ES2340667T3 - Inmunodeficiencia homogeneos para multiples alergenos. - Google Patents
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Abstract
Método de inmunoensayo homogéneo para detectar y cuantificar simultáneamente niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas contra una pluralidad de alérgenos en una muestra de sangre, que comprende (a) poner en contacto una muestra de sangre que tiene un volumen de 1 a 25 μl con una pluralidad de partículas acopladas a una pluralidad de alérgenos, las partículas estando en suspensión en 1 a 50 μl de un medio acuoso, cada combinación de partículas con alérgeno específico siendo distinguible de combinaciones de partículas con otros alérgenos, en condiciones en las que los anticuerpos de inmunoglobulinas presentes en la muestra de sangre que se unen específicamente a uno o más de los alérgenos se unen a las partículas; (b) después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (a) con un primer conjugado que comprende un anticuerpo anti-humano IgE o IgG conjugado con biotina; (c) después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (b) con un segundo conjugado que contiene una porción fluorófora unida a avidina o estreptavidina, siendo el peso molecular del segundo conjugado de 400.000 a 1.000.000 de Daltons; y siendo la proporción molar del primer conjugado respecto al segundo conjugado de 1:1 a 1:5; y (d) después de eso, determinar los niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas en los materiales de la etapa (c), determinando simultáneamente las señales de emisión fluorescente de los subconjuntos de partículas y midiendo las señales de emisión fluorescente de la porción fluorófora.
Description
Inmunoensayos homogéneos para múltiples
alérgenos.
Esta invención se refiere a un método de
inmunoensayo homogéneo para determinar niveles de anticuerpos
específicos contra una multiplicidad de alérgenos a partir de una
muestra de sangre, o para determinar los niveles de
inmunoglobulinas E totales en dicha muestra, con el fin de
diagnosticar una alergia.
El término "alergia" es sinónimo de atopia
o hipersensibilidad y es el resultado de una reacción
inmunológicamente mediada por los individuos contra diversos
materiales antigénicos, conocidos como alérgenos. Las personas con
alergias producen inmunoglobulinas específicas de alérgeno, IgE e
IgG, en respuesta a la exposición a sustancias normalmente
inofensivas de pólenes, mohos, caspa o alimentos que se inhalan o se
ingieren. Los anticuerpos generados se liberan para su circulación
en la sangre y finalmente se fijan a células específicas en
tejidos. Generalmente, la exposición a alérgenos da como resultado
reacciones inmediatas o retardadas, que se manifiestan con varios
síntomas comúnmente identificables tales como estornudos, picor de
ojos, rinorrea e inflamación de los pulmones y de las fosas
nasales. Generalmente, el término "alergia" también es sinónimo
de fiebre del heno, rinitis, eccema, urticaria, y está relacionado
con la aparición de asma. El diagnóstico de alergia implica una
revisión de la historia del paciente, exámenes físicos y realización
de un ensayo de diagnóstico confirmatorio para identificar si los
síntomas del paciente son de origen alérgico o no alérgico. Si una
alergia es responsable de los síntomas, entonces deben identificarse
los alérgenos responsables. Los pacientes con enfermedades atópicas
o alérgicas pueden ser monosensibles a un alérgeno; sin embargo, la
sensibilización a múltiples alérgenos es más habitual. Las
reacciones de las personas a alérgenos pueden variar de las molestas
a las graves o incluso mortales. Por lo tanto, es deseable ser
capaz de determinar, no sólo si una persona tiene alergias, sino de
ser así, a qué alérgenos y en qué nivel de gravedad, de modo que
pueda evitarse, minimizarse o mitigarse la exposición por métodos
farmacoterapéuticos o inmunoterapéuticos.
El ensayo de diagnóstico confirmatorio puede
realizarse mediante un ensayo cutáneo in vivo, un ensayo de
provocación in vivo o un ensayo in vitro para
determinar la presencia de anticuerpos específicos contra alérgenos
circulantes a partir de muestras de sangre. La provocación directa,
por inhalación o ingestión directa de alérgenos que posiblemente
actúan como agentes causales, aunque relevante, es desagradable,
posiblemente peligrosa y no puede realizarse para múltiples
alérgenos de una vez.
El ensayo cutáneo (también denominado ensayo de
escarificación o ensayo de punción cutánea) es un procedimiento
in vivo que implica aplicar una muestra de alérgeno, o más
generalmente una multiplicidad de alérgenos, directamente en el
antebrazo o la espalda de un paciente por medio de una pequeña
lesión de raspado con aguja y medir el tamaño de la reacción
inflamatoria (habón) en el sitio de aplicación en la piel. El ensayo
de punción cutánea, usado ampliamente, es fiable en condiciones de
ensayo óptimas, puede ser doloroso, está sujeto a grandes
diferencias en la técnica y las interpretaciones y no puede usarse
en pacientes que toman determinados fármacos o pacientes con
problemas cutáneos. Además, los métodos de diagnóstico in
vivo tanto de provocación como de punción cutánea tienen el
potencial de sensibilizar a los pacientes a nuevos alérgenos y, en
casos extremos, generar una reacción anafiláctica potencialmente
mortal tras la exposición directa al alérgeno o alérgenos
causales.
Los métodos de ensayo de diagnóstico in
vitro miden directamente los niveles circulantes de anticuerpos
específicos contra alérgenos en una muestra de sangre obtenida de
pacientes. Generalmente, estos métodos son procedimientos de
inmunoensayo que son reproducibles, son equivalentes en sensibilidad
y especificidad a ensayos de punción cutánea bien realizados, no se
ven afectados por ninguno de los factores que impiden el uso de
cualquiera de los dos métodos in vivo y no causan
acontecimientos anafilácticos. Las técnicas de inmunoensayo capaces
de medir niveles de anticuerpos específicos contra alérgenos
individuales se han empleado durante muchos años (Johansson, S. G.
O. y Yman, L., In vitro assay for immunoglobulin E, Coin.
Rev. Allergy 6, 93-139, 1988). Como alternativa,
los métodos que miden niveles específicos de alérgenos contra una
pluralidad de alérgenos simultáneamente han proporcionado exámenes
de alergias más útiles como se describe, por ejemplo, en las
patentes de Estados Unidos 4.459.360 y 5.082.768. La patente de
Estados Unidos 6.087.188 describe un método de detección de un
anticuerpo en una muestra usando partículas paramagnéticas y un
compuesto de acridinio quimioluminiscente unido a avidina o
estreptavidina. Se indica que el método descrito en esta patente es
útil para la detección de alérgenos. Sin embargo, el método se
limita a la detección de un solo alérgeno en una muestra dada.
