMP分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。 ３６． (１)請求項７に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のLMW-COMP分解産物の レベルの測定； (２)体液サンプル中のＫＳのレベルの測定；そして (３)LMW-COMP対ＫＳの比率の測定 を含む、LMW-COMP分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。 ３７． (１)請求項８に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のLMW-COMP分解産物の レベルの測定； (２)体液サンプル中のＫＳのレベルの測定；そして (３)LMW-COMP対ＫＳの比率の測定 を含む、LMW-COMP分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。 ３８． (１)請求項２３に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のLMW-C0MP分解産物 のレベルの測定； (２)体液サンプル中のＫＳのレベルの測定；そして (３)LMW-COMP対ＫＳの比率の測定 を含む、LMW-COMP分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。 ３９． (１)請求項３４に従った、関節炎患者由来の体液サンプル中のLMW-COMP分解産物 のレベルの測定； (２)体液サンプル中のＫＳのレベルの測定；そして (３)LW-COMP対ＫＳの比率の測定 を含む、LMW-COMP分解産物対ＫＳの比率の測定のアッセイ。 ４０．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項３５記載のアッセイ。 ４１．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項３６記載のアッセイ。 ４２．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項３７記載のアッセイ。 ４３．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項３８記載のアッセイ。 ４４．抗−ＡＤＰ抗体がペプチドＨ７４１およびペプチドHrat、ペプチドHbov およびペプチドＨ６６９からなる群から選択される合成ペプチドに対する抗体で ある、請求項３９記載のアッセイ。 ４５．請求項１に従ったＡＤＰの測定を含む、哺乳類における関節炎状態の存 在および／または進行の診断法。 ４６．請求項７に従ったＡＤＰの測定を含む、哺乳類における関節炎状態の存 在および／または進行の診断法。 ４７．請求項８に従ったＡＤＰの測定を含む、哺乳類における関節炎状態の存 在および／または進行の診断法。 ４８．請求項２３に従ったＡＤＰの測定を含む、哺乳類における関節炎状態の 存在および／または進行の診断法。 ４９．請求項３４に従ったＡＤＰの測定を含む、哺乳類における関節炎状態の 存在および／または進行の診断法。
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