En el campo del diagnóstico clínico, existe una
amplia categoría de métodos disponibles para determinar una lista
en expansión de analitos clínicamente pertinentes. Una de estas
categorías son los inmunoensayos, que se usan actualmente para
determinar la presencia o la concentración de diversos analitos en
muestras biológicas, de forma tanto conveniente como fiable (The
Immunoassay Handbook, editado por David Wild, M Stockton Press,
1994). Los inmunoensayos utilizan agentes de unión específicos
contra analitos diana en fluidos, donde al menos uno de dichos
agentes de unión está generalmente marcado con una diversidad de
compuestos, incluyendo radioisótopos, enzimas y compuestos
fluorescentes o quimioluminiscentes, que pueden medirse por las
desintegraciones radioactivas, los sustratos productores de color
inducidos enzimáticamente, la emisión o la inhibición de
fluorescencia y la emisión de luz quimioluminiscente. Dichos agentes
de unión específicos incluyen típicamente anticuerpos específicos
de analito (inmunoglobulinas) y fragmentos de anticuerpos,
receptores, lectinas y anticuerpos artificiales modificados
químicamente o por ingeniería genética. Los métodos de inmunoensayo
destacados incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
(Enzyme-Immunoassay, Edward T. Maggio, CRC Press,
1980), inmunoensayo fluorescente (FIA) y ensayos quimioluminiscentes
(CLA) (Luminescent Assays, Perspectives in Endocrinology and
Clinical Chemistry, Vol. 1, Mario Serio y Mario Pazzagli, Raven
Press, 1982), (Bioluminescence and Chemiluminescense, Basic
Chemistry and Analytical Applications, Marlene, A. DeLuca y William
D. McElroy, Academic Press, 1981), (Journal of Bioluminiscence, Vol.
4, M. Pazzagli, et al., Proceedings of the Vth International
Symposium-on-Bioluminiscence and
Chemiluminiscence, Wiley, 1989), etc. Están disponibles numerosas
variaciones de métodos y dispositivos para realizar dichos ensayos,
los conocen los expertos en la materia y pueden encontrarse en la
bibliografía científica y de patentes.
Los inmunoensayos pueden ser heterogéneos u
homogéneos. Los inmunoensayos heterogéneos se han aplicado a
analitos tanto de bajo peso molecular como de alto peso molecular y
requieren la separación de los materiales unidos (a detectar o
determinar) de los materiales libres (que pueden interferir con esa
determinación). Los inmunoensayos heterogéneos pueden comprender un
anticuerpo o un antígeno inmovilizado sobre superficies sólidas
tales como placas de microtitulación de plástico, perlas, tubos o
similares o sobre láminas de membrana, microplacas y fragmentos de
vidrio, nylon, celulosa o similares (Immobilized Enzymes, Antigens,
Antibodies, and Peptides, Howard H. Weetall, Marcel Dekker, Inc.,
1975). En los inmunoensayos heterogéneos, los complejos de
antígeno-anticuerpo unidos a la fase sólida se
separan del analito inespecífico y que no ha reaccionado en
solución, generalmente por centrifugación, filtración,
precipitación, separación magnética o aspiración de los líquidos de
las fases sólidas, seguido de lavado repetido del complejo
antígeno-anticuerpo unido a la fase sólida. Son de
interés particular los ensayos tipo "sándwich" inmunométricos
(Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, John E.
Butler, CRC Press, 1991) que primero requieren la unión de un
antígeno o anticuerpo inmovilizado con el analito diana de la
muestra biológica. La separación del par inmovilizado y el posterior
lavado repetido se siguen de la introducción de un agente de unión
segundario específico para el analito, estando habitualmente dichos
agentes de unión secundarios conjugados químicamente con los
radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes o
quimioluminiscentes descritos anteriormente. Típicamente, los
agentes de unión secundarios son anticuerpos de inmunoglobulinas,
fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales o anticuerpos
recombinantes. El analito queda "intercalado" entre el primer
antígeno inmovilizado o anticuerpo y el agente de unión secundario
marcado. Es necesaria una separación y un lavado posterior para
eliminar los agentes de unión secundarios marcados no unidos. Se
emprende entonces la medición directa del complejo unido
inmovilizado marcado o la medición indirecta con el uso de
sustratos. Los expertos en materia de realización de inmunoensayos
de fase sólida pueden apreciar que los procedimientos son
laboriosos, requieren mucho tiempo y requieren un equipamiento o
dispositivos especiales para separar los agentes de unión
inmovilizados y los analitos.
Los ensayos homogéneos son, en general,
procedimientos en fase líquida que no utilizan antígenos o
anticuerpos que están inmovilizados sobre materiales sólidos. No
son necesarias etapas de separación y lavado. Los procedimientos
implican más comúnmente el uso de antígenos o anticuerpos marcados
fluorescentemente que tras la unión con un analito diana
experimentan una excitación o extinción de las emisiones de
fluorescencia debido a la estrecha proximidad estérica del par de
unión. Los métodos homogéneos se han desarrollado típicamente para
la detección de haptenos, moléculas pequeñas tales como fármacos,
hormonas y péptidos. Habitualmente, los analitos macromoleculares,
tales como proteínas o péptidos con un peso molecular superior a
5000, no se determinan por métodos homogéneos debido a una falta de
sensibilidad de los ensayos. Se describió un método homogéneo para
la detección de proteínas en la patente US 5.807.675, que requería
modificaciones químicas en ambos agentes de unión, pero se limita a
la detección de analitos individuales.
Para el diagnóstico de alergias es útil la
determinación de los niveles de inmunoglobulina E total, pero lo
que es más importante, existe la necesidad de un método de
inmunoensayo conveniente y fiable que mida simultáneamente niveles
de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas contra un panel de
alérgenos, donde uno o más alérgenos pueden ser responsables de la
aparición de los síntomas alérgicos. Se desea además que el ensayo
del protocolo de inmunoensayo se lleve a cabo fácilmente y sea
adaptable a la automatización. Los métodos in vitro
actualmente disponibles utilizan métodos de inmunoensayo
heterogéneos en los que es necesaria la separación y el lavado,
haciendo que requieran mucha mano de obra, mucho tiempo y sean
difíciles de automatizar. También sería ventajoso combinar la
versatilidad y la sensibilidad de los métodos de ensayo heterogéneos
de fase sólida con la sencillez de un protocolo homogéneo. Además,
la realización de ensayos de alergia in vitro sobre un panel
de alérgenos requiere extraer una muestra significativa,
generalmente de 3-5 mililitros, de sangre venosa del
paciente. De hecho, el paciente debe acudir a un laboratorio o
consulta médica con el único fin de que se le extraiga la muestra
de sangre.
Los avances recientes en los métodos de
inmunoensayo han introducido microtécnicas que utilizan fases
sólidas más pequeñas y requerimientos de muestra menores. Un
ejemplo es un método de microinmunoensayo para realizar el análisis
y la detección de múltiples biomoléculas que se describe en la
patente US 5.981.180. Se ha comercializado un aparato de este tipo
general por la Luminex Corporation con la marca comercial
FlowMettix®. La tecnología incorpora un procedimiento citométrico
de flujo y el uso de conjuntos de perlas de poliestireno pequeñas de
5,6 micrómetros, conteniendo cada conjunto un distintivo
fluorescente interno que permite la detección de múltiples
analitos. Para el ensayo de alergias in vitro, cuando los
niveles específicos de anticuerpos están en bajas concentraciones
en la sangre circulante, es necesaria sangre o suero sin diluir para
permitir la detección de anticuerpos que están a niveles de
subnanogramos a picogramos por mililitro. Hasta ahora, se han
empleado métodos de inmunoensayo heterogéneos más que homogéneos con
los métodos de ensayo de alergias in vitro existentes ya que
la sangre o suero sin diluir contiene muy a menudo niveles de
microgramos de niveles de anticuerpos libres o inespecíficos
(totales) que pueden interferir con las determinaciones usando
ensayos homogéneos.
Se ha sabido que los métodos de ensayo
homogéneos que usan sangre o suero sin diluir para medir niveles de
anticuerpos de subnanogramos o picogramos por mililitro muestran
niveles falsamente reducidos o falsamente indetectables de
anticuerpos específicos en muestras en las que los niveles de
anticuerpos libres o inespecíficos en suero sin diluir están en el
intervalo de microgramos por mililitro. Dichos falsos resultados se
conocen como "efecto gancho". El efecto gancho se describe por
Robard, D., (Radioisotopes: 37, (10), 1988), en el Immunoassay
Handbook (Editado por David Wild, M Stockton Press 1994) y el Manual
of Clinical Laboratory Immunology (4ª ed. Rose, et al.,
Editores) publicado por la American Society for Microbiology
(Capítulo 2, página 5). Implica una disminución inesperada en la
cantidad de un analito en el extremo elevado de una curva de
dosis-respuesta que da como resultado una
estimación bruta demasiado baja del analito. El efecto gancho está
causado por altas concentraciones de analito libre, es decir, no
unido, de muestras de suero o sangre puras que se unen a agentes de
unión secundarios, reduciendo la disponibilidad del agente de unión
secundario para el analito unido a la fase sólida, dando
posteriormente una señal falsamente menor, que indica por lo tanto
una concentración de analito falsamente reducida. Los formatos de
ensayo heterogéneos, en concreto, ensayos tipo sándwich
inmunométricos, evitan generalmente la interferencia con las etapas
de separación y lavado intrínsecas a los procedimientos.
Las referencias mencionadas anteriormente
sugieren varios modos en los que los laboratorios pueden resolver
este efecto gancho. Una estrategia sugerida es procesar todas las
muestras de pacientes a dos diluciones como un filtro para este
problema. Si la muestra más diluida indica un nivel
significativamente superior de analito, se alerta al laboratorio de
la posibilidad de un efecto gancho. Después pueden realizarse
diversas diluciones para proporcionar una determinación exacta de
la cantidad de analito existente en la muestra. Dichos
procedimientos, por supuesto, dan como resultado la duplicación del
trabajo y la prolongación del tiempo y de los costes necesarios
para realizar el ensayo de la muestra de un paciente dado. Como
alternativa, pueden usarse grandes excesos de agente de unión
secundario, suficientes para unirse a anticuerpos de analitos
específicos e inespecíficos tanto unidos como no unidos. Sin
embargo, esta estrategia no ha resultado ser práctica debido a las
grandes concentraciones de anticuerpos de analitos específicos e
inespecíficos no unidos en sangre sin diluir, los volúmenes
relativamente grandes de suero o plasma típicamente necesarios en la
realización de ensayos de alergia in vitro y los costes del
agente de unión secundario que se usaría.
Sería ventajoso proporcionar un método de ensayo
homogéneo para detectar la presencia de anticuerpos específicos
contra una multiplicidad de alérgenos, simultáneamente en un solo
ensayo, o determinar el contenido de anticuerpo de IgE total en una
muestra de sangre que no tendería a la aparición del efecto gancho.
También sería ventajoso proporcionar un método de ensayo de
muestras de sangre de un paciente para determinar alergias que
pudiera eliminar la necesidad de que el paciente acuda a un
laboratorio o consulta médica, así como la necesidad de que se le
extraiga una cantidad bastante sustancial de sangre con el fin de
este ensayo. La invención descrita en este documento proporciona
dichas ventajas, así como otras que pueden ser evidentes a partir de
la información descrita.
Hablando muy en general, esta invención
proporciona un método para detectar y cuantificar simultáneamente
niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas contra una
pluralidad de alérgenos, usando una muestra de sangre muy pequeña,
con el fin de diagnosticar una alergia. La invención también
proporciona un método para detectar y cuantificar niveles de
inmunoglobulina E total en dicha toma de muestra de sangre
pequeña.
La invención proporciona los métodos que se
definen en las reivindicaciones.
La Figura 1 es una vista de gráfica y en forma
de tabla de un ensayo de IgE específica contra un panel de diez
alérgenos conforme a la presente invención de acuerdo con el Ejemplo
1.
La Figura 2 es una vista de gráfica y en forma
de tabla de un ensayo de IgE total de acuerdo con el Ejemplo 2.
Esta invención proporciona un método para
detectar y cuantificar anticuerpos específicos contra alérgenos en
una muestra de sangre de un individuo, para el diagnóstico de una
alergia. Hasta ahora, los ensayos in vitro para determinar
alergias han empleado métodos de inmunoensayo que requieren
extracción de muestras de sangre venosa para permitir el ensayo en
un panel de alérgenos. Típicamente, los requerimientos de muestra
de los métodos actuales, para determinar niveles de anticuerpos
específicos contra un panel de cinco o más alérgenos, son de uno a
tres mililitros de sangre. En comparación con la técnica anterior,
la invención limita los requerimientos de volumen de muestra a diez
microlitros de muestra o menos, que pueden usarse para realizar un
ensayo contra dos o más alérgenos, preferiblemente contra diez,
veinte, cuarenta o más alérgenos. La cantidad de muestra necesaria
es lo bastante pequeña para que los individuos puedan obtener a
distancia una muestra de sangre usando un procedimiento de punción
en la yema del dedo o similar. La invención elimina la necesidad de
obtener muestras de sangre por procedimientos de extracción venosa
en consultas médicas, laboratorios hospitalarios o laboratorios
clínicos de referencia.
Al individuo cuya sangre se va a ensayar se le
proporciona un kit para recoger y enviar, o remitir de otro modo,
la muestra de sangre. El kit contiene típicamente uno o más
dispositivos para la punción de la piel de un dedo u otra porción
del cuerpo (por ejemplo, un dispositivo de punción digital o
pinchazo en la yema del dedo) para extraer algo de sangre, un
hisopo con alcohol u otro antiséptico para limpiar el área en la
que se va a realizar la punción, un vial u otro recipiente pequeño
en el que deberá depositarse la sangre y cerrarse herméticamente y
un recipiente apropiado para enviar la muestra de sangre al
laboratorio para su ensayo. El kit también puede contener artículos
adicionales tales como esparadrapo para proteger la herida,
prospectos de instrucciones y etiquetas con números de
identificación individuales (por ejemplo, PIN) para muestras. En
cualquier caso, la forma y el contenido exactos de un kit de este
tipo pueden variar de acuerdo con los deseos del laboratorio y no
forman parte de esta invención. Están fácilmente disponibles
numerosos componentes para dichos kits para la recogida y/o ensayo
de sangre (por ejemplo, en casa) con diversos fines.
Además, debería señalarse que el suministro de
una muestra de sangre por el individuo sin acudir a una consulta
médica o laboratorio no es una característica limitante, sino sólo
una ventaja del mismo. La muestra de sangre puede bien tomarse
durante una visita a una consulta médica y remitirse a un
laboratorio para su ensayo. En tal caso, se consiguen otras
ventajas de la invención, tales como la capacidad de ensayar una
muestra pequeña sin requerir la dilución y/o duplicación de los
ensayos.
El uso de dicho volumen de muestra limitado
evita esencialmente la presencia de grandes cantidades de anticuerpo
de IgE libre en el ensayo y los efectos gancho resultantes que
hasta ahora han constituido un obstáculo para los formatos
homogéneos con ensayos in vitro para determinar alergias. Los
métodos de ensayo in vitro para diagnosticar alergias han
empleado hasta ahora métodos de inmunoensayo heterogéneos, más en
general, procedimientos de ensayo tipo sándwich inmunométricos de
dos sitios que requieren que se realicen etapas de separación y
lavado. También son necesarias muestras de suero, plasma o sangre
puras en estos procedimientos para obtener los niveles de
sensibilidad necesarios para determinar niveles circulantes en
sangre de anticuerpo específico que estén en los niveles de
10^{-9} a 10^{-12} molar o en el intervalo reducido de
nanogramo/ml a picogramo/ml. Hasta ahora no se han empleado ensayos
homogéneos debido a los altos niveles de anticuerpos específicos e
inespecíficos que están presentes generalmente en muestras de sangre
puras de individuos alérgicos y a la aparición del efecto gancho de
alta dosis en estos ensayos. La invención proporciona un método de
ensayo que combina un procedimiento de inmunoensayo de tipo
sándwich en fase sólida con un formato de ensayo homogéneo, en el
que no existe necesidad de separación de materiales, lavado, etc., y
no existe necesidad de dilución de la muestra.
El método de ensayo cuantifica los niveles de
IgE total y los niveles de anticuerpos específicos que son
esenciales para el diagnóstico de una alergia y para la
determinación del grado o intensidad de la respuesta alérgica a
alérgenos conocidos.
Una etapa preliminar en la realización del
método para su uso en esta invención es la preparación y recogida
de una pluralidad de partículas sólidas acopladas a una pluralidad
de alérgenos para proporcionar un panel de alérgenos a ensayar, por
ejemplo, para determinar si los síntomas alérgicos de un individuo
están mediados por uno o más de los alérgenos que se están
investigando.
Cada combinación de partículas con un alérgeno
específico en el panel puede distinguirse de combinaciones de
partículas con otros alérgenos. Un alérgeno específico puede estar
compuesto por proteínas extraídas, fracciones proteicas purificadas
por métodos cromatográficos o de cromatografía de afinidad,
proteínas recombinantes o combinaciones de las anteriores. También
pueden utilizarse mezclas de alérgenos, tales como dos o más
hierbas, árboles o alimentos, por ejemplo. La capacidad para
distinguir entre combinaciones de partículas con diferentes
alérgenos se logra proporcionando una pluralidad de partículas de
diferentes tipos. Es decir, las partículas pueden dividirse en
subconjuntos, siendo cada subconjunto distinguible de otros
subconjuntos conforme a una propiedad, característica o
características particulares. Por ejemplo, las partículas pueden
dividirse en subconjuntos en los que cada subconjunto es capaz de
distinguirse por un color o espectro de emisión específico, que
puede proporcionarse por la presencia de un fluorocromo o
combinaciones de fluorocromos incorporados en o sobre las mismas,
por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos
5.981.180. Cada subconjunto de las partículas se acopla a un
alérgeno específico de modo que, de nuevo, la combinación de
partículas con alérgenos específicos puede distinguirse de
combinaciones de partículas con otros alérgenos, conforme a la
característica o características particulares que distinguen a la
partícula o perla en cuestión de otras que se usan. El acoplamiento
de los alérgenos a las perlas o partículas se logra por métodos de
acoplamiento covalente o adsorción bien conocidos por los expertos
en la materia y descritos en la bibliografía de patentes y
científica (véase, por ejemplo, Immunochemistry of
Solid-Phase Immunoassay, John E. Butler, CRC Press,
1991 e Inmobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides,
editado por Howard H. Weetall, Marcel Dekker, Inc. Nueva York,
1975).
Las propias partículas son típicamente esféricas
(es decir, "perlas o microesferas"), con una superficie rugosa
o lisa, y se preparan como se sabe en la técnica. Están hechas de
diversos materiales, habitualmente vidrio no poroso, poliestireno,
látex u otros materiales poliméricos, y generalmente tienen un
diámetro de 0,05 micrómetros a 90 micrómetros, preferiblemente de
0,5 a 10 micrómetros de diámetro, con densidades que varían de
aproximadamente 1 a 2 g/ml, preferiblemente próximas a la densidad
del agua.
Las combinaciones de partícula/alérgeno se
almacenan preferiblemente en una solución tamponada que contiene un
estabilizante de proteínas y un agente bacteriostático para su uso
según se desee.
Una vez que están preparados los subconjuntos de
combinaciones de partículas/alérgenos individuales, los subconjuntos
puede usarse individualmente o pueden mezclarse entre sí para
formar un solo ensamblaje de alérgenos acoplados a partículas. Esto
puede realizarse antes de realizar ensayos para proporcionar un
panel preensamblado de alérgenos para su uso en general, o puede
realizarse para cada ensayo individual, por ejemplo, en el caso de
que se desee adaptar uno o más ensayos a la localización geográfica
o entorno de determinados pacientes. Las concentraciones de
partículas pueden determinarse y ajustarse usando un contador
convencional y el número de partículas deseado para el ensayo puede
dividirse en alícuotas. Se prefiere que el número de partículas en
suspensión sea de una cantidad limitada y de un volumen limitado
para asegurar la sensibilidad, velocidad y adaptabilidad del ensayo
a formatos de microensayo automáticos (si se va a usar un ensayo
automático). Las partículas en suspensión deberían estar a una
densidad próxima a la del agua y suspenderse en un medio tamponado
o acuoso suficiente en volumen para permitir el movimiento molecular
y el contacto molecular y poder adaptarse a formatos de
microensayo.
El panel para ensayo puede contener, en su
conjunto, tan pocos como 2, preferiblemente tan pocos como
aproximadamente 5, y hasta aproximadamente 100 alérgenos
específicos o mezclas de alérgenos; sin embargo, son más comunes
paneles de 10 a 40 alérgenos. Se prefiere que para cada ensayo, la
muestra se añada a un suspensión que contiene de aproximadamente
1000 partículas a aproximadamente 4000 partículas de cada conjunto
de alérgeno acoplado a partícula o mezcla de alérgenos,
preferiblemente en un volumen pequeño, por ejemplo, un volumen de
aproximadamente 1 a aproximadamente 50 \mul, preferiblemente de
aproximadamente 5-25 \mul. Por lo tanto, por
ejemplo, un ensayo con un panel de 10 alérgenos contendría
aproximadamente 10.000 partículas en 5-20
microlitros de una solución tamponada. Así mismo, un ensayo con un
panel de 20 alérgenos incorporaría aproximadamente 20.000
partículas en un volumen de 5-20 microlitros. El
aumento del número de partículas en un ensayo disminuye la cantidad
de tiempo necesario para identificar y leer las partículas.
Las partículas preparadas de este modo se ponen
en contacto con una muestra de sangre de un individuo. La muestra
de sangre tendrá un volumen de aproximadamente 1 a aproximadamente
25 \mul, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente
10 \mul, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5 \mul. Los expertos en la materia reconocerán
que la unión de analitos a antígenos o anticuerpos está influenciada
por las condiciones de incubación, tales como el tiempo, la
temperatura, el pH, la fuerza iónica de los reactivos y similares,
y las condiciones de un ensayo dado se seleccionarán como se sabe en
la técnica para optimizar la sensibilidad y especificidad del
ensayo y ser apropiadas en general para la facilidad de uso del
protocolo y su adaptabilidad a la automatización. En general,
dichas condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente 18 a
aproximadamente 37ºC, preferiblemente temperaturas ambiente de
aproximadamente 18 a aproximadamente 25ºC, y un tiempo de
aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas,
preferiblemente de 1 hora o menos. Durante la primera fase de
incubación, los anticuerpos específicos de una muestra de sangre de
un individuo se unirán a alérgenos específicos sobre partículas a
través de fuerzas de unión de antígeno-anticuerpo
normales. La suspensión contendrá tanto anticuerpos específicos
libres como inespecíficos libres, así como anticuerpos específicos
unidos a partículas.
Para la determinación de los anticuerpos de
inmunoglobulina total en una muestra de sangre, los anticuerpos
anti-humano acoplados a partículas se ponen en
contacto con una muestra de un individuo. La muestra tendrá un
volumen de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 \mul,
preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 \mul,
más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 \mul.
Los tiempos y las condiciones de incubación se determinan como se
describe en este documento. En una realización de esta invención, el
ensayo para determinar las inmunoglobulinas totales es capaz de
determinar niveles de hasta 4800 ng/ml de inmunoglobulinas
totales.
Después, se añade secuencialmente a la mezcla un
primer conjugado que comprende un anticuerpo contra el analito
específico, tal como anti-IgE humana, que se acopla
al primer miembro de un par de unión específico. No es necesaria la
separación de las partículas de fase sólida del medio de reacción y
la muestra. El par de unión específico es un par de moléculas que
tienen especificidad de unión entre sí. Son ejemplos de tipos de
pares de unión específicos biotina-avidina,
biotina-estreptavidina,
digoxina-antidigoxina y homopolinucleótidos
poli(dA)-poli(dT) complementarios
(descritos en la patente de Estados Unidos 6.245.513). El par de
unión específico de biotina-estreptavidina se
emplea en esta invención. En una realización preferida, una
pluralidad de un miembro del par de unión específico (biotina) se
acopla (conjuga) con el anticuerpo (por ejemplo,
anti-IgE humana). El segundo miembro del par de
unión específico, la estreptavidina, se acopla a un marcador
fluorescente o porción fluorófora como se describe a continuación.
La unión del segundo miembro del par de unión específico, la
estreptavidina, a la pluralidad de biotinas conjugadas con
anticuerpo amplifica la señal fluorescente, proporcionando una
mayor sensibilidad de ensayo. La biotinilización de anticuerpos
puede realizarse por procedimientos bien conocidos en la técnica.
Típicamente, los conjugados de anticuerpo-biotina
obtenidos en el mercado o preparados contienen de 5 a 10 moléculas
de biotina por molécula de anticuerpo. En esta solicitud preferida,
la sensibilidad de ensayo óptima se obtiene cuando se acoplan de
aproximadamente 10 a aproximadamente 30 moléculas de biotina por
molécula de anticuerpo, preferiblemente aproximadamente
15-25 moléculas de biotina por molécula de
anticuerpo.
De nuevo aquí, los expertos en la materia
reconocerán que la unión de analitos a antígenos o anticuerpos está
influenciada por las condiciones de incubación, tales como el
tiempo, la temperatura, el pH, la fuerza iónica de los reactivos y
similares, y las condiciones de un ensayo dado se seleccionarán como
se sabe en la técnica para optimizar la sensibilidad y
especificidad del ensayo y ser apropiadas en general para la
facilidad de uso del protocolo y su adaptabilidad a la
automatización. En general, dichas condiciones incluyen una
temperatura de aproximadamente 18 a aproximadamente 37ºC,
preferiblemente temperaturas ambiente de aproximadamente 18 a
aproximadamente 25ºC, y un tiempo de aproximadamente 15 minutos a
aproximadamente 24 horas, preferiblemente de 1 hora o menos.
Durante la segunda fase de incubación, los agentes de unión
secundarios se unirán al complejo de
partícula-analito a través de fuerzas de unión de
antígeno-anticuerpo normales.
La selección de los conjugados se realiza con el
objetivo de aumentar el rendimiento y la sensibilidad del ensayo
por un intervalo de 10^{-9} a 10^{-12} molar sin encontrar
efectos gancho y de extinción de la florescencia.
Después de un periodo de incubación adecuado del
primer conjugado con la mezcla de partículas y muestra, se añade a
la mezcla un segundo conjugado que contiene el segundo miembro del
par de unión específico conjugado con un fluoróforo. El segundo
miembro del par de unión es avidina o estreptavidina, más
preferiblemente estreptavidina.
Puede efectuarse la unión covalente de
marcadores fluorescentes a avidina o estreptavidina mediante una
diversidad de técnicas anteriormente descritas en la bibliografía
de patentes y científica (Haugland, R. P., Bhalagat, M. K.,
Preparation of avidin conjugates, Methods Mol. Biol. 1998; 80:
185-96). Se describen restos fluorescentes típicos
en el Capítulo 3 del Manual of Clinical Laboratory Immunology, véase
anteriormente. Como alternativa, los conjugados pueden obtenerse de
fuentes comerciales. Pueden usarse colorantes fluorescentes tales
como fluoresceína, los colorantes de arilsulfonato cianina,
colorantes de ficobiliproteína, colorantes BODIPY y similares. Si
los subconjuntos de partículas se distinguen entre sí basándose en
la incorporación de fluorocromos, los colorantes usados en los
conjugados se seleccionan de modo que tengan emisiones fluorescentes
que sean diferentes de y no interfieran con los espectros de
emisión de los subconjuntos de partículas. Un tipo preferido de
material fluorescente es una clase de compuestos conocidos como
ficobiliproteínas, más particularmente las ficoeritrinas, las
ficocianinas y las aloficocianinas, más preferiblemente las
ficoeritrinas. Los conjugados con ficoeritrina tienen
sensibilidades que oscilan entre cinco y diez veces superiores a las
de los conjugados con fluoresceína correspondientes, con
rendimientos cuánticos de hasta 0,98 y coeficientes de extinción de
hasta 2,4 millones (cm^{-1} M^{-1}). La más preferida de éstas
es la R-ficoeritrina. En el segundo conjugado, la
proporción molecular de colorante fluorescente respecto al segundo
miembro del par de unión puede variar generalmente de
aproximadamente 1:1 a aproximadamente más de 5:10. El peso molecular
del segundo conjugado es generalmente de 400.000 a 1.000.000 de
daltons.
Los materiales se incuban en condiciones
apropiadas para la unión de los miembros del par de unión. Éstas,
como se conocen en la técnica, incluyen típicamente una temperatura
de aproximadamente 18ºC a aproximadamente 45ºC, preferiblemente de
aproximadamente 18ºC a aproximadamente 25ºC, y un tiempo de
aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas,
preferiblemente de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 3
horas.
En este proceso global, los anticuerpos marcados
fluorescentemente se unen a las partículas a través del primer y
segundo compañeros de unión y a través de la unión del anticuerpo al
antígeno analito. Por lo tanto, pueden detectarse y medirse por
aplicación de una energía de excitación que tenga una longitud de
onda seleccionada para excitar el marcador fluorescente
seleccionado, donde los espectros de emisión que se genera son
diferentes de los espectros de emisión incorporados en las
partículas.
Una característica importante del método global
de esta invención es que el inmunoensayo puede realizarse sin
dilución de la muestra. Además, al permitir el uso de muestras de
pequeño volumen, ahora es posible un formato de ensayo homogéneo
con partículas de fase sólida con una sensibilidad y un intervalo de
ensayo apropiados.
Siendo aplicable a ensayos tanto de
inmunoglobulina total como específica, el individuo que remitió la
muestra, u otro individuo que actúa con su permiso, puede obtener
acceso a los resultados de ensayo en Internet, o un sistema
informático global similar, por ejemplo, en un sitio Web por medio
de un servidor Web.
Como se usa en este documento, la expresión
"servidor Web" también puede referirse a una pluralidad de
servidores organizados para manejar un gran número de solicitudes
para un servidor Web, es decir, un sistema de servidor Web
distribuido. La expresión "sitio Web" se usa a menudo para
referirse a un grupo de servidores Web organizados por una entidad
empresarial u otra entidad para sus fines. Se dice que un usuario
"entra" o "accede" a un sitio Web cuando el usuario
dirige su cliente Web para realizar una solicitud de un o de los
servidores Web del sitio y mostrar la respuesta al usuario (aunque
en realidad el usuario y el cliente Web no se mueven físicamente).
La percepción del usuario es que existe una localización en la Web
en la que existe este sitio Web, pero debería entenderse que la
expresión "sitio Web" se refiere a menudo al servidor o
servidores Web que responden a las solicitudes de clientes Web,
aunque el "sitio" no se refiere necesariamente a la
localización física de los servidores Web. De hecho, en muchos
casos, los servidores que sirven un sitio Web pueden estar
distribuidos físicamente para evitar tiempos de inactividad cuando
se producen cortes locales en el servicio eléctrico o de red.
La expresión "sitio Web" se refiere
típicamente a un grupo de páginas mantenidas por un administrador
común para su presentación a visitantes, independientemente de que
el grupo se mantenga en un servidor físico en una localización
física o esté distribuido por muchas localizaciones y/o servidores.
Las páginas (o el código de datos/programa necesario para generar
las páginas dinámicamente) no tienen que generarse por el
administrador común del grupo de páginas. Dicho administrador del
grupo de páginas se denomina típicamente operador del sitio
Web.
La expresión "sitio Web" también incluye
sitios Web conectados a los clientes Web por una intrarred, una red
de protocolo de acceso inalámbrico (WAP), una red de área local
(LAN), una red de área amplia (WAN), una red privada virtual (VPN)
u otra organización de red. El término "Web" se refiere
típicamente a "Red Global Mundial" (o sólo "la WWW"), un
nombre dado al grupo de documentos conectados por hipervínculos
accesibles en Internet usando HTTP. Como se usa en este documento,
el término "Web" puede referirse a la Red Global Mundial, un
subconjunto de la Red Global Mundial, un grupo local de páginas
conectadas por hipervínculos o similares.
El remitente de la muestra (u otra persona que
tenga autorización del remitente, tal como un familiar, médico y
otro asistente sanitario) puede obtener acceso a información con
respecto a los resultados de ensayo en un sitio Web, "página"
Web o similar. Una página Web consiste típicamente en cierta
información. Las páginas Web incluyen tanto páginas estáticas como
páginas dinámicas. Las páginas estáticas son páginas que se
almacenan en el servidor, o en un dispositivo de almacenamiento
accesible por el servidor, antes de la solicitud, y que se envían
desde el dispositivo de almacenamiento al cliente en respuesta a una
solicitud para esa página. Las páginas dinámicas son páginas que se
generan, en su totalidad o en parte, tras la recepción de una
solicitud. Por ejemplo, cuando la página es una vista de datos de
una base de datos, un servidor puede generar la página
dinámicamente usando normas o plantillas y datos de la base de
datos, dependiendo los datos particulares usados de la solicitud
particular realizada.
Al remitente se le puede asignar una contraseña
o código (PIN) que le permita acceder a sus resultados de ensayo en
una página Web o dentro de una base de datos que se mantenga por, o
para, la organización de ensayo (por ejemplo, el laboratorio de
ensayo). Por lo tanto, en esta realización un remitente también
puede recibir los resultados de ensayo sin tener que acudir a una
consulta médica y entonces puede proporcionar dicha información a
un médico de su elección según le convenga.
El programa informático que puede usarse para
mantener y proporcionar acceso a dichos resultados de ensayo está
disponible de proveedores y no forma parte de esta invención.
Se usó el siguiente procedimiento de ensayo para
todos los ejemplos descritos en este documento.
a. Los alérgenos extraídos, típicamente de
árboles, hierbas, mohos, alimentos, caspas y similares, se acoplan
a micropartículas por procedimientos covalentes o de adsorción. Cada
extracto de alérgeno se acopla a un subconjunto de partículas
único, siendo cada subconjunto distinguible por las emisiones
fluorescentes incorporadas o por el tamaño de partícula, donde
dichas características diferentes pueden reconocerse mediante una
instrumentación apropiada. Los subconjuntos de partículas acopladas
a alérgenos se almacenan individualmente o los subconjuntos se
combinan como un panel de alérgenos en un medio tamponado con
estabilizantes de proteínas y agentes bacteriostáticos. Para
determinar los niveles de IgE específica contra un panel de 10
alérgenos, por ejemplo, se disponen 10 \mul de los subconjuntos
de partículas combinados, que suman un total de 10.000 partículas,
estando cada subconjunto de partícula con alérgeno representado por
1.000 partículas, en un tubo de microfuga o pocillo de
microtitulación. Para las determinaciones de inmunoglobulina total,
se acopla anti-IgE humana a micropartículas por
procedimientos covalentes o de adsorción y se disponen 1.000
partículas en un tubo de microfuga o pocillo de microtitulación
para cada ensayo.
b. La sangre, plasma o suero recogido de un
individuo por medio del kit de recogida por punción en la yema del
dedo, como se describe en este documento, u otros métodos de
recogida se etiqueta apropiadamente o se le incorpora un código de
barras para su identificación. Unas pocas gotas de sangre, plasma o
suero recogido son adecuadas para determinar los niveles de
anticuerpos específicos contra un panel de alérgenos. Se añade una
muestra de 5 \mul a las partículas acopladas a alérgenos que se
encuentran en los tubos de microfuga o pocillos de microtitulación.
La mezcla combinada puede agitarse vorticialmente (con tubos de
microfuga) o sacudirse (agitador de placas de microtitulación)
brevemente e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. Para
las determinaciones de inmunoglobulina total, se añade una muestra
de 1 \mul a las partículas acopladas a anti-IgE
humana que se encuentran en el tubo de microfuga o pocillo de
microtitulación para cada ensayo.
c. Después, un volumen de un conjugado de
anticuerpo-biotina, como se describe, en una
solución tamponada se añade a la muestra y a la mezcla de
partículas acopladas a alérgenos descrita anteriormente. Después, el
material total se agita vorticialmente o se sacude brevemente de
nuevo y se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
d. Después, se añade a la mezcla (c) un volumen
de un conjugado de
estreptavidina-R-ficoeritrina, como
se describe, en una solución tamponada y la mezcla resultante se
agita vorticialmente o se sacude brevemente de nuevo y se deja
incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de esta incubación, la mezcla de
materiales resultantes se somete a una lectura mediante una
instrumentación citométrica de flujo apropiada, tal como los
instrumentos Luminex Corporation Luminex 100 System® o
Becton-Dickinson Immunocytometry FACSCAN®, que
simultáneamente determina el subconjunto de partículas por las
emisiones fluorescentes incorporadas en las partículas o el tamaño
de partícula y mide los espectros de emisión de la
R-ficoeritrina unida a la partícula por medio de la
unión de antígeno-anticuerpo y de
biotina-estreptavidina, como se ha descrito
anteriormente. Para determinar los niveles de concentración
cuantitativos de anticuerpos específicos contra alérgenos, se
procesan patrones conocidos, atribuibles al patrón de la
Organización Mundial de la Salud (por ejemplo, Patrón de IgE de la
OMS 75/502 UI/ml) para proporcionar una curva patrón, a partir de la
cual se extrapola, se registra y se informa de la concentración de
IgE específica en una muestra de un paciente para cada alérgeno.
Los niveles de específicos de anticuerpos contra alérgenos pueden
describirse en unidades de concentración, como por ejemplo unidades
por mililitro y/o niveles de clase, como reconocerán los expertos
en el diagnóstico de alergias in vitro.
Los siguientes son ejemplos ilustrativos de la
invención.
A 15 \mul de biotina (éster de
N-hidroxisuccinimida de amidocaproato de biotina)
(Sigma, MO Estados Unidos) 25 mg/ml en dimetilformamida (Sigma) se
añaden 0,4 ml de anti-IgE humana purificado por
afinidad (Bethy Labs, TX, Estados Unidos) 3,0 mg/ml en NaHCO_{3}
0,1 M. La solución de reactivo se agita durante 1 hora a 25ºC. Se
añade hidroxilamina (Spectrum Quality Products, CA, Estados Unidos),
20 \mul, 20 mg/ml en NaHCO_{3} 0,1 M y la solución se mezcla
brevemente. La solución de anticuerpo biotinilado se purifica en una
columna de desalación Sephadex G-25 (Pharmacia,
Suecia) equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS),
pH 7,2, que contiene azida sódica al 0,1% (Sigma).
Se suspenden microesferas de poliestireno
carboxilado (Luminex Corporation, TX, Estados Unidos) en 80 \mul
de tampón MES 0,1 M (Fisher Scientific, PA, Estados Unidos) pH 6,1.
A la suspensión se añaden 10 \mul de sal sódica de
N-hidroxisulfosuccinimida (Pierce Chemicals, IL,
Estados Unidos) 50 mg/ml y 10 \mul de clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
(Pierce Chemicals, IL, Estados Unidos) 5 mg/ml. La solución se
agita vorticialmente y se deja reposar en la oscuridad durante
15-20 minutos a temperatura ambiente. Las
microesferas activadas se centrifugan durante 5 minutos a 5000 g y
el sobrenadante se aspira. Después, las microesferas se resuspenden
en 250 \mul de solución de PBS 0,1 M (Fosfato Sódico 0,1 M, NaCl
0,14 M) pH 7,3. La mezcla se agita vorticialmente, las microesferas
activadas se centrifugan y el sobrenadante se aspira como
antes.
Después, las microesferas activadas se
resuspenden en 250 \mul de extracto de alérgeno, proteínas
purificadas o proteínas recombinantes. Después, la mezcla se hace
girar (protegida de la luz) durante al menos 1 hora a temperatura
ambiente y se centrifuga durante 5 minutos a 5000 g. El sobrenadante
se aspira y las microesferas se resuspenden en 250 \mul de tampón
PBS/HSA pH 7,3 que contiene PBS 0,01 M y albúmina de suero humano
0,02 mg/ml (Sigma, MO, Estados Unidos) y se agitan vorticialmente
para lavar las microesferas de extracto de alérgeno residual. El
sobrenadante se centrifuga de nuevo y se aspira como se ha descrito
anteriormente. El procedimiento de lavado se repite dos veces más y
las microesferas se resuspenden en 250 \mul de PBS/HSA. La
concentración de microesferas en solución se determina por recuento
usando un hemocitómetro (Fisher Scientific, PA, Estados Unidos) y
un microscopio (Nippon Kogaku, Japón).
\vskip1.000000\baselineskip
Subconjuntos de microesferas marcadas
fluorescentemente obtenidas de Luminex Corporation se acoplaron
covalentemente con proteínas extraídas de moho Alternaria, grama,
hierba timotea, caspa de gato, cedro de montaña, clara de huevo,
leche, trigo, ambrosía y ácaros. Se ensayaron muestras de suero
obtenidas de individuos atópicos y no atópicos contra este panel de
diez alérgenos. Se añadió una muestra de 5 \mul a 10 \mul de
microesferas acopladas a alérgenos suspendidas en pocillos de
microtitulación de polipropileno de fondo en V (Evergreen
Scientific, CA, Estados Unidos) o tubos de microfuga de
polipropileno de 0,5 ml (Evergreen Scientific, CA, Estados Unidos).
Para la curva patrón de seis puntos, se añadieron 5 \mul de cada
uno de los patrones de suero (patrones secundarios calibrados
frente al Patrón de IgE de la OMS 75/502) a 10 \mul de
microesferas recubiertas con antígeno en pocillos de
microtitulación. La placa de microtitulación se colocó en un
agitador de placas de microtitulación (Fisher Scientific, PA,
Estados Unidos) y se sacudió durante 10-20 segundos.
Se incubaron microesferas con patrones o muestra durante 1 hora a
temperatura ambiente como se ha descrito anteriormente. Se añadió
un volumen de 40 \mul de conjugado de anti-IgE
humana-biotina directamente al contenido de cada
pocillo; la placa se sacudió brevemente como antes y el contenido se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se
añadió un volumen de 40 \mul de conjugado de
estreptavidina-R-ficoeritrina
(Advanced Biosystems, CA, Estados Unidos) al contenido de cada
pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después,
las microesferas se introdujeron directamente en el citómetro de
flujo Luminex 100 para su aspiración hacia el instrumento, que
identifica simultáneamente las señales de emisión de las partículas
de un subconjunto y la presencia del marcador fluorescente de
R-ficoeritrina que se encuentra sobre las
partículas. La curva patrón se determinó usando una ecuación de
función de transición no lineal acumulativa lorentziana de cuatro
parámetros y los niveles de IgE específica contra alérgenos se
interpolaron a partir de la curva patrón como se muestra en la
Figura 1.
La Figura 1 muestra los resultados de dos
individuos no alérgicos y tres alérgicos con respuestas de IgE
específicas positivas contra un panel de diez alérgenos. Se usó un
volumen de 5 \mul de muestra de cada individuo en un
procedimiento de ensayo homogéneo de tres horas para medir
simultáneamente los niveles de IgE específica contra los diez
alérgenos acoplados a microesferas. La medición de señales de
intensidad de fluorescencia usando el sistema Luminex 100 se usó
para describir los resultados en UI/ml o unidades de clase según se
interpolaron a partir de una curva patrón de seis puntos de 0,35
UI/ml. Se obtuvo un intervalo de interpretaciones de respuesta de
Negativo a Extremadamente Alto basándose en los niveles de
clase.
\vskip1.000000\baselineskip
Se acopló anticuerpo de cabra
anti-IgE humana (Bethyl Laboratories, TX, Estados
Unidos) a partículas de microesferas (Luminex Corporation, TX,
Estados Unidos) siguiendo el mismo procedimiento descrito
anteriormente para acoplar alérgenos. Se obtuvieron muestras de
suero de individuos obtenidas por los métodos descritos
anteriormente. Se añadió un volumen de 1,0 \mul de patrón
(patrones secundarios calibrados frente al Patrón de IgE de la OMS
75/502) o muestra individual a 25 \mul de microesferas suspendidas
acopladas con anticuerpo en pocillos de microtitulación, se
sacudieron brevemente como se ha descrito anteriormente y se
incubaron durante 1 hora. Posteriormente, se añadió un volumen de
40 \mul de conjugado de anti-IgE
humana-biotina al contenido de cada pocillo y se
incubó durante 1 hora. Posteriormente, se añadió un volumen de 40
\mul de conjugado de
estreptavidina-R-ficoeritrina al
contenido de cada pocillo, la placa de microtitulación se sacudió
brevemente y la mezcla se incubó durante 1 hora. Después, las
microesferas se introdujeron directamente en el citómetro de flujo
Luminex 100 para su aspiración hacia el instrumento, que identifica
simultáneamente las señales de emisión de las partículas de un
subconjunto y la presencia del marcador fluorescente de
R-ficoeritrina que se encuentra sobre las
partículas. La curva patrón se determinó usando una ecuación de
función de transición no lineal acumulativa lorentziana de cuatro
parámetros y los niveles de IgE total en las muestras se
interpolaron a partir de la curva patrón como se muestra en la
Figura 2.
La Figura 2 muestra los resultados de la curva
patrón de IgE total y los resultados de IgE total de diez
individuos. Se usó un volumen de 1 \mul de muestra de cada
individuo en un procedimiento de ensayo homogéneo de tres horas. La
cantidad de IgE total unida a microesferas acopladas a
anti-IgE humana se determinó por medición de la
intensidad de señal de las señales indicadoras fluorescentes usando
el sistema Luminex 100 y se interpoló a partir de una curva patrón
de seis puntos de 2-2000 UI/ml. Los resultados
esperados en las muestras se proporcionaron por un laboratorio de
referencia usando un procedimiento de ensayo alternativo.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet US 4459360 A [0005]
- \bullet US 5807675 A [0008]
- \bullet US 5082768 A [0005]
- \bullet US 5981180 A [0010] [0024]
- \bullet US 6087188 A [0005]
- \bullet US 6245513 A [0031]
\bulletJohansson, S. G.O,;
Yman, L. In vitro assay for immunoglobulin E, Coin.
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\bullet The Immunoassay Handbook. M
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\bullet Edward T. Maggio.
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\bullet Mario Serio; Mario
Pazzagli. Luminescent Assays, Perspectives in Endocrinology
and Clinical Chemistry. Raven Press, 1982, vol. 1
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McElroy. Bioluminescence and Chemiluminescense, Basic
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\bullet Proceedings of the Vth International
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Bioluminescence. Wiley, 1989, vol. 4 [0006]
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Inc, 1975 [0007]
\bullet Immunochemistry of
Solid-Phase Immunoassay. CRC Press,
1991 [0007]
\bulletRobard, D.
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\bullet Immunoassay Handbook. M Stoekton
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\bullet Manual of Clinical Laboratory
Immunology. American Society for Microbiology, 5 [0011]
\bullet John E. Butler. Immunochemistry
of Solid -Phase Immunoassay. CRC Press, 1991
[0024]
\bullet Immobilized Enzymes, Antigens,
Antibodies, and Peptides. Marcel Dekker, Inc, 1975
[0024]
\bulletHaugland, R. P.;
Bhalagat, M. K. Preparation of avidln conjugates. Methods
Mol. Biol, 1998, vol. 80, 185-96
[0034]
Claims (13)
1. Método de inmunoensayo homogéneo para
detectar y cuantificar simultáneamente niveles de anticuerpos de
inmunoglobulinas específicas contra una pluralidad de alérgenos en
una muestra de sangre, que comprende
- (a)
- poner en contacto una muestra de sangre que tiene un volumen de 1 a 25 \mul con una pluralidad de partículas acopladas a una pluralidad de alérgenos, las partículas estando en suspensión en 1 a 50 \mul de un medio acuoso, cada combinación de partículas con alérgeno específico siendo distinguible de combinaciones de partículas con otros alérgenos, en condiciones en las que los anticuerpos de inmunoglobulinas presentes en la muestra de sangre que se unen específicamente a uno o más de los alérgenos se unen a las partículas;
- (b)
- después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (a) con un primer conjugado que comprende un anticuerpo anti-humano IgE o IgG conjugado con biotina;
- (c)
- después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (b) con un segundo conjugado que contiene una porción fluorófora unida a avidina o estreptavidina, siendo el peso molecular del segundo conjugado de 400.000 a 1.000.000 de Daltons; y siendo la proporción molar del primer conjugado respecto al segundo conjugado de 1:1 a 1:5; y
- (d)
- después de eso, determinar los niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas en los materiales de la etapa (c), determinando simultáneamente las señales de emisión fluorescente de los subconjuntos de partículas y midiendo las señales de emisión fluorescente de la porción fluorófora.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método de inmunoensayo homogéneo para
detectar y cuantificar los anticuerpos de inmunoglobulina E totales
en una muestra de sangre, que comprende
- (a)
- poner en contacto una muestra de sangre que tiene un volumen de 0,5 a 10 \mul con una pluralidad de partículas acopladas a inmunoglobulina E anti-humana, las partículas estando en una suspensión de 1 a 50 \mul de un medio acuoso;
- (b)
- después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (a) con un primer conjugado que comprende un anticuerpo de IgE anti-humana conjugado con biotina;
- (c)
- después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (b) con un segundo conjugado que contiene una porción fluorófora unida a avidina o estreptavidina; siendo el peso molecular del segundo conjugado de 400.000 a 1.000.000 de Daltons y siendo la proporción molar del primer conjugado respecto al segundo conjugado de 1:1 a 1:5;
- (d)
- después de eso, determinar los niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas en los materiales de la etapa (c), determinando simultáneamente las señales de emisión fluorescente de las partículas y midiendo las señales de emisión fluorescente de la porción fluorófora unida a las partículas.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la pluralidad de partículas contiene de 10 a 40
alérgenos.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el anticuerpo específico se selecciona de inmunoglobulina E,
inmunoglobulina G y subclases de inmunoglobulina G.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que el fluoróforo es una ficobiliproteína.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que la ficobiliproteína es ficoeritrina.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que la biotina se conjuga al anticuerpo IgE
anti-humana en una proporción molecular de 10:1 a
30:1.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la etapa (a) se lleva a cabo poniendo en contacto la muestra
con una pluralidad de partículas acopladas a de 2 a 100 alérgenos
específicos.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que el anticuerpo acoplado a partículas se selecciona de IgE
policlonal anti-humana.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el anticuerpo acoplado a partículas es un fragmento de
IgE anti-humana que se une específicamente a
inmunoglobulina E.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el anticuerpo acoplado a partículas es un anticuerpo
monoclonal que se une específicamente a inmunoglobulina E.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se determinan los anticuerpos específicos de alérgeno sin
diluir la muestra de sangre.
13. Método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la proporción molecular de anticuerpo IgE
anti-humana respecto a biotina en el primer
conjugado es de 1:10 a 1:30.
